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Exchanging the amino acid valine for cysteine at position 388 (corresponding to Shaker position 438) in hKv1.3 channels leads – as described in the literature – to two different ion conducting pathways: i) the central potassium selective α pore and ii) the σ-pore pathway which is characterized by an inward current for certain conditions. The σ-pore currents can be seen in extracellular sodium Ringer solution, but not in extracellular potassium Ringer solution. In addition, σ-pore currents are carried by sodium ions at potentials more negative than -100 mV where the central α-pore would normally be closed. To further characterize the σ-pore I tested the influence of extracellular Barium ions (Ba2+) on currents through hKv1.3_V388C channels using the whole-cell recording mode of the patch clamp technique. My results show that extracellular Ba2+ block both, currents through the α- and through the σ-pore. Comparing the characteristics of block by extracellular Ba2+ the following conclusions on the hKv1.3_V388C channel could be drawn: Currents through the α-pore were blocked by Ba2+ in a concentration- and voltage-dependent manner. The binding site for Ba2+ to block current through the α pore of the hKv1.3_V388C channels was calculated to be about 60% into the electric membrane field from the outside. In wildtype channels this value was reported to be about 75% indicating that the V388C mutation changed the binding site for Ba2+ in the selectivity filter. In contrast, Ba2+ block of currents through the α-pore did not depend on voltage. This voltage-independent Ba2+ block indicates that Ba2+ binds at a site outside the membrane electric field, either directly at the σ-pore entrance or Ba2+ binds at a potassium binding site near the α-pore entrance of the selectivity filter thereby mimicking a potassium ion stabilizing the selectivity filter and preventing the creation of the σ-pores., Der Austausch der Aminosäure Valin gegen Cystein an Position 388 (entspricht der Shaker-Position 438) in hKv1.3-Kanälen führt - wie in der Literatur beschrieben - zu zwei verschiedenen Ionenleitwegen: i) der zentralen K+-selektiven α-Pore und ii) dem σ -Porenweg. Die σ-Porenströme können in extrazellulärer Natrium-Ringer-Lösung beobachtet werden, nicht aber in extrazellulärer Kalium-Ringer-Lösung. Dazu kommt, dass σ-Porenströme von Natriumionen getragen werden und nur bei stark hyperpolarisierenden Potentialen negativer als -100 mV auftreten, bei denen die zentrale α-Pore normalerweise geschlossen wäre. Um die σ-Pore genauer zu charakterisieren, wurde der Einfluss von extrazellulären Bariumionen (Ba2+) auf Ionenströme durch hKv1.3_V388C Kanäle unter Verwendung der Ganzzellmessmethode der Patch-Clamp-Technik getestet. Die Ergebnisse zeigen, dass extrazelluläres Ba2+ sowohl Ströme durch die α-Pore als auch durch die σ-Pore blockiert. Durch einen Vergleich der unterschiedlichen Eigenschaften der Blockade durch extrazelluläres Ba2+ konnten folgende Aussagen für den Modellkanal hKv1.3_V388C getroffen werden: Ströme durch die α-Pore wurden durch Ba2+ konzentrationsabhängig und spannungsabhängig blockiert. Die Bindungsstelle für Ba2+ zur Blockade von α-Strömen liegt laut Berechnungen zu etwa 60% im elektrischen Membranfeld. Für den Wildtyp wurden Werte um 75% gefunden. Daher wird vermutet, dass die V388C Mutation die Bindungsstelle für Ba2+ im Selektivitätsfilter verändert hat. Im Unterschied dazu war der Ba2+ Block der σ-Pore nicht spannungsabhängig. Diese Spannungsunabhängigkeit der Ba2+ Blockade von σ-Strömen bedeutet, dass extrazelluläres Ba2+ bei der Blockade an einer Stelle außerhalb des elektrischen Membranfeldes bindet. Ba2+ bindet entweder direkt am Eingang der σ-Pore oder an einer Kaliumionen-Bindungsstelle in der Nähe des α-Poren Eingangs des Selektivitätsfilters. Dort ahmt es ein Kaliumion nach, welches den Selektivitätsfilter stabilisiert und dadurch die Entstehung der σ-Poren verhindert.

The replacement of the amino acid valine with the smaller cysteine at position 388 (Shaker position 438) in the mutant voltage-gated potassium channel hKv1.3_V388C opened a new pathway (σ-pore) behind the central α-pore. At potentials more negative than -100 mV, where the central α-pore of the hKv1.3_wt would normally be closed, a large inward current through the σ-pore appeared being carried by different cations like Na+, Li+, Cs+, and NH4+ (Prütting et al. 2011; JBC 286:20031-20042) whereas the current through the α-pore in Na+ solution showed faster inactivation. For the pharmacological characterization of the σ-pore we performed measurements with the patch-clamp technique in the whole cell recording mode. For each experiment drugs were added to the external bath solution. To simultaneously measure current through both α- and σ-pores and determine the blocking effect we used depolarizing pulses from the holding potential of -120 mV to +40 mV for 100 ms to show currents through the α-pore, followed by hyperpolarizing pulses to -180 mV to show currents through the σ-pore. α-pore-blocking peptide toxins acting at the external vestibule of the channel such as CTX, KTX, and AgTX blocked the α-pore with five-times lower affinity than hKv1.3_wt channels and showed no blocking effect on the σ-pore of the mutant channel. PAP-1 blocked current through both α- and σ-pore with high affinity similar to wildtype (KD ~ 2 nM). The phenylalkylamine blocker verapamil and its derivate norverapamil acting from the intracellular side of the channel reduced currents through both pores with the same affinity, similar to wildtype. Methoxyverapamil and acyanoverapamil could also reduce both currents, however with somewhat different affinities for the σ-pore compared to current through the α-pore indicating a possibility to distinguish the location of the α-pore- and σ-pore-exit into the internal vestibule.

G-Protein gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (GIRK-Kanäle) sind im Herzen an der Ausbildung des Ruhepotentials beteiligt. Sie werden über M\(_2\)R aktiviert und über G\(_q\)PCRs durch PIP\(_2\)-Depletion und/oder Kanalphosphorylierung durch PKCs inhibiert. Der exakte Mechanismus der Inhibition der GIRK-Kanäle ist bisher nicht bekannt. Deshalb wurde in der folgenden Arbeit die Inhibition der GIRK-Kanäle während der Aktivierung von \(\alpha\)1-AR bzw. ET-R mithilfe verschiedener Methoden (FRET, Patch-Clamp) analysiert. Dabei zeigte sich, dass die Rezeptor-spezifische Aktivierung der Ca\(^{2+}\)-abhängigen PKC-Isoformen \(\alpha\) und \(\beta\) zur Inhibition des GIRK beiträgt. Außerdem regulieren cPKCs Rezeptor-spezifisch Dauer und Stärke des Signals von G\(_q\)PCRs. Die Rezeptor-spezifischen Unterschiede in der Aktivierung der cPKCs stellen somit einen neuen Signalweg dar, bei dem die Aktivität des GIRK-Kanals und die Stärke des Rezeptor-Signals über einen negativen Feedback-Mechanismus reguliert werden.

Persönlichkeit wird zum einen durch genetische Einflüsse, zum anderen durch Erziehung und Umweltfaktoren geprägt. In heutigen Tagen ist es weitestgehend akzeptiert, dass das menschliche Naturell und die Persönlichkeit durch vielfältige genetische Faktoren beeinflusst werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine Genotypisierung an einer Patientenstichprobe, bestehend aus Patienten der Universitätsklinik Würzburg, mit der gesicherten Diagnose einer Persönlichkeitsstörung, und einem Kollektiv aus gesunden Probanden (Bevölkerungskollektiv) durchgeführt. Es wurden zwei verschiedene Gen-Polymorphismen (rs7275707 und rs722557) des Kandidatengens KCNJ6 hinsichtlich ihrer Beteiligung an Persönlichkeitsstörungen untersucht. Das von diesem Gen codierte Protein ist ein G-protein aktivierter einwärtsgleichrichtender Kaliumkanal (GIRK2). Es konnte zwar ein signifikanter Zusammenhang zwischen einem Single-Nukleotid-Polymorphismus (SNP) in dem Kandidatengen KCNJ6 und der antisozialen sowie Borderline-Persönlichkeitsstörung nachgewiesen werden, die molekulargenetischen Entstehungswege bis hin zur phänotypischen Ausprägung der Persönlichkeitsstörung sind allerdings multifaktoriell und an viele Rezeptor- und Neurotransmittersysteme gekoppelt. Der Ursprung kann auf den Austausch bzw. die Variation einer einzelnen Base im DNA-Strang zurückgeführt werden, im Ganzen betrachtet bleiben die Entstehung der Persönlichkeit und die daran gekoppelten Störungen aber ein multidimensionaler Prozess., Personality of a human beiing is based on the one hand on genetic conditions, on the other hand on education and social environment. Nowadays it is broadly accepted, that human disposition and personality is influenced by a variety of genentic factors. In this study we compared patients with a diagnosis of a personality disorder in comparison to healthy candidates via genotyping. We focused on the role of the two gene polymorphisms (rs 7275707 and rs 722557) of the candidate gene KCNJ6. This gene encodes for an inwardly rectifying potassium channel (GIRK2). Though an association between one single nucleotide polymorphism(SNP) of our candidate gene and the antisocial personality disorder and the Borderline-Disorder was found, the molecular genetic pathways from the origin to the expression of the phenotype is multifactorial and linked to many systems of receptors and neurotransmitters. The origin of a disorder can be explained by the exchange of one base in the DNS, but in total the development of personality and the linked disorders are a multidimensional process.

T- and B-lymphocytes usually express the human voltage-gated Kv1.3 channel (hKv1.3). Verapamil known as a potent L-type Ca2+channel blocker is also able to block hKv1.3 channels. The blocking effect of verapamil on currents through wild-type and six hKv1.3 mutant channels in the open and not in the inactivated state was determined using the whole-cell patch clamp technique. From the time course of the open channel block kon of verapamil was calculated. Comparing on-rates of different mutations helps to identify the interaction of different amino acid residues with verapamil reaching its blocking site. The on-rate of verapamil was not altered by a mutation to position 419. Mutations to position 417, 418, 346 and 346/418 had a moderate effect whereas a mutation to position 420 had a great effect and reduced kon ~ 6 fold. We conclude that position 420 in hKv1.3 channels strongly interacts with verapamil and is a presumed second binding site. Both positions 417 and 418 in hKv1.3 channels interfere with verapamil whereby mutation L418C only interferes with verapamil until verapamil has reached its blocking site. Position 419 does not interfere with verapamil at all. Mutant hKv1.3_L346C and hKv1.3_L346C_L418C mutant channels indirectly influenced verapamil’s ability to reach its binding site.

Diese Doktorarbeit gliedert sich in drei Teilprojekte, welche sich alle mit der strukturellen und funktionellen Charakterisierung von medizinisch-relevanten Proteinen (HMGA1a, NFKB1, Bs6) mittels mehrdimensionaler NMR-Spektroskopie beschäftigten. Projekt 1: Strukturelle und funktionelle Charakterisierung des durch Festphasensynthese hergestellten Kaliumkanalinhibitors, isoliert aus dem Gift von \(\textit {Buthus sindicus}\), Alpha-KTx 3.8 (Bs6) mittels homonuklearer 2D NMR-Spektroskopie, MD Simulation und elektrophysiologischer Messungen. Projekt 2: Heteronukleares NMR-Zuordnung des 2D [\(^1\)H,\(^{15}\)N] HSQC Spektrums und klassische Dynamikstudien (T\(_1\)/T\(_2\)/hetNOE) der Dimerisierungsdomäne des Transkriptionsfaktors NFKB1 (p50). Projekt 3: NMR-basierte Charakterisierung des dreidimensionalen Strukturensembles des intrinsisch ungefalteten Proteins HMGA1a und Untersuchung des Einflusses von post-translationalen Modifikationen (z.B. Phosphorylierung) auf die globale Struktur und Funktion von HMGA1a.

In vielen Tumorzellen ist eine aberrante Expression von Ionenkanälen im Allgemeinen und spannungsaktivierten Kaliumkanälen im Besonderen nachgewiesen. Diese nehmen großen Einfluss auf den Zellzyklus, die Differenzierung und die Proliferationsrate der Zellen. Bisher noch kaum erforscht ist die Wechselwirkung von Bestrahlung als eine der grundlegenden Säulen der Krebstherapie und spannungsaktivierten Kaliumkanälen. Das Ziel der vorliegenden Dissertation ist es, die Effekte von Bestrahlung auf spannungsaktivierte Kv-Kanäle sowie die Auswirkungen auf den Kalziumhaushalt und die Zellzyklusprogression der Zellen zu beschreiben. Die einmalige Bestrahlung von HEK 293-Zellen induzierte innerhalb von 24 Stunden einen partiellen G2/M-Arrest, welcher nach 48 Stunden wieder überwunden werden konnte. Diesem Zellzyklusarrest ging eine Aktivierung von spannungsabhängigen Kv-Kaliumkanälen voraus. Die Kaliumkanalaktivierung konnte eine Stunde nach der Bestrahlung nachgewiesen werden und erreichte nach ungefähr drei Stunden ein Maximum, um danach auf Werte wie vor der Bestrahlung abzufallen. Die Hemmung der Kaliumkanäle durch den unselektiven Kaliumkanalinhibitor TEA in submillimolaren Konzentrationen, die Use Dependent Inactivation sowie die Aktivierungs- und Inaktivierungskinetik lassen auf eine Zugehörigkeit zu Shaker- und Shaw-Subtypen schließen. Durch eine Inhibition der Kv-Kanäle konnte das Wiedereintreten der Zellen in den Zellzyklus nach 48 Stunden verhindert werden. Nach Bestrahlung zeigte sich zudem ein erhöhter Kalziumeinstrom nach extrazellulärer Kalziumdepletion. Hier konnte durch eine Kv-Kanalinhibition eine deutliche Steigerung des Kalziumeinstroms nach Bestrahlung nachgewiesen werden. Ein möglicher zu Grunde liegender Signalweg könnte eine radiogene Aktivierung des IGF-Rezeptors mit konsekutiver Aktivierung der PI3Kinase, der PDK-1 sowie der SGK-1 und nachfolgender Aktivierung der Kv-Kanäle mit hieraus resultierenden Auswirkungen auf den Kalziumhaushalt und das Kalziumsignaling sowie auf den Zellzyklus darstellen. Die funktionelle Signifikanz der beobachteten Effekte im Sinne der Klonogenität und des postradiogenen Zelltodes muss anhand weiterer Experimente erforscht werden.

TASK potassium channels control the membrane potential in many cell types and thus affect a plethora of cellular functions such as excitability of neurons and cardiac muscle, and secretion of aldosterone in the adrenal gland. Although commonly termed ‘leak channels’, TASK channels are highly regulated. Most importantly, they are strongly inhibited by a variety of hormones and neurotransmitters activating Gq-protein coupled receptors (GqPCRs). Despite extensive studies of TASK inhibition by the GqPCR-induced signaling cascade, the underlying mechanism of channel regulation has not been elucidated. Thus I aimed to unravel the second messenger responsible for GqPCR-mediated TASK channel inhibition and validate my findings from the heterologous expression system in cerebellar granule neurons. The signaling cascade induced by GqPCRs is initiated by activation of Gαq, which in turn stimulates phospholipase Cβ to hydrolyze the membrane phospholipid phosphatidylinositol( 4,5)bisphosphate producing the second messengers 1,2-diacylglycerol (DAG) and inostol( 1,4,5)trisphosphate. Using different approaches, I first established that phospholipase C is critical for GqPCR-mediated TASK channel inhibition. Next, I found that direct application of a DAG analog was sufficient to inhibit TASK channels. Accordingly, experimental attenuation of the DAG transients evoked by GqPCR stimulation diminished TASK channel inhibition, indicating that DAG is responsible for the current reduction following receptor activation. Because it had been previously established that a six amino acid motif within the proximal C-terminus is important for TASK channel regulation by GqPCRs, I compared the effects of GqPCR stimulation and DAG application on TASK channel proteins either truncated or mutated within this motif. A correlation of the sensitivities towards DAG and GqPCR activation further supported the hypothesis of DAG production as the underlying mechanism for the GqPCR-mediated effect. Lastly, to test whether native TASK-mediated currents were also inhibited by DAG, I probed application of this lipid on dissociated cerebellar granule neurons that express the TASK-mediated standing outward potassium current (IKSO). IKSO was inhibited by muscarinic receptor agonist as well as by direct application of DAG, producing a significant membrane depolarization. In conclusion, my findings demonstrate that DAG mediates the GqPCR-induced inhibition of TASK channels in an expression system as well as native, TASK-mediated currents. Thus, my data expand the view on the signaling effects of the small membrane lipid DAG and establish a link between DAG and cell excitability. Additionally, they may pave the way towards understanding the mechanism of DAG action on ion channels as atypical DAG effector proteins., TASK Kaliumkanäle tragen in vielen Zelltypen zur Generierung des Membranpotentials bei, wodurch sie zahlreiche zelluläre Funktionen beeinflussen. Obwohl TASK-vermittelte Ströme häufig als „Hintergrundleitfähigkeit“ bezeichnet werden, sind sie vielfach reguliert; unter anderem werden TASK Kanäle durch jene Hormone und Neurotransmitter gehemmt, welche Gαq/11-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GqPCR) aktivieren. Diese Kanalregulation spielt zum Beispiel für die Anpassung der Erregbarkeit von Nerven- und Herzmuskelzellen, wie auch für die Aldosteronsekretion in der Nebenniere eine Rolle. Trotz der physiologischen Bedeutung von TASK Kanälen und deren Inhibition konnte der zugrunde liegende Mechanismus für die GqPCRvermittelte Regulation noch nicht aufgeklärt werden. Die vorliegende Arbeit hat zum Ziel, das verantwortliche Signalmolekül zu identifizieren und seinen Effekt auf zerebelläre Körnerzellen zu untersuchen. Die klassische GqPCRs Signalkaskade beginnt mit der Aktivierung von Gαq, welches die Phospholipase Cβ aktiviert. Diese spaltet daraufhin das Membranlipid Phosphatidylinositol( 4,5)bisphosphat zu Diacylglycerol (DAG) und Inositol(1,4,5)trisphosphat. Mit verschiedenen experimentellen Ansätzen habe ich zuerst die Bedeutung der Phospholipase C für die GqPCR-vermittelte TASK Regulation herausgearbeitet. In weiterer Folge konnte ich zeigen, dass die direkte Applikation eines DAG-Analogons ausreicht, um den Kanal zu inhibieren. Die Abschwächung des durch Stimulation von GqPCRs erreichten DAG-Transienten durch Überexpression DAG-metabolisierender Enzyme reduzierte gleichermaßen die Inhibition der TASK Kanäle. Da bereits gezeigt wurde, dass ein sechs Aminosäuren langes Motiv im TASK C-Terminus essentiell für die GqPCR-vermittelte Inhibition ist, habe ich den Kanal in diesem Motiv mutiert und die Mutanten auf ihre DAG-Sensitivität untersucht. Die Ergebnisse zeigen eine Korrelation zwischen der Inhibition durch Aktivierung eines GqPCRs und der Applikation des DAG-Analogons und untermauern die vorangegangenen Resultate, dass die DAG Produktion der GqPCR-vermittelten TASK Inhibition zugrunde liegt. Um die Ergebnisse aus den heterolog exprimierenden Zellen im nativen System zu validieren, untersuchte ich den TASK-vermittelten Strom IKSO in dissoziierten zerebellären Körnerzellen. Sowohl die Aktivierung muskarinischer Rezeptoren, als auch die Applikation des DAG-Analogons führten zu einer deutlichen Reduktion des IKSO, welche mit einer Depolarisation der Zellmembran einher ging. Zusammengefasst zeigen meine Ergebnisse, dass DAG der verantwortliche second messenger in der GqPCR Signalkaskade ist, welcher zur Schließung der TASK Kanäle führt. Das erweitert die Sicht auf die Signalwirkung des kleinen Membranlipids DAG und betont den Zusammenhang zwischen DAG und zellulärer Erregbarkeit.

