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The aim of this dissertation was the biophysical characterization of the dimer structure of tRNA-guanine transglycosylase (TGT) as a case study. In addition to X-ray crystallography, enzyme kinetic measurements, isothermal titration calorimetry, native mass spectrometry, thermal shift assay and protein-based 19F NMR spectroscopy were used for the comprehensive study of the ligand-induced influence on dimer stability. The Z. mobilis TGT catalyzes the incorporation of a modified nucleobase into the tRNA as a homodimer. This modification is essential in the pathogenesis of the inflammatory bowel dis¬ease dysentery caused by Shigella. For this purpose, TGT replaces the purine base guanine at the wobble position-34 of tRNAsAsn,Asp,His,Tyr with the modified nucleobase preQ1. The lin-benzoguanine scaffold derived from the purine base competitively binds to the active site of the protein. By inserting modifications at the C(2') or C(4') positions, the adjacent ribose-33/uracil-33 and ribose-34/phosphate-35 site pockets can be addressed. Since TGT can catalytically convert the natural tRNA substrate only in a 2:1 ratio (monomer:tRNA) as a homodimer, the stabilization of the quaternary structure in an incompetent arrangement represents an alternative way of inhibition besides the classical blocking of the active site. The contact surface of the two TGT monomers (dimer interface) falls close to the ribose-34/phosphate-35 pocket. By addressing the hydrophobic region of the above-mentioned pocket, the geometry of an adjacent loop-helix motif can be disturbed, reducing the dimer sta¬bility associated with a massive rearrangement of up to 20 amino acids. Three ligands have been crystallographically identified which, when bound in the ribose-34 pocket, induce a "twisted" arrangement of the TGT dimer (twisted dimer), which should prevent catalytic activity due to its rearrangement in a catalytically incompetent geometry. By introducing a fluorine probe inside the dimer, the "twisted" dimer was investigated under native conditions in solution (Chapter 2). The 19F NMR results indicate that the loop-helix motif and especially the amino acid Trp95 have a regulatory function for the dimer arrangement and formation. Therefore, modulation of the malleable motif with suitable ligands appears as an ideal concept to inhibit the dimer protein. Within the ribose-33/uracil-33 pocket, a water network was replaced by binding of C(2')-monosaccharide-modified lin-benzoguanine inhibitors in a charge-neutral manner (Chapter 3). It was also shown that acetonide-protected sugar motifs play a decisive role in the stabiliza¬tion of a [5+5+4] water cluster and thus significantly influencing the binding affinity of the applied ligands. In addition to the binding affinity, the motif used increases the physicochemical proper¬ties of the lin-benzoguanine ligands. Based on an earlier study, the TGT mutant Y330C was introduced. Although the crystal struc¬ture under investigation does not allow the complete structural elucidation of the TGT mono¬mer, it shows an arrangement of the molecules in space group P6522 in a largely unconstrained arrangement lacking restrictions from the packing of the neighboring dimer mate. Interest¬ingly, the β1α1 loop (Thr47 – Lys55) is observed in a previously unobserved conformation. The new arrangement of the loop is not compatible with the formation of the functional dimer interface. Therefore, the determination of the monomer structure remains an unresolved problem. For this purpose, MS-coupled tethering screening was applied at the Cys330 position for the search of optimal crystallization conditions (Chapter 4). In addition to the use of reversible disulfide binders, the concept has been extended by the introduction of irreversible binders. It