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Die vorliegende hypothesengenerierende Pilotstudie beschäftigt sich mit den Änderungen der Formation der Hautbarriere im Zuge der Hautalterung. Für die Ausbildung und Aufrechterhaltung einer intakten Hautbarriere ist ein korrekter Ablauf der epidermalen Keratinozytendifferenzierung und ein Zusammenspiel zahlreicher Gene essentiell. Inwiefern sich der Alterungsprozess auf die Genexpression auswirkt, ist in vielen Fällen bis jetzt noch unzureichend erforscht. Ziel dieser Arbeit war es zu analysieren, ob sich die Genexpression von Filaggrin, Loricrin und Keratin 10 im Zuge des Alterungsprozesses verändert. Weiters wurde untersucht, ob sich Unterschiede in der mRNA Expression, welche mittels Einzelzell-Sequenzierung identifiziert wurden, auch auf Proteinebene, mittels Western-Blot Analysen und immunhistochemischen Färbungen, bestätigen lassen. In der Einzelzell-Sequenzierung des FLG-Gens zeigte sich im Vergleich zur Kohorte „Jung“ ein gesteigertes Vorkommen in der Kohorte „Alt“. Dieses Ergebnis konnte sowohl mittels Immunfluoreszenz als auch mittels Western Blot auf Proteinebene bestätigt werden. Die Untersuchung des LOR-Gens mittels Einzelzell-Sequenzierung konnte ein leicht erhöhtes Vorkommen im Zuge des Alterungsprozesses identifizieren. In der Immunfärbung präsentierte sich demgegenüber ein reduziertes Auftreten von Loricrin in der Kohorte „Alt“. Die Western Blot Analyse war aufgrund der mangelnden Intensitätsunterschiede nur schwer interpretierbar. Bei KRT10 wurde ein vermindertes Genexpressionslevel in den 52-Wochen alten Mäusen, im Vergleich zu den 8-Wochen jungen Mäusen, in der Einzelzell-Sequenzierung festgestellt. Diese Annahme ließ sich mit den angewandten Proteinnachweismethoden bestätigen, wobei sich die Interpretation des Western Blots als herausfordern darstellte. Die Ergebnisse legen weitgehend nahe, dass von den Resultaten der RNA-Einzelzell-Sequenzierung, unter Anbetracht der Intensität der Genexpressionsunterschiede, auf den Umfang des Proteinvorkommens im Maushautgewebe geschlossen werden kann. This hypothesis-generating pilot study deals with changes in the formation of the skin barrier in the course of skin aging. The process of epidermal keratinocyte differentiation and the interaction of numerous genes are essential for the formation and maintenance of an intact skin barrier. To what extent the aging process affects gene expression has been insufficiently researched yet. The aim of this work is to investigate whether the genes filaggrin, loricrin and keratin 10 change with regard to their specific expression patterns during the aging process. Furthermore, we investigate whether there are differences between the gene level, indicated by the method of RNA single-cell sequencing, and the detection of protein level by Western blot analyses and immunohistochemical staining. In the single-cell sequencing of the FLG gene, compared to the “young” cohort, there was an increased occurrence in the “old” cohort. This result was confirmed by immunofluorescence and Western blot at the protein level. Examination of the LOR gene using single-cell sequencing was able to identify a slightly increased occurrence in the course of the aging process. In contrast, the immune staining showed a reduced incidence of loricrin in the “old” cohort. The Western Blot analysis was difficult to interpret due to the lack of intensity differences. In the case of KRT10, a reduced level of gene expression was observed in the 52-week-old mice compared to the 8-week-old mice in single-cell sequencing. This assumption was confirmed by the applied protein detection methods, whereby the interpretation of the Western Blot proved to be challenging. The results strongly suggest that the results of single-cell RNA sequencing, considering the intensity of the differences in gene expression, can be used to infer the extent of protein presence in mouse tissue.

Pemphigus vulgaris and pemphigus foliaceus are rare bullous autoimmune diseases of the skin and mucous membranes mediated by autoreactive antibodies directed against the desmosomal cadherins desmoglein (Dsg)1 and Dsg3. Binding of these antibodies leads to acantholysis, the loss of cell-cell adhesion between keratinocytes and thus manifests in blisters and erosions of the skin and mucosa in patients suffering from pemphigus. Previous data indicate that T helper type 2 (Th2) cells and related cytokines play a major role in disease initiation and manifestation, yet the contribution of other T cell subsets remains unclear and evidence is emerging for the involvement of Th17 cell subsets and associated cytokines in pemphigus pathogenesis. To address this issue, the cytokine signature in lesional skin of pemphigus patients was determined by whole transcriptome sequencing and quantitative real-time PCR (qPCR). Further, the distribution of Th and follicular T helper (Tfh) cells in peripheral blood from pemphigus patients with different disease activity stages was analyzed by flow cytometry. Transcriptome analysis identified a broad spectrum of cytokines and chemokines, including interleukins (IL), as well as other immune mediators differentially expressed in lesional pemphigus skin compared to healthy skin samples. Most importantly, an IL-17A-dominated immune signature and an upregulation of the IL-17A signaling pathway were revealed in the skin of pemphigus patients. The dominance of IL-17A and associated cytokines was further validated by qPCR. Moreover, flow cytometry analyses demonstrated elevated levels of IL 17A-producing Th17, Th17.1, Tfh17 and Tfh17.1 cells in the blood of patients with active pemphigus disease. Of note, levels of Th17, Tfh17 and Tfh17.1 cell subsets positively correlated with the levels of circulating Dsg3 reactive memory B cells in active patients. Follow-up experiments by the collaborating partners in Marburg identified Tfh17 cells as the primary inducers of Dsg-specific antibody production by B cells. These findings demonstrate that Tfh17 cells are substantially implicated in pemphigus pathogenesis and offer novel therapeutic approaches, for instance with small molecules targeting cytokine signal transduction of cells involved in disease initiation and manifestation. In the next step, such small compounds aiming to block Janus kinase (JAK)/signal transducer and activator of transcription (STAT)-mediated signal transduction were investigated for their ability to interfere with various signaling cascades initiated by cytokines in CD4+ Th cells. In particular, compounds targeting JAK3 were assessed and compared with the clinically established pan-JAK inhibitor Tofacitinib. In this setting, four of the five inhibitors tested were able to selectively block JAK3-mediated signal transduction without affecting other JAKs. Furthermore, the compounds abrogated the signaling cascade activated by IL-21, a cytokine crucial for Tfh cell differentiation and autoantibody formation. Immunohistochemical staining revealed STAT1 and STAT3 activation in epidermal keratinocytes of perilesional pemphigus skin. Blockade of JAK1 as well as JAK3 in primary human epidermal cells resulted in a protective effect towards cell sheet fragmentation of keratinocyte monolayers in dispase-based dissociation assays. Taken together, these findings indicate a potentially beneficial effect of JAK inhibition in patients suffering from pemphigus and provide the basis for further investigations regarding the therapeutic application of JAK inhibitors in clinical practice.

Pemphigus vulgaris (PV) ist eine blasenbildende Autoimmunerkrankung, die durch Autoantikörper gegen Dsg1 und Dsg3 gekennzeichnet ist. Der genaue Pathomechanismus, der zu einem PV-IgG vermittelten Verlust der interzellulären Adhäsion führt, ist noch unklar. Die Dsg3-Depletion und die Modulation von Signalkaskaden stellen hierbei kennzeichnende Merkmale der Erkrankung dar. Mit den Ergebnissen der vorliegenden Arbeit ist eine bessere Einordnung der Dsg3-Depletion in den pathogenetischen Kontext von Pemphigus vulgaris möglich. Die Experimente zeigen, dass die Dsg3-Depletion von Differenzierungsprozessen abhängig ist und mit einem Adhäsionsverlust einhergehen kann. Die Hemmung der PKC verhindert hierbei sowohl die PV-IgG vermittelten Effekte in der Zellkultur als auch die Blasenbildung im Mausmodell in vivo und in humaner Haut ex vivo. Des Weiteren liefert die Arbeit neue Erkenntnisse, welche für die suprabasale Lokalisation der Blasenbildung bedeutsam sein könnten., Pemphigus vulgaris (PV) is a blistering autoimmune disease characterised by antibodies directed against Dsg1 (desmoglein 1) and Dsg3 (desmoglein 3). The exact pathomechanism leading to PV-IgG induced loss of intercellular adhesion is still unclear. The Dsg3-depletion and the modulation of signaling pathways are characteristics of the disease. With the results of this study, a better classification of Dsg3-depletion in the pathogenetic context of pemphigus vulgaris becomes possible. The experiments show that the Dsg3-depletion is dependent on differentiation processes and can be accompanied by a loss of adhesion. Inhibition of PKC in this case prevents PV-IgG-mediated effects in the cell culture as well as blistering in murine skin in vivo and in human skin ex vivo. Furthermore, this work provides new insights that could be significant for the suprabasal localisation of blistering.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der Detektion und Analyse des Vorkommens von Beta-microseminoprotein (MSMB) in der menschlichen Epidermis, sowie seinem Verhalten in der chronisch entzündlichen Hauterkrankung Psoriasis. In Bezug auf die Relevanz und den Einfluss von MSMB in der Haut sind bisher keine Publikationen vorzufinden. Deshalb wird mit dieser Arbeit ein kleiner Einblick verschaffen, wie sich MSMB in der menschlichen Epidermis und in Psoriasis Läsionen verhält. Die Daten wurden mittels Single-cell RNA Sequencing generiert und durch weiterführende qualitative und semi-quantitative Methoden die Validität, der durch single cell sequencing erhaltenen Daten überprüft. Dabei wurde auf die Unterschiede in der Expression von MSMB in den verschiedenen Differenzierungsstadien der Keratinozyten ein Hauptaugenmerk gelegt, indem in einen in - vitro- Modell jeweils Proben an verschieden Tagen der Differenzierung eines Monolayers herangezogen worden. Die generierten Daten legen nahe, dass MSMB eine Rolle in der terminalen Differenzierung bzw. in terminal differenzierten Keratinozyten spielt, da es eben in diesen in jedem der durchgeführten Experimente zu finden war. Weiters konnte festgestellt werden, dass MSMB in Psoriasis-Läsionen weniger stark exprimiert wird und im Vergleich zur gesunden Haut etwas hinunterreguliert ist. Alles in allem induzieren die gewonnenen Daten einen Einfluss von MSMB in die Formation der epidermalen Barriere, durch das Vorhandensein vorhanden sein in den terminal differenzierten Keratinozyten. This thesis deals with the detection and analysis of the occurrence of beta-microseminoprotein (MSMB) in the human epidermis and its behaviour in the chronic inflammatory skin disease psoriasis. Concerning the relevance and the influence of MSMB in the skin, there are no publications to date. Therefore, this work will provide a little insight into how MSMB behaves in the human epidermis and psoriasis lesions. The data were generated through single-cell RNA sequencing, and the validity of the data obtained by single-cell sequencing was checked by other qualitative and semi-quantitative methods. The main focus was on the differences in the expression of MSMB in the various stages of differentiation of the keratinocytes by using samples of the differentiation from a monolayer in an in-vitro model gained at different points in time. The generated data suggests that MSMB plays a role in the terminal differentiation or terminally differentiated keratinocytes since it was found in these in each of the experiments carried out. Furthermore, it was found that MSMB is expressed less strongly in psoriasis lesions and is somewhat downregulated compared to healthy skin. Overall, the data obtained induce an influence of MSMB in forming the epidermal barrier, through which it is present in the terminally differentiated keratinocytes.