Mutationen bei kardialen Ionenkanälen können Auswirkungen auf die Kanalfunktion haben und zu einem modifizierten Herzaktionspotenzial führen. Funktionsstörungen der kardialen Kaliumkanäle K\(_V\)1.5 und K\(_V\)7.1 können durch ihre Beteiligung an der Repolarisation des Herzaktionspotenzials lebensbedrohliche Herzrhythmusstörungen auslösen. Ziel dieser Arbeit war die Charakterisierung und Funktionsanalyse von potenziell pathophysiologisch auffälligen Genmutationen der spannungsabhängigen Ionenkanäle K\(_V\)1.5 und K\(_V\)7.1 sowie die Identifizierung der Bindestelle des Kalium-Kanalinhibitors JNJ303. Untersuchungen der molekularen Aspekte im K\(_V\)7.1-Kanal identifizierten die neue \(\textit {gain of function}\)-Mutation A287T als Schlüsselaminosäure im K\(_V\)7.1/KCNE1-Kanalkomplex. Die pharmakologischen Aspekte erfassten ein neues Bindemotiv des Inhibitors JNJ303 im K\(_V\)7.1/KCNE1-Kanal. Untersuchungen der evolutionären Aspekte zeigten Funktionsveränderungen von K\(_V\)1.5-Mutationen mit hohem arrhythmogenen Potenzial des Neanderthalers.

Kalium-Kanäle der Zwei-Poren-Domänen Familie (KCNK, \(K_{2P}\)) sind \(K^{+}\)-selektive Kanäle, die sich spannungsunabhängig und spontan öffnen. Sie sind verantwortlich für den Hintergrund-\(K^{+}\)-Strom, der in den meisten erregbaren Zellen vorhanden ist und ihre Erregbarkeit reguliert. In der vorliegenden Studie wurden 6 KCNK-Kanäle pharmakologisch charakterisiert. Es wurde beobachtet, dass die Basalaktivität von manchen KCNK-Kanälen sowohl durch scharfe Substanzen als auch durch, in der Natur vorkommende, Terpene modifiziert werden kann. Im nächsten Schritt wurden Aminosäuren identifiziert, die in die Kanal-Ligand-Interaktionen involviert sind. Zuletzt wurde der Effekt von der scharf- und prickelnden Substanz Piperin auf die Hintergrund \(K^{+}\)-Leitfähigkeit trigeminaler Neurone der Maus untersucht. Dies zeigte, dass Piperin eine Depolarisierung in vielen Neuronen induziert. Diese Depolarisierung entsteht in vielen Neuronen durch die Hemmung der Hintergrund-\(K^{+}\)-Leitfähigkeit.

Die vorliegende Arbeit beschreibt funktionelle und histologische Charakteristika des \(5-HT_{7}\)-Rezeptors im \(\textit {Nucleus raphe dorsalis}\) der Maus. X-Gal- und Antikörperfärbungen zeigen ein charakteristisches Expressionsmuster des \(5-HT_{7}\)-Rezeptors im \(\textit {Nucleus raphe dorsalis}\) und belegen, dass der \(5-HT_{7}\)-Rezeptor nicht von serotonergen Neuronen exprimiert wird und somit als Heterorezeptor fungiert. Einzelzell-RT-PCR Studien legen nahe, dass der \(5-HT_{7}\)-Rezeptor im \(\textit {Nucleus raphe dorsalis}\) auf GABAergen Neuronen lokalisiert ist. Funktionell reguliert der \(5-HT_{7}\)-Rezeptor intrinsische Eigenschaften von Neuronen wie den Membranwiderstand und die Nachhyperpolarisierung und inhibiert die spontane und maximale Feuerungsrate. Die maximale Entladerate wird durch die cAMP-Konzentration und über die Inhibierung von \(\textit {delayed rectifier}\) Kaliumkanälen moduliert.

In der vorliegenden Arbeit wurden, mit Hilfe von \(\textit {in vitro}\) elektrophysiologischen Methoden an akuten Hirnschnitten von Ratten, umfassend beschriebene Effekte cholinerger Erregung auf CA1 Pyramidalneurone repliziert. Des Weiteren wurde zum ersten Mal für diese Neuronenpopulation gezeigt, dass cholinerge Aktivierung der Zellen sogenanntes persistierendes Feuern (PF) ermöglicht. PF wird als Kurzzeitgedächtnismechanismus betrachtet. Es ist die fortlaufende Erzeugung von Aktionspotentialen, obwohl ein kurzer, Aktionspotential-initiierender, elektrischer Stimulus beendet wurde, und obwohl die Zelle vor der elektrischen Stimulation keine Aktionspotentiale zeigte. PF schien von denselben Mechanismen mediiert zu werden, wie eine, bereits ausführlich beschriebene, epilepsiebezogene neuronale Aktivitätsform. Das Ausmaß cholinerger Aktivierung schien zu bestimmen ob die Zelle lediglich transiente, oder gedächtnisbezogene, oder epilepsiebezogene Aktivität zeigte.

Der Locus Coeruleus (LC) ist ein noradrenerger Kern des Hirnstammes, der an der Regulation vielfältiger, physiologischer Prozesse beteiligt ist. Störungen des LC-Noradrenalin Systems sind in der Pathogenese verschiedener psychiatrischer und neurodegenerativer Erkrankungen beteiligt und sind ein frühes Kennzeichen der Parkinson-Krankheit (PD). Während die Degeneration von Neuronen der Substantia Nigra pars compacta (SNpc) den motorischen Leitsymptomen der PD unterliegt, wird der ausgeprägte Verlust noradrenerger Neurone des LC für einen Großteil der nichtmotorischen Dysfunktionen dieser Erkrankung verantwortlich gemacht. Die Ursachen für die selektive Vulnerabilität der LC Neurone in der Pathogenese der PD sind bislang jedoch weitestgehend unklar. Um eine tonische Noradrenalin-Ausschüttung zu gewährleisten, verfügen LC Neurone über einen intrinsischen Schrittmachermechanismus, welcher direkt an intrazelluläre Überlebenssignalwege gekoppelt ist. So führt aktivitätsabhängiger, durch L-Typ Ca2+ Kanäle vermittelter Ca2+ Influx, zu oxidativem Stress in LC Neuronen und anderen von der PD Pathogenese betroffenen Kerngebieten. Des Weiteren wird eine neuroprotektive Rolle Ca2+ aktivierter Kaliumkanäle postuliert, welche den Schrittmachermechanismus dopaminerger SNpc Neurone modulieren. Die Identifikation von Ionenkanälen, die der elektrischen Aktivität unterliegen, kann somit zu einem besseren Verständnis der selektiven Vulnerabilität coerulärer Neurone führen. Innerhalb dieser Arbeit wurden daher mittels RT-PCR Expressionsanalysen und Patch-Clamp Messungen in akuten Hirnstammschnitten die molekulare Komposition und Funktion verschiedener Ionenkanalfamilien in LC Neuronen der Maus charakterisiert. Zunächst erstellte ich ein Profil bezüglich der elektrophysiologischen Charakteristika und der Expression kaliumselektiver Ionenkanäle coerulärer Neurone. Diese Analysen zeigten, dass der elektrophysiologische Phänotyp der LC Neurone durch regelmäßige, breite Aktionspotenziale mit einer ausgeprägten Nachhyperpolarisation, die um ein depolarisiertes Membranpotenzial fluktuieren, gekennzeichnet ist. Mittels der Expressionsanalyse konnte ich die molekulare Komposition spannungsabhängiger Kaliumkanäle aufklären, die wahrscheinlich den A-Typ K+ Strom und den persistierenden K+ Strom der LC Neurone vermitteln. Als A-Typ Kaliumkanäle wurden unter anderem Kv4.3 sowie Kv1 in Kombination mit Kvβ1 detektiert, welche durch das oxidative Potenzial der Zelle reguliert werden und deshalb unter pathologischen Bedingungen mit gestörter Funktion der Mitochondrien von Bedeutung sein könnten. Des Weiteren detektierte ich Amplifikate der GIRK Kanal Unterheinheiten GIRK-1 und GIRK-4 sowie verschiedene K2P Kanal-Untereinheiten, welche an der Aufrechterhaltung des Ruhemembranpotenzials zentraler Neurone beteiligt sind. Zur funktionellen Charakterisierung spannungsabhängiger Ca2+ Kanäle führte ich RT-PCR Expressionsanalysen sowie Patch-Clamp Messungen in Kombination mit L- und T-Typ Ca2+ Kanal Blockern durch. Diese Experimente zeigten, dass sowohl Ca2+ Kanäle der Unterfamilien Cav1 als auch Cav3 in LC Neuronen exprimiert sind und eine ausgeprägte „low voltage“ aktivierte Ca2+ Leitfähigkeit vermitteln. Die Analyse der Aktionspotenzial-Folgen ergab, dass weder die Inhibition von L- noch von T-Typ Ca2+ Kanälen allein die Feurrate oder die Aktionspotenzial-Parameter der LC Neurone verändert. Die kombinierte Applikation der Kanal-Blocker führte jedoch zu einer signifikanten Reduktion der Nachhyperpolarisation und daraus resultierend zu einer Beschleunigung der Feuerrate. Diese Ergebnisse beschreiben erstmals die funktionelle Expression von T-Typ Ca2+ Kanälen in LC Neuronen und demonstrieren ihre Rolle bei der Modulation des Schrittmachermechanismus im Zusammenspiel mit L-Typ Ca2+ Kanälen. T-Typ Ca2+ Kanäle sollten demnach neben den „low-voltage“ aktivierten L-Typ Ca2+ Kanälen als Kandidaten in Betracht gezogen werden, die aktivitätsabhängigen oxidativen Stress im Kontext pathologischer Bedingungen vermitteln könnten. Im Rahmen der funktionellen Charakterisierung Ca2+ aktivierter Kaliumkanäle detektierte ich die Expression der SK Kanal Familienmitglieder SK1, SK2 und SK3 in LC Neuronen. Mittels Patch-Clamp Messungen in Kombination mit dem selektiven SK Kanal Blocker Apamin und dem positiven SK Kanal Modulator NS309 konnte ich demonstrieren, dass SK Kanäle maßgeblich für die während der Nachhyperpolarisation fließenden K+ Auswärtsströme verantwortlich sind. Während Aufnahmen der Aktionspotenzialabfolgen bewirkte die Inhibition der SK Kanäle eine Reduktion der Nachhyperpolarisation und eine beschleunigte Feuerrate, während ihre Aktivierung zu einer Vergrößerung der Nachhyperpolarisation und einer verlangsamten Frequenz führte. SK Kanäle können demnach als wichtige Regulatoren der Schrittmacherfrequenz von LC Neuronen angesehen werden. Mittels Calcium Imaging Experimenten im in vitro Glutamat- und Rotenon-Toxizitätsmodell konnte ich darüber hinaus zeigen, dass die pharmakologische SK Kanal Aktivierung die Dysregulation der Ca2+ Homöostase unter toxischen Bedingungen verhindert. Mittels Patch-Clamp Messungen konnte ich erstmals demonstrieren, dass die akute Rotenon-Exposition eine Depolarisation und eine Steigerung der Aktionspotenzial-Frequenz in LC Neuronen induziert, welche durch die SK Kanal Aktivierung unterbunden werden konnte. Stereologische Analysen zeigten schließlich, dass die SK Kanal Aktivierung mit NS309 signifikant der Degeneration von LC Neuronen im in vitro Rotenon- Toxizitätsmodell entgegenwirkt. Die Aktivierung von SK Kanälen wird demnach als ein vielversprechender Ansatzpunkt zur Neuroprotektion des LC während früher Stadien der PD Pathogenese postuliert.

Die Serum- und Glucocorticoid-induzierbare Kinase 3 (SGK3) erhöht die Oberflächenexpression zahlreicher Membranproteine. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus, durch den SGK3 die Oberflächenexpression des Kaliumkanals Kir2.2 erhöht, in Xenopus laevis Oozyten und einer Säugerzelllinie (COS-7) untersucht. Dazu wurden die Zwei-Elektroden-Spannungsklemme, luminometrische Oberflächen-Assays und Fluoreszenz-mikroskopie eingesetzt. Eine Vielzahl unterschiedlicher Mechanismen, durch die SGK3 die Oberflächenexpression von verschiedenen Membranproteinen und Transportern erhöht, wurde bereits beschrieben. Darunter die Phosphorylierung der Ubiquitin-Ligase Nedd4-2, die Phosphorylierung des Transkriptionsfaktors FOXO3a und die Phosphorylierung der Phosphoinositid-Kinase PIKfyve. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass keiner dieser Mechanismen für die erhöhte Anzahl von Kir2.2-Kanälen in der Membran verantwortlich ist. Sie lassen weiterhin den Schluss zu, dass SGK3 weder einen Effekt auf die Anzahl der endozytierten Kir2.2-Kanäle, noch auf die Anzahl der neu synthetisierten Moleküle hat. Mit einem auf Antikörpern basierenden Recycling-Assay konnte gezeigt werden, dass ein Großteil der Kanäle während zweier dreißigminütiger Inkubationszeiten internalisiert und anschließend zurück an die Zellmembran transportiert wurde. Weiterhin wurde beobachtet, dass die Ko-Expression einer konstitutiv aktiven SGK3-Mutante im Vergleich zu der Ko-Expression einer dominant-negativen Mutante zu einer erhöhten Anzahl von recycelten Kir2.2 Kanälen führte. Fluoreszenzmikroskopie-Aufnahmen mit lebenden COS-7 Zellen und zwei verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen zeigten, dass der Kaliumkanal Kir2.2, die Kinase SGK3 und das kleine G-Protein Rab7 in hohem Maße in PI(3)P positiven, endosomalen Kompartimenten kolokalisiert waren. In Übereinstimmung mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass eine SGK3-Mutanten, die nicht mehr in der Lage ist an PI(3)P zu binden, einen deutlich geringeren Effekt auf die Oberflächenexpression von Kir2.2 hat, als die Wildtyp-Kinase. Diese Beobachtungen legen die Vermutung nahe, dass die intrazelluläre Lokalisation von SGK3 an endosomalen Membranen eine wichtige Rolle für ihren Effekt auf Kir2.2 spielt. Zusammengefasst lässt sich sagen, dass die in dieser Arbeit erzielten Ergebnisse darauf hinweisen, dass SGK3 das Recycling von Kir2.2-Kanälen aus einem PI(3)P und Rab7 positiven Kompartiment stimuliert. Bei diesem Kompartiment handelt es sich um ein Zwischenstadium im Reifungsprozess von frühen zu späten Endosomen. Während des Recyclings zurück an die Zellmembrane werden die Kanäle wahrscheinlich durch das Rab11-positive Recycling Endosom geschleust., Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 (SGK3) increases the expression of various membrane proteins at the cell surface. In this study, the mechanism by which SGK3 increases the surface expression of the potassium channel Kir2.2 was investigated using two-electrode voltage clamp, luminometric surface expression measurements and fluorescence microscopy in a mammalian cell line (COS-7) and Xenopus laevis oocytes. A number of different mechanisms by which SGK3 increases the membrane expression of various channel and transporter proteins has been proposed, including phosphorylation of the ubiquitin ligase Nedd4-2, phosphorylation of the transcription factor FOXO3a and phosphorylation of the phosphoinositide kinase PIKfyve. The results obtained in this study suggest that none of these mechanisms is responsible for the increased surface expression of Kir2.2 induced by SGK3. They furthermore indicate that SGK3 neither affects the amount of endocytosed Kir2.2 channels nor the number of newly synthesized channel molecules. An antibody-based recycling assay showed that a substantial amount of Kir2.2 was internalized and recycled back to the plasma membrane during two 30 min time periods. It further indicated that coexpression of a constitutively active SGK3-mutant leads to an increased number of recycled channel proteins in comparison to coexpression of a dominant negative mutant. Live-cell fluorescence imaging with two different colors revealed that Kir2.2 channels, SGK3 and the small G-protein Rab7 were extensively colocalized in a PI(3)P positive endosomal compartment. Furthermore, frequent interactions of Kir2.2-positive, SGK3-positive or Rab7-positive vesicles with the Rab11-positive recycling endosome were observed. I line with these results, a mutant of SGK3 that does not bind to PI(3)P had a much smaller effect on Kir2.2 surface expression than the wild-type kinase, suggesting that the intracellular localization of SGK3 to endosomal membranes plays a crucial role for its effect on Kir2.2. Taken together, the results obtained in this study suggest that SGK3 promotes the recycling of Kir2.2 channels from a PI(3)P and Rab7-positive intracellular compartment that represents an intermediate stage of maturing early endosomes. The recycling of the channel back to the plasma membrane possibly occurs via Rab11 positive recycling endosomes.

We have studied some of the mechanisms responsible for controlling the density of Kir2.1 channels at the cell surface. In particular, we have explored the mechanisms underlying the of Kir2.1 channel into the endocytic pathway. We found that 1. The antibody uptake assay showed that about 20% of the antibodies labeled surface channels were internalized within 5 min of temperature shift; an apparent maximum was reached after 15 min. Kir2.1 undergoes constitutive internalization. 2. Co-expression of a dominant-negative mutant of dynamin K44A or AP180C enhanced the surface expression of Kir2.1 by 40% and 49% respectively. AP180C inhibited clathrin mediated internalization of Kir2.1 by 80% compared with COS-7 cells transfected with Kir2.1 and a control vector. Kir2.1 is internalized by clathrin-mediated endocytosis. 3. In both Xenopus oocytes and mammalian cells system, disruption of Y242 and Y341 motif significantly increased the amount of Kir2.1 at cell surface respectively. The mutants Y242A and Y341A also showed dramatic decrease in the rate of endocytosis as compared to wild-type Kir2.1 channels respectively. Two tyrosine based endocytic motifs 242YIPL245 and 341YSRF344 in the C-terminal domain of Kir2.1 are both involved in the endocytosis of Kir2.1. 4. Live cell imaging clearly showed that Kir2.1 channels strongly colocalized with early endosomal marker, Rab5 or late endosomal marker, Rab7 or recycling endosome marker, Rab11 or Lyso-Tracker Red. Kir2.1 is targeted to the endosome-lysosomal and endosomal- recycling pathway. 5. The two endocytosis signals studied here are in close vicinity as indicated by the tertiary structure of the cytosolic pore of Kir2.1 channels. Since mutation of both motifs had the similar effect as mutation of only one of these motifs. We hypothesize that both signals must be present for efficient constitutive endocyosis to occur.

Tamoxifen ist ein selektiver Östrogen-Antagonist und wird in der Therapie des hormonsensitiven Mammakarzinoms eingesetzt. In dieser Arbeit wurden die Effekte von Tamoxifen am G-Proteingekoppelten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal an isolierten atrialen Myozyten von Ratten mit Hilfe der Patch Clamp Technik in der "Whole Cell"-Konfiguration untersucht. Extrazellulär appliziertes Tamoxifen, wie auch der aktive Metabolit 4-Hydroxytamoxifen inhibieren den aktivierten GIRK-Kanal reversibel und konzentrationsabhängig. Diese Inhibition besteht aus zwei Komponenten: der basalen, spannungsunabhängigen Reduktion des Spitzenstroms und einem, bisher nicht beschriebenen offenen, spannungsabhängigen Kanalblock. Dieser Kanalblock ist beim auswärtsgerichteten, physiologischen Kaliumstrom nicht nachweisbar. Intrazelulläre Applikation von wasserlöslichem PIP2 reduzierte die spannungsunabhängige Komponente der Inhibition, hatte jedoch keinen Einfluss auf den spannungsabhängigen offenen Kanalblock.