turned out that acrylamides used have a high potential for the modification of cysteine residues and bind irrespectively of the affinity of the fragment to the target protein. This opens up a new perspective for possibilities of dimer investigation. The functionality of TGT is only guaranteed in the dimeric arrangement. Thus, the regulation of dimer formation seems to be a possibility to inhibit its catalytic capability. A cluster consisting of four aromatic amino acids (Phe92', Trp326, Tyr330, His333) was identified, which is essential for the stability of the dimer interface. By introducing phenylalanine mutants, the hydrogen bonds have been selectively removed, while the aromatic character of the residues is preserved (Chapter 5). The effect on the dimer interface was investigated by X-ray crystallo-graphy, native mass spectrometry, enzyme kinetics and the determination of the melting temperature of the respective mutants. The position His333 seems to be of greater importance, and seemingly its protonation strongly influences the stability of the dimer interface. This finding is also based on the experience that crystals grown at pH 5.5 show a more pronounced change in the structural loop-helix motif. Also, the mutagenesis study shows that the Trp95 residue, which is located in the center of the loop-helix motif, appears to be essential concerning dimer regulation. The reduction of this residue to phenylalanine causes a significant depression of the melting temperature by >15 °C. Furthermore, dimerization rate, structural stability of the loop-helix motif and binding behavior of differently substituted ligands, which are characterized more in detail in chapter 2, are significantly influenced., Das Ziel dieser Dissertation war die biophysikalische Charakterisierung einer Dimerstruktur am Beispiel der tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT). Für die intensive Untersuchung des Dimers wurden neben der Röntgenkristallographie auch enzymkinetische Messungen, isotherme Titrationskalorimetrie, native Massenspektrometrie, Thermal-Shift-Assays und proteinbasierte 19F-NMR-Spektroskopie zur Untersuchung und Einflussnahme auf die Dimer- stabilität durch die verwendeten Liganden eingesetzt. Die Z. mobilis TGT katalysiert als Homodimer den Einbau einer modifizierten Base in die tRNA. Diese Modifikation ist von wesentlicher Bedeutung in der Pathogenese der entzünd- lichen Darmerkrankung Bakterienruhr, die durch Shigellen verursacht wird. Dazu tauscht die TGT die Purinbase Guanin in der Wobble -Position-34 von tRNAsAsn,Asp,His,Tyr durch die modifi- zierte Base preQ1aus. Das von der Purinbase abgeleitete lin-Benzoguanin-Grundgerüst bindet kompetitiv in das aktive Zentrum des Proteins. Durch Einfügen von Modifikationen an C(2') bzw. C(4') können die angrenzenden Ribose-33/Uracil-33- und Ribose-34/Phosphat-35-Seiten- taschen adressiert werden. Dadurch dass die TGT das natürliche tRNA-Substrat nur im Verhältnis 2:1 (Monomer:tRNA) als Homodimer katalytisch umsetzen kann, stellt die Stabilisierung der Quartärstrukur in einer inkompetenten Anordnung neben der klassischen Blockierung des aktiven Zentrums eine alternative Form der Inhibition dar. Die Kontaktfläche der beiden TGT-Monomere (Dimer- Grenzfläche) befindet sich in unmittelbarer Nähe zur Ribose-34/Phosphat-35-Tasche. Durch Adressierung des hydrophoben Bereichs der vorherig erwähnten Tasche kann ein angrenzende Schleifen-Helix-Motiv in seiner Geometrie gestört werden, wodurch die mit einer massiven Umlagerung von bis zu 20 Aminosäuren verbundene Dimerstabilität reduziert wird. Drei Liganden wurden kristallographisch identifiziert, die durch ihre Bindung in der Ribose-34- Tasche eine "verdrehte" Anordnung des TGT-Dimers (twisted dimer ) induzieren, wodurch die katalytische Aktivität aufgrund der Neuausrichtung nicht mehr möglich sein