Die vorliegende Dissertation hatte zum Ziel, die Wirkung von Flagellin und Lithium Chlorid auf die Expression von Interleukin-18 mRNA sowie die Sekretion von Interleukin-18 Protein in primären humanen Keratinozyten mittels qPCR bzw. ELISA zu untersuchen. In mehreren Versuchsreihen wurde eine zeitabhängige Wirkung von Flagellin und Lithium Chlorid auf die Interleukin-18 Produktion in einem Zeitraum von 4 bis 96 Stunden untersucht und ein signifikanter Abfall nach 4 Stunden sowie ein signifikanter Anstieg ab 24 Stunden bei Inkubation mit Lithium Chlorid festgestellt. Bei Flagellin zeigte sich kein statistisch signifikanter Effekt. Eine Konzentrationsreihe von 1 bis 40 mmol Lithium Chlorid konnte eine Wirkung auf die Interleukin-18 mRNA Expression, nicht aber auf die Proteinsekretion zeigen. Hohe Konzentrationen von Lithium Chlorid und lange Inkubationszeiten (96 Stunden) waren jedoch Auslöser zytotoxischer Reaktionen. Insgesamt konnte allerdings keine signifikante Wirkung von Lithium Chlorid auf Expression sowie Sekretion von Interleukin-18 in humanen Keratinozyten nachgewiesen werden. Damit erscheint eine pathophysiologisch relevante Induktion von Interleukin-18 in humanen Keratinozyten isoliert durch Lithium Chlorid oder Flagellin als Erklärung für eine Exazerbation oder Manifestation der Psoriasis unwahrscheinlich.

Die vorliegende Arbeit dient der Untersuchung zur immunmodulierenden Wirkung von Milchsaft aus Euphorbia mauritanica L. auf humane Hautzellen. Milchsäfte der Pflanzenfamilie Euphorbiaceae gehören zu den am stärksten entzündungsauslösenden Pflanzensäften im gesamten Pflanzenreich. Entzündliche Haut- und Augenreaktionen nach dem Kontakt mit Milchsäften einiger Euphorbiaceae, wie z.B. dem von Hippomane mancinella L., sind ein massives Problem für Menschen, die in unmittelbarer Nähe zu diesen Pflanzen leben und mit ihnen in Kontakt kommen. Neben Proteinen wie Proteasen, Lysozym und Chitinasen beinhalten die Milchsäfte der Euphorbiaceae auch sekundäre Pflanzeninhaltsstoffe wie Diterpene, Zucker, Alkaloide oder Polyterpene. Da die Ursachen der Immunreaktionen auf die Milchsäfte bisher nicht geklärt ist, sollte in der vorliegenden Arbeit der Milchsaft von Euphorbia mauritanica L. (Euphorbiaceae) auf seine immunmodulierende Wirkung an humanen Hautzellen untersucht werden. Neben den G-Protein-gekoppelten Protease-aktivierten Rezeptor 2 (PAR2) ist auch die Aktivierung der PKC durch Diterpene geeignet, Entzündungsreaktionen auslösen zu können. Mögliche synergistische Einflüsse sollten dahingehend untersucht werden. Dazu wurde zunächst ein humanes Hautmodell entwickelt, um Informationen über die immunmodulierende Wirkung des verdünnten Milchsaftes von E. mauritanica zu erhalten. Desweiteren wurde an HaCaT-Keratinozyten und primären humanen dermalen Fibroblasten untersucht, ob es einen gemeinsamen Effekt in der Entzündungsmediation zwischen der in E. mauritanica stark exprimierten Protease Mauritanicain und dem Diterpen Phorbol-12-myristat-13-acetat gibt. Dazu wurde die relative Freisetzung von IL-8 Parameter zur Entzündungsauslösung gemessen und mit dem positiven PAR2 Agonisten 2-Furoyl-LIGRLO-Amid verglichen. In der vorliegenden Dissertation konnte zusätzlich die Aminosäuresequenz von der Subtilisin-like Protease Mauritanicain aufgeklärt werden.

Die durch den demografischen Wandel ständig ansteigende Inzidenz an Patienten mit chronischen Wunden stellt ein großes gesellschaftliches und gesundheitsökonomisches Problem dar. Ziel dieser Arbeit ist es, die PRF-Applikation mit autolog kultivierten Keratinozyten zu kombinieren, um so eine verbesserte Wundheilung zu erreichen und eine neue Behandlungsmöglichkeit bei Patienten mit chronischen Wunden zu schaffen. Um eine breite klinische Anwendung zu ermöglichen, steht die Optimierung und Beschleunigung des Isolierungsverfahrens von Keratinozyten im Mittelpunkt dieser Dissertation. Dazu wurden versuchsweise in Lokalanästhesie kleine Hautproben vom Oberschenkel der Patienten entnommen und im Labor kultiviert. Durch Erfahrungen anderer Protokolle sowie eigene Ergebnisse wurde ein neues Isolierungsprotokoll entwickelt. Die korrekte Differenzierung der Zellen konnte molekularbiologisch bestätigt werden. Nach histologischer Auswertung zeigten sich eine gleichmäßige Verteilung und Vitalität der im Co-Delivery-Verfahren aufgesprühten Zellen. In einem letzten Schritt erfolgten zwei individuelle Heilversuche am Patienten. Die Ergebnisse zeigen die erfolgreiche Optimierung und Verbesserung der Keratinozyten-Isolierung. Die Fragestellungen bzw. Ziele bezüglich der Verkleinerung der am Patienten zu entnehmenden Hautprobe, des verbesserten sowie regelhaften Anwachsens der isolierten Keratinozyten und vor allem der Verkürzung der Kultivierungsdauer in Hinblick auf eine spätere klinische Anwendung bei Patienten mit chronischen Wunden konnten positiv beantwortet werden. Der individuelle Heilversuch am Patienten konnte eine deutliche Verkleinerung der Wundfläche auf Niveau der intakten Haut zeigen. Zudem traten keine Infektionen auf, sodass die Applikation von Keratinozyten im Co-Delivery-Verfahren mit PRF eine vielversprechende alternative Therapieoption bei chronischen Wunden darstellt

Um dem wachsenden Bedarf an geeigneten Methoden der Wundbehandlung von Vollhautdefekten nachzukommen und unabhängiger von dem Verfahren der Spalthauttransplantation zu werden, haben sich in den letzten Jahrzehnten innovative Therapieansätze im Bereich des „Tissue Engineerings“ entwickelt. Dazu gehören unter anderem kollagene Biomaterialien, die als so genannte composite grafts mit dermalen und epidermalen Zellen besiedelt werden, um anschließend als Vollhautersatz zur Hautdefektdeckung genutzt zu werden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine neu entwickelte Kollagen-I-Matrix (CCC, Collagen Cell Carrier) im Tiermodell auf die Eignung als Trägermaterial humaner Keratinozyten und Dermisfibroblasten untersucht. Dazu wurde die Kollagenmatrix mit humanen Keratinozyten und Dermisfibroblasten in Suspension mit Matrigel® als so genanntes composite graft besiedelt. Diese composite grafts wurden in „upside-down“ Technik in epifasziale Implantationskammern auf dorsale Vollhautdefekte athymischer Ratten eingebracht. Jedes Versuchstier wurde mit drei Implantationskammern versehen. Die Fragestellung dieser Arbeit wurde im Rahmen eines umfangreicheren Projektes realisiert. Die Verteilung verschiedener Versuchsansätze erfolgte randomisiert auf die Transplantationskammern von insgesamt 30 Tieren. Von 30 Ratten innerhalb des Gesamtprojektes entfielen rechnerisch 8 Ratten als Träger der in dieser Studie untersuchten Präparate. Jeweils nach 14 Tagen (6 Proben, 2 Tiere) und 28 Tagen (5 Proben, ca. 2 Tiere) wurden den Empfängertieren die Gewebeproben des composite grafts entnommenen und makroskopisch wie histologisch untersucht. Ein Vergleichsansatz aus humanen Keratinozyten und Dermisfibroblasten mit Verwendung der Matrix aber ohne vorherige Besiedlung diente als Kontrolle (Explantation nach 14 Tagen, 7 Proben, 2-3 Tiere; Explantation nach 28 Tagen, 6 Proben, 2 Tiere). Die vorbeschriebenen, positiven mechanischen Eigenschaften der Kollagenmatrix konnten in dieser Studie im Rahmen der Handhabung der besiedelten Matrix bestätigt werden. In der deskriptiven histologischen Auswertung zeigten sich zwischen den Vergleichsgruppen und im zeitlichen Verlauf keine wegweisenden Unterschiede in Bezug auf Neoepithelialisation, Vaskularisierung und Infiltration durch Entzündungszellen. Die gemessene Keratinozytenschichtdicke des nach 14 und 28 Tagen postoperativ explantierten composite grafts wies im zeitlichen Verlauf keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen den errechneten Mittelwerten (10,19±9,12 μm vs 14,26±7,80 μm; p= 0,184) auf. Auch die errechneten Mittelwerte der Keratinozytenschichtdicke der nach 14 und 28 Tagen postoperativ explantierten Proben der Vergleichsansätze wiesen keinen statistisch signifikanten Unterschied auf (21,96±8,30 μm vs 26,74±10,48 μm; p= 0,12). Jedoch zeigten sich im Vergleich der Versuchsansätze untereinander (composite graft vs. Kontrollansatz ohne vorherige Kultivierung der Zellen auf der Kollagenmatrix) jeweils nach 14 Tagen sowie nach 28 Tagen signifikante Differenzen (10,19±9,12 μm vs 21,96±8,30 μm; p= 0,00 und 14,26±7,80 μm vs 26,74±10,48 μm; p= 0,001). Aufgrund der begrenzten Anzahl an Vergleichsproben sollte die Signifikanz der erhobenen Daten äußerst kritisch und als Tendenz betrachtet werden. Die Ergebnisse dieser Arbeit erlauben unter anderem bezüglich der Methodik (Wahl des Tiermodells, „upside-down“ Technik) eine kritische Interpretation und können als Grundlage für weitere Studien dienen. Prinzipiell erscheint anhand der gewonnenen Daten die Bildung einer Epithelschicht durch Kultivierung von humanen Fibroblasten und Keratinozyten auf der untersuchten Kollagenmembran (CCC) in vivo möglich zu sein. Das untersuchte Material hat sich in den Versuchen als Trägermaterial für die untersuchten Zellen als geeignet dargestellt. Dies ermutigt zu weiterführenden Untersuchungen im Bereich Tissue Engineering und Regenerative Medizin.