TASK-1 (TWIK-related acid-sensitive K+ channel 1) is an acid-sensitive K+ channel. It belongs to the family of two-pore domain K+ (K2P) channels, which are involved in array of physiological and pathophysiological processes. TASK-1 is widely distributed, being particularly abundant in the pancreas and placenta, but it is also found in the brain, heart, lung and kidney. The intracellular traffic of TASK-1 has been studied in some detail but relatively little is known about the endocytosis of TASK-1. The channel expression at the cell surface is regulated by both forward trafficking and endocytosis mechanisms. We have tried here to elucidate the functional relevance of the interaction between the potassium channel and the SCAMPs. We performed a split-ubiquitin based yeast two-hybrid screen with a brain cDNA library using TASK-1 as bait and identified Secretory Carrier Membrane Protein 5 (SCAMP5) as an interaction partner. Structurally, all SCAMPs contain a highly conserved four hydrophobic transmembrane domains (TMDs) with three inter-TMD-flanking sequences. The hydrophilic loop between transmembrane domain 2 and 3, known as the E-peptide, shows the highest degree of sequence conservation. The cytoplasmic N- and C-termini, flanking the SCAMP domain, have variable length and highest diversity. Of all SCAMP isoforms, SCAMP4 and SCAMP5 are the only isoforms that lack the N-terminal NPF-repeat domains. SCAMP5 is mainly expressed in neural tissues, whereas the other members of SCAMP family are ubiquitously expressed. Expression of TASK-1 in Xenopus oocytes gave rise to an acid-sensitive outward current. The amplitude of this current was reduced to about 50 % when TASK-1 was co-expressed with SCAMP5. A similar reduction of current amplitude was observed after co-expression of the channel with SCAMP1 and SCAMP2. Deletion of the (NPF) domains in the amino terminus of SCAMP1 and 2 proteins abolished the effects of SCAMP1 and SCAMP2 on the endocytosis of TASK-1. When we co-expressed the C-terminal part of the adaptor protein AP180 (AP180C) the effect of SCAMPs on the amplitude of TASK-1 currents was abolished. A similar effect was also observed by Dynasore, a specific blocker for dynamin dependant endocytosis. An antibody uptake assay performed in COS7 cells (where only SCAMP1 and 2 are moderately expressed but SCAMP5 is not expressed) showed a substantially reduced surface expression of TASK-1 after co-expression of SCAMP5. Fluorescence microscopy showed a clear co-localisation of TASK-1 and SCAMP5 at the cell surface. Additional biochemical interaction studies like His-tag pull-down assay showed that SCAMP5 can form homo and heteromers with SCAMP1 and SCAMP2. Our data suggests that SCAMP1 and SCAMP2 can exert their effect on TASK-1 via SCAMP5, where SCAMP5 plays a role as an adaptor protein. Taken together, these results strongly indicate that the secretory carrier membrane proteins play a crucial role in clathrin mediated endocytosis of TASK-1 via NPF domains., TASK-1 (TWIK-related Acid-Sensitive K+ channel 1) ist ein säuresensitiver K+ Kanal und gehört zu der Familie der K2P-Kanäle (Kaliumkanäle mit zwei Porendomänen). TASK-1 wird in Neuronen, Herzmuskelzellen, glatten Muskelzellen und zahlreichen anderen Zellen exprimiert. In diesen Zellen besitzt TASK-1 eine wichtige Rolle bei der Regulation ihrer Erregbarkeit. Sowohl die transkriptionelle als auch die posttranslationale Regulation von TASK-1 bestimmen die Anzahl der Kanäle auf der Zellmembran und damit direkt den durch TASK-1 vermittelten Strom. Die Regulation der Oberflächenexpression von TASK-1 hat demnach direkten Einfluss auf die elektrophysiologischen Eigenschaften einer Zelle. Die Menge eines Membranproteins an der Zelloberfläche wird im Wesentlichen von zwei Faktoren bestimmt: (1) von dem Vorwärtstransport und (2) von der Endozytose der Zellmembran. Der Vorwärtstransport („forward trafficking“) bezeichnet den Transport von Transmembranproteinen vom rauen endoplasmatischen Retikulum (rER) zum Golgi-Komplex und weiter zur Zellmembran. Die Aufnahme von Proteinen aus der Zellmembran ins Zellinnere wird Endozytose genannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Split-Ubiquitin basierter Hefe-Zwei-Hybrid-Screen mit einer cDNS-Bibliothek aus dem Gehirn durchgeführt, wobei TASK-1 als „Köder“-Protein verwendet wurde. Wir identifizierten Secretory Carrier Membrane Protein 5 (SCAMP5) als neuen Interaktionspartner („Beute“) für TASK-1. Dieses Protein, SCAMP5, gehört zur Familie der „Secretory Carrier Membrane Proteins“. Die strukturellen Gemeinsamkeiten der Proteine dieser Familie sind die vier Transmembran-Domänen (TMD), ein E-Peptid und eine Prolin reiche Sequenz im N Terminus. Die Mitglieder SCAMP1, SCAMP2 und SCAMP3 besitzen in ihrem N Terminus drei NPF-Domänen. Die NPF-Domänen bestehen aus den Aminosäuren Asparagin-Prolin-Phenylalanin und sind in der Lage an EH-Domänen (Epsin Homologe Domänen) zu binden, während SCAMP4 und SCAMP5 nur einen kurzen N-Terminus besitzen, der keine NPF-Domänen enthält. SCAMP5 wird vorwiegend im neuronalen Gewebe exprimiert, im Gegensatz dazu zeichnen sich die anderen Mitglieder der Familie durch eine ubiquitäre Expression aus. In dieser Arbeit wurde mit Hilfe elektrophysiologischer Messungen gezeigt, dass bei Koexpression von TASK-1 mit SCAMP5, SCAMP1 oder SCAMP2 der durch TASK-1 Kanäle fließende Strom deutlich reduziert wird. Die Oberflächenexpression von TASK-1 wurde mittels eines auf der extrazellulären Seite zugänglichen Hämagglutinin-Motivs (HA-Tag) durch einen luminometrischen Oberflächenassay gemessen. Es zeigte sich, dass bei einer Koexpression der SCAMPs mit TASK 1 die Anzahl der Kanäle auf der Zellmembran deutlich reduziert wird. Die Entfernung der NPF-Domänen im N-Terminus von SCAMP1 und SCAMP2 führen zu einer deutlichen Erhöhung des TASK-1 induzierten Stroms sowie zu einer erhöhten Oberflächenexpression der Kanäle im Vergleich zur Koexpression mit den Wildtypen von SCAMP1 oder SCAMP2. Die Clathrin-vermittelte Endozytose wurde gezielt inhibiert um zu zeigen, dass die Verringerung der Oberflächenexpression auf eine erhöhte Endozytoserate zurückzuführen ist. Sowohl der chemische Blocker Dynasore als auch die Koexpression des dominant-negativen Adapterproteins AP180C konnten den Effekt der SCAMP Proteine auf den TASK-1 induzierten Strom in Oozyten aufheben. Interessanterweise konnte mit der Hefe-Zwei-Hybrid Methode eine direkte Interaktion ausschließlich zwischen TASK-1 und SCAMP5, aber nicht zwischen TASK-1 und SCAMP1 und auch nicht zwischen TASK-1 und SCAMP2 nachgewiesen werden. In der Fluoreszenzmikroskopie zeigte sich, dass eine Kolokalisation an der Zellmembran nur zwischen TASK-1 und SCAMP5 stattfand. Die direkte Quantifizierung der Endozytoserate erfolgte mit dem Antikörper-Aufnahme-Assay. Nach 30 min wurde eine signifikante Internalisierung von TASK-1 bei Kotransfektion mit SCAMP5 beobachtet, jedoch nicht nach einer Kotransfektion mit SCAMP1 oder SCAMP2. Proteinbiochemische Analysen (Histidin Pull-Down Assay) zeigten, dass SCAMP5 sowohl Homomere (wahrscheinlich Homodimere) als auch Heteromere mit SCAMP1 oder SCAMP2 bilden kann. Aus diesen Ergebnissen lässt sich ableiten, dass SCAMP1 und SCAMP2 nur indirekt über das Adapterprotein SCAMP5 einen Effekt auf TASK-1 ausüben. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass die Secretory Carrier Membrane Proteine eine entscheidende Rolle bei der Clathrinvermittelten Endozytose von TASK-1 spielen.

Das Empfinden von Schmerz ist für uns überlebenswichtig. Chronischer Schmerz hingegen hat seine physiologische Bedeutung verloren und wird als eigenes Krankheitsbild angesehen. Schmerzempfindung beginnt mit der Nozizeption. Die Zellkörper nozizeptiver Neurone befinden sich in den Spinalganglien (Hinterwurzelganglion, dorsal root ganglion DRG) und Trigeminalganglien (TG). In den DRG-Neuronen macht der Zwei-Poren-Kaliumkanal (K2P) TRESK die Hauptkomponente eines Kaliumstromes, des „standing outward currents“ IKSO, aus. Die physiologische Hauptaufgabe der TRESK-Kanäle liegt in der Regulation der zellulären Erregbarkeit nozizeptiver Neurone. Während einer Entzündungsreaktion werden Entzündungsmediatoren wie Histamin, Bradykinin, Serotonin und Lysophosphatidsäure (LPA) ausgeschüttet und können durch die Aktivierung ihrer G-Protein gekoppelten Rezeptoren (GPCR) oder direkte Interaktion mit Ionenkanälen die nozizeptive Erregung beeinflussen. Durch Anwendung von RT-PCR und eines neu entwickelten Antikörpers wurde die Ko-Expression von TRESK-Kanälen zusammen mit Kanälen der Transient-Receptor-Potential-Kationenkanalfamilie (TRP) und LPA-Rezeptoren in DRG-Neuronen nachgewiesen. Durch rekombinante Ko-Expression von TRESK-Kanälen und LPA2-Rezeptoren in Xenopus Oozyten konnte durch Zugabe von LPA eine fast 10-fache Aktivierung des basalen K+-Stromes erzielt werden. Die Auswertung der Dosis-Wirkungskurve ergab einen EC50-Wert von 0,2 µM LPA. Die LPA-induzierte TRESK-Stromaktivierung konnte durch die Verwendung des mutierten Kanals TRESK[PQAVAD] oder durch die Zugabe des Phospholipase C (PLC) Inhibitors U73122 verhindert werden. Dies zeigt die Beteiligung des PLC-Signalwegs und die Bindung von Calcineurin an den TRESK-Kanal bei der Stromaktivierung. TRESK ist das einzige Mitglied der K2P-Familie, das eine LPA-induzierte Aktivierung des Stromes zeigt. TREK- und TASK-1-Ströme werden durch LPA inhibiert. In DRG-Neuronen mit kleinem Durchmesser wird Nozizeption durch die Aktivierung von TRPV1-Kanälen durch Hitze oder Capsaicin, dem Inhaltsstoff des Chilis, und zusätzlich durch die Substanz LPA verursacht. Ein weiteres Mitglied der TRP-Familie, der TRPA1-Kanal, ist bei der verstärkten Nozizeption während einer Entzündung involviert. Werden TRESK- und TRP-Kanäle in Xenopus Oozyten ko-exprimiert, verursacht LPA gleichzeitig einen Kationeneinwärts- wie auch -auswärtsstrom. Unter diesen Bedingungen verschob sich das Umkehrpotenzial in einen Bereich zwischen den Umkehrpotenzialen von Oozyten, die nur den K+-Kanal exprimieren und von Oozyten, die nur den unspezifischen Kationenkanal exprimieren. Durch diese Experimente konnte gezeigt werden, dass die LPA-induzierte Ko-Aktivierung von TRP-Kanälen und TRESK zu einer Begrenzung des exzitatorischen Effekts führen kann. Die DRG-ähnlichen F11-Zellen exprimieren keine TRESK-Kanäle. Sie sind in der Lage durch Strompulse Aktionspotenziale zu generieren. Mit TRESK transfizierte F11-Zellen zeigten eine Verschiebung des Umkehrpotenzials in negative Richtung, einen größeren Auswärtsstrom und den Verlust von spannungsgesteuerten Natriumkanälen. Auch hohe Strompulse konnten keine Aktionspotenziale mehr auslösen. Bei Spannungs-Klemme-Messungen von primären DRG-Neuronen von TRESK[wt]-Mäusen erhöhte sich der IKSO nach Zugabe von LPA um über 20 %. Im Gegensatz dazu zeigten DRG-Neurone von TRESK[ko]-Mäusen unter diesen Bedingungen eine leichte Hemmung des IKSO von etwa 10 %. In Neuronen, die TRPV1 exprimieren, führte LPA nicht nur zum Anstieg des IKSO, sondern auch zur Aktivierung eines Einwärtsstromes (TRPV1). Im Vergleich dazu wurde in TRESK[ko]-Neuronen durch LPA nur der Einwärtsstrom aktiviert. In Strom-Klemme-Experimenten führte LPA-Applikation zur Entstehung von Aktionspotenzialen mit höherer Frequenz in Zellen von TRESK[ko]-Mäusen im Vergleich zu Zellen von TRESK[wt]-Mäusen. Zusätzlich wurde die Erregung, die durch Strompulse von 100 pA ausgelöst wurde, in den beiden Genotypen durch LPA unterschiedlich moduliert. Die Aktionspotenzialfrequenz in TRESK[wt]-Neuronen wurde gesenkt, in TRESK[ko]-Neuronen wurde sie erhöht. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass die Erregung nozizeptiver Neurone durch LPA aufgrund der Ko-Aktivierung der TRESK-Kanäle abgeschwächt werden kann. Die Erregbarkeit von sensorischen Neuronen wird strak durch die Aktivität und Expression der TRESK-Kanäle kontrolliert. Deswegen sind TRESK-Kanäle gute Kandidaten für die pharmakologische Behandlung von Schmerzkrankheiten., Pain sensation is essential for survival. Chronic pain lost its physiological function and is categorized as a disease. Pain sensation is initiated by nociception. The cell bodies of nociceptive neurons are located in dorsal root ganglia (DRG) and trigeminal ganglia (TG). In DRG neurons TRESK two-pore-domain potassium channels (K2P) constitute the major current component of the standing outward current IKSO. A prominent physiological role of TRESK channels has been attributed to the regulation of pain sensation. During inflammation mediators of pain e.g. histamine, bradykinin, serotonin and lysophosphatidic acid (LPA) are released and modulate nociceptive signaling by activation of their G-protein coupled receptors (GPCR) or ionic channels. By means of RT-PCR and a newly developed antibody the co-expression of TRESK channels, channels of the transient-receptor-potential (TRP) cation channel family and LPA receptors in DRG neurons were demonstrated. Recombinant co-expression of TRESK channels and LPA2 receptors in Xenopus oocytes revealed an almost 10 fold activation of basal K+ currents upon LPA application with an EC50 of 0.2 µM LPA. Using mutant TRESK[PQAVAD] or application of the phospholipase C (PLC) inhibitor U73122 blocked current augmentation by LPA indicating cellular signaling via PLC pathway and calcineurin binding to TRESK channels. TRESK was the only member of the K2P family that showed a LPA induced activation of current. TREK- und TASK-1 currents were inhibited through LPA. In small diameter DRG neurons nociception results from TRPV1 channel activation by painful stimuli including the inflammatory substance LPA or activation of TRPA1 channels during inflammation. When TRESK and TRP channels are co-expressed in Xenopus oocytes cationic inward and outward currents were simultaneously activated by LPA. Under these conditions the reversal potential of ramp recordings was intermediate to recordings from oocytes expressing only the K+ or the unspecific cation channel. Principally this finding demonstrates that TRESK activation by an inflammatory substance dampens noxious excitation induced by the same agent. DRG-like F11 cells lacking endogenous TRESK channels generate action potential upon current stimulation. However when TRESK channels were recombinantly expressed in F11 cells, they exhibit a shift of the reversal potential to more negative values, a larger outward current and a loss of voltage-gated sodium currents. Accordingly, depolarizing pulses failed to elicit action potentials. In patch-clamp recordings from primary cultured DRG neurons of TRESK[wt] mice IKSO currents increased after application of LPA by over 20 % whereas under these conditions IKSO currents of neurons from TRESK[ko] mice decreased moderately by about 10 %. In TRPV1 positive neurons LPA application induced in TRESK[wt] neurons not only an activation of the IKSO but also an increase of the inward (TRPV1) current. In contrast, in TRESK[ko] neurons LPA only activated an inward (TRPV1) current. Under current-clamp conditions LPA application elicited spike trains in DRG neurons, with higher frequency in cells of TRESK[ko] mice than in cells of TRESK[wt] animals. In addition, upon depolarizing pulses (100 pA) excitability was differentially modulated by LPA in these genotypes. Spike frequency was attenuated in TRESK[wt] neurons and augmented in TRESK[ko] neurons. Accordingly, excitation of nociceptive neurons by LPA is balanced by co-activation of TRESK channels. It is evident that the output of sensory neurons is strongly controlled by the activity and the expression of TRESK channels, which therefore are good candidates for the pharmacological treatment of pain disorders.

Serum- and glucocorticoid-inducible kinase 3 (SGK3) increases the expression of various membrane proteins at the cell surface. In this study, the mechanism by which SGK3 increases the surface expression of the potassium channel Kir2.2 was investigated using two-electrode voltage clamp, luminometric surface expression measurements and fluorescence microscopy in a mammalian cell line (COS-7) and Xenopus laevis oocytes. A number of different mechanisms by which SGK3 increases the membrane expression of various channel and transporter proteins has been proposed, including phosphorylation of the ubiquitin ligase Nedd4-2, phosphorylation of the transcription factor FOXO3a and phosphorylation of the phosphoinositide kinase PIKfyve. The results obtained in this study suggest that none of these mechanisms is responsible for the increased surface expression of Kir2.2 induced by SGK3. They furthermore indicate that SGK3 neither affects the amount of endocytosed Kir2.2 channels nor the number of newly synthesized channel molecules. An antibody-based recycling assay showed that a substantial amount of Kir2.2 was internalized and recycled back to the plasma membrane during two 30 min time periods. It further indicated that coexpression of a constitutively active SGK3-mutant leads to an increased number of recycled channel proteins in comparison to coexpression of a dominant negative mutant. Live-cell fluorescence imaging with two different colors revealed that Kir2.2 channels, SGK3 and the small G-protein Rab7 were extensively colocalized in a PI(3)P positive endosomal compartment. Furthermore, frequent interactions of Kir2.2-positive, SGK3-positive or Rab7-positive vesicles with the Rab11-positive recycling endosome were observed. I line with these results, a mutant of SGK3 that does not bind to PI(3)P had a much smaller effect on Kir2.2 surface expression than the wild-type kinase, suggesting that the intracellular localization of SGK3 to endosomal membranes plays a crucial role for its effect on Kir2.2. Taken together, the results obtained in this study suggest that SGK3 promotes the recycling of Kir2.2 channels from a PI(3)P and Rab7-positive intracellular compartment that represents an intermediate stage of maturing early endosomes. The recycling of the channel back to the plasma membrane possibly occurs via Rab11 positive recycling endosomes.