sollte. Mit Ein- führung einer Fluor-Sonde innerhalb des Dimers wurde das "verdrehte" Dimer unter nativen Bedingungen in Lösung untersucht (Kapitel 2). Die Ergebnisse der 19F-NMR deuten darauf hin, dass das Schleifen-Helix-Motiv und dort vor allem der Rest Trp95 eine regulative Funktion in der Dimeranordnung bzw. -bildung tragen. Daher stellt die Modulation des formbaren Mo- tivs mit geeigneten Liganden eine ideale Vorgehensweise zur Inhibition des Dimerproteins dar. Innerhalb der Ribose-33/Uracil-33-Tasche wurde ein Wassernetzwerk durch Bindung von C(2')-Monosaccharid-modifizierten lin-Benzoguanin-Inhibitoren ladungsneutral ersetzt (Ka- pitel 3). Es zeigte sich zudem, dass Acetonid-geschützte Zuckermotive eine entscheidende Rolle zur Stabilisierung eines [5+5+4] Wasserclusters spielen und dadurch die Bindungsaffinität dereingesetzten Liganden signifikant beeinflussen. Neben der Bindungsaffinität, steigert das einge- setzte Motiv die physikochemischen Eigenschaften der lin-Benzoguanin-Liganden. Aufbauend auf einer früheren Studie wurde die TGT-Mutante Y330C eingeführt. Die unter- suchte Kristallstruktur erlaubt zwar nicht die vollständige Strukturaufklärung des TGT- Monomers, zeigt aber eine Anordnung der Moleküle in der Raumgruppe P6522 in einer weit- gehend konformationsfreien Anordnung in der ursprünglichen Dimer-Grenzfläche. Inte- ressanterweise wird die β1α1-Schleife (Thr47 - Lys55) in einer zuvor nicht beobachteten Konformation beobachtet. Die neue Anordnung der Schleife ist mit der Ausbildung der funktionalen Dimer-Grenzfläche nicht kompatibel. Daher bleibt die Bestimmung der Mono- merstruktur ein noch zu lösendes Problem. Hierzu wurde ein MS-gekoppeltes Tethering- Screening an der Position Cys330 angewandt und die Suche nach optimalen Kristallisierungs- bedingungen durchgeführt (Kapitel 4). Neben der Anwendung reversibler Disulfid-Binder, wurde das Konzept durch die Einführung von irreversiblen Bindern erweitert. Es stellte sich heraus, dass angewandte Acrylamide ein hohes Potenzial zur Modifikation von Cysteinresten besitzen und unabhängig von der Affinität des Fragments zum Zielprotein binden. Dies eröffnet eine neue Perspektive für Möglichkeiten der Dimer-Untersuchung. Die Funktionalität der TGT ist nur in der dimeren Anordnung gewährleistet. Somit erscheint die Regulierung der Dimerbildung eine Möglichkeit zur Hemmung ihrer katalytischen Fähigkeit zu sein. Es wurde ein aus vier aromatischen Aminosäuren (Phe92', Trp326, Tyr330, His333) bestehender Cluster identifiziert, der für die Stabilität der Dimer-Grenzfläche essentiell ist. Durch die eingeführten Phenylalanin-Mutanten wurden die Wasserstoffbrücken gezielt entfernt, während der aromatische Charakter der Reste beibehalten wird (Kapitel 5). Die Wirkung auf die Dimer-Grenzfläche wurde durch Röntgenkristallstrukturanalyse, native Massenspektrometrie, Enzymkinetik und Bestimmung der Schmelztemperatur der jeweiligen Mutanten untersucht. Von größerer Bedeutung scheint die Position His333 zu sein, dessen Protonierungsszustand die Stabilität der die Dimer-Grenzfläche stark beeinflusst. Diese Erkenntnis beruht auch auf der Erfahrung, dass Kristalle, die bei pH 5.5 gezüchtet werden, eine ausgeprägtere Veränderung des strukturellen Schleifen-Helix-Motivs aufweisen. Darüber hinaus zeigt die Mutationsstudie, dass der Trp95-Rest, der sich in der Mitte des Schleifenhelix- Motivs befindet, in Bezug auf die Dimer-Regulation essentiell zu sein scheint. Die Reduzierung dieses Restes zu Phenylalanin bewirkt eine signifikante Verringerung der Schmelztemperatur >15 °C. Weiterhin werden Dimerisierungsrate, Strukturstabilität des Schleifen-Helix-Motivs und Bindungsverhalten von unterschiedlich substituierten Liganden die in Kapitel 2 genauer charakterisiert werden, deutlich beeinflusst.