Die subklinische Klauenrehe oder claw horn disruption (CHD) ist von großer wirtschaftlicher Bedeutung für die Rinderhaltung, da sie zu Lahmheiten, Beeinträchtigungen des Allgemeinbefindens sowie einer eingeschränkten Leistungsfähigkeit der Tiere führt. Trotz zahlreicher Untersuchungen sind die pathophysiologischen Grundlagen der CHD noch immer nicht vollständig geklärt. Die derzeitigen Hypothesen weisen auf eine Ischämie in den noch lebensfähigen Epidermisschichten infolge einer veränderten dermalen Mikrozirkulation. Diese hat pathophysiologische Veränderungen zur Folge, die eine Störung der epidermalen Zellproliferation, eine Schädigung der dermo-epidermalen Verbindung sowie eine veränderte Keratinisierung und Hornproduktion umfassen. Von Bedeutung sind daher In-vitro-Ischämiemodelle, um die epidermale Reaktionsmechanismen auf die pathologischen Veränderungen der Dermis zu untersuchen. Ziel in der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines In-vitro-Ischämiemodells auf der Grundlage boviner Keratinozyten aus der Klauenepidermis. Mithilfe dieses Modells sollten die zellulären Pathomechanismen infolge einer Ischämie, einer Hypoxie sowie eines Glukoseentzugs untersucht werden. Des Weiteren stand die Analyse des Differenzierungsverhaltens der Keratinozyten infolge ischämischer, hypoxischer und hypoglykämischer Konditionen im Mittelpunkt. Für die Etablierung des In-vitro-Ischämiemodells diente als Grundlage das oxygen glucose deprivation (OGD)-Modell, das die Untersuchung eines gleichzeitigen Sauerstoff- und Glukosemangels sowie lediglich einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs bei bovinen Keratinozyten ermöglichte. Die Versuche wurden in eine Kurzzeitanalyse über 96 Stunden sowie eine Langzeitanalyse über drei Wochen geteilt. Nach erfolgter Exposition wurde die Zellviabilität mittels LDH(Lactatdehydrogenase)- und MTT(3-(4,5-Dimethylhiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid)-Assay untersucht. Des Weiteren wurde das veränderte Differenzierungsverhalten der Keratinozyten infolge der veränderten Kultivierungsbedingungen mittels Western Blot-Analyse anhand der Involukrin- und Lorikrin-Expression untersucht. Die Keratinozyten zeigten infolge einer OGD nach kurzer Expositionsdauer die höchsten zytotoxischen Effekte, die von einer zeitabhängigen Abnahme der Zellviabilität sowie massiven morphologischen Veränderungen gefolgt wurde. Hypoxische Bedingungen bewirkten eine zeitabhängige Abnahme der Zellviabilität, die erst nach zweiwöchiger Inkubation die größte Zytotoxizität aufwies, sowie eine geringgradig veränderte Zellmorphologie bei Erhaltung des Zellverbands. Der Glukoseentzug bewirkte eine stark verminderte Zellviabilität sowie starke morphologische Zellveränderungen. In der Western Blot-Analyse konnte eine gesteigerte Involukrin- und Lorikrin-Expression infolge einer OGD, einer Hypoxie und eines Glukoseentzugs nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmalig ein auf bovinen Keratinozyten basierendes In-vitro-Ischämiemodell etabliert werden, das die Untersuchung zellulärer Mechanismen der Epidermis ermöglichte. Die OGD zeigte den stärksten Einfluss auf die Zellviabilität sowie eine veränderte Zelldifferenzierung der Keratinozyten, was die pathophysiologischen Veränderungen im Rahmen der CHD reflektiert. Die ebenfalls starken Zellveränderungen infolge eines Glukoseentzugs verdeutlichen die Rolle der Glukose im Zellmetabolismus der Keratinozyten. Solch ein epidermaler Glukosemangel ist in Verbindung mit der negativen Energiebilanz der Rinder im peripartalen Zeitraum denkbar. Die Ergebnisse infolge einer Hypoxie verweisen auf vielfältige Adaptationsmechanismen der Keratinozyten an hypoxische Bedingungen, denen sie in der Epidermis in vivo während der Zelldifferenzierung ausgesetzt werden. Damit besitzt das In-vitro-Ischämiemodell ein großes Potenzial für den Einsatz in der Klauenreheforschung, um einerseits die mit einer Ischämie einhergehenden pathologischen Veränderungen der CHD untersuchen zu können. Andererseits liefert das Modell wertvolle Informationen zu den physiologischen Grundlagenmechanismen der Epidermis, die mit der Zelldifferenzierung einhergehen. The subclinical laminitis or claw horn disruption (CHD) is of great economic importance in the dairy industry as it causes lameness, poor general condition and reduced performance. Despite extensive research efforts, the pathomechanism of CHD remains widely unclear. The current hypotheses on CHD pathogenesis include ischemic alterations of the epidermal keratinocytes resulting from an impaired blood supply. This causes an alteration of cell proliferation, a dermo-epidermal separation and an impaired keratinization and horn production. Therefore, in vitro ischemia models are of critical importance in clarification of the epidermal responses to an altered microcirculation. The aim of this study was the establishment of an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes. This in vitro model should enable the investigation of cellular pathomechanisms following exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation. An additional aim was the analysis of the differentiation pattern of keratinocytes under ischemic, hypoxic and hypoglycaemic conditions. To establish the in vitro ischemia model, the keratinocytes were exposed to oxygen-glucose deprivation (OGD). In addition, this model allowed the parallel examination of hypoxic and hypoglycaemic conditions on bovine claw keratinocytes. The experiments were divided into a short-term analysis over 96h and a long-term analysis over three weeks. Measurement of cell viability was performed by LDH(lactatedehydrogenase) and MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetra- zolium bromide) assays. Furthermore, the differentiation pattern of the keratinocytes after exposure to ischemia, hypoxia and glucose deprivation was detected by western blot analysis of the focus on expression of involucrin and loricrin. The highest cytotoxic effect was measured after short exposure to OGD followed by a time-dependent decrease of cell viability and extensive morphological changes of the keratinocytes. Hypoxic conditions lead to a time-dependent decrease of cell viability with the highest cytotoxicity after two weeks. The keratinocytes showed slight changes in cell morphology while maintaining a confluent cell layer. Exposure of keratinocytes to glucose deprivation showed a high decrease of cell viability and strong morphological changes. Furthermore, western blot analysis showed an altered expression pattern with increased involucrin and loricrin levels after exposure to OGD, hypoxia and glucose deprivation. The present study established for the first time an in vitro ischemia model based on bovine claw keratinocytes to study the cellular mechanisms of the epidermis. After exposure to OGD, keratinocytes showed the highest loss in cell viability and an altered cell differentiation. This reflects the pathophysiological changes following epidermal ischemia occurring during the pathogenesis of CHD. The massive cellular alterations after glucose deprivation provide good evidence for the importance of glucose in the cellular metabolism of keratinocytes. An epidermal glucose deficiency may occur in combination with a negative energy balance during peripartal period in cattle. The results of hypoxia show the different adaptive mechanisms of keratinocytes to hypoxic conditions which are present in the epidermis during cell differentiation. Thus, the in vitro ischemia model has a great potential for use in research into CHD pathogenesis and pathomechanisms associated with ischemia. On one side, it is possible to investigate the pathological changes following ischemia during CHD. On the other side, the model offers useful information on physiological response mechanisms of the epidermis that correlate with cell differentiation.

Die menschliche Haut hat neben anderen Mechanismen antimikrobielle Proteine (AMP) als chemische Barriere gegen Mikroorganismen entwickelt. Ziel der Arbeit war es, die Induzierbarkeit von AMP (Rnase7, Psoriasin, hBD-2, hBD-3) durch Zytokine, bzw. Zytokinkombinationen in humanen Keratinozyten zu analysieren. Die Proteinsekretion der AMP nach Stimulation wurde mittels ELISA bestimmt, die Analyse der Induktion der mRNA-Expression erfolgte mittels „real-time“-RT-PCR. Die Kombination von IFN-? mit IL-17 war besonders potent, um die Protein - und Genexpression der AMP RNase7, hBD-2 und hBD-3 synergistisch zu induzieren. Für Psoriasin ließ sich kein synergistischer Effekt durch diese Zytokinkombination nachweisen. IFN-? mit IL-1ß war hier die einzig potente Kombination. Zusammenfassend konnte im Rahmen dieser Arbeit die Kombination von Zytokinen, v. a. IFN-? plus IL-17 als sehr potenter Induktor der AMP Expression von RNase-7, hBD-2 und hBD-3 in humanen Keratinozyten identifiziert werden.