Stomata sind mikroskopisch kleine Poren in der Blattoberfläche der Landpflanzen, über die das Blattgewebe mit CO2 versorgt wird. Als Schutz vor Austrocknung oder einer Infektion durch Pathogene entwickelte sich ein Mechanismus, um die Porenweite durch Bewegung der sie umgebenden Schließzellen an die Bedürfnisse der Pflanze anzupassen. Ein eng geknüpftes Signalnetzwerk kontrolliert diese Bewegungen und ist in der Lage, externe wie interne Stimuli zu verarbeiten. Der Schließvorgang wird osmotisch durch den Turgorverlust in den Schließzellen angetrieben, der durch den Efflux von Ionen wie K+ ausgelöst wird. In dieser Arbeit wurde die Regulation durch Phosphorylierung des wichtigsten K+-Effluxkanals für den Stomaschluss, GORK, untersucht. Folgende Erkenntnisse wurden durch elektrophysiologische Untersuchungen mit der DEVC-Methode gewonnen: GORK wird durch OST1 auf Ca2+- unabhängige und durch CBL1/9-CIPK5 und CBL1-CIPK23 auf Ca2+-abhängige Weise phosphoryliert und damit aktiviert. CBL1 muss CIPK5 an der Plasmamembran verankern und Ca2+ binden. CIPK5 benötigt ATP und eine Konformationsänderung, um GORK zu phosphorylieren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde auch zum ersten Mal gezeigt, dass die PP2CPhosphatase ABI2 direkt mit einem Kanal interagiert und dessen Aktivität hemmt. ABI2 interagiert auch mit den Kinasen OST1, CIPK5 und CIPK23, sodass die Kontrolle der Kanalaktivität auf multiple Weise stattfinden kann. OST1 und ABI2 verbinden die GORKRegulation mit dem ABA-Signalweg. Schließzellen von gork1-2, cbl1/cbl9 und cipk5-2 sind insensitiv auf MeJA, nicht aber auf ABA. Dies stellt eine direkte Verbindung zwischen dem Jasmonatsignalweg und der Ca2+-Signalgebung dar. Im Rahmen dieser Arbeit konnten weitere Hinweise für das komplexe Zusammenspiel der Phytohormone ABA, JA und des Pseudomonas- Effektors Coronatin gefunden werden. Hier konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Schließzellen je nach Inkubationszeit unterschiedlich auf MeJA und das Phytotoxin Coronatin reagieren. ABA und Coronatin verhalten sich dabei antagonistisch zueinander, wobei der Effekt der Stimuli auf die Stomaweite von der zeitlichen Abfolge der Perzeption abhängt. Der Jasmonat-Signalweg in Schließzellen löst eine geringe ABA-Synthese sowie den Proteinabbau durch das Ubiquitin/26S-Proteasom-System aus und benötigt ABA-Rezeptoren (PYR/PYLs), um einen Stomaschluss einzuleiten. Durch diese Arbeit konnte somit die JA-gesteuerte Regulation des Kaliumefflux-Kanals GORK entschlüsselt sowie einige Unterschiede zwischen den ABA, JA und Coronatin-vermittelten Schließzellbewegungen aufgedeckt werden., Stomata are microscopically small pores in the leaf surface of land plants, through which the leaf tissue is supplied with CO2. To protect the plant from both desiccation and infection by pathogens, a mechanism evolved to adjust the pore width to the plant’s needs by movement of the surrounding guard cells. A dense signaling network controls these movements and is able to integrate external as well as internal stimuli. Stomatal closure is osmotically driven by the loss of turgor in guard cells caused by efflux of ions such as K+. In this work, we investigated the regulation by phosphorylation of the main K+ efflux channel for stomatal closure, GORK. The following results were obtained with electrophysiological measurements via the DEVC- technique: GORK is phosphorylated by OST1 in a Ca2+- independent and by CBL1/9-CIPK5 as well as CBL1-CIPK23 in a Ca2+-dependent manner. CBL1 anchors CIPK5 at the plasma membrane and must bind Ca2+ for activation of CIPK5. CIPK5 requires both ATP binding and a conformational change for phosphorylation of GORK. For the first time it was shown that the PP2C phosphatase ABI2 interacts directly with an ion channel and inhibits its activity. ABI2 also interacts with the kinases OST1, CIPK5 and CIPK23, implying a control by ABI2 over channel activity in multiple ways. OST1 and ABI2 link GORK regulation with the ABA signaling pathway. Guard cells of gork1-2, cbl1/cbl9 and cipk5-2 are insensitive to MeJA, but not to ABA. This represents a direct connection between JA signal transduction and Ca2+ signaling. In this work, further hints could be found for the complex interplay of the phytohormones ABA, JA and the effector Coronatine of Pseudomonas. Here it was shown for the first time that guard cells respond differently to MeJA and the phytotoxin Coronatine, based on incubation time. Depending on the temporal sequence of perception, ABA and Coronatine act antagonistically on the pore width. Jasmonate signal transduction in guard cells leads to a minor synthesis of ABA as well as protein degradation via the ubiquitin/ 26S proteasome system and initiates stomatal closure requiring ABA receptors (PYR/PYLs). This work describes the JA-controlled regulation of the potassium efflux channel GORK as well as some differential aspects of ABA, JA and Coronatine triggered stomatal movements.

Tamoxifen ist ein selektiver Östrogen-Antagonist und wird in der Therapie des hormonsensitiven Mammakarzinoms eingesetzt. In dieser Arbeit wurden die Effekte von Tamoxifen am G-Proteingekoppelten einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal an isolierten atrialen Myozyten von Ratten mit Hilfe der Patch Clamp Technik in der "Whole Cell"-Konfiguration untersucht. Extrazellulär appliziertes Tamoxifen, wie auch der aktive Metabolit 4-Hydroxytamoxifen inhibieren den aktivierten GIRK- Kanal reversibel und konzentrationsabhängig. Diese Inhibition besteht aus zwei Komponenten: der basalen, spannungsunabhängigen Reduktion des Spitzenstroms und einem, bisher nicht beschriebenen offenen, spannungsabhängigen Kanalblock. Dieser Kanalblock ist beim auswärtsgerichteten, physiologischen Kaliumstrom nicht nachweisbar. Intrazelulläre Applikation von wasserlöslichem PIP2 reduzierte die spannungsunabhängige Komponente der Inhibition, hatte jedoch keinen Einfluss auf den spannungsabhängigen offenen Kanalblock.

(hSK3) Small-conductance calcium-activated channels play an important role by controlling the after-hyperpolarization of excitable cells. Endophilin 3 belongs to a family of BAR- and SH3 domain containing proteins that bind to dynamin and are involved in the process of vesicle scission in clathrin-mediated endocytosis. Using the yeast two-hybrid system and the GST pull down assay was demonstrated that Endophilin 3 interacts with the N-terminal part of hSK3 channels. In addition, we studied the impact of this interaction on channel activity by patch clamp measurements in PC12 cells expressing endogenous hSK3 channels. hSK3 currents were activated by using pipette solutions containing 1 myM free Ca2+. Whole-cell measurements of PC12 cells transfected with Endophilin 3 showed a reduction of hSK3 specific Cs+ currents indicating that the interaction of Endophilin 3 with hSK3 channels also occurs in mammalian cells and that this interaction has functional consequences for current flowing through hSK3 channels.

Die spannungsabhängigen Kaliumkanäle Kv7 werden unter anderem in Herz, Gehirn und Innenohr exprimiert. Hier wurde die Interaktion zwischen Kv7.1/KCNE1-Kanälen und dem regulatorischen Lipid PI(4,5)P2 untersucht. Potentielle Interaktionsstellen wurden in den intrazellulären S2-S3- und S4-S5-Linkern und in der intrazellulären Region von S6 identifiziert. Molekulardynamik (MD)-Simulationen zeigten eine Stabilisierung von Spannungssensor-Domäne, Domänenverbindung und S6. PI(4,5)P2-Regulation war in krankheitsassoziierten Mutanten gestört. Weiterhin wurde die Regulation von Kv7.4 durch das Lipid PI(3,5)P2 und die synthetisierende Kinase PIKfyve untersucht. Tatsächlich regulierten PIKfyve und PI(3,5)P2 die Kanäle. Die Ergebnisse wiesen auf einen komplexen Mechanismus mit unbekannten Komponenten hin. Die Region vor S1 war wichtig für diese Regulation. MD Simulationen zeigten kleine strukturelle Veränderungen in der Porendomäne aber nicht in der vermuteten Bindestelle.

Ortsständige Mikroglia sind immunologische Haupteffektorzellen des ZNS. In aktiven Läsionen von Multiplen- Sklerose - Patienten findet sich u.a. eine erhöhte Anzahl aktivierter Mikroglia. In Vorarbeiten konnten wir eine erhöhte Konzentration des chemotaktisch wirkenden CXCL-8 im Liquor cerebrospinalis von MS-Patienten mit schubäquivalentem Ereignis zeigen. In unserer Arbeit untersuchen wir die Hypothese, dass CXCL-8 einen aktivierenden Einfluss auf die morphologischen und elektrophysiologischen Eigenschaften, insbesondere des Kv1.3-Kaliumkanals, der Mikroglia-Zelle hat. Entgegengesetzt zu den Erwartungen entsprechen unsere Ergebnisse morphologisch und elektrophysiologisch den Kriterien der Mikroglia-Inaktivierung. Es zeigt sich ein dosisabhängiger antiinflammatorischer Einfluss von CXCL-8 auf die Zellen, der vermutlich über einen Kv1.3-Kanal-abhängigen-Mechanismus vermittelt wird. Die mikrogliale Morphologie ist kein sicherer Parameter für die mikrogliale Aktivität.

In dieser Arbeit wurde die Proteolyse eines Kaliumkanals untersucht. Die Spaltung des C-Terminus wurde als Möglichkeit der Regulation der Kanalaktivität untersucht. Als Verantwortliche Proteasen konnte die Familie der Cysteinproteasen identifiziert werden.

hKv1.3 Kanäle kommen auf T-Lymphozyten vor und sind dort an der T-Zellaktivierung beteiligt. Eine überschießende T-Zellaktivierung kann Ursache für Krankheiten wie der Multiplen Sklerose sein. Um Krankheiten wie diese besser therapieren zu können, ist es rationell Medikamente zu entwickeln, die diesen Kanal spezifisch inhibieren, um so die überschießende T-Zellaktivierung zu hemmen. hKv1.3 Kanäle zeichnen sich zudem gegenüber anderen Kaliumkanälen durch ihre typische C-Typ Inaktivierung aus. Es wäre daher sinnvoll mit einem potentiellen Medikament genau diesen C-Typ inaktivierten Zustand des hKv1.3 Kanals zu inhibieren, um so die anderen humanen Kaliumkanäle, die nicht in diesen C-Typ inaktivierten Zustand übergehen, unbeeinflusst zu lassen. Allerdings muss für eine Medikamentenentwicklung mehr über die dreidimensionale Struktur des Kanals im C-Typ inaktivierten Zustand bekannt sein. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit das Valin an Position 417 im hKv1.3 zu einem Cystein mutiert und die Bewegung der Aminosäure an Position 417 im hKv1.3 während der C-Typ Inaktivierung untersucht. Dabei konnte unter Anwendung von MTS-Reagenzien gezeigt werden, dass der hKv1.3_V417C mutierte Kanal im offenen und C-Typ inaktivierten Zustand, jedoch nicht im geschlossenen Zustand von MTSEA modifiziert werden kann. Zudem konnte gezeigt werden, dass diese MTS-Reagenzien von intrazellulär wirken und dass Verapamil eine Modifikation des V417C mutierten Kanals verhindern kann. Dies deutet darauf hin, dass das "activation gate" auf der intrazellulären Seite des Kanals sowohl im offenen als auch im C-Typ inaktivierten Zustand zur Seite schwingt. Zudem bedeutet dies, dass die Bewegung von S6 während der C-Typ Inaktivierung nicht eine Bewegung der Seitenkette des Cysteins an der Position 417 beinhaltet, sodass diese Seitenkette nicht mehr in die Pore ragt.

Der Kanalkomplex aus Kv7.1 und seiner \(\beta\)-Untereinheit KCNE1 wird im Herzen exprimiert und vermittelt einen Kaliumstrom, der an der Repolarisation des kardialen Aktionspotentials beteiligt ist. Ein erst kürzlich entdeckter, hochpotenter Inhibitor dieses Kanals ist JNJ303. Ziel dieser Arbeit war es, den inhibitorischen Mechanismus von JNJ303 sowie seine Bindestelle im Kv7.1/KCNE1-Kanal aufzuklären. Elektrophysiologische Studien zeigten dabei, dass JNJ303 seine inhibitorische Wirkung nicht wie die klassischen Kv7.1-Inhibitoren durch den Verschluss der Kanalpore vermittelt, sondern das \(\it Gating\) des Ionenkanals modifiziert und diesen so in einem geschlossenen Zustand stabilisiert. Mittels Mutagenesestudien, dem molekularen \(\it Docking\) und einem im Rahmen dieser Arbeit völlig neu etablierten Verfahren wurde die Bindestelle von JNJ303 charakterisiert. Dabei konnte gezeigt werden, dass diese unter Beteiligung von Resten des S6-Segments von Kv7.1 sowie des Transmembransegments von KCNE1 gebildet wird.

Cochlear outer hair cells (OHCs) are characterised by the voltage-dependent K+ conductance IK,n that previously was shown to be mediated by KCNQ4 (Kv7) channel subunits. IK,n/KCNQ4 dominates the electrical properties of the OHC cell membrane and furthermore is essential for OHC survival. Genetic deletion of KCNQ4 causes progressive degeneration of OHCs and deafness. Similarly, KCNQ4 loss-of-function mutations cause the progressive form of hereditary deafness DFNA2. The molecular mechanism leading to OHC degeneration remains elusive, but the survival of OHCs has been linked directly to KCNQ4 channel function. Strikingly, the loss of OHCs is phenotypically similar to OHC degeneration caused by ototoxic substances and noise damage (acquired hearing loss), but a role of IK,n/KCNQ4 in acquired hearing loss has never been investigated so far. In the present study I investigated the pathophysiological relevance of IK,n for OHC degeneration caused by aminoglycoside (AG) antibiotics. Since KCNQ4 channel function is essential for OHC survival, chemical current augmentation may provide a protective strategy against KCNQ4-related hearing loss. Thus, I analysed whether chemical KCNQ channel openers rescued IK,n currents from pathological inhibition. In brief, I found that AGs rapidly entered OHCs and that entry was necessary for IK,n current inhibition. The inhibition was caused by functional depletion of phospholipids by the AGs that are essential for the function of IK,n/KCNQ4. Various AGs exhibit different ototoxic potential, i.e. neomycin causes OHC degeneration whereas gentamicin damages vestibular hair cells. Strikingly, the degree of IK,n inhibition (neomycin > gentamicin) correlated with the phospholipid binding efficiency and with the ototoxic potential of the respective AG. Given the dependence of OHCs on IK,n, the ototoxic potential of AGs thus may be determined by their chemical nature and by their inhibitory impact on IK,n. Furthermore, I showed that IK,n was sensitive to current augmentation by chemical KCNQ channel openers. A combination of openers rescued IK,n from AG-induced inhibition to wild-type levels indicating full restoration of IK,n activity. Most DFNA2 patients are heterozygous carriers of KCNQ4 mutations that reduce IK,n through a dominant-negative effect. This reduction of IK,n activity causes OHC degeneration. Residual currents in the dominant-negative situation were essentially rescued to wild-type levels by the application of KCNQ channel openers, at least in a heterologous expression system. The current rescue indicated that KCNQ channel openers might be used to stabilise IK,n in heterozygous DFNA2 patients. In summary, the present work demonstrated for the first time a role of the essential OHC K+ conductance IK,n in acquired hearing loss. The dependence of OHCs on IK,n may explain the high vulnerability of OHCs towards ototoxic influences. IK,n current augmentation by chemical KCNQ openers may be used to stabilise IK,n in OHCs and protect the sensory cells from KCNQ4-related degeneration. KCNQ openers rescued IK,n from AG-induced inhibition in OHCs and recombinant KCNQ4 from dominant-negative inhibition by mutant subunits. However, it remains elusive whether chemical KCNQ agonists alleviate OHC degeneration and protect from hearing loss., Äußere Haarsinneszellen (ÄHZ) des Corti´schen Organs im Innenohr werden biophysikalisch charakterisiert durch den K+ Strom IK,n, dessen molekulare Grundlage der spannungsabhängige K+ Kanal KCNQ4 (Kv7.4) ist. IK,n/KCNQ4 dominiert die elektrischen Eigenschaften der ÄHZ Zellmembran und ist darüber hinaus essentiell für das Überleben der Zellen. Im knock-out Tiermodell führte der Verlust der KCNQ4 Kanalaktivität zum Untergang der ÄHZ und zu Taubheit. Dies ist klinisch bedeutend, da im Menschen KCNQ4 Mutationen die Ursache für die erbliche Taubheit DFNA2 sind. Der Mechanismus, der zum Haarzelluntergang führt, ist noch unklar, doch korreliert das Überleben von ÄHZ direkt mit der Funktion von KCNQ4. Obwohl der durch Giftstoffe oder Lärm bewirkte Haarzelluntergang (erworbener Hörverlust) dem KCNQ4-bedingten ÄHZ Verlust ähnelt, wurde eine Verbindung zwischen IK,n/KCNQ4 und erworbenem Hörverlust bisher noch nicht experimentell erfasst. In der vorliegenden Arbeit habe ich mich mit der pathophysiologischen Rolle von IK,n/KCNQ4 in klinisch relevantem Haarzelluntergang beschäftigt, der durch Aminoglykosid (AG) Antibiotika hervorgerufen wird. Des Weiteren wurde untersucht, ob chemische KCNQ Kanalöffner die Funktion von IK,n trotz pathophysiologisch relevanter Inhibition wiederherstellen können, um eventuell Protektion der ÄHZ zu ermöglichen. Ich konnte erstmalig zeigen, dass AG Antibiotika schnell in Haarzellen eindringen und IK,n inhibieren. Die Inhibition war darauf zurückzuführen, dass AG über elektrostatische Wechselwirkungen negativ geladene Phospholipide funktionell depletieren, die für die Funktion von IK,n essentiell sind. Verschiedene AG zeigen unterschiedliches ototoxisches Potential: Neomycin führt zum Untergang von ÄHZ, während Gentamycin vestibuläre Haarzellen schädigt. Das Ausmaß der IK,n Kanalinhibition korrelierte (Neomycin > Gentamycin) mit dem Grad der Phospholipid Bindung und mit dem ototoxischen Potential der AG. Dies legt nahe, dass die hohe Anfälligkeit der ÄHZ gegenüber Neomycin auf die Inhibition von IK,n zurückzuführen ist. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Aktivität von IK,n durch chemische KCNQ Kanalöffner verstärkt wird. Die AG-induzierte Hemmung von IK,n konnte aufgehoben und die Kanalaktivität vollkommen wiederhergestellt werden. In heterozygoten DFNA2 Patienten werden IK,n Ströme durch einen dominant-negativen Effekt mutierter KCNQ4 Kanaluntereinheiten verringert, was den ÄHZ Untergang bewirkt. Es ist mir im heterologen System gelungen, mittels chemischer KCNQ Kanalöffner KCNQ4 von dieser dominant-negativen Inhibition zu befreien. Die Ströme in Gegenwart der Kanalöffner waren vergleichbar mit Strömen unter Kontrollbedingungen, was gleichbedeutend mit der vollständigen Wiederherstellung der Kanalfunktion war. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass ich in dieser Arbeit erstmals eine Rolle der Kaliumleitfähigkeit IK,n in erworbenem Hörverlust demonstrieren konnte. Dies kann die verstärkte Anfälligkeit von ÄHZ gegenüber ototoxischen Einflüssen erklären. Darüber hinaus stabilisieren chemische Kanalöffner IK,n in Anwesenheit von AG und stellen die Funktion von rekombinanten KCNQ4 Kanälen trotz dominant-negativer Inhibition wieder her. Dies könnte Haarzellen vor KCNQ4-bedingtem Untergang schützen. Es bleibt allerdings offen, ob die Substanzen den Verlust der ÄHZ verzögern und Taubheit abwenden können.