Der Begriff der Serendipität spielt in der Wissenschaft und insbesondere bei der Entdeckung neuer Medikamente eine historisch bedeutsame Rolle. So führten Zufallsentdeckungen zu wichtigen Arzneimittelentwicklungen, die die pharmazeutische Industrie sowie unser heutiges Gesundheitssystem prägen. In den letzten Jahrzehnten entwickelte sich das rationale Wirkstoffdesign zu einem der Schlüsselansätze zur Erforschung neuer und spezifischer Arzneistoffe. Dennoch stellt die Inhibitorentwicklung für Protein–Protein-Interaktionen, insbesondere von oligomeren Proteinkontaktflächen, eine besondere Herausforderung dar. Das bakterielle Enzym, tRNA-Guanin-Transglycosylase (TGT), ist ein Beispiel für ein homodimeres Protein und dient in dieser Arbeit als Modell-Zielprotein. Diese Arbeit fasst drei Projekte zusammen, die aus zufälligen Entdeckungen früherer Studien entstanden sind, um neue Ansätze für die Modulation der Homodimerkontaktfläche von TGT zu entwickeln und damit die Grundlage für alternative Inhibitionswege in oligomeren Enzymen zu legen. Eine frühere kristallographische Studie von TGT–Inhibitor-Komplexen enthüllte eine unerwartete, verdrehte Anordnung des TGT-Homodimers. Die gewonnenen Informationen aus den Röntgenkristallstrukturen können jedoch weder kristallographische Artefakte von Kristallpackungskräften ausschließen noch den Übergang zwischen den beiden dimeren Endzuständen aufklären. Daher wurde eine auf der Elektronenspinresonanz (EPR) basierende Methode etabliert, um diesen ligandeninduzierten Umlagerungsmechanismus des TGT-Homodimers in Lösung zu untersuchen (Kapitel 2). Zu diesem Zweck wurden paramagnetische Spinmarker über ortsgerichtete Cystein-Mutationen auf der Proteinoberfläche eingeführt. Die folgenden gepulsten EPR-Techniken ermöglichten die Beobachtung von Inter-Spin-Abstandsverteilungen innerhalb des Homodimers. Während der Studie wurde ein Pyranose-substituierter lin-Benzoguanin-Inhibitor als bester Ligand für die Umwandlung des funktionalen TGT-Dimers in seinen verdrehten Zustand identifiziert. Somit kann die entwickelte Methode zur Differenzierung zwischen der funktionalen und verdrehten TGT-Dimerspezies bei Zugabe von Liganden im Lösungsgleichgewicht eingesetzt werden. Ein zweites Projekt umfasst die Suche nach kleinen Molekülfragmenten, die auf eine neu entdeckte transiente Bindungstasche in der Homodimerkontaktfläche von TGT abzielen (Kapitel 3). In einer früheren Mutationsstudie wurde eine neue Kristallform des TGT-Dimers entdeckt, in der die beiden Protomere durch eine eingeführte Disulfidbrücke kovalent miteinander verknüpft sind. Diese Anordnung bricht die ursprüngliche Dimerkontaktfläche auf und legt eine kleine hydrophobe Bindetasche durch eine Konformationsänderung der nahegelegenen β1α1-Schleife frei. Überraschenderweise war die neu gebildete Tasche von einem Dimethylsulfoxid-Molekül besetzt. In dieser Arbeit wurde eine weitere stabilisierte Variante des Disulfid-gebundenen Dimers für nachfolgende Fragment-Soaking-Studien entworfen, um die neue Bindungstasche zu adressieren. Im Verlauf der Soaking-Experimente wurden die Solvenskanäle des kovalent verknüpften TGT-Dimers in silico analysiert, um die mutmaßlichen Cutoff-Radien kleiner Moleküle abzuschätzen, die in der Lage sind, frei durch den Proteinkristall zu diffundieren. Die strukturelle Charakterisierung der ersten Hits führte zum rationalen Design von Fragmenten mit optimierten Funktionalitäten, die in der Lage sind, die β1α1-Schleife zu modulieren. Darüber hinaus wurden Bindungsstudien mittels magnetischer Kernspinresonanz (NMR)-Techniken durchgeführt. Obwohl mit einer 19F-basierten Methode keine Bindung nachgewiesen werden konnte, wurden die Bindungskonstanten zweier Fragmente mit Hilfe der diffusionsgeordneten Spektroskopie (DOSY) erfolgreich im mikromolaren Bereich abgeschätzt. Während DOSY für zwei der untersuchten Fragmente Bindungsdaten liefert, erweist