Ziel der Arbeit war, die Expression und Funktionalität von TLRs auf Keratinozyten anhand der Zelllinien PAM 212 und HaCaT zu bestimmen sowie die Interaktion mit dem immunmodulierenden POMC-System der Haut zu untersuchen. Mittels RT-PCR konnte die Expression der TLRs 1, 2, 4 und 6 in den PAM 212 Zellen nachgewiesen werden. Da nach rezeptorspezifischer Stimulation (Pam3Cys, Poly (I:C), LPS, Flagellin) eine vermehrte Zytokinexpression (IL-6, IL-8, CXCL-2) in der real-time PCR sowie eine verstärkte Phosphorylierung der MAP-Kinasen ERK 1/2 und p38 im Western Blot nachgewiesen werden konnte, war die Funktionalität der Rezeptoren in beiden Zelllinien anzunehmen. Jedoch konnte eine mittels Immunfluoreszenz detektierte Aktivierung des Transkriptionsfaktors Nf-kB nur nach Stimulation mit Flagellin in den HaCaTs gezeigt werden. Weitere Versuche deuten darauf hin, dass das POMC-System über eine Erhöhung der cAMP Konzentration die TLR-vermittelte Entzündungsreaktion in beiden Zelllinien beeinflusst.

In Human- und Veterinärmedizin werden bei großen Hautdefekten mit der Applikation von verschiedenen therapeutischen Behandlungen natűrliche Regenerationsprozesse vom beschädigten Gewebe beschleunigt und/oder stimuliert. In moderner Humanmedizin entwickelte man die Technologie der Zuchtung von Hautverpflanzungen, die in der Behandlung der Brandwunden oder anderer Hautbeschädigungen der Menschen benutzt werden. Nämlich, die in vitro Bedingungen der Zuchtung von Keratinozyten aus den Mustern von humaner Haut sind optimisiert. In vitro Zuchtung der Keratinozyten ermöglicht die Vorbereitung der Verpflanzungen für klinische Applikation in Humanmedizin. In dieser Studie von den Mustern entnommen in kontrolierten sanitär-hygienischen Bedingungen für die Fleischindustrie vom kürzlich geschlachteten Schwein, mit der Zuchtung der humanen Keratinozyten am Nährmedium (nach dem Protokol vom Laboratorium fúr Hautzuchtung der Klinik fűr Traumatologie der Medizinischen Fakultät, Universität in Zagreb) wurde gezeigt, dass in optimisierten Bedingungen, die schweinischen Verpflanzungen der schweinischen Abstammung mit nahezu 100% Auswirkung wie mit dem humanen Material gezüchtet werden können.

Biocompatibility is one of the main requirements for the safe use of medical devices. Determination of cytotoxicity is part of the initial evaluation stipulated by ISO standards for the biological evaluation of medical devices. The use of cell cultures to test the biocompatibility of drugs, biomaterials or treatment techniques used in various disciplines is gaining in importance. A wide variety of self-initiated and commercially available cell lines has been evaluated and used: cultured fibroblasts from human skin, buccal mucosa, periodontal membrane, embryonic lung, epithelial and HeLa cells; cultures of human keratinocytes and HaCaT cells; different murine cell lines (C3H-L, Balb/c 3T3, L929 and others) as well as murine cells cultured from liver and spleen; T-lymphocytes from lymph nodes and macrophages obtained by lavage. All of the above cells are suitable for use in biocompatibility tests. Nevertheless, the general opinion is that toxicity tests in vitro will be more convincing when performed with cells that are homologous with the human tissue concerned. In accordance, appropriate cell lines for use in cytotoxicity and tolerance tests concerning the skin would be human dermal fibroblasts and human epidermal keratinocytes, as they take an active part in the immune response, inflammatory processes, and wound healing. The evaluation of the in vitro cytotoxicity of a biomaterial is often a qualitative analysis based on the morphological examination of cell damage and growth after direct or indirect contact with the material. Different commercial assays based on the determination of nucleic acids, metabolic activity, protein content or membrane integrity are available to measure cell proliferation and cell viability. A small selection - Pico Green® DNA Cell Proliferation Assay, ATPLite(TM) Luminescence ATP Detection Assay, BC Assay: protein quantitation kit, AlamarBlue(TM) Proliferation Assay and Live/Dead Staining with SYTO-13 and EthD-2 - are discussed concerning sensitivity, reliability and applicability. Biokompatibilität ist eine der Hauptforderungen für den sicheren Einsatz von Medizinprodukten. Die Bestimmung der Zytotoxizität gehört daher auch zu den Evaluierungsprozessen, die in den ISO Standards für die biologische Beurteilung von medizinischen Produkten festgelegt sind. Die Anwendung von Zellkulturen für die Testung auf Biokompatibilität von Pharmazeutika, Biomaterialien oder Behandlungsmethoden gewinnt dafür zunehmend an Bedeutung. Eine Vielzahl von selbst gewonnenen oder kommerziell erhältlichen Zelllinien kommen dabei zum Einsatz: Fibroblasten isoliert aus humaner Haut, der Mundschleimhaut, der Wurzelhaut oder aus embryonalen Lungengewebe; epitheliale Zellen und HeLA-Zellen; Kulturen von humanen Keratinozyten und HaCaT-Zellen; verschiedene murine Zelllinien (C3H-L, Balb/c 3T3, L929 u. a.) sowie Zellen isoliert aus der Milz oder der Leber der Maus und T-Lymphozyten aus Lymphknoten. Die genannten Zellen sind alle für Biokompatibilitätsuntersuchungen geeignet. Die generelle Meinung ist jedoch, dass in vitro durchgeführte Toxizitätstest überzeugender sind, wenn sie mit Zellen durchgeführt werden, die im Zusammenhang mit dem humanen Gewebe stehen an dem die Applikation des Medizinproduktes erfolgt. Dementsprechend eignen sich am besten humane dermale Fibroblasten und humane epidermale Keratinozyten für die Anwendung in Zytotoxizitäts- und Toleranztests die die Haut betreffen, da sie eine wichtige Rolle bei der Immunantwort, inflammatorischen Prozessen und der Wundheilung spielen. Die Evaluierung der in vitro- Zytotoxizität von Biomaterialien ist oft eine qualitative Analyse basierend auf der morphologischen Untersuchung von Zellschäden und Zellwachstum nach direktem oder indirektem Kontakt mit dem Material. Verschiedene kommerzielle Testsysteme sind erhältlich, um die Zellproliferation und Zellviabilität zu messen. Sie beruhen auf der Bestimmung von Nukleinsäure, der metabolischen Aktivität, dem Proteingehalt oder der Membranintegrität. Eine kleine Auswahl, wie Pico Green® DNA Cell Proliferation Assay, ATPLite(TM) Luminescence ATP Detection Assay, BC Assay: protein quantitation kit, AlamarBlue(TM) Proliferation Assay und Lebend/Tot-Färbung mit SYTO-13 und EthD-2, soll hier bezüglich ihrer Sensitivität, Verlässlichkeit und Anwendbarkeit vorgestellt werden.

Human mesenchymal stem cells (hMSC) are able to differentiate into mature cells of various mesenchymal tissues. Recent studies have reported that hMSC may even give rise to cells of ectodermal origin. This indication of plasticity makes hMSC a promising donor source for cell-based therapies. This study explores the differentiation potential of hMSC in a tissue-specific microenvironment simulated in vitro. Human MSC were cultured air-exposed on dermal equivalents (DEs) consisting of collagen types I and III with dermal fibroblasts and subjected to similar conditions used for tissue engineering of skin with keratinocytes. Culture conditions were additionally modified by pre-treating the cells with 5-azacytidine or supplementing the medium with all trans retinoic acid. Human MSC were capable of adaptation to epidermis-specific conditions without losing their mesenchymal multipotency. However, despite the viability and evident three-dimensional epidermis-like growth pattern, hMSC showed a persistent expression of mesenchymal but not of epithelial markers, thus indicating a lack of epidermal (trans) differentiation. Further, electron microscopy and immunohistochemical analyses demonstrated that hMSC cultured under epidermis-specific conditions adopted myofibroblastic phenotype and function, promoted in particular by air-exposure. In conclusion, multipotent hMSC failed to differentiate into E-cadherin- or cytokeratin-expressing cells under optimized organotypic culture conditions for keratinocytes but differentiated into myofibroblast-like cells contracting the extracellular matrix, a phenomenon which was enhanced by retinoic acid and 5-azacytidine. These results indicate that hMSC might contribute to wound healing processes by extracellular matrix reorganization and wound contraction but not by differentiation into keratinocytes.

Das atopische Ekzem und die allergische Kontaktdermatitis gehören zu den häufigsten ekzematösen Erkrankungen. In dieser Arbeit konnten wir zeigen, dass Keratinozyten nicht nur Zielzellen dieser Entzündungsreaktion darstellen, sonder aktiv in das Geschehen eingreifen. Keratinozyten modulierten in in vitro Modellen der Ekzemreaktion die Proliferation und Zytokinproduktion in Allergen-spezifischen T-Zellklonen, unabhängig von deren Subtyp, meist im Sinne einer Hemmung. Die modulierende Kapazität der Keratinozyten konnte auf sezernierte Mediatoren zurückgeführt werden. Keratinozyten sind somit zentrale Regulatoren, die im Mikromilieu der Haut den Verlauf von Immunreaktionen entscheidend beeinflussen.