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphat (PIP2) und Phosphatidylinositol-3,4,5-trisphosphat (PIP3) sind bedeutende Signalmoleküle in der Plasmamembran, die unter anderem direkt an der Regulation der meisten Ionenkanalspezies beteiligt sind. In dieser Arbeit wurden molekulare toolkits zur Untersuchung dieser Regulation entwickelt. Zur Messung von Veränderungen der Phosphoinositidkonzentrationen wurden FRET-Sensoren verwendet und zur Depletion von PIP2 und PIP3 wurde die spannungsgesteuerte Phosphatase von Ciona intestinalis (CiVSP) eingesetzt. Selbst-spaltende virale 2A-Peptide wurden zur multicistronischen adenoviralen Expression von CiVSP und den FRET-Sensoren aus einem Leserahmen genutzt. Diese toolkits erlaubten die simultane Manipulation und Messung von PIP2 oder PIP3 in intakten Zellen bei gleichzeitiger Registrierung von Ionenströmen. Die durchgeführten Untersuchungen zeigen die vielseitige Anwendbarkeit der toolkits in Zelllinien und terminal differenzierten Zellen.

Spannungsgesteuerte Kaliumkanäle (Kv-Kanäle) sind an der Regulation neuronaler und kardialer Aktivität beteiligt. Sie öffnen bei Depolarisation der Zelle und leiten unter physiologischen Bedingungen Kaliumauswärtsströme, wodurch sie zur Repolarisation beitragen. Kv-Kanäle modulieren die Dauer von Aktionspotentialen und die Erregbarkeit der Zellen. Verschiedene Regulationsmechanismen können die Kanalfunktion beeinflussen. Zu den physiologischen Regulationsmechanismen gehören unter anderem die durch endogene mehrfach ungesättigte Lipide induzierte Inaktivierung von Kv-Kanälen, die RNA Editierung des Kv1.1-Kanals, welche zu einem Austausch von Isoleucin gegen Valin innerhalb der zentralen Pore führt sowie die Inaktivierung durch akzessorische Untereinheiten. Sowohl der zugrunde liegende Mechanismus der durch Lipide induzierten Inaktivierung als auch die Folgen der Kv1.1 RNA Editierung sind bisher nur ansatzweise bekannt und wurden in der hier vorliegenden Arbeit genauer untersucht. Zudem wurde die Konformation des Inaktivierungspartikels der akzessorischen Kvβ1.3-Untereinheit und die Regulation der durch sie eingeführten A-Typ Inaktivierung analysiert. Zunächst wurde der Mechanismus der Inaktivierung durch endogene Lipide wie Arachidonsäure, Docosahexaensäure und Anandamid anhand verschiedener Methoden untersucht. Die Charakteristika der Inaktivierung wie Kinetik, Kompetition mit dem Porenblocker TEA und Beeinflussung durch Mutationen in der zentralen Pore sowie die in silico Modelle zeigen, dass eine physikalische Blockade der offenen Kanalpore den wahrscheinlichsten Mechanismus der Inhibition durch Lipide darstellt. Untersuchungen der funktionellen Folgen der Kv1.1 RNA Editierung ergaben, dass editierte Kanäle eine verminderte Sensitivität gegenüber Porenblockern aufweisen. Dazu zählen sowohl die Substanzen 4-Aminopyridin (4-AP) und Psoralen-4, welche experimentell und klinisch genutzt werden, als auch die in dieser Studie neu als Porenblocker identifizierten Lipide und deren verwandte Substanzen. Zudem konnte gezeigt werden, dass editierte Kv1.1-Untereinheiten durch Heteromerisierung die Pharmakologie und Lipidsensitivität aller Kv1-Kanäle modulieren können. Im Rahmen der funktionellen Charakterisierung von editierten Kv1.1-Kanälen wurde in verschiedenen Expressionssystemen eine Verringerung der Stromgröße als Folge der Editierung beobachtet. Daraufhin wurde die molekulare Grundlage dieser Stromverringerung untersucht. Messungen auf Einzelkanal- und Ganzzellebene sowie Quantifizierung der Proteinmenge ergaben, dass die Editierung weder Veränderungen im Öffnungs- und Schließverhalten noch in der Gesamtmenge der Kanalproteine zur Folge hat. Es konnte jedoch eine signifikant verminderte Oberflächenexpression der editierten Kv1.1-Kanaluntereinheiten nachgewiesen werden, die wahrscheinlich für den geringeren Gesamtstrom verantwortlich ist. Diese Ergebnisse beschreiben erstmals eine Modulation des intrazellulären Transportes der Kv1.1-Kanaluntereinheiten durch RNA Editierung. Eine pathophysiologische Relevanz der RNA Editierung des Kv1.1-Kanals wird in Zusammenhang mit dem Krankheitsbild der Epilepsie vermutet. Eine Quantifizierung der Kv1.1 Editierungsrate im entorhinalen Cortex chronisch epileptischer Ratten des Kainat-induzierten Tiermodells zeigte eine erhöhte Editierungsrate im Vergleich zu gesunden Kontrolltieren. Die epileptischen Tiere zeichnen sich durch eine Resistenz gegenüber 100 µM des iktogenen Kv-Kanalblockers 4-AP aus, einer Konzentration, die in gesunden Kontrolltieren epileptiforme Potentiale auslöst. In der vorliegenden Arbeit wurden die Auswirkungen der erhöhten Editierungsrate auf diese Konzentration an 4-AP anhand elektrophysiologischer Versuche im Expressionssystem untersucht. Während eine Beeinflussung des Zeitverlaufes oder der Spannungsabhängigkeit des 4-AP Blocks durch die beobachtete Erhöhung der Editierungsrate ausgeschlossen werden konnte, wurde eine signifikante Verminderung der 4-AP Sensitivität festgestellt. Diese, auf der erhöhten Editierungsrate beruhende, verminderte 4-AP Sensitivität von Kv1-Kanälen liegt vermutlich der veränderten 4-AP Sensitivität der epileptischen Tiere zugrunde. Neben der RNA Editierung wurden im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit Aspekte der Inaktivierung von Kv1-Kanälen untersucht. Kvβ1-Untereinheiten können nach Assoziation mit Kv1-Kanälen eine schnelle A-Typ Inaktivierung hervorrufen. Anhand elektrophysiologischer Versuche und Molecular Modelling wurde die Konformation bzw. der Bindungsmodus des Inaktivierungspartikels der Kvβ1.3-Untereinheit analysiert. Die Ergebnisse zeigen, dass der Kvβ1.3-Inaktivierungspartikel während der Bindung innerhalb der zentralen Pore des Kv1.5-Kanals am wahrscheinlichsten in einer Haarnadelkonformation vorliegt und die Inaktivierung durch Phosphoinositide reguliert werden kann., Voltage-gated potassium channels (Kv-channels) participate in the regulation of neuronal and cardiac activity. They open upon depolarization of the cell and conduct potassium outward currents under physiological conditions, thus contributing to repolarization. Kv-channels modulate action potential duration and cell excitability. Different regulatory mechanisms can influence channel function. Amongst others, the physiological regulatory mechanisms include inactivation of Kv-channels induced by endogenous lipids, the RNA editing of the Kv1.1-channel, which leads to an exchange of isoleucine for valine within the central pore, as well as inactivation induced by accessory subunits. The underlying mechanism for lipid-induced inactivation and the consequences of Kv1.1 RNA editing are only partly understood and were examined in more detail in the present study. Furthermore, the structure of the inactivation particle of the accessory Kvβ1.3-subunit and the regulation of inactivation by this subunit were analyzed. First, the mechanism of channel inhibition by endogenous lipids like arachidonic acid, docosahexaenoic acid and anandamide was analyzed with the help of different methods. The characteristics of the inactivation such as kinetics, competition with the pore blocker TEA and influence by mutations in the central pore as well as the in silico models suggest that a physical occlusion of the open channel pore is the most likely mechanism for channel inhibition by lipids. Examination of the functional consequences of Kv1.1 RNA editing showed that edited channels exhibit a reduced sensitivity to pore blockers. This applies to the substances 4-Aminopyridine (4-AP) and Psoralen-4, which are used for experimental and clinical purposes, as well as to the lipids and related substances that have been newly identified as pore blockers in this study. Furthermore, it could be demonstrated that edited Kv1.1 subunits can modulate the pharmacology and lipid sensitivity of all Kv1-channels through heteromerization with other Kv1 channel subunits. In the course of the functional characterization of edited Kv1.1-channels a reduced current amplitude due to the editing was observed in different expression systems. Thereupon, the molecular correlates of this current reduction were investigated. Recordings on single-channel and whole-cell level and quantification of protein amount revealed that the editing does not cause changes neither in gating nor in the total amount of channel protein. However, a significantly diminished surface expression of edited Kv1.1-channel subunits could be detected, which is likely to be responsible for the reduced total current. These results describe for the first time a modulation of intracellular transport of Kv1.1-channel subunits by RNA editing. A pathophysiological relevance of Kv1.1 RNA editing is assumed in the context of epilepsy. A quantification of the extent of Kv1.1 editing in the entorhinal cortex of chronic epileptic rats from the kainic acid induced animal model showed an increased editing ratio in comparison to healthy control animals. Characteristic of epileptic animals is a resistance to 100 µM of the ictogenic Kv-channel blocker 4-AP, a concentration that induces epileptiform potentials in healthy control animals. In the present work, the effects of the increased editing ratio on this 4-AP concentration were examined in electrophysiological experiments in an expression system. While any influence of the observed increase in editing ratio on the time course or voltage-dependence of 4-AP block could be ruled out, a significant reduction of 4-AP sensitivity was detected. This reduced 4-AP sensitivity of Kv1-channels which is caused by the elevated editing ratio is presumably the basis of the altered 4-AP sensitivity of epileptic animals. Furthermore, aspects of the inactivation of Kv1-channels were examined in the course of this study. Kvβ1-subunits can induce fast A-type inactivation when attached to Kv1-channels. The conformation (or rather the binding mode) of the inactivation particle of the Kvβ1.3-subunit was analyzed by means of electrophysiological experiments and molecular modelling. The results suggest that the Kvβ1.3 inactivation particle most probably adopts a hairpin conformation when bound within the central pore of the Kv1.5-channel. Moreover, I could show that the Kvβ1.3-induced inactivation can be regulated by phosphoinositides.

Introduction The mechanosensitive K2P-channel TREK-1 is expressed at high levels in the nervous system and is regulated by diverse physical and chemical stimuli and interaction partners. Several in vivo studies have demonstrated that TREK-1 is involved in pathophysiological processes like neuroprotection, pain and depression. TREK-1 channels stabilize the resting membrane potential of neurons and consequently have a key role in the regulation of membrane excitability. The aim of this study was to compare the direct interaction of the inducible enzyme heme oxygenase 1 (HO-1) and the constitutively expressed heme oxygenase 2 (HO-2) with TREK-1 and to identify amino acid regions responsible for the interaction. Material and Methods To characterize the direct interaction of TREK-1 with HO-1 und HO-2, the split-ubiquitin yeast two-hybrid system was used, which is specialized for membrane proteins. This method utilizes complementation between separable domains of ubiquitin to study protein interactions. The C-terminal half of ubiquitin (Cub), along with an artificial transcription factor complex was fused to TREK-1 (bait) and the N-terminal half of ubiquitin (NubG) was fused to HO-1 or HO-2 (preys). Interaction between bait and prey proteins brings Cub and NubG together which activates the transcription factor complex. This complex enters the nucleus and activates the expression of several reporter genes which in turn enable the yeast cells to grow on a selective medium lacking histidine and turn blue in a -galactosidase assay. To investigate the physiological relevance of the interaction of TREK-1 with HO-1 and HO-2 the channel and the two heme oxygenase isoforms were co-expressed in Xenopus laevis oocytes and the TREK-1 currents were measured with the two-electrode voltage-clamp method. In order to produce TREK-1 constructs with specific antigenic epitopes the HA-epitope (N-terminally) and the EGFP (C-terminally) were fused to the TREK-1 by using the site-directed mutagenesis method. Subsequently the fusion constructs were characterized with the Westernblot technique. Results Specific and strong interactions between several K2P-channels (TREK-1, TREK-2c and TASK-1) and HO-2 but not with its closely related isoform HO-1 could be demonstrated using a yeast two-hybrid direct interaction study. Additionally, it could also been shown that neither HO-2 nor HO-1 interacted with the inwardly rectifying potassium channel Kir2.1. Furthermore, physiological significance of the interaction between TREK-1 and HO-2 was demonstrated by two-electrode voltage-clamp measurements showing an increase in channel currents following the co-expression of TREK-1 and HO-2 in Xenopus laevis oocytes. On the contrary, co-expression of TREK-1 with HO-1 did not yield any changes in the channel currents. Discussion From the two studied heme oxygenases only HO-2 could be identified as a specific interaction partner of TREK-1 and other K2P-channels. Functionally, the interaction between TREK-1 and HO-2 leads to an increase of the channel currents, which in turn stabilizes the membrane potential of the cells in which both proteins are expressed. Although HO-1 and HO-2 have a high similarity (76 %) in their amino acid sequences, they exhibit several structural differences especially in the distal C-termini and the heme regulatory motifs of HO-2. These structural differences could be responsible for the absence of interaction between HO-1 and TREK-1 and in contrary be important for the specific interaction between HO-2 and TREK-1. Further analysis of defined HO-2 deletion mutants and the exchange of the distal C-termini between HO-2 and HO-1 could give more information about the importance of these regions for their interaction with TREK-1. Designing more experiments with the TREK-1 fusion constructs could be helpful for carrying out further immunochemical studies. Hilfe der ortsgerichteten Mutagenese mit TREK-1 fusioniert. Anschließend wurden die Fusionskonstrukte durch Westernblot-Analysen immunochemisch charakterisiert. Ergebnisse Es konnten spezifische und starke Interaktionen zwischen verschiedenen K2P-Kanälen (TREK-1, TREK-2c und TASK-1) und HO-2 mit Hilfe der Hefe-Zwei-Hybrid-Methode gezeigt werden, die für den nahen Verwandten HO-1 nicht nachweisbar waren. Zudem konnte gezeigt werden, dass weder HO-2 noch HO-1 mit dem einwärtsgleichrichtenden Kaliumkanal Kir2.1 interagieren. Die physiologische Relevanz der Interaktion zwischen TREK-1 und HO-2 konnte durch Messungen mit der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gezeigt werden, bei denen es nach Coexpression beider Proteine in Xenopus laevis Oozyten zu einer signifikanten Erhöhung des Ionenkanalstroms kam. Im Gegensatz dazu führte die Coexpression von TREK-1 und HO-1 zu keinen signifikanten Änderungen der Ionenkanalströme. Diskussion Von beiden untersuchten Hämoxygenasen konnte nur HO-2 als ein spe-zifischer Interaktionspartner für TREK-1 und andere K2P-Kanäle nachge-wiesen werden. Funktionell wirkt sich die Interaktion zwischen TREK-1 und HO-2 in einer Zunahme des Ionenkanalstroms aus, wodurch das Membran-potential von Zellen, in denen beide Proteinpartner exprimiert werden, stabilisiert werden könnte. Obwohl HO-1 und HO-2 auf Ebene der Amino-säuresequenzen eine hohe Similarität (76 %) haben, zeigen sich einige strukturelle Unterschiede, vor allem in den distalen C-Termini und bei den hämregulatorischen Motiven der HO-2. Diese strukturellen Unterschiede könnten zum einen für die fehlende Interaktion von HO-1 und TREK-1 verant-wortlich sein und zum anderen für die spezifische Interaktion von HO-2 und TREK-1 wichtig sein. Weitere Untersuchungen von speziellen HO-2 Deletions-mutanten und der Austausch der distalen C-Termini zwischen HO-2 und HO-1 könnten Aufschluss über die Wichtigkeit dieser Regionen bei der Interaktion mit TREK-1 geben. Experimente mit den TREK-1 Fusionskonstrukten könnten bei weiteren immunochemischen Charakterisierungen hilfreich sein., Einleitung Der mechanosensitive K2P-Kanal TREK-1 ist stark in neuronalem Gewebe exprimiert und wird durch verschiedene chemische und physikalische Stimuli und einige Interaktionspartner reguliert. Verschiedene Studien haben gezeigt, dass TREK-1 an pathophysiologischen Prozessen wie Neuroprotektion, Schmerz und Depression beteiligt ist. TREK-1-Kanäle können das Ruhemembranpotential von Neuronen stabilisieren und spielen damit eine wichtige Rolle bei der Regulation der Membranerregbarkeit. Ziel dieser Arbeit war es, die direkte Interaktion der induzierbaren HO-1 und der konstitutiv exprimierten HO-2 mit TREK-1 zu vergleichen und Aminosäureregionen zu identifizieren, die für die Interaktion wichtig sind. Material und Methoden Um die direkte Interaktion von TREK-1 mit HO-1 und HO-2 zu testen, wurde das Split-Ubiquitin Hefe Zwei-Hybrid-System zur Untersuchung von Membran-proteinen verwendet. Dieses System nutzt die funktionelle Zusammenlagerung der beiden separierbaren Domänen des Ubiquitins, um Proteininteraktionen zu untersuchen. Die C-terminale Hälfte des Ubiquitins (Cub), an das ein artifizieller Transkriptionsfaktorkomplex gebunden ist, wurde an TREK-1 (Bait) fusioniert und die N-terminale Hälfte des Ubiquitins (NubG) wurde an HO-1 und HO-2 (Prey) fusioniert. Die Interaktion zwischen den Bait und Prey Proteinen bringt beide Ubiquitinhälften Cub und NubG zusammen, wodurch der Transkriptionsfaktorkomplex freigesetzt wird, in den Zellkern transloziert und dort die Expression von Reportergenen aktiviert. Die Hefezellen sind dann befähigt auf einem histidinfreien Selektionsmedium zu wachsen und beim -Galaktosidase-Assay eine Blaufärbung zu ergeben. Um die physiologische Relevanz der Interaktion von TREK-1 mit HO-1 und HO-2 zu untersuchen, wurden das Kanalprotein und die beiden Hämoxy-genasen in Xenopus laevis Oozyten coexprimiert und die TREK-1-Ströme mit Hilfe der Zwei-Elektroden-Spannungsklemme gemessen. Zur Herstellung von TREK-1-Konstrukten, die spezifische antigene Epitope enthalten, wurden das HA-Epitop (N-terminal) und das EGFP (C-terminal) mit Material and Methods To characterize the direct interaction of TREK-1 with HO-1 und HO-2, the split-ubiquitin yeast two-hybrid system was used, which is specialized for membrane proteins. This method utilizes complementation between separable domains of ubiquitin to study protein interactions. The C-terminal half of ubiquitin (Cub), along with an artificial transcription factor complex was fused to TREK-1 (bait) and the N-terminal half of ubiquitin (NubG) was fused to HO-1 or HO-2 (preys). Interaction between bait and prey proteins brings Cub and NubG together which activates the transcription factor complex. This complex enters the nucleus and activates the expression of several reporter genes which in turn enable the yeast cells to grow on a selective medium lacking histidine and turn blue in a -galactosidase assay. To investigate the physiological relevance of the interaction of TREK-1 with HO-1 and HO-2 the channel and the two heme oxygenase isoforms were co-expressed in Xenopus laevis oocytes and the TREK-1 currents were measured with the two-electrode voltage-clamp method. In order to produce TREK-1 constructs with specific antigenic epitopes the HA-epitope (N-terminally) and the EGFP (C-terminally) were fused to the TREK-1

Cardiac GIRK channels are composed of Kir3.1 and Kir3.4 subunits and contribute to vagally induced bradycardia. Here, the effects of altered subunit expression ratios on cardiac GIRK currents were studied using adenovirally induced overexpression and RNA interference in primary cultured atrial myocytes of adult rats. We show that \(Na^{+}\)-dependent activation of GIRK channels is restricted to Kir3.4 homomers. Adenovirus-driven RNA interference specifically targeting Kir3.1 and Kir3.4 resulted in both cases in parallel reduction of Kir3.1 and Kir3.4 mRNA, suggesting a co-regulation of transcription. To study the role of GIRK channel regulation in chronic atrial fibrillation (cAF), \(Na^{+}\)-sensitivity of GIRK currents in atrial myocytes of cAF patients were compared to normal sinus rhythm (SR). The receptor dependent GIRK current in SR-myocytes increased with \([Na^{+}]_{i}\). This \(Na^{+}\)-sensitivity was impaired in cAF, suggesting decreased Kir3.4 expression due to cAF induced remodeling processes.