sich die Röntgenkristallstrukturbestimmung in Kombination mit Soaking-Experimenten als überlegen bei der Identifizierung von Bindungsereignissen von Fragmenten mit niedriger Affinität. Diese Studie verdeutlicht die Herausforderung bei der Charakterisierung schwacher Binder an einer transienten Bindetasche innerhalb des TGT-Homodimers. Das letzte Projekt initiierte das Design von peptidbasierten Modulatoren, die von der Kontaktfläche des TGT-Dimers abgeleitet wurden (Kapitel 4). Die Idee für diesen Ansatz wurde durch eine Kristallstruktur aus dem zweiten Projekt inspiriert, in der N-terminale Aminosäuren, die zuvor undefiniert in der Elektronendichte vorlagen, durch die exponierte Dimerkontaktfläche eines kristallographischen Symmetriepartners strukturell aufgelöst und stabilisiert wurden. Im funktionalen Dimer wird die Position dieses N-terminalen Anhangs von Helix αE eingenommen, die zwei aromatische Reste des dimerstabilisierenden Hotspots enthält. Dies diente als Ausgangspunkt für die Entwicklung von helikalen Peptiden, die in der Lage sind, mit dem nativen Dimerpartner an der Kontaktfläche zu konkurrieren. Zur Bestimmung des Bindungsepitops an der TGT wurde ein Peptid-Microarray verwendet. Anschließend wurden die vielversprechendsten Peptide synthetisiert und durch Fluoreszenzpolarisation in ihrem Bindungsverhalten charakterisiert. Ein Optimierungsansatz wurde durch konformative Peptidzyklisierung unternommen. Um die Modulation der TGT-Dimerisierung zu untersuchen, wurden zwei biophysikalische, jeweils auf MicroScale-Thermophorese und isothermale Titrationskalorimetrie basierende, Assays entwickelt mit denen Änderungen in den Dimerisierungskonstanten verfolgt werden konnten. Darüber hinaus wurde ein Shigella-Wirtszellinvasionsassay etabliert, um die Pathogenität zweier Shigella flexneri-Stämme zu untersuchen. In Zukunft können die etablierten in-vitro-Assays verwendet werden, um Peptide und Wirkstoffkandidaten für die TGT-Inhibition zu testen. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass Serendipität als Grundlage für die in dieser Arbeit diskutierten Projekte diente. Es konnte gezeigt werden, dass zufällige Entdeckungen aus der Grundlagenforschung genutzt und umgesetzt werden können, um neue Wirkmechanismen aufzudecken oder um neue kleine Molekülfragmente und Peptide als Ausgangspunkt für das gemeinsame Ziel der Modulation herausfordernder Protein–Protein-Interaktionen zu entwerfen., Serendipity has played a historically significant role in science and especially in the discovery of new drugs. Chance discoveries have led to important drug developments that characterize the pharmaceutical industry and our current health care system. Over the last decades, the concept of rational drug design has developed into one of the key approaches to the research of new and specific drugs. Nevertheless, the development of inhibitors for protein–protein interactions, especially oligomeric protein contact surfaces, remains challenging. The bacterial enzyme, tRNA-guanine transglycosylase (TGT), is an example of a homodimer protein and serves as model target protein in this work. This thesis summarizes three projects that were created from serendipitous discoveries of previous studies to develop new approaches for the modulation of the TGT homodimer interface and thus lay out the basis for alternative inhibition pathways in oligomeric enzymes. A previous crystallographic study of TGT–inhibitor complexes revealed an unexpected, twisted arrangement of the TGT homodimer. However, data from the obtained X-ray crystal structures can neither exclude crystallographic artifacts resulting from crystal packing forces nor study the transition between the two dimeric end states. Therefore, a method based on electron paramagnetic resonance (EPR) was established to study this ligand-induced rearrangement mechanism of the TGT homodimer in a solution equilibrium (Chapter 2). For this purpose, paramagnetic spin markers were introduced via site-directed cysteine mutations on the protein surface. The following pulsed EPR techniques enabled the observation of inter-spin distance distributions within the TGT homodimer. During the study, a pyranose-substituted lin-benzoguanine inhibitor was identified to be superior in transforming the functional TGT dimer to its twisted state. Thus, the developed method can be used to distinguish between the functional and twisted TGT dimer species upon ligand addition in a solution equilibrium. A second project comprises the search of small molecule fragments that target a newly discovered transient binding pocket at the homodimer interface of TGT (Chapter 3). In an earlier mutational study, a new crystal form of the TGT dimer was discovered, in which the two protomers are covalently linked by an introduced disulfide bridge. This arrangement breaks up the original dimer interface and exposes a small hydrophobic binding pocket through an extended movement of the nearby β1α1-loop motif. Surprisingly, the newly formed pocket was occupied by a dimethyl sulfoxide molecule. In this work, a further stabilized variant of the disulfide-linked dimer was designed for subsequent fragment soaking studies to target the interface binding pocket. In the course of the soaking experiments, the solvent channels of the covalently linked TGT dimer were analyzed in silico to estimate the putative cutoff radii of small molecules that are capable of freely traversing through the protein crystal. The structural characterization of initial fragment hits led to the rational design of compounds with optimized functionalities which are able to modulate the β1α1-loop. Furthermore, fragment binding studies were attempted by nuclear magnetic resonance (NMR) techniques. Although no binding could be detected using a 19F-based method, the binding constants of two fragments were successfully estimated in the micromolar range using diffusion-ordered spectroscopy (DOSY). While DOSY provides binding data on two of the investigated fragments, structure determination by X-ray crystallography combined with soaking experiments proves to be superior in the identification of fragment binding events. This study highlights the difficulties in characterizing weak binders to a transient interface pocket within the TGT homodimer. The last project initiated the design of peptide-based modulators derived from the interface of the TGT homodimer (Chapter 4). The idea for this approach was inspired by a crystal structure from the second project in which N-terminal residues of TGT, which were usually ill-defined in the electron density, were structurally resolved and stabilized by the exposed dimer contact surface of a crystallographic symmetry mate. In the functional dimer, the position of this particular N-terminal tail is occupied by helix αE, which contains two aromatic residues of the dimer-stabilizing hot spot. This served as a starting point for the development of helical peptides, that are capable to compete with the native dimer partner at the contact surface. A peptide microarray was used to determine the binding epitope to TGT. Subsequently, the most promising peptides were synthesized and characterized with respect to their binding properties by fluorescence polarization. An optimization approach by peptide stapling was attempted. In order to determine the modulation of TGT dimerization, two biophysical assays each based on MicroScale thermophoresis and isothermal titration calorimetry were developed to track changes in the dimerization constants of TGT. Furthermore, a Shigella host cell invasion assay was established to investigate the invasion pathogenicity of a Shigella flexneri Δtgt mutant