The therapy of critically colonized or locally infected chronic wounds often demands a antiseptic treatment to ensure the removal of pathogenic micro-organisms that could lead to an infection. Therefore, wound dressings combined with antimicrobial agents such as silver, povidone-iodine or polihexanide are increasingly utilized. Polihexanide is regarded first choice for chronic wounds because of its good skin and wound tolerance beside its antimicrobial effectivity. Furthermore, it possesses the ability to induce proliferation in vitro as well as in animal models. The present study was able to show that polihexanide has a positive effect on the proliferation of human keratinocytes in concentrations up to 2 µg/ml. On the other hand, higher concentrations of polihexanide inhibit cell proliferation or were directly cytotoxic to the tested cell types in vitro . Die Therapie von kritisch kolonisierten oder lokal infizierten chronischen Wunden verlangt oft eine antiseptische Behandlung, um pathogene Mikroorganismen, die zu einer Infektion führen könnten, abzutöten. Dabei wird in zunehmendem Maß die Kombination von Wundverbänden mit antimikrobiellen Mitteln wie Silber, PVP-Iod oder Polihexanid verwendet. Polihexanid ist wegen seiner guten guten Haut- und Wundverträglichkeit in Verbindung mit der antimikrobiellen Effektivität das Mittel der Wahl zur Behandlung dieser Wunden. Darüber hinaus besitzt es auch das Vermögen, sowohl in vitro als auch im Tiermodell die Wundheilung durch eine verbesserte Proliferation der Hautzellen zu fördern. In der vorliegenden Studie konnte anhand von zwei verschiedenen Methoden gezeigt werden, dass Polihexanid in geringen Konzentrationen (bis zu 2 µg/ml) einen positiven Effekt auf die Proliferation humaner Keratinozyten hat. Konzentrationen von Polihexanid >2 µg/ml, inhibierten in den Versuchen entweder die Zellproliferation oder waren direkt zytotoxisch für die getesteten Zelltypen in vitro .

Gestörte Proliferations- und Differenzierungsprozesse in Keratinozyten spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese vieler Hauterkrankungen. Intrazelluläre Signalmechanismen, die die korrekte Balance zwischen epidermaler Proliferation und Differenzierung aufrecht halten, sind bis jetzt größtenteils unbekannt. Einer dieser ausschlaggebenden Transkriptionsfaktoren ist der Nukleäre Faktor-kappaB (NF-kB). Uns interessierte der Einfluss des IKK/IkBa/NF-kB-Signalweges auf das intrinsische Differenzierungsprogramm von Keratinozyten. Mittels retroviraler Infektion wurden sowohl in primären Keratinozyten als auch in HaCaT verschieden mutante Formen von Faktoren des NF-kB-Signalweges eingebracht: dominant negative (dn) Formen der IKK1 und IKK2, eine konstitutiv aktive Form der IKK2 (IKK2 EE) und eine nicht-degradierbare Form des Inhibitors IkBa. Zusätzlich wurden auch pharmakologische Inhibitoren von NF-kB (BAY 11-7082 und SC-514) untersucht. Die Funktionalität der Mutanten wurde im Westernblot durch Analyse der IkBa Degradation überprüft. Anschließend wurde die Differenzierung der Keratinozyten durch Erhöhung des extrazellulären Calciums induziert. Der Grad der Differenzierung wurde durch morphologische Studien und Untersuchung der Expression der Differenzierungs-marker p21 und Involucrin untersucht. Im Gegensatz zu Ergebnissen aus Tiermodellen, konnten wir keine Effekte der mutierten IkB Kinasen 1 und 2 auf die Calcium-induzierte in vitro Differenzierung beobachten. Jedoch wurde die Aktivierung inflammatorischer Gene, gemessen an der Induktion von ICAM-1 und IL-8 nach TNF-a Stimulation, vollständig in den IKK2 KD und mut IkBa exprimierenden Zellen inhibiert. In der Zelllinie, welche die entsprechende IKK1 Mutante trug, wurde deren Expression nur teilweise geblockt. Zusammenfassend lässt sich aus unseren Ergebnissen schließen, dass zumindest in vitro IKK1 und IKK2 nicht an der Regulation des Calcium-induzierten intrinsischen Differen-zierungsprozesses von Keratinozyten beteiligt sind, jedoch eine zentrale Rolle in der inflammatorischen Aktivierung dieser Zellen spielen., Disturbed proliferation and differentiation processes of keratinocytes play a major role in the pathogenesis of many skin diseases. Intracellular signalling mechanisms which regulate the balance between epidermal proliferation and differentiation, however, are thus far largely unknown. Earlier reports suggest a role for the transcription factor nuclear factor–kappaB (NF-kB) in such processes. Here we attempted to analyze the impact of the IKK/IkBa/NF-kB signalling pathway on the intrinsic differentiation process of keratinocytes. Primary human keratinocytes as well as HaCaT cells were retrovirally infected to express different mutant forms of components of the IKK/NF-kB pathway: dominant negative (dn) mutants of NF-kB upstream kinases IKK1 and IKK2, a constitutive active form of IKK2 (IKK2 EE), and a non degradable mutant form of IkBa. In addition, pharmacological inhibitors of the pathway such as BAY 11-7082 and SC-514 were analysed. Proper functionality of the generated mutants was subsequently confirmed by Western blot analysis monitoring induced IkBa degradation. Thereafter, differentiation of keratinocytes was induced by elevation of extracellular calcium levels. The differentiation state of keratinocytes was then assessed by studying morphology and expression of differentiation markers such as p21 as well as involucrin. In contrast to data reported from animal models, we could not detect any effects of mutated IKK1 or IKK2 on the calcium-induced intrinsic differentiation program in keratinocytes. However, inflammatory activation of keratinocytes as measured by TNF-a-mediated up-regulation of ICAM-1 and IL-8 was almost completely inhibited in cells expressing dn IKK2 and the IkBa mutant form whereas it was only partly blocked in IKK1dn cells. In conclusion, our data suggest that, in least in vitro, IKK1 and IKK2 are not involved in the regulation of calcium-induced keratinocyte differentiation while they are pivotal for inflammatory activation of these cells.

Aim of this work is the formation of biologically functional PDMS surfaces which are able to control adhesion and proliferation of cells like fibroblasts and keratinocytes. This purpose requires biologically inert hydrogel layers on PDMS that prevent unspecific protein adsorption and - as a consequence - cell adhesion. Hydrogels were covalently bound to amino groups, produced in the PDMS surface. Peptide sequences or aptamers were reacted with the hydrogel layer to allow specific cell adhesion via ligand-receptor interactions. First PDMS surfaces were functionalised with amino groups. Exposition in ammonia-plasma leads to higher surface hydrophilicity compared to the untreated material. Measurement of the zeta-potential and derivatisation reactions showed the presence and accessibility of primary amine groups, additional surface crosslinking was observed. However, the functionalisation with amino groups was not stable over several days of storage. The influence of plasma treatment with ammonia-argon mixtures, argon plasma supported graft-co-polymerisation of allylamine and CVD-polymerisation of amino functionalized paracyclophane were also investigated. Lateral structuring of the surface functionalisation was achieved with mask techniques on a 10 µm scale. In a second step hydrogels were bound to PDMS surfaces which were functionalized in ammonia plasma. Carboxymethylated dextran (CM-dextran), maleimid functionalised dextran (MI-dextran) and a six-arm isocyanate functionalised star shaped polyether (80% ethylene oxide and 20% propylene oxide) (starPEG) were used. Modification with dextran or starPEG showed distinct improvement of the wettability with water. Surface tension and zeta-potential indicated beside surface hydrophilicity readily accessible amino endgroups of the starPEG. The dextran- as well as the starPEG-coating were able to reduce the protein adsorption. This was proved by the use of surface-MALDI-ToF-MS and studies with the streptavidin-rhodamin-conjugate. Adsorption of insulin, lysozym and albumin were prohibited, after treatment with human blood plasma no albumin, transferrin, transthyretin and no lipoproteins apo C-I and apo C-II could be detected. PDMS surfaces modified with starPEG showed no adhesion and proliferation of human HaCaT keratinocytes and SaOs-2 osteoblasts over 21 days. Only a few fetal rat fibroblasts adhered on surfaces modified with either starPEG or CM-dextran, compared to cells on untreated surfaces which were vital and thus documented the in vitro biocompatibility of the modifications. Mixtures of starPEG and CM-dextran showed as well good protein- and cell-repellent properties. In a third step biological ligands were grafted onto PDMS foils modified with CM-dextran, MI-dextran or starPEG. Covalently immobilised peptides with the RGD-sequence resulted in enhanced adhesion and proliferation of fibroblasts. The concentration of the peptide regulated the density of adherent cells. Adhesion of keratinocytes on surfaces modified with starPEG- or CM-dextran and bound peptide sequences from fibronectin (GRGDS and PHSRN), laminin (YIGSR) or collagen IV (GEFYFDLRLKGDK) or rather mixtures of these peptides was found to be strong, partially the cells formed confluent epithelial aggregates. Combination of GRGDS with GEFYFDLRLKGDK lead to the strongest positive influence on adhesion and proliferation of keratinocytes on all investigated modified surfaces with single peptide sequences or mixtures of two or more peptides. With the microcontact printing technique even small peptide sequences were immobilized in lateral structures, so fibroblasts had the possibility to adhere and to form focal contacts at well-defined sites. Studies of the influence of mechanical stimulation of fibroblasts during their adhesion on PDMS showed, that more cells adhered better spread and distributed than without mechanical stimulation. A lot of cells aligned orthogonally to the stress direction and had a flattened morphology. Modification of PDMS for a targeted attachment of haematopoietic precursor cells was achieved through immobilisation of specifically selected aptamers onto PDMS-surfaces modified with CM-dextran or starPEG. Investigations of the endothelialisation behaviour of human as well as porcine endothelial precursor cells (EPCs) from the whole blood showed that the modified surfaces are able to selectively bind EPCs and hence to promote a specific endothelialisation of the synthetic material surfaces.