Im ersten Teil der Arbeit wurde eine genetische Disposition für Vorhofflimmern (VHF) untersucht. Der Einzelnukleotidpolymorphismus ("single nucleotide polymorphism", SNP) 38G/S befindet sich im N-Terminus der ß-Untereinheit KCNE1. Diese ß-Untereinheit konstituiert gemeinsam mit der alpha-Untereinheit KCNQ1 die langsame Komponente des verzögerten Gleichrichterstromes, IKs. Die ß-Untereinheit hat hierbei eine modulierende Funktion. Frühere Studien beschäftigten sich hauptsächlich mit der transmembranären Domäne und dem C-Terminus. Über die Rolle des N-Terminus war bislang wenig bekannt. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Aufgabe des N-Terminus bei der Modulation der alpha-Untereinheit zu identifizieren. Außerdem sollte festgestellt werden, welche Aminosäuren hierbei besonders von Bedeutung sind. Zu diesem Zweck wurden diverse Konstrukte synthetisiert. Für das Konstrukt delta1-38’ wurden die Aminosäuren 1-38 und damit der Großteil des N-Terminus entfernt. Das Konstrukt "linker" enthält anstelle des Glyzins oder Serins an Position 38 fünf Alanine. In der Nähe der von dem SNP betroffenen Aminosäure befinden sich des Weiteren drei Arginine, die mit jeweils einem Alanin substituiert wurden. Für alle Versuche diente die nicht VHF-assoziierte Variante des SNPs als Kontrolle. Alle Konstrukte konnten erfolgreich heterolog exprimiert werden und gleichermaßen mit der alpha-Untereinheit immunopräzipitiert werden. Die aus der Co-Transfektion von KCNQ1 und KCNE1 resultierende Stromdichte wurde mittels "Patch-clamp"-Technik untersucht. Im Vergleich zum Kontrollstrom (KCNQ1 + KCNE1-38S) waren die Ströme aller anderen Gruppen während De- und Repolarisation signifikant kleiner. Zellfraktionierung und konfokale Mikroskopie zeigten, dass im Vergleich zur Kontrolle alle anderen Konstrukte eine verminderte Plasmamembranlokalisation aufwiesen. Die Aufgabe des N-Terminus liegt offensichtlich im Transport beider Untereinheiten an die Plasmamembran und/oder der Verankerung dort. Sowohl die Aminosäure in Position 38 als auch die drei N-terminalen Arginine in der Nähe scheinen für den hier gesuchten Mechanismus von Bedeutung zu sein. Zukünftige Experimente könnten beispielsweise 3D-Simulationen der Proteinfaltung beinhalten, um die potentielle Membranverankerung weiter zu untersuchen. Der zweite Teil der Arbeit untersuchte erworbene elektrophysiologische Veränderungen im Rahmen von VHF am Beispiel der einwärts gleichrichtenden Kaliumströme IK1 und IKACh. Es sollten die zugrunde liegenden regulatorischen Mechanismen für die Heraufregulierung von IK1 und IKACh bei VHF untersucht werden. Alle Experimente wurden an humanem Gewebe des linken Vorhofs durchgeführt. Das Gewebe stammt von VHF-Patienten, die sich einer Mitralklappen-Operation unterzogen. Als Kontrolle wurde Gewebe von Patienten im Sinusrhythmus (SR) verwendet. Zunächst wurde untersucht, ob transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Veränderungen oder funktionelle Effekte der Heraufregulierung der Ströme zugrunde liegen. Entsprechend wurde die Proteinexpression mittels Western Blot quantifiziert. Die Quantifizierung der mRNA erfolgte per Realtime-PCR. Veränderungen für IK1 konnten sowohl auf mRNA- als auch auf translationaler Ebene beobachtet werden. Protein- und mRNA-Expression von Kir2.1, der zugrunde liegenden Proteinuntereinheit, waren bei VHF signifikant erhöht; die Expression der inhibitorischen miR-1 war reduziert. Die Bestimmung der Protein- und mRNA-Expression der zugrunde liegenden Proteinuntereinheiten für den Strom IKACh zeigte dagegen keinen Unterschied zwischen Gewebe von Patienten mit VHF und SR. Eine funktionelle Regulierung schien daher möglich. Die Expression der IKACh modulierenden Proteine Calmodulin und G alpha i-3 unter VHF zeigte jedoch keinen signifikanten Unterschied zu der SR-Gruppe. Es war eine Tendenz zur Reduktion des inhibierenden G alpha i-3 zu beobachten. Die Regulierung von IKACh,c bei VHF bleibt in zukünftigen Arbeiten zu untersuchen. Ein möglicher Versuch wäre, therapeutisch in die Regulation der Kir-Untereinheiten einzugreifen, um das VHF-unterstützende, elektrische "Remodeling" des IK1 zu verhindern. The first part of the thesis dealt with a genetic predisposition to Atrial fibrillation (AF). The N-terminal KCNE1 polymorphism 38S is highly prevalent and KCNE1-38G is associated with AF. Together with the alpha-subunit the ß-subunit KCNE1 constitutes the slow component of the delayed rectifier current, IKs. The ß-subunit has a modulatory function. Previous studies regarding this protein mainly investigated its transmembrane domain and C-terminus. Detailed structure-function relationship of the KCNE1 N-terminus for IKs modulation is poorly understood and was subject of this study. KCNE1-constructs with N-terminal mutations disrupting structurally important positively charged amino-acids (arginines) at positions 32, 33, 36 and constructs modifying position 38 including an N-terminal truncation mutation were studied. All constructs expressed heterogenously and on the same level. Co-immunoprecipitation with the alpha-subunit was successful for all constructs. IKs resulting from co-expression of KCNQ1 with non-AF ‘38S’ was greater than with KCNE1-38G or with any other construct. Ionic currents resulting from co-transfection of a KCNE1 mutant with arginine substitutions were comparable to currents evoked from cells transfected with an N-terminally truncated KCNE1-construct. Western blots from plasma membrane preparations and confocal images consistently showed a greater amount of KCNQ1 protein at the plasma membrane in cells co-transfected with the non-AF ‘38S’ than with the other constructs. The results of this project indicate N-terminal position 38 and arginines in positions 32, 33, 36 of KCNE1 are important for reconstitution of IKs. This work provides evidence for a role of these N-terminal amino-acids in membrane trafficking and/or anchoring of the delayed rectifier current complex. Future tasks could involve 3D protein folding simulations in order to investigater further into membrane anchoring. The second part of the thesis investigated acquired electrophysiological changes in AF. It aimed to evaluate regulatory mechanisms underlying these changes in inward rectifier currents IK1 and constitutively active IKACh. All experiments were conducted on human left atrial tissue from patients undergoing mitral valve repair. IK1 and IKACh density was increased in cells from patients with AF. IK1 underlying subunit Kir2.1 showed increased protein and mRNA expression. Also inhibitory microRNA-1 was reduced. Protein and mRNA expression of subunits Kir3.1 and Kir3.4, underlying IKACh, was unchanged. Functional modulators of Kir3 currents Calmodulin and G alpha i-3 were quantified as well. While Calmodulin was unchanged inhibitory G alpha i-3 tended to reduction. Underlying mechanisms of IKACh upregulation needs to be further studied. A therapeutic approach to the underlying mechanisms of IK1 upregulation might inhibit the AF maintaining Remodeling of the inward rectifier current.

Cardiac GIRK channels are composed of Kir3.1 and Kir3.4 subunits and contribute to vagally induced bradycardia. Here, the effects of altered subunit expression ratios on cardiac GIRK currents were studied using adenovirally induced overexpression and RNA interference in primary cultured atrial myocytes of adult rats. We show that Na+-dependent activation of GIRK channels is restricted to Kir3.4 homomers. Adenovirus-driven RNA interference specifically targeting Kir3.1 and Kir3.4 resulted in both cases in parallel reduction of Kir3.1 and Kir3.4 mRNA, suggesting a co-regulation of transcription. To study the role of GIRK channel regulation in chronic atrial fibrillation (cAF), Na+-sensitivity of GIRK currents in atrial myocytes of cAF patients were compared to normal sinus rhythm (SR). The receptor dependent GIRK current in SR-myocytes increased with [Na+]i. This Na+-sensitivity was impaired in cAF, suggesting decreased Kir3.4 expression due to cAF induced remodeling processes.

Long QT syndrome is characterized by prolongation of the QT interval on electrocardiogram. Early after depolarisations may develop to torsade de pointes degenerating into ventricular fibrillation and cause sudden cardiac death. In the present study Marburg patients were screened for mutations in 14 ion channel genes by PCR-based SSCP-analysis. One heterozygote mutation in hERG potassium channel, one heterozygote mutation in KvLQT1 potassium channel as well as one polymorphism in the Nav1.5 sodium channel, that is associated with longer QTc interval, were identified. The functional characterization of the H1153Y channel in Xenopus oocytes showed a minimal loss of channel function and no dominant negative effect on wildtype channel. However, mutant hERG channel subunits indicated normal trafficking to the plasma membrane in oocytes and mammalien cells. The functional characterization of the G269S channel in Xenopus oocytes represented a 60 % current reduction when expressed alone and no dominant negative effect could be observed when co-expressed with wildtype channel. Also the mutant channel shows an assembly defect with the ß-subunit minK. The common H558R polymorphism in the sodium channel SCN5A gene is associated with the QTc length. It is not possible to disentangle the effect of the H558R polymorphism from that of the 1141-3 C>A SNP because of their tight LD. This latter SNP is located in the acceptor splice site in intron 9 and might affect the splicing. The splicing of the C>A sequence variation was analysed using a modified version of the EBD minigene construct. The results clearly indicate that the sequence change will not interfere with the splicing. The H558R polymorphism had significantly larger peak current amplitudes than wt-hH1. However, no difference in Na+ channel activation, inactivation, recovery of inactivation and levels of persistant sodium current had been observed between the wt and H558R clones. Also in the present study a novel long QT form is characterized functionally. Andersen syndrome is a rare genetic multisystem disorder characterized by periodic paralysis, a cardiac phenotype and dysmorphic features. The N318S and W322C mutation clinically manifested only with a cardiac phenotype and without the dysmorphic features and periodic paralysis typical for AS. These results were correlated with the clinical phenotype. These two mutations were the farthest C-terminal mutations reported in Kir2.1 and the aminoacid Trp322 is well conserved among Kir family members. According to the crystal structure of Kir2.1 the localization of these two mutations was very uncommon. Both mutations represented no dominant negative effect and only a 20 % to 25 % current reduction when coexpressed with wild type. The minimal loss of channel function resulted from a deficient trafficking in case of W322C and a defect in gating for N318S. W322C displayed a perinuclear staining pattern residing in relatively large vesicular structures. Furthermore the mutations exhibited no dominante negative effects on Kir2.2 and Kir2.3 channels. The findings support the notion, that a novel LQTS form is described and as such we propose, that these clinical and electrophysiological manifestations should be considered as a subtype of LQTS7., Das Lange-QT-Syndrom ist charakterisiert durch ein längeres QT-Intervall im Elektrokardiogramm. Frühe Nachdepolarisationen können zu lebensbedrohlichen torsade de pointes Tachykardien führen, die in Synkopen resultieren oder in Kammerflimmern übergehen und das Risiko für den plötzlichen Herztod drastisch erhöhen. In dieser Arbeit wurde bei Marburger Patienten mit Hilfe der PCR-basierten SSCP-Analyse nach Mutationen in 14 verschiedenen Genen gesucht. Es ist gelungen, eine heterozygote Mutation im hERG-Kanal sowie eine weitere im KvLQT1-Kanal und einen mit der QTc-Zeit assoziierten homozygoten Polymorphismus im Nav1.5-Kanal zu identifizieren. Die funktionelle Charakterisierung der H1153Y-Kanalvariante in Xenopus Oozyten zeigte einen Funktionsverlust und keinen dominant negativen Effekt auf Wildtyp-Kanäle. Die Leitfähigkeits-Spannungs-Beziehung ist unverändert. Der Transport an die Zellmembran ist weder in Xenopus Oozyten noch in Säugerzellen gestört. Die funktionelle Charakterisierung der G269S-Kanalvariante zeigte in Xenopus Oozyten einen 60 % Funktionsverlust, ohne einen dominant negativen Effekt auf die Wildtyp-Kanäle zu haben. Zudem ist die Assemblierung mit der ß-Untereinheit minK gestört. Der H558R-Polymorphismus im Natriumkanal Nav1.5 ist mit einer Verlängerung der QTc-Zeit assoziiert. Zusammen mit dem H558R-Polymorphismus konnte der IVS9-3-C>A-Polymorphismus in der Akzeptor-Spleißstelle identifiziert werden. Die Untersuchung von 400 Kontrollpersonen zeigte, dass beide Polymorphismen gekoppelt vorliegen. Das Spleißing des IVS9-3-Polymorphismus wurde mittels eines α-Globin-Fibronektin-EBD-Minigen-Systems analysiert. Ein fehlerhaftes Spleißing konnte ausgeschlossen werden. Die funktionelle Charakterisierung in Xenopus Oozyten im hH1-Hintergrund zeigte im Vergleich mit dem Wildtyp-Kanal eine um 25 % erhöhte Stromamplitude. Die Spannungsabhängigkeit der Aktivierung und der Inaktivierung, die Erholung von der Inaktivierung sowie die späten Natriumströme sind verändert. Zudem konnte in dieser Arbeit erstmals eine neue Form des Andersen-Syndroms funktionell charakterisiert werden. Das Andersen-Syndrom als eine Multisystemerkrankung ist charakterisiert durch periodische Paralyse, einen kardialen Phänotyp und verschiedene Dysmorphologien. Die Träger der Mutationen N318S und W322C im Kir2.1-Kaliumkanal zeigen ausschließlich einen kardialen Phänotyp. Die für das Andersen-Syndrom typischen Dysmorphologien und die periodische Paralyse sind in den beiden untersuchten Patienten nicht vorhanden. In dieser Arbeit ist es gelungen, den neuen klinischen Phänotyp mit den funktionellen Eigenschaften der mutierten Kanäle zu begründen. Die Mutationen sind die bisher am weitesten C-terminal beschriebenen Mutationen und zeigen eine ungewöhnliche Lokalisation im humanen Kir2.1-Kanal. Anders als alle bisher beschriebenen Andersen-Mutationen zeigen die mutierten Kanäle keinen absoluten Funktionsverlust und keinen dominant negativen Effekt auf Untereinheiten des Wildtyp-Kanals. Im Homomer ist die N318S-Kanalvariante nicht vom Wildtyp zu unterscheiden, die W322C-Kanalvariante zeigt einen 60 % Funktionsverlust. Der Funktionsverlust basiert bei dem W322C-Kanal auf einem defizienten Transport an die Plasmamembran. Dieses konnte mittels eines Chemielumineszenz-Versuches in Xenopus leavis Oozyten und Fluoreszenzmikroskopie in Säugerzellen nachgewiesen werden. Durch Immunozytochemie konnte gezeigt werden, dass der Kanal perinuklear in den späten Endosomen lokalisiert ist und wahrscheinlich degradiert wird. Bei beiden Patienten liegen die Mutationen heterozygot vor. Die funktionellen Eigenschaften der mutierten Kanäle sind unter diesen heterozygoten Bedingungen identisch. Beide Kanalvarianten zeigen zusammen mit den WT-Untereinheiten nur einen 20-25 % Funktionsverlust und damit keinen dominant negativen Effekt. Zudem zeigen sie keinen dominant negativen Effekt auf die Kanäle der Kir-Familie Kir2.2 und Kir2.3. Diese ungewöhnlichen elektrophysiologischen Eigenschaften der mutierten Kanäle könnten den ausschließlich kardialen Phänotyp der Patienten erklären. Eine Einordnung des beschriebenen Krankheitsbildes als Unterform des LQT7 wird angestrebt.

Die Neurone der medialen Amygdala spielen eine wichtige Rolle bei der Verarbeitung von unkonditionierter Angst und aggressivem Verhalten (Nelson and Trainor, 2007). Ihre Erregbarkeit wird höchstwahrscheinlich durch eine Hintergrundleitfähigkeit von K2P-Kanälen und ihrem molekularen Korrelat reguliert. Bisher sind 15 dieser K2P-Kanäle bekannt. In der hier vorliegenden Arbeit wurden die Expression und die physiologische Funktion des TASK-3, einem säure-sensitivem K2P-Kanal, in dieser Gehirnregion untersucht. Bisher konnte die TASK-3-Expression durch in situ-Hybridisierungen in erwachsenen Ratten gezeigt werden (Karschin et al., 2001). Entsprechend konnten wir einen, dem TASK-3 ähnlichen Strom, durch elektrophysiologische Ganzzellmessungen in akuten Hirnschnitten nachweisen. Um die Beteiligung des TASK-3 an diesem Gesamtstrom zu überprüfen, verwendeten wir den selektiven TASK-3 Antagonisten Ruthenium Rot oder veränderten den extrazellulären pH-Wert auf pH 6,4. Ruthenium-Rot- bzw. pH-sensitive Neurone zeigten ein negativeres Ruhemembranpotential (-56.31 mV ± 1.51; n = 17) als die Neurone, die nicht sensitive für Ruthenium-Rot oder pH-Veränderungen waren (-48.39 mV ± 1.55; n = 13; p = 0.001). Zusätzlich verstärkte Ruthenium Rot die Aktionspotenzialfrequenz und die Aktionspotenzialbreite bei Stromapplikation in den Zellen mit einem positiveren Ruhemembranpotenzial. Unsere in situ-Hybridisierungen in C57/Bl6 Mäusen zeigten eine starke Expression des TASK-3-Kanals in den Neuronen der medialen Amygdala. Darum wurde die Erregbarkeit von TASK-3 Wildtypneuronen mit denen von TASK-3-Knockoutneurone verglichen. Wir konnten einen säuresensitiven Kaliumstrom in den TASK-3 Wildtypzellen identifizieren, welche in den TASK-3 Knockoutzellen abwesend war. Überraschenderweise tauchten keine Unterschiede in der Aktionspotenzialform, dem Ruhemembranpotenzial oder des Rheobasestrom auf. Verhaltenstests zeigten, dass TASK-3 Wildtyp Mäuse auf die Präsentation von TMT, ein Duftstoff aus den Fäkalien von Füchsen, stärker freezen, als TASK-3 Knockoutmäuse. Dies zeigt, dass ein Fehlen des TASK-3 zu einer geringeren Furchtantwort beiträgt. Zusammengefasst zeigen diese Daten, dass TASK-3 bei der zellulären Erregbarkeit von Neuronen der medialen Amygdala von Ratten eine große Rolle spielt. Diese TASK-3-Kanäle sind in der medialen Amygdala von Mäusen ebenso exprimiert, wo sie zur Verarbeitung von Furchtverhalten beitragen., Neurones of the medial amygdala play an important role in processing unconditioned fear and aggressive behaviour (Nelson and Trainor, 2007). Their excitability is supposed to be regulated by a background conductance with two-pore domain potassium channels (K2P) as its molecular correlate. So far, there are 15 K2P channels known. In this thesis the expression and the physiological function of TASK-3, an acid-sensitive K2P-channel, in this brain region was investigated. Previously, there was a TASK-3 channel expression in the medial amygdala from adult rats demonstrated by in situ-hybridisation (Karschin et al., 2001). Correspondingly, we also detected a TASK-3-like current by electrophysiological whole-cell measurements in acute brain slices. To identify the contribution of TASK-3 to the standing outward current (IKso) upon depolarising pulses we used the selective TASK-3 antagonist ruthenium red (RR) or acidification to pH 6.4. RR- or pH-sensitive neurones showed a more hyperpolarised resting membrane potential (-56.31 mV ± 1.51; n = 17) compared to neurones lacking TASK-3-like currents (-48.39 mV ± 1.55; n = 13; p = 0.001). In addition, Ruthenium Red enhanced action potential frequency and action potential width during current injections in the more hyperpolarised cells. Our in situ-hybridizations in C57/Bl6 mice indicate that the same member of the K2P, acid sensitive TASK-3 channel, is also strongly expressed in neurones of the medial amygdala of mice. We therefore compared medial amygdaloid excitability in TASK-3 wildtype and TASK-3 knockout mice. We could detect an acid sensitive potassium current in the TASK-3 wildtype mice, which was absent in the TASK-3 knockout mice. Surprisingly, we could not detect significant differences in parameters defining the shape of an action potential, the resting membrane potential or the rheobase current. Behavioural tests analyzing the freezing behaviour showed that TASK-3 wildtype mice do react stronger to the frightful odour of TMT than TASK-3 knockout mice. Indicating, that TASK-3 knockout mice do have less fear response. Taken together, these data suggest that TASK-3 channels are very important in controlling cellular excitability of medial amygdaloid neurones in rats. These TASK-3 channels are also expressed in mice where they contribute to the fear behaviour of freezing.

Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit der Wirkung von Antidepressiva auf K2P-Kanäle. Sie stellen wie spannungsabhängige Ca2+, Na+ und K+-Kanäle als neuronale Ionenkanäle aufgrund ihrer Expressionsmuster und physiologischen Eigenschaften potentielle Zielproteine für Antidepressiva dar. Darum werden K2P-Kanäle in heterologen Expressionssystemen von klinisch verabreichten Antidepressiva inhibiert. Die K2P-Kanäle TREK-1, TASK-1 und THIK-1 zeigten sich in dieser Arbeit alle sensitiv auf das Antidepressivum Fluoxetin, welches die Kaliumströme der Kanäle unterschiedlich stark inhibierte. Hierbei lieferten die vorliegenden Untersuchungen den Nachweis, dass TREK-1 auf Fluoxetin am meisten, THIK-1 am wenigsten sensitiv reagiert. Der humane TREK-1 wird durch Fluoxetin in den Expressionssystemen Oozyten und HEK-Zellen zu fast 80% inhibiert, wobei bei der humanen Zelllinie nur ein Zehntel der vorher eingesetzten Antidepressivakonzentration für die gleiche Inhibition des Auswärtsstroms notwendig war. Die vorliegende Arbeit weist Inhibitionen des Kanals bei einer Fluoxetinkonzentration von 1 µM nach, was der Serumkonzentration von depressiven Patienten entspricht. Zudem wird TREK-1 durch die Antidepressiva Maprotilin, Mirtazapin, Citalopram, Doxepin und Venlafaxin inhibiert, wobei letzteres kaum eine Wirkung zeigt. Alle verwendeten Antidepressiva nutzen die gleichen Angriffspunkte am Kanalprotein, da es bei einer Koapplikation mit einem weiteren Antidepressivum oder Benzodiazepin zu keiner Inhibitionsverstärkung kommt. Die Interaktion zwischen Antidepressivum und Kanalprotein verläuft mit großer Wahrscheinlichkeit direkt und ohne „second-messenger-Wege“. Hierbei konnten die porenformende Region und der C-Terminus des Kanals als Interaktionspartner ausgeschlossen werden. Der Mechanismus der alternativen Translations-Initiaton generiert zwei unterschiedliche Proteinprodukte aus einem TREK-1 Transkript, eine lange Version des Proteins mit 426 Aminosäuren und zusätzlich eine kurze Version mit 374 Aminosäuren, welcher die ersten 52 N-terminalen Aminosäuren fehlen. Die Fluoxetin-Sensitivität von TREK-1 [N52] verringert sich um 70%. Dies verdeutlicht, dass die ersten 52 Aminosäuren essentiell zur TREK-1 Interaktion mit Antidepressiva beitragen., The study at hand is about the effect of antidepressants on K2P-channels. As neuronal ion-channels like voltage-gated Ca2+, Na+ and K+-channels, the K2P-channels constitute a potential target for antidepressants because of their tissue expression and physiological characteristics. Clinically prescribed antidepressants inhibit the K2P-channels in heterologous expression systems for that reason. In our experiments the K2P-channels TREK-1, TASK-1 and THIK-1 were sensitive to the antidepressant Fluoxetine, which inhibited the potassium current in different ways. The study provides evidence that TREK-1 reacts to Fluoxetine most sensitively whereas THIK-1 reacts least. The humane TREK-1 is inhibited up to 80% by Fluoxetine in expression systems oocytes and HEK-cells, in which only a tenth of the antidepressant concentration induced the same current inhibition. Our experiments showed already a channel block already at 1 µM Fluoxetine concentration, which is conform to the antidepressant serum concentration of depressive patients. Furthermore TREK-1 is inhibited by the antidepressants Maprotiline, Mirtazapine, Citalopram, Doxepin and Venlafaxine, whereas the last one showed least effects. The used antidepressants occupy the same targets at the channel protein, because a coapplication with a further antidepressant or benzodiazepine didn´t increase the maximum channel block. The interaction between antidepressant and channel protein is working directly without second messenger pathway. The pore forming region and the C-terminus of the channels could be excluded as interaction partner. Alternative translation initiation (ATI) generates two different protein products from a single transcript of TREK-1, a long version of the protein with 426 amino acids and in addition a short version with 374 amino acids, lacking the first 52 amino acids at the N-terminus. The sensitivity of TREK-1[N52] to fluoxetine declined by 70% indicating that the first 52 amino acids essentially contribute to the interaction of TREK-1 with the antidepressant.

Physiological interaction of ROMK with the ABCB1-protein (ABC-transporter B1) Hereditary salt-losing tubular disorders are rare but life-threatening genetic deseases. Early diagnosis and therapeutic intervention prevent patients fatal outcome. Prenatal diagnosis may reveal up to 60% of underlying genetic defects. While searching for new candidate genes, we identified ABCB1 in Yeast-Two-Hybrid studies as a ROMK interacting protein. The Renal Outer Medullary Potassium Channel (ROMK) is crucial for the process of salt absorption in the thick ascending limb of Henle’s loop (TAL). A functional defective ROMK channel results in severe, prenatal onset renal salt wasting accompagnied by maternal polyhydramnios, prematurity, and hypovolemia showing the phenotype of the antenatal Bartter-Syndrome. Therefore ROMK-interacting partners may be promising candidates, which could be responsible for genetically unexplained salt wasting tubular disorders. In this study the physiological interaction of ROMK and ABCB1 is characterised in Xenopus laevis oocytes as a heterologous expression system by using the Two-Electrode-Voltage-Clamp method (TEVC-method) and a luminometric assay for surface quantification studies. Results revealed a strong effect of ABCB1 on ROMK mediated whole-cell currents when coexpressed in Xenopus Oocytes. ABCB1 causes a massive inhibition (up to 100%) of the ROMK-dependent whole cell current. The inhibition depends upon injected ABCB1 m-RNA concentrations. ABCB1 coexpression did not inhibit currents mediated by Kir2.1, an inward rectifier potassium channel closely related to ROMK. These findings indicate the interaction to be specific for ROMK and ABCB1. Additionally surface-quantification-studies with a heamagglutinin tagged ROMK-Protein (ROMK-HA) were carried out. The studies showed a 60% reduction of surface signal, when ROMK-HA was coinjected with ABCB1 compared to ROMK-injection alone. We conclude that ABCB1 interferes with ROMK trafficking towards the cell membrane. However, an additional effect of ABCB1 on ROMK channel gating can not be excluded. Other ABC-transporter proteins have been shown to interact with ATP-dependent K+ inward-rectifier (Kir) channels. One well known example is the interaction of Kir6.2 with the sulfonyl urea receptor (SUR) in the pancreatic β-cell. Both, channel and ABCmolecule, form an heterooctamer which is the molecular basis of the ATP-sensitive β-cell potassium conductance. Coexsistence of at least two distinct apical K+ channels in the TAL, a 35 pS (lowconductance)channel and a 70 pS (intermediate-conductance) channel, has been shown. Functional characterisation of isolated expressed ROMK was compatible with the native 35 pS K+ channel. Whereas isolating the 70 pS K+ channel failed in the past. In addition to that ROMK-deficient mice neither express the 35 pS K+-channel nor the 70 pS K+-channel. These findings strongly suggest the 70 pS K+-channel to be composed out of ROMK and an accessory protein which may serve as a β-subunit. Our studies indicate a possible interaction between ROMK and ABCB. If the partners do or do notheteromerise to build a functional channel e.g. similar to the Kir6.2 and SUR interaction, remains unclear. Despite the attenuating effect of ABCB1 on ROMK generated whole cell currents it still might be possible that some functional heteromeric channels reach the plasma membrane. Additionaly certain limitatons should be considered when using Xenopus Oocytes, such as low incubation temperature or possible interaction between endogenously and heterologously expressed proteins. Regarding this, a possible influence of ABCB1 on renal salt-and water reabsorption requires further investigation. This includes studies in human cell lines or e.g. knockout mice studies. Although these observations were made independently and not in direct comparison, it should be noted that there is a phenotypical concordance between ROMK and ABCB knock out mice concerning several features of renal concentration capabilities and salt wasting. Both types of knockout mice show increased diuresis, lower renal plasma flow combined with lower glomerular filtration rate, as well as an augmented urinary excretion of sodium and calcium along with poor concentration capabilities. If ABCB1 should be proofen to function as a distinct modulating element in renal saltand water reabsorption, genomic DNA samples of patients could be screened to define genetically unexplained salt wasting tubular disorders. Beyond that our findings may possibly contribute to the understanding of the overall process of renal salt absorption., Zusammenfassung In der Entstehung von hereditären Bartter-ähnlichen Salzverlusttubulopathien spielt der einwärtsgleichrichtende ROMK-Kalium-Kanal mit Sitz im dicken aufsteigenden Teil der Henle-Schleife eine entscheidende Rolle. Insbesondere die enge funktionale Kopplung der verschiedenen Transporter in den Tubulusepithelzellen führt in diesem Nephronabschnitt bei Ausfall eines Elements zum Zusammenbruch des gesamten Resorptionsmechanismus. In der vorliegenden Arbeit wurde das ABCB-Protein als ein möglicher neuer Interaktionspartner des ROMK-Kanals identifiziert und die Interaktion der beiden Proteine funktionell in Xenopus laevis Oozyten untersucht. Bei elektrophysiologischen Experimenten mit Hilfe der Two-Electrode-Voltage-Clamp (TEVC) konnte hier erstmals eine funktionelle Interaktion von ROMK und ABCB beobachtet werden. In Anwesenheit des ABC-Transporters verringerten sich die ROMK-generierten Ganzzellströme in Abhängigkeit von der injizierten ABCB-mRNA Menge bis zu 100%. Zur Spezifizierung des gezeigten Effektes führten wir in einem zweiten Schritt eine Oberflächenquantifizierung von Hämagglutinin markiertem ROMK-Kanalprotein per Antikörperdetektion durch. Es zeigte sich, dass die Oberflächenexpression von ROMKHA in den Oozyten bei Koexpression mit ABCB um ca. 60% vermindert ist. Daraus lässt sich schließen, dass ABCB im heterologen Expressionsystem das Trafficking des ROMK-Kanals zur Zelloberfläche behindert. Ob dies auch in vivo der Fall ist, muss durch weitere Untersuchungen geklärt werden. Ebenso bleibt die Frage offen, ob ABCB als β-Untereinheit von ROMK fungiert und evtl. Teil des 70pS Kanals in der TAL ist. Es wäre durchaus denkbar, dass die beiden Proteine Kanalheteromultimere bilden und diese aus bisher unbekannten Gründen in den Oozyten nur sehr begrenzt die Zelloberfläche erreichen. Patch-Clamp-Untersuchungen zur Einzelkanalaktivität können hier näheren Aufschluss geben. Eine Interaktion in Form einer Heteromultimerisierung von Kir-Kanälen und ABCTransporten wie z.B. in der pankreatischen β-Zelle zwischen Kir6.2 und dem Sulfonyl-Harnstoff-Rezeptor ist durchaus nicht ungewöhnlich. Des Weiteren zeigen Daten aus verschiedenen Studien mit Knockout-Mäusen starke Homologien hinsichtlich des renalen Phänotyps zwischen ABCB-defizienten Mäusen und ROMK-defizienten Mäusen. Vor diesem Hintergrund liefert die vorliegende Arbeit weitere Indizien dafür, dass zwischen ROMK und ABCB auch in vivo eine enge biophysikalische Verknüpfung mit physiologischer Relevanz besteht.

BK Kanäle regulieren das Membranpotential glatter Muskelzellen und spielen bei der Regulation des Gefäßtonus eine wichtige Rolle. Die Gendeletion der β1-Untereinheit des BK Kanals könnte zu erhöhtem Blutdruck und der Entstehung einer chronischen Hypertonie von BK β1 knockout Mäusen führen. Ziel dieser Arbeit war es, den kardiovaskulären und renalen Phänotyp von BK β1 knockout und wildtyp Mäusen unterschiedlichen Alters zu untersuchen. Wir überprüften die Hypothese, dass die Deletion der β1-Untereinheit des BK Kanals in der Maus zu einem charakteristischen kardiovaskulären und oder renalen Phänotyp führt, der auf die fehlende Expression der BK β1-Untereinheit während der Embryonalentwicklung zurückzuführen ist BK channels regulate the membrane potential of arterial smooth muscle cells and play an important role in regulating vascular resistance. Disruption of the gene encoding the BK β1-subunit in mice may cause an elevation in blood pressure and lead to chronic hypertension. This study aimed to determine the cardiovascular and renal phenotype in mice of different age and BK β1 genotype. Our hypothesis was that the deletion of the BK β1-subunit in mice leads to a characteristic cardiovascular and or renal phenotype, caused by the missing expression of BK β1-subunits during embryonic development

Background—It has been proposed that activation of endothelial SK3 (KCa2.3) and IK1 (KCa3.1) K channels plays a role in the arteriolar dilation attributed to an endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF). However, our understanding of the precise function of SK3 and IK1 in the EDHF dilator response and in blood pressure control remains incomplete. To clarify the roles of SK3 and IK1 channels in the EDHF dilator response and their contribution to blood pressure control in vivo, we generated mice deficient for both channels. Methods and Results—Expression and function of endothelial SK3 and IK1 in IK1//SK3T/T mice was characterized by patch-clamp, membrane potential measurements, pressure myography, and intravital microscopy. Blood pressure was measured in conscious mice by telemetry. Combined IK1/SK3 deficiency in IK1//SK3T/T (doxycycline) mice abolished endothelial KCa currents and impaired acetylcholine-induced smooth muscle hyperpolarization and EDHFmediated dilation in conduit arteries and in resistance arterioles in vivo. IK1 deficiency had a severe impact on acetylcholine-induced EDHF-mediated vasodilation, whereas SK3 deficiency impaired NO-mediated dilation to acetylcholine and to shear stress stimulation. As a consequence, SK3/IK1-deficient mice exhibited an elevated arterial blood pressure, which was most prominent during physical activity. Overexpression of SK3 in IK1//SK3T/T mice partially restored EDHF- and nitric oxide–mediated vasodilation and lowered elevated blood pressure. The study demonstrates that endothelial SK3 and IK1 channels have distinct stimulus-dependent functions, are major players in the EDHF pathway, and significantly contribute to arterial blood pressure regulation. Endothelial KCa channels may represent novel therapeutic targets for the treatment of hypertension., Das Endothel nimmt Einfluss auf den Tonus der glatten Gefäßmuskulatur und ist somit wichtig für die adäquate Regulation der Gewebeperfusion und des systemischen Blutdrucks. Zur endothelvermittelten Vasodilatation tragen die diffusiblen Moleküle Stickstoffmonoxid (NO) und Prostazyklin (PGI2) sowie der sogenannte EDHF (endothelium-derived hyperpolarizing factor) bei. Obwohl dieser EDHF insbesondere in kleineren Arterien und Arteriolen eine wesentliche Rolle zu spielen scheint, konnte die molekulare Identität bzw. die physiologischen Mechanismen dieses Faktors noch nicht abschließend geklärt werden. Mittlerweile werden sowohl eine Reihe diffusibler Moleküle als auch elektrophysiologische Prozesse als Ursache für das EDHF-Phänomen diskutiert. Eine der Hypothesen schreibt der Hyperpolarisation durch die endothelialen Ca2+-aktivierten Kaliumkanäle KCa2.3 und KCa3.1 eine wesentliche Rolle bei der EDHF-vermittelten Vasodilatation zu. Zur Klärung der Funktion von KCa2.3 und KCa3.1 im Endothel sollte in dieser Arbeit erstmals ein Mausmodell generiert und untersucht werden, bei dem die Expression beider Ionenkanäle durch genetische Veränderungen beeinflusst wurde. Hierzu sollten zwei bestehende Mausmodelle, die KCa3.1-/- - Maus und die KCa2.3T/T - Maus, miteinander gekreuzt werden. Während es sich bei der KCa3.1-/- - Maus um einen konventionellen Knockout handelte, ließ sich bei dem KCa2.3T/T - Gen die Kanalexpression durch orale Gabe der Antibiotikums Doxyzyklin (Dox) unterdrücken. Ohne die Gabe von Doxyzyklin wurde der Kanal durch das veränderte Gen stark überexprimiert. Die Gene wurden gemäß der Mendelschen Regeln vererbt und der Genotyp der Tiere wurde durch Polymerasekettenreaktion (PCR) bestimmt. KCa3.1-/-/KCa2.3T/T-Tiere zeigten sowohl mit als auch ohne orale Gabe von Doxyzyklin gegenüber Wildtyptieren keine offensichtlichen Auffälligkeiten in Verhalten und Gesundheitszustand. Die elektrophysiologischen Eigenschaften der Endothelzellen dieser Tiere wurden durch die Patch-Clamp-Technik untersucht. Hierbei zeigte sich jeweils eine Halbierung des KCa-Stomes bei KCa3.1-/- - Tieren und KCa2.3T/T - Tieren (+Dox) gegenüber Wildtyptieren und eine nahezu vollständige Unterdrückung des KCa-Stromes bei KCa3.1-/-/KCa2.3T/T -Tieren (+ Dox). Die Sharp-Electrode-Untersuchung des Membranpotenzials der glatten Gefäßmuskulatur ergab, dass der Verlust der KCa-Kanäle im Endothel zu einer signifikanten Reduktion der Hyperpolarisation der Gefäßmuskelzellen auf einen intravasalen Azetylcholinstimulus führte, wobei der Verlust von KCa3.1 einen stärkeren Effekt hatte als der Verlust von KCa2.3. Somit konnte die funktionelle Bedeutung der endothelialen KCa-Kanäle für die Azetylcholin-induzierte Hyperpolarisation der glatten Gefäßmuskulatur und eine funktionelle Interaktion zwischen Endothelzelle und glatter Gefäßmuskulatur bei der EDHF-mediierten Vasodilatation bestätigt werden. Die Vasodilatation der Gefäße wurde durch Myographenexperimente an der Arteria carotis communis der Versuchstiere bestimmt. Der Knockout beider KCa-Kanäle führte zu einer signifikanten Reduktion der Vasodilatation auf intravasale Stimulation mit Azetylcholin. KCa3.1 schien die dominierende Rolle bei der Azetylcholin-induzierten EDHF-vermittelten Vasodilatation einzunehmen. Außerdem war die fluss- und shear-stress- induzierte Vasodilatation ebenfalls signifikant reduziert, wobei der Vergleich der KCa3.1-/-/KCa2.3T/T - Mäuse (+ Dox) mit KCa2.3T/T- Mäusen (+ Dox) für eine dominierende Rolle von KCa2.3 bei der fluss- und shear- stress- induzierten Vasodilatation sprach. Neben den beschriebenen gravierenden funktionellen Veränderungen auf der zellulären und vaskulären Ebene führten die genetischen Veränderungen auch zu einer signifikanten Erhöhung des arteriellen Blutdruckes der KCa3.1-/-/KCa2.3T/T - Mäuse (+Dox) gegenüber den Wildtypmäusen, was die Bedeutung von KCa3.1 und KCa2.3 und der von ihnen initiierten EDHF-vermittelten Vasodilatation für die systemische Blutdruckregulation zeigt. Insgesamt konnte durch die vorliegenden Ergebnisse dieser Studie bestätigt werden, dass die beiden untersuchten KCa-Kanäle bei der Entstehung der EDHF-Antwort eine wichtige Rolle spielen. Offensichtlich tragen KCa3.1 und KCa2.3 über unterschiedliche Mechanismen und Stimuli zur Vasodilatation bei: KCa2.3 scheint die wichtigere Rolle bei der flussinduzierten Vasodilatation zu spielen, während KCa3.1 vor allem für die Azetylcholin-induzierten Vasodilatation verantwortlich zu sein scheint. Die Bedeutung des EDHF als wesentlicher Faktor der Kreislaufregulation konnte durch die Blutdruckuntersuchungen und die Myographenexperimente bestätigt werden. Das bessere Verständnis der physiologischen Funktion des Endothels und des vaskulären Systems liefert den Schlüssel zum Verständnis pathophysiologischer Prozesse und eröffnet neue therapeutische Perspektiven. So ist es vorstellbar, dass spezifische Ionenkanalöffner für KCa3.1 und KCa2.3 zukünftig als Antihypertensiva und Vasodilatatoren eingesetzt werden.

Background Recently, members of the two-pore domain potassium channel family (K2P channels) could be shown to be involved in mechanisms contributing to neuronal damage after cerebral ischemia. K2P3.1-/- animals showed larger infarct volumes and a worse functional outcome following experimentally induced ischemic stroke. Here, we question the role of the closely related K2P channel K2P9.1. Methods We combine electrophysiological recordings in brain-slice preparations of wildtype and K2P9.1-/- mice with an in vivo model of cerebral ischemia (transient middle cerebral artery occlusion (tMCAO)) to depict a functional impact of K2P9.1 in stroke formation. Results Patch-clamp recordings reveal that currents mediated through K2P9.1 can be obtained in slice preparations of the dorsal lateral geniculate nucleus (dLGN) as a model of central nervous relay neurons. Current characteristics are indicative of K2P9.1 as they display an increase upon removal of extracellular divalent cations, an outward rectification and a reversal potential close to the potassium equilibrium potential. Lowering extracellular pH values from 7.35 to 6.0 showed comparable current reductions in neurons from wildtype and K2P9.1-/- mice (68.31 ± 9.80% and 69.92 ± 11.65%, respectively). These results could be translated in an in vivo model of cerebral ischemia where infarct volumes and functional outcomes showed a none significant tendency towards smaller infarct volumes in K2P9.1-/- animals compared to wildtype mice 24 hours after 60 min of tMCAO induction (60.50 ± 17.31 mm3 and 47.10 ± 19.26 mm3, respectively). Conclusions Together with findings from earlier studies on K2P2.1-/- and K2P3.1-/- mice, the results of the present study on K2P9.1-/- mice indicate a differential contribution of K2P channel subtypes to the diverse and complex in vivo effects in rodent models of cerebral ischemia.

In der vorliegenden Arbeit wurde die schnelle Desensitisierung von Agonisten-aktivierten GIRK-Kanälen analysiert. Simultane FRET- und Ganzzell-Ableitungen wurden durchgeführt, um zugrunde liegende molekulare Ereignisse innerhalb von Millisekunden zu untersuchen. Mittels elektrophysiologischer Messungen von fusionierten Kanaluntereinheiten konnte gezeigt werden, dass kinetische Eigenschaften der GIRK-Ströme sowohl von der Stöchiometrie der G-Protein-Untereinheiten als auch von der GIRK-Kanal Zusammensetzung abhängig sind. Diese Ergebnisse deuten auf zwei unterschiedliche, aber additive Mechanismen hin. Beide Mechanismen werden durch RGS4 vermittelt, unterscheiden sich aber in ihrem zeitlichen Verlauf. Die schnellere Komponente wird durch Strom-abhängige Veränderungen der elektrochemischen Triebkraft verursacht. Die langsamere Komponente dagegen spiegelt eine Desensitisierungskomponente wieder, die durch die GTPase-Aktivität des RGS Proteins vermittelt wird. In the present study, a FRET-based approach was used for studying acute desensitization of agonist-activated GIRK current. Simultaneous FRET-recordings and whole-cell measurements of current were performed to analyse underlying molecular events in a range of milliseconds. Whole-cell recordings using tagged channel subunits revealed that current kinetics depend on the stoichiometry of G protein subunits and on the composition of GIRK channels. We suggest that two distinct, but additive mechanisms contribute to acute desensitization of GIRK current. Both mechanisms depend on RGS4, but differ in their time course. The fast desensitizing component is caused by current-dependent changes in the electrochemical driving force for potassium ions. The slower desensitizing component, a \(\textit {bona fide}\) signalling mechanism, could be detected on protein level in the presence of RGS4 and corresponds to previous publications suggesting that acute desensitization is promoted by the GTPase activity of RGS4.

Die Periventrikuläre Leukomalazie ist eine Erkrankung, von der besonders Kinder mit einem Geburtsgewicht von unter 1.5 kg betroffen sind und spiegelt sich sowohl in physischen als auch psychischen Defiziten wider. Multifaktorielle Ursachen, u.a. Ischämie oder Entzündungen aufgrund der Unreife dieser Kinder, führen zu einer zellspezifischen Schädigung von Oligodendrocytenvorläuferzellen (OPCs). In der hier vorliegenden Arbeit konnte herausgearbeitet werden, dass an den Schadensmechanismen der Erkrankung nach einer Entzündung der einwärts-gleichrichtenden Kaliumkanal (KIR) beteiligt ist. Seine Blockade bedingt Änderungen des Membranpotentials, wodurch spannungsabhängige Calciumkanäle aktiviert werden können und ein cytotoxischer Calciumeinstrom erfolgt. Evidenzen für den so propagierten Mechanismus liefern die Ergebnisse eines beobachteten akuten Anstiegs intrazellulärer Calciums nach Imitation einer Entzündung, sowie der Schutz der OPCs durch den Calciumkanalblocker Magnesium.

Die Rolle von Pannexin1 und Pannexin2 im zentralen Nervensystem wurde auf molekularer und funktioneller Ebene untersucht. Es wurde gezeigt, dass eine akzessorische Kaliumkanaluntereinheit, Kv\(\beta\)3, mit Panx1 interagiert und die Wirkung von Pharmaka durch diese Interaktion moduliert wird. Diese beiden Proteine sind in retinalen Ganglienzellen koexprimiert. Des Weiteren wurde die Bedeutung der Cysteine von Pannexin1 für dessen Funktion als Ionenkanal und der Einfluss von Reduktionsmitteln auf die Kanaleigenschaften untersucht. Mutationen einzelner Cysteine führen zu einem Hemikanal mit erhöhter oder erniedrigter Aktivität. Es wurde ein Pannexin2 spezifischer Antikörper hergestellt, mit Hilfe dessen die Expression im zentralen Nervensystem sowie die subzelluläre Lokalisation des Proteins analysiert wurden. Pannexin2 ist in Neuronen in weiten Bereichen des Gehirns vorzufinden. Es liegt vor allem intrazellulär vor, aber geringe Mengen konnten auch in der Plasmamembran nachgewiesen werden.

In adulten Herzmuskelzellen konvergieren sowohl der purinerge A\(_{1}\)-Adenosin-Rezeptor als auch der muskarinische M\(_{2}\)-Azetylcholin-Rezeptor über G-Proteine der Klasse G\(_{i/o}\) auf G-Protein gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (GIRK). Unter physiologischen Bedingungen ist die Amplitude des maximal aktivierbaren A\(_{1}\)-vermittelten Stroms I\(_{K(Ado)}\) deutlich kleiner als die des M\(_{2}\)-vermittelten Stroms I\(_{K(ACh)}\). Nach adenoviral vermittelter Überexpression des A\(_{1}\)-Rezeptors kommt es zu einem vergrößerten Strom I\(_{K(Ado)}\), bei gleichzeitiger Reduktion des Stroms I\(_{K(ACh)}\). Dieser Zusammenhang wird als negative Signalinterferenz bezeichnet. Die Aufklärung der Ursache der negativen Signalinterferenz war das Ziel dieser Arbeit. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die negative Signalinterferenz von der dauerhaften Aktivierung des G\(_{i/o}\) gekoppelten Signalwegs abhängig ist. Dies geschieht infolge von extrazellulär akkumuliertem Adenosin. Als Substrate für Adenosin konnten AMP und cAMP identifiziert werden.

Einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (Kir), aktuell in die 7 Unterfamilien Kir1-Kir7 eingeteilt, sind an der Regulation einer Vielzahl von Körperfunktionen, beispielsweise Herzfrequenz, Erregbarkeit von Nervenzellen, Tonus von Gefäßmuskelzellen, Hormonsekretion oder Aktivierung von Immunzellen, beteiligt. Für die Kontrolle dieser Funktionen ist es von entscheidender Bedeutung, dass die Leitfähigkeit dieser Kanäle beeinflusst werden kann. Die Kir3-Unterfamilie (früher GIRK für G-protein-activated-K+-channels) wird beispielsweise obligat durch die direkte Bindung der beta/gamma-Untereinheit des trimeren Gi/0-Proteins aktiviert (Karschin, 1999). Es gibt Hinweise in der Literatur, dass auch die stark einwärts gleichrichtenden Kanäle der Kir2-Familie durch G-Proteine der Gq-Familie reguliert sein können. Dabei widersprechen sich insbesondere zwei Untersuchungen zur Spezifität der Interaktion (Jones, 1996; Chuang et al., 1997). Ebenso ist der intrazelluläre Signalweg bislang nicht hinreichend geklärt. Um dies genauer zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit die Kir-Kanäle Kir2.1-Kir2.4 jeweils mit 5 verschiedenen Gq-gekoppelten Rezeptoren in Xenopus-Oozyten koexprimiert und mit der Technik der „Zwei-Elektroden-Spannungsklemme“ der Strom über die Kir-Kanäle vor und nach Rezeptoraktivierung mit dem jeweils physiologischen Rezeptoragonisten gemessen. Es zeigte sich, dass ausschließlich Kir2.3 nach Aktivierung des M1-Acetylcholinrezeptors inhibiert wird. Eine Sequenzanalyse zeigte in der Extrazellulärregion von Kir2.3 eine zu den anderen Kir2-Kanälen abweichende Aminosäuresequenz, welche durch Mutation aber als potentielle Bindestelle zur Vermittlung des inhibitorischen Effektes ausgeschlossen werden konnte. Nachdem bereits gezeigt werden konnte, dass die Koexpression von Kir2.3 und M1-Acetylcholinrezeptor in bestimmten Gehirnregionen der Kontrolle neuronaler Erregbarkeit dient (Shen et al., 2007), ist es wahrscheinlich, dass derselbe Mechanismus auch in ventrikulären Kardiomyozyten existiert und dort als Schutzmechanismus vor vagaler Überstimulation fungiert., Inwardly rectifying K+ (Kir) channels, which can be classified into the subfamilies Kir1-Kir7, participate in the regulation of many functions of the human organism, e.g. heart rate, excitability of neurons or hormone release. In order to control these functions it is important that the conductance of these channels can be modulated. Channels of the Kir2 subfamily are regulated by Gi/o-coupled as well as Gq/11-coupled receptors. So far, it is still under debate whether these receptors selectively target to different members of the Kir2 subfamily. In order to investigate this issue rat Kir2.1-2.4 and Gq-coupled seven-helix receptors were coexpressed in Xenopus laevis oocytes and two electrode voltage-clamp measurements were performed recording the inwardly rectifying potassium currents before and after receptor activation. We showed that Kir2.3 is selectively inhibited by activation of the acetylcholine M1 receptor, whereas Kir2.1, 2.2 and 2.4 are not affected by activation of the M1 receptor. All other Gq-coupled receptors tested have no influence on Kir2 currents. Furthermore, mutation of a putative binding site within the extracellular loop between transmembrane region M1 and the pore region of rat Kir2.3 has no influence on M1 receptor induced inhibition. As it has been demonstrated that the cholinergic modulation of Kir2.3 channels selectively elevates dendritic excitability in certain brain areas (Shen et al., 2007), we postulate that the same mechanism also exists in cardiomyocytes in order to protect the heart function against an overwhelming parasympathetic stimulation.

In adulten Herzmuskelzellen konvergieren sowohl der purinerge A1-Adenosin-Rezeptor als auch der muskarinische M2 - Azetylcholin-Rezeptor über G-Proteine der Klasse Gi/o auf G-Protein gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (GIRK). Unter physiologischen Bedingungen ist die Amplitude des maximal aktivierbaren A1-vermittelten Stroms IK(Ado) deutlich kleiner als die des M2-vermittelten Stroms IK(ACh). Nach adenoviral vermittelter Überexpression des A1- Rezeptors kommt es zu einem vergrößerten Strom IK(Ado), bei gleichzeitiger Reduktion des Stroms IK(ACh). Dieser Zusammenhang wird als negative Signalinterferenz bezeichnet. Die Aufklärung der Ursache der negativen Signalinterferenz war das Ziel dieser Arbeit. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die negative Signalinterferenz von der dauerhaften Aktivierung des Gi/o gekoppelten Signalwegs abhängig ist. Dies geschieht infolge von extrazellulär akkumuliertem Adenosin. Als Substrate für Adenosin konnten AMP und cAMP identifiziert werden.

Biophysical influence of Kv6.1-, Kv6.3- and Kv6.4-proteins on the voltage dependant potassium channel Kv2.1., Zusammenfassung Spannungsabhängige Kaliumkanäle (Kv) nehmen Schlüsselfunktionen bei wichtigen physiologischen Prozessen in unterschiedlichsten Zelltypen ein. Zu diesen Prozessen gehören unter anderem die Bildung des Membranpotentials, die Erregbarkeit von Zellen oder der Ablauf des Aktionspotentials. Ein funktionsfähiger Kaliumkanal setzt sich dabei immer aus vier Untereinheiten zusammen und obwohl zahlreiche dieser Untereinheiten bekannt sind, besitzen nur relativ wenige von ihnen die Fähigkeit selbständig ein Tetramer zu formen. Bausteine dieser Art werden als α-Untereinheiten bezeichnet. Im Gegensatz hierzu können sich die sogenannten γ-Untereinheiten nur in Kombination mit α-Untereinheiten am Kanalaufbau beteiligen. Es wird angenommen, dass diese Heteromultimerisierung aus α- und γ-Proteinen das elektrophysiologische Verhalten des Kanals an die unterschiedlichen Anforderungen in den verschiedenen Zellen anpasst. Der genaue Ablauf der heteromeren Kanalbildung und die modifizierende Potenz vieler γ-Proteine sind bislang jedoch noch unbekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden daher die Auswirkungen von drei dieser modifizierenden γ-Proteine (Kv6.1, Kv6.3 und Kv6.4) auf die grundlegenden biophysikalischen Eigenschaften des humanen spannungsabhängigen Kaliumkanals hKv2.1 mit elektrophysiologischen Methoden näher untersucht. Das Aktivierungs-, Inaktivierungs- und Deaktivierungsverhalten wurde nach transienter Transfektion der cDNA von Kv2.1, Kv6.1, Kv6.3 und Kv6.4 in CHO-K1-Zellen mit Hilfe der patch-clamp-Technik analysiert. Da die γ-Proteine nicht in der Lage sind selbständig funktionsfähige Ionenkanäle zu bilden, zeigte sich bei Monotransfektion erwartungsgemäß keine eigenständige elektrische Aktivität. Bei Kotransfektion mit hKv2.1-Genen beteiligten sich die Kv6-Untereinheiten jedoch am Kanalaufbau und nahmen Einfluss auf das biophysikalische Verhalten des Ionenkanals. So wiesen die heteromeren Kanalkonstrukte von hKv2.1 mit Kv6.1, Kv6.3 oder Kv6.4 jeweils eigenständige elektrophysiologische Charakteristika auf, die sich von den Eigenschaften des homotetrameren hKv2.1-Kanals teils deutlich unterschieden. Zusammenfassend ergab sich für die hier untersuchten Mitglieder der Kv6-Familie folgendes Bild: 1.) Sie können keine homotetrameren Ionenkanäle bilden. 2.) Zusammen mit hKv2.1 entstehen funktionsfähige heteromere Kanalproteine. 3.) Die elektrophysiologischen Eigenschaften wie Aktivierung, Deaktivierung und Inaktivierung der Heteromere unterscheiden sich deutlich von den hKv2.1-Charakteristika. 4.) Die Kanalvielfalt und –funktionsweise wird durch heteromultimeren Aufbau beträchtlich erweitert. 5.) Zellen können sich mit diesen modifizierten Kanalkomplexen an die unterschiedlichen Anforderungen und Aufgaben in den verschiedenen Organen anpassen. 6.) Die Aufgaben der Kv6-Familie entsprechen daher einer regulatorischen und modifizierenden Komponente. Desweiteren wurden neue Erkenntnisse über den Vorgang der Multimerisierung gewonnen. Erkennung und Assemblierung der einzelnen Untereinheiten eines spannungsabhängigen Kaliumkanals zum arbeitenden Ionenkanal werden spezifisch über die sogenannte T1-Domäne mit der hochkonservierten Aminosäuresequenz HX5CX20CC vermittelt. Experimente mit dem Kanal hKv2.1H105V, bei dem die Aminosäure Histidin an der Position 105 durch Valin mittels gezielter Mutagenese ersetzt wurde, lieferten folgendes Ergebnis: Obwohl eine Tetramerisierung zum arbeitenden Kanal trotz Punktmutation möglich war, konnten sich Kv6.4-Untereinheiten nicht mehr daran beteiligen. Die Stromkinetik des hKv2.1H105V wurde anders als beim Wildtyp hKv2.1 durch Kotransfektion mit dem Kv6.4-Protein nicht verändert. Diese Ergebnisse zeigen, dass die Aminosäure Histidin im HX5CX20CC-Motiv für die Bildung von Heteromultimeren aus α- und γ-Proteinen eine essentielle Rolle spielt, während die Bildung von homotetrameren Kanälen, die nur aus α-Untereinheiten zusammengesetzt sind weiterhin möglich ist und unabhängig von Histidin verläuft. Diese Erkenntnisse liefern einen wichtigen Beitrag zum besseren Verständnis sowohl des Vorgangs als auch der Bedeutung der Multimerisierung bei spannungsabhängigen Kaliumkanälen.