Die antiinflammatorischen Effekte von Desloratadin und Loratadin wurden in einem inflammatorischen Hautmodell in vitro untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass beide Antihistaminika die Expression von IFN-gamma induzierten Zelladhäsionsmolekülen und die Ausschüttung von Chemokinen in humanen Keratinozyten inhibieren - dies konnte sowohl auf RNA-Ebene als auch auf Proteinebene gezeigt werden. Funktionell wurden diese Daten in Migrationsstudien mit Keratinozytenüberständen untermauert - beide Antihistaminika hemmen die chemotaktische Aktivität von IFN-gamma stimulierten Keratinozyten gegenüber Granulozyten. Dies zeigt, dass Antihistaminika neben ihrem anti-allergischen Effekt einen - vom Histaminrezeptor sehr wahrscheinlich unabhängigen - antiinflammatorischen Effekt ausüben.

Der humane Stammzellfaktor (SCF) ist ein zentraler Wachstumsfaktor für Mastzellen in der Dermis und für Melanozyten in den Basalzellschichten der Epidermis. Er wird u. a. von Keratinozyten produziert. In dieser Arbeit wurde die mögliche Regulation der Expression von SCF aus Keratinozyten durch All-Trans-Retinsäure (RA) und Dexamethason in vitro an Hand der HaCaT-Zelllinie untersucht. Die HaCaT-Zellen wurden mit den beiden o. g. Substanzen (10 hoch -5 M bis 10 hoch -9 M) über 24 Stunden und 11 Tage inkubiert. Die Auswertung der HaCaT-Zellzahl, des Gesamt-Proteins SCF, dessen Splicevarianten (mSCF, sSCF) und der Rezeptoren von RA (RAR-alpha, -beta, -gamma) und von Dexamethason (GR-alpha, -beta) erfolgte mittels ELISA und RT-PCR. Dabei ergaben sich folgende Resultate: RA bewirkt einen Anstieg von SCF, Dexamethason bewirkt bei Kurzinkubation eine deutliche Zunahme von SCF, bei Dauerinkubation einen starken Abfall. Die RA-Rezeptoren RA-alpha und -gamma waren nach Inkubation mit RA verstärkt nachzuweisen; die Glukokortikoid-Rezeptoren GR-alpha und -beta zeigten nach Inkubation mit Dexamethason ebenfalls eine vermehrte Expression. Die Expression des Mastzellwachstumsfaktors SCF könnte deshalb unter physiologischen, pathologischen und therapeutischen Bedingungen durch Retinoide und Glukokortikoide reguliert sein. The human stem cell factor (SCF) is a crucial growth factor for mast cells in the dermis and for the melanocytes in the basal layers of the epidermis. SCF is produced, among others, by keratinocytes. This study examines the possible regulation of the expression of SCF from keratinocytes by all-trans retinoic acid (RA) and dexamethasone in vitro by the keratinocyte cell line HaCaT. The HaCaT-cells were incubated for 24 hours or 11 days, respectively, with one of the above mentioned substances (10 to the power of -5 M to 10 to the power of -9 M). The analysis of the number of HaCaT-cells, of the total SCF protein, its splice variants (mSCF, sSCF), the receptors of RA (RAR-alpha, -beta, -gamma), and of the dexamethasone (GR-alpha, -beta) was done by ELISA and RT-PCR. The following results were found: RA induces an increase of SCF, dexamethasone at a short incubation period a considerable increase of SCF, and at long-term incubation a strong decrease. The RA-receptors RA-alpha und -gamma expression is increased after incubation with RA, and the glucocorticoid-receptors GR-alpha and -beta after the incubation with dexamethasone. Therefore, it is probable that the increase of the mast cell growth factor SCF under physiological, pathological and therapeutic conditions could be regulated by retinoic acid and glucocorticoids.

Epidemiologische Studien zeigen weltweit eine steigende Häufigkeit und einen zunehmenden Schweregrad des atopischen Ekzems beim Menschen. Ziel der vorliegenden Arbeit war, in in vitro Experimenten eine mögliche ursächliche Beteiligung der umweltrelevanten Luftschadstoffe Toluol und m-Xylol zu untersuchen. Hierfür wurde eine Expositionsapparatur in Form eines offenen, kontinuierlich gasdurchströmten Systems konstruiert, das die simultane Exposition von 12 submersen oder 6 luftexponierten Zellkulturen gegenüber Substanzen aus der Gasphase ermöglicht. Die Apparatur eignet sich aufgrund der Langzeitstabilität physikalisch-chemischer und biologischer Betriebsparameter für Langzeitexpositionen, aufgrund ihrer Dichtigkeit für den Einsatz hochtoxischer Substanzen. Ferner wurden Zellisolierungs- und Kultivierungsmethoden entwickelt, um sterile, homogene und proliferierende Primärkulturen aus humaner Haut von hautgesunden Probanden und Patienten mit atopischem Ekzem zu gewinnen. Eine Dekontaminationsmethode für Hautproben und Keratinozytenkulturen mit 1 % Flucloxacillin gegen die im atopischen Ekzem häufige, multiresistente Staphylococcus aureus Infektion verbesserte den Anteil erfolgreicher Isolierung und Kultivierung proliferierender Primärkeratinozyten aus atopischem Ekzem von 30 % auf 90 %, vergleichbar mit Keratinozyten aus gesunder Haut. Das Differenzierungs- und Zytokinsezernierungsverhalten von Keratinozytenkulturen aus läsionaler und ekzemfreier Haut desselben Probanden mit atopischem Ekzem unterschied sich signifikant. Das war ein klarer Hinweis darauf, dass tatsächlich Keratinozyten läsionalen Ursprungs kultiviert wurden. Darüber hinaus wurden organrekonstruierende Methoden für die Entwicklung eines dreidimensionalen, humanen in vitro -Modells für das atopische Ekzem evaluiert, wobei sich humane tote Dermis als geeignetste Biomatrix erwies. Unter Einsatz der Expositionsapparatur wurden schließlich humane Keratinozyten aus atopischer und gesunder Haut gegenüber VOC (flüchtige organische Substanzen)-Konzentrationen im umwelt- und arbeitsplatzrelevanten Bereich exponiert. Anhand der Zytokinfreisetzung wurden erste Erkenntnisse über eine mögliche ursächliche Beteiligung von umweltrelevanten Luftschadstoffen an der weltweit steigenden Häufigkeit und am zunehmenden Schweregrad des atopischen Ekzems beim Menschen gewonnen: Keratinozyten aus Atopikerhaut setzten konstitutiv im Mittel doppelt so hohe GM-CSF- und IL-6-Konzentrationen frei wie die Zellen gesunder Probanden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die im atopischen Ekzem in situ nachgewiesenen erhöhten Zytokinkonzentrationen u. a. keratinozytären Ursprungs sind. Die konstitutive wie auch die VOC-induzierte Zytokinfreisetzung von IL-1a, IL-6 und GM-CSF aus Keratinozyten läsionaler und nicht läsionaler Haut desselben Probanden unterschied sich signifikant. Daraus folgt, dass in in vitro Untersuchungen zwischen Keratinozyten aus läsionaler und ekzemfreier Atopikerhaut unterschieden werden muss. Vor allem Keratinozyten aus atopisch läsionaler Haut reagierten aus ihrem proinflammatorischen Status heraus empfindlicher auf VOC. Die Ergebnisse unterstützten die allergotoxikologische These von der VOC-sensitiveren atopischen Haut. Da die Auslöser des atopischen Ekzems stark patientenabhängig sind, zeigte nur eine Untergruppe der Probanden eine erhöhte VOC-Empfindlichkeit. Weitere Ergebnisse dieser Arbeit deuten auf synergistische, multiplikative Kombinationswirkungen von niedrigkonzentrierten, umweltrelevanten VOC-Gemischen auf die in vitro Zytokinfreisetzung von IL-1a, IL-6 und GM-CSF aus Keratinozyten gesunder Haut hin. Beispielsweise entsprach die verstärkte GM-CSF-Freisetzung der Sekretion nach 3 MAK (maximale Arbeitsplatzkonzentration) Toluol-Exposition. Auf Zellen aus atopischem Ekzem zeigten sich keine Kombinationseffekte. Allerdings sezernierten Zellen von Atopikern höhere Absolutkonzentrationen als Zellen gesunder Probanden. Das bedeutet zum einen, dass bei der Beurteilung von umweltrelevanten Einflüssen auf gesunde Haut die MAK-Größen nicht ohne weiteres als Bewertungsmassstab herangezogen werden können, da diese keine Kombinationseffekte berücksichtigen. Zum anderen lässt sich - nach den Ergebnissen des in der vorliegenden Arbeit angewendeten in vitro Expositionssystems - der epidemiologisch beobachtete Prävalenzanstieg des atopischen Ekzems nicht mit der Wirkung des umweltrelevant konzentrierten VOC-Gemischs insbesondere auf Primärkeratinozyten aus atopischem Ekzem begründen. Die Dissertation behandelt eine auf Methoden- und Geräteentwicklung basierende experimentelle Arbeit im Fachgebiet der Allergotoxikologie. Alle entwickelten Verfahren wie auch die Apparatur können auch im Rahmen weiterer Fragestellungen eingesetzt werden. Epidemiological studies indicate worldwide raising prevalence and severity of atopic dermatitis in human beings. The goal of the present thesis was to investigate a potential causal contribution of the environmentally relevant airborne pollutants toluene and m-xylene in in vitro experiments. For this purpose, an exposure system for gasous compounds was developed consisting of an open, continuously gas-flooded system which enables the simultaneous exposition of twelve submerse or of six air exposed cell cultures towards substances out of the gas phase. The system is suited for long-time exposures due to the longtime stability of the physical-chemical and the biological operating parameters as well as for the application of highly toxical substances due to its tightness. Moreover, methods to isolate and cultivate cells were developed to get sterile, homogeneous and proliferating primary cell cultures of human skin from both subjects with healthy skin as well as from patients suffering from atopic dermatitis. A method to decontaminate skin samples and keratinocyte cultures from the often occurring infection with multiresistent Staphylococcus aureus by means of 1% flucloxacillin improved the percentage from 30% to 90% of successfully isolated and cultivated, proliferating primary keratinocytes from atopic dermatitis skin, comparable with the keratinocytes from healthy skin. The differentiation and the secretion of cytokines from cultures of keratinocytes from lesional skin was significantly different to those of eczema-free skin of the same patient with atopic dermatitis. This was a clear hint for cultivation of keratinocytes from real lesional origin. Furthermore, methods to reconstruct organs in culture were evaluated to develope a three-dimensional human in vitro model of the atopic dermatitis, with dead human dermis found to be the most suited biomatrix. Finally, applying the exposition system, human keratinocytes from atopic and healthy skin were exposed towards VOC concentrations of an order of magnitude relevant for environmental and work-place exposures. From the release of cytokines, first insights were found about a potential causal contribution of environmentally relevant airborne pollutants to the worldwide increasing prevalence and incidence of the atopic dermatitis in human beings: On the average, keratinocytes from the skin of atopics released constitutively twice the concentrations of GM-CSF and IL-6 compared to cells of healthy subjects. These results indicate that the increased concentrations of cytokines in atopic dermatitis, found in situ , are originating among other things from keratinocytes. The constitutive as well as the VOC (volatile organic compounds)-induced release of IL-1a, IL-6 and GM-CSF from keratinocytes of lesional and non-lesional skin of the same subject were sigificantly different. This means that in in vitro experiments the keratinocytes from lesional skin have to be distinguished from keratinocytes from non-lesional skin of atopics. Especially keratinocytes from atopic lesional skin reacted more sensitively towards VOC with respect to there pro-inflammatory state. These results support the allergotoxicological hypothesis of the more VOC-sensitive atopic skin. As the triggers of atopic dermatitis are strongly depending on the individual subject, an increased sensitivity towards VOC was found only for a subgroup of subjects. Further results indicate that there is a synergistic, multiplicative combination of impacts of low-concentrated, environmentally relevant mixtures of VOC on the in vitro secretion of cytokines from keratinocytes of healthy skin. For example, the increased secretion of GM-CSF resembled that one after an exposition of three MAK (maximum concentrations at the workplace) toluene. In contrast, no combinatory effect was found in atopic dermatitis. But the level of cytokines secreted by cells of atopic patients was higher than the one secreted by keratinocytes of healthy subjects. This means that the MAK values cannot be used offhand to evaluate the environmentally relevant influence on healthy skin, because these values do not take into account combinatory effects. On the other hand, the results of the in vitro exposure system applied in the present work do not induce that the increased prevalence of atopic dermatitis - observed from epidemiological studies - is due to the impact of the environmentally concentrated VOC mixture especially on primary keratinocytes from atopic dermatitis. This thesis comprises an experimental work in the subject of allergotoxikology based on the development of methods and equipment in form of an exposure system for cell cultures towards gasous compounds. All methods as well as the exposure system can also be used for investigations of other questions.

Die befallene sowie die unbefallene Haut von Patienten mit atopischem Ekzem weist in vivo, im Vergleich zur Haut gesunder Probanden, ein erhöhtes Chemilumineszenzsignal nach UVA-Bestrahlung auf. Ziel dieser Arbeit war es zu untersuchen, welche Bestandteile der menschlichen Haut für die erhöhte Chemilumineszenz (CL) nach UVA-Bestrahlung verantwortlich sein können. Die Chemilumineszenz der Haut ist unseren Untersuchungen zufolge nicht auf die zellulären Bestandteile der Epidermis und Dermis zurückzuführen, da in vitro weder an primär isolierten noch an etablierten Keratinozyten oder Fibroblasten eine UVA-induzierte CL gemessen werden konnte. Unter Verwendung eines Lipidoxidationsmodells konnte nach einer Bestrahlung von Riboflavin und Linolsäure CL detektiert werden, die sich abhängig sowohl von der Riboflavin- als auch von der Linolsäurekonzentration zeigte, wobei vor allem Superoxidanionen für das entstandene CL-Signal verantwortlich waren. Auch Histidin, sowie die cis- und die trans- UCA, neben ihrer UV-Filterfunktion, und Eisen können eine vermehrte Sauerstoffradikalbildung induzieren, wobei unseren Untersuchungen zufolge ebenfalls vor allem die Superoxidanionen für die entstehenden CL-Signale verantwortlich sind. Unsere Untersuchungen belegen, daß verschiedene Strukturen in der Haut für die Sauerstoffradikalbildung nach UV-Bestrahlung verantwortlich sind. Neben einem veränderten Antioxidantienstatus können eine Veränderungen im Lipidstatus, eine Erhöhung des Histidins, eine Verringerung des UCA-Gehaltes als UV-Absorber und ein erhöhter Eisengehalt bei Patienten mit atopischem Ekzem für eine erhöhtes Chemilumineszenzsignal verantwortlich sein. Both lesional and non-lesional skin of patients with atopic eczema is characterized by an increased chemiluminescence(CL)-signal after ultraviolet(UV)-A irradiation in comparison to healthy non-atopic individuals. Skin structures responsible for this ef-fect are not known at the moment. After irradiation with UVA, CL could neither be detected in HaCat keratinocytes nor in keratinocytes or fibroblasts from primary cell cultures of patients with or without atopic eczema. In contrast, after irradiation of li-noleic acid and riboflavin, histidine, trans-urocanic acid and trans-cis-urocanic acid CL was found. In order to identify the reactive form of oxygen, inducing the CL-signal, the antioxidants superoxide dismutase and catalase were added to the assay before UVA-irradiation. Only the addition of superoxide dismutase showed a clear CL-decrease. Based on these results, various structures of the skin are involved in the formation of oxygen radicals (especially superoxide radicals) after ultraviolet-irradiation. In addition to a different status of antioxidants, the reasons for an increased CL-signal in the skin of patients with atopic eczema could be a changed lipid status, an increase of histidine, a decrease of urocanic acid as an absorber of UVA and an in-creased concentration of ferrous ions.

Trotz mikrobieller Besiedlung kommt es relativ selten zu Infektionen der Haut. Einen wichtigen Grund dieser natürlichen Resistenz stellen durch Mikroorganismen induzierbare antimikrobielle Proteine wie hBD-2 dar. In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob die Haut in der Lage ist, zwischen verschiedenen Mikroorganismen zu differenzieren. Dazu wurde die differentielle Genexpression in Keratinozyten nach Kontakt mit verschiedenen mikrobiellen Stimuli analysiert. Mithilfe der Systematischen Differential Display-PCR wurde IFIT4 als ein Gen identifiziert, welches in Keratinozyten v.a. durch P.aeruginosa-Überstände induzierbar ist, während S.aureus- und C.albicans-Überstände IFIT4 nicht induzieren. Anhand von Microarray-Analysen und der Suppressiven Subtraktiven Hybridisierung wurde der Einfluss hBD-2-induzierender und hBD-2-inhibierender P.aeruginosa-Kulturüberstände auf die Keratinozytengenexpression untersucht. Während hBD-2-induzierende Überstände vornehmlich antimikrobielle Proteine induzieren, induzieren hBD-2-inhibierende Überstände auch Gene der adaptiven Immunabwehr. Letzteres ist als Schutz vor Infektionen trotz eingeschränkter angeborener Immunabwehr zu werten.

Schlüsselereignisse bei der epidermalen Differenzierung sind das Ablösen der Basalzellen von der Basalmembran und ihre Aufwärtswanderung synchron zur terminalen Differenzierung mit dem Endstadium der Hornschuppen, die die äußerste Barriere bilden. Zellrezeptoren, die bei der Auslösung dieses Prozesses eine wichtige Rolle spielen, sind die Integrine, die einen erheblichen Anteil an der Gewebeorganisation haben. Andererseits sind Integrine auch maßgeblich an der zellulären Signaltransduktion beteiligt. Als Hauptkomponente der Hemidesmososmen, die die Basalzellen mit der darunter liegenden Basalmembran verbinden, kommt Integrin alpha6beta4 eine herausragende Funktion zu. Über seine cytoplasmatischen Domänen interagiert alpha6beta4 mit PKCalpha und PKCdelta, und wird dabei seinerseits modifiziert. Grundlegende Änderungen in der Integrin-Expression und -Verteilung werden bei der Tumorigenese beobachtet. Auffallend bei Hautcarcinomen sind vor allem die Dislokation und Überexpression von Integrin alpha6beta4, was weitreichende Konsequenzen für die PKC-Signaltransduktion hat. Ziel dieser Arbeit war daher die Analyse der Rolle von PKCalpha, PKCdelta und Integrin alpha6beta4 in Keratinozyten und deren mögliche Bedeutung bei der Tumorentstehung. Dabei sollte die Funktion von PKCalpha, PKCdelta und Integrin alpha6beta4 bei der Regulation von Zell-Matrix-Interaktionen, Migration und Differenzierung untersucht werden. Hierfür wurden normale humane primäre Keratinozyten und die humane Keratinozyten-Zell-Linie HaCaT, eine immortale „prämaligne“ Zelle, mit adenoviralen Konstrukten für PKCalpha, PKCdelta, für die Integrin alpha6-Kette und für beta-Gal als Negativkontrolle infiziert. Reproduzierbare Infektionen mit hohen Infektionseffizienzen und die langsam abnehmende Synthese der exogenen Proteine erlaubten funktionelle Analysen in zweidimensionalen Kulturen, als auch in der komplexeren, physiologischen, dreidimensionalen organotypischen Kokultur (OTK). In zweidimensionalen Kulturen erhöhte PKCdelta die Migrationsaktivität der Zellen, vermutlich durch reduzierte Adhäsion an Laminin-5. Erhöhte Integrin alpha6 Level dagegen veränderten das Wachstumsverhalten dramatisch, was schließlich zu einem massiven Absterben der Zellen führte. Daher entwickelten sich in OTKs von alpha6 Zellen nur atrophische Epithelien. Differenzierungsmarker konnten, wahrscheinlich aufgrund der verminderten Lebenszeit der Zellen, nicht detektiert werden. Das Fehlen einer kompensierenden Hochregulation der Integrin beta4-Kette, die in überlebenden Maus-Keratinozyten beobachtet wurde, wird als Ursache für den Zelltod im humanen System angesehen. HaCaT-Zellen sind im Allgemeinen in der Lage ein Epithel vergleichbar der Epidermis zu bilden, obwohl sie bestimmte Differenzierungs-Defizite zeigen. So verläuft die Entwicklung stratifizierter Epithelien langsamer als bei normalen Keratinozyten und ist charakterisiert durch das Vorhandensein eines parakeratotischen Stratum corneums, was auf eine unvollständige Differenzierung hinweist. PKCalpha und PKCdelta überexprimierende Zellen dagegen bildeten gut differenzierte Epithelien, die denen normaler Keratinozyten ähnelten. Differenzierungsmarker und Basalmembrankomponenten wurden regulär exprimiert. Bei normalen Keratinozyten hatte die adenovirale Überexpression der PKC Isoformen keinen stimulierenden Einfluss auf Epithelwachstum und Stratifizierung. Die Überexpression der beiden PKC-Isoformen schien somit die bei HaCaT veränderte bzw. nicht ausreichende Interaktion mit Fibroblasten zu verbessern, was letztendlich zu einer normalisierten Differenzierung und Stratifizierung führte. One key event in epidermal differentiation is the detachment and upward movement of basal cells upon their commitment. Cell receptors playing a major role in this process are integrins which provide spatial organization and participate in signaling events. Among those integrin alpha6beta4 is a key component of epidermal attachment devices to the basement membrane, the hemidesmosomes. These connect the proliferative basal cell layer with the underlying basement membrane. By its cytoplasmic integrin tails alpha6beta4 interacts with PKCalpha and PKCdelta, thereby getting itself modified. Profound changes in integrin expression and tissue distribution occur during tumorigenesis. Most striking in skin carcinomas are dislocation and dramatic expansion of alpha6beta4 which coincides with anomalies in PKC signaling. This project was devoted to functional links of PKCalpha, PKCdelta, and alpha6beta4 integrin in regulation of cell-matrix interactions, migration, and differentiation which also concerns respective defaults in neoplasia such as loss of tissue polarity. Thus, normal human keratinocytes (NHK) and the derived line HaCaT (clone 6) were infected with adenoviral constructs for PKCalpha, PKCdelta, integrin alpha6 chain, or beta-gal as control. Reproducible infections, high efficiency rates, and slowly declining synthesis of exogenous proteins allowed functional tests in 2D-cultures, but also in the more complex, physiological 3D-organotypic cocultures. In 2D-cultures PKCdelta enhanced closure of scratch wounds, presumably by reducing adhesion to epidermal laminin-5. Contrasting mouse data, elevated integrin alpha6 levels altered the growth behavior, causing massive cell death eventually. Thus, in 3D-cocultures of alpha6-cells only poorly stratified, atrophic epithelia developed and no differentiation markers were detectable apparently due to the reduced lifespan. The lack of compensatory up-regulation of the integrin beta4 chain, occurring in the surviving mouse cells, is considered to cause cell death in the human system. HaCaT cells in general are able to produce a nearly epidermis-like epithelium, although they display certain defficiencies in differentiation depending on environmental conditions. Thus, compared to normal keratinocytes the development of stratified epithelia occurs more slowly and is characterized by a parakeratotic stratum corneum, indicating uncomplete differentiation. PKCalpha and PKCdelta over-expressing cells, however, gave rise to normal, well differentiated epithelia that resembled more closely those of NHK. Stratification was improved and parakeratosis reduced. All differentiation markers as well as components of the basement membrane zone were regularly expressed. Normal human keratinocytes, revealing no differentiation defficiencies in 3D-coculture, did not behave differently upon adenoviral infection. Thus, PKC-mediated improved interactions between HaCaT cells and dermal fibroblasts, being otherwise weakened, may be considered to induce epithelial normalization.

Schlüsselereignisse bei der epidermalen Differenzierung sind das Ablösen der Basalzellen von der Basalmembran und ihre Aufwärtswanderung synchron zur terminalen Differenzierung mit dem Endstadium der Hornschuppen, die die äußerste Barriere bilden. Zellrezeptoren, die bei der Auslösung dieses Prozesses eine wichtige Rolle spielen, sind die Integrine, die einen erheblichen Anteil an der Gewebeorganisation haben. Andererseits sind Integrine auch maßgeblich an der zellulären Signaltransduktion beteiligt. Als Hauptkomponente der Hemidesmososmen, die die Basalzellen mit der darunter liegenden Basalmembran verbinden, kommt Integrin alpha6beta4 eine herausragende Funktion zu. Über seine cytoplasmatischen Domänen interagiert alpha6beta4 mit PKCalpha und PKCdelta, und wird dabei seinerseits modifiziert. Grundlegende Änderungen in der Integrin-Expression und -Verteilung werden bei der Tumorigenese beobachtet. Auffallend bei Hautcarcinomen sind vor allem die Dislokation und Überexpression von Integrin alpha6beta4, was weitreichende Konsequenzen für die PKC-Signaltransduktion hat. Ziel dieser Arbeit war daher die Analyse der Rolle von PKCalpha, PKCdelta und Integrin alpha6beta4 in Keratinozyten und deren mögliche Bedeutung bei der Tumorentstehung. Dabei sollte die Funktion von PKCalpha, PKCdelta und Integrin alpha6beta4 bei der Regulation von Zell-Matrix-Interaktionen, Migration und Differenzierung untersucht werden. Hierfür wurden normale humane primäre Keratinozyten und die humane Keratinozyten-Zell-Linie HaCaT, eine immortale „prämaligne“ Zelle, mit adenoviralen Konstrukten für PKCalpha, PKCdelta, für die Integrin alpha6-Kette und für beta-Gal als Negativkontrolle infiziert. Reproduzierbare Infektionen mit hohen Infektionseffizienzen und die langsam abnehmende Synthese der exogenen Proteine erlaubten funktionelle Analysen in zweidimensionalen Kulturen, als auch in der komplexeren, physiologischen, dreidimensionalen organotypischen Kokultur (OTK). In zweidimensionalen Kulturen erhöhte PKCdelta die Migrationsaktivität der Zellen, vermutlich durch reduzierte Adhäsion an Laminin-5. Erhöhte Integrin alpha6 Level dagegen veränderten das Wachstumsverhalten dramatisch, was schließlich zu einem massiven Absterben der Zellen führte. Daher entwickelten sich in OTKs von alpha6 Zellen nur atrophische Epithelien. Differenzierungsmarker konnten, wahrscheinlich aufgrund der verminderten Lebenszeit der Zellen, nicht detektiert werden. Das Fehlen einer kompensierenden Hochregulation der Integrin beta4-Kette, die in überlebenden Maus-Keratinozyten beobachtet wurde, wird als Ursache für den Zelltod im humanen System angesehen. HaCaT-Zellen sind im Allgemeinen in der Lage ein Epithel vergleichbar der Epidermis zu bilden, obwohl sie bestimmte Differenzierungs-Defizite zeigen. So verläuft die Entwicklung stratifizierter Epithelien langsamer als bei normalen Keratinozyten und ist charakterisiert durch das Vorhandensein eines parakeratotischen Stratum corneums, was auf eine unvollständige Differenzierung hinweist. PKCalpha und PKCdelta überexprimierende Zellen dagegen bildeten gut differenzierte Epithelien, die denen normaler Keratinozyten ähnelten. Differenzierungsmarker und Basalmembrankomponenten wurden regulär exprimiert. Bei normalen Keratinozyten hatte die adenovirale Überexpression der PKC Isoformen keinen stimulierenden Einfluss auf Epithelwachstum und Stratifizierung. Die Überexpression der beiden PKC-Isoformen schien somit die bei HaCaT veränderte bzw. nicht ausreichende Interaktion mit Fibroblasten zu verbessern, was letztendlich zu einer normalisierten Differenzierung und Stratifizierung führte. One key event in epidermal differentiation is the detachment and upward movement of basal cells upon their commitment. Cell receptors playing a major role in this process are integrins which provide spatial organization and participate in signaling events. Among those integrin alpha6beta4 is a key component of epidermal attachment devices to the basement membrane, the hemidesmosomes. These connect the proliferative basal cell layer with the underlying basement membrane. By its cytoplasmic integrin tails alpha6beta4 interacts with PKCalpha and PKCdelta, thereby getting itself modified. Profound changes in integrin expression and tissue distribution occur during tumorigenesis. Most striking in skin carcinomas are dislocation and dramatic expansion of alpha6beta4 which coincides with anomalies in PKC signaling. This project was devoted to functional links of PKCalpha, PKCdelta, and alpha6beta4 integrin in regulation of cell-matrix interactions, migration, and differentiation which also concerns respective defaults in neoplasia such as loss of tissue polarity. Thus, normal human keratinocytes (NHK) and the derived line HaCaT (clone 6) were infected with adenoviral constructs for PKCalpha, PKCdelta, integrin alpha6 chain, or beta-gal as control. Reproducible infections, high efficiency rates, and slowly declining synthesis of exogenous proteins allowed functional tests in 2D-cultures, but also in the more complex, physiological 3D-organotypic cocultures. In 2D-cultures PKCdelta enhanced closure of scratch wounds, presumably by reducing adhesion to epidermal laminin-5. Contrasting mouse data, elevated integrin alpha6 levels altered the growth behavior, causing massive cell death eventually. Thus, in 3D-cocultures of alpha6-cells only poorly stratified, atrophic epithelia developed and no differentiation markers were detectable apparently due to the reduced lifespan. The lack of compensatory up-regulation of the integrin beta4 chain, occurring in the surviving mouse cells, is considered to cause cell death in the human system. HaCaT cells in general are able to produce a nearly epidermis-like epithelium, although they display certain defficiencies in differentiation depending on environmental conditions. Thus, compared to normal keratinocytes the development of stratified epithelia occurs more slowly and is characterized by a parakeratotic stratum corneum, indicating uncomplete differentiation. PKCalpha and PKCdelta over-expressing cells, however, gave rise to normal, well differentiated epithelia that resembled more closely those of NHK. Stratification was improved and parakeratosis reduced. All differentiation markers as well as components of the basement membrane zone were regularly expressed. Normal human keratinocytes, revealing no differentiation defficiencies in 3D-coculture, did not behave differently upon adenoviral infection. Thus, PKC-mediated improved interactions between HaCaT cells and dermal fibroblasts, being otherwise weakened, may be considered to induce epithelial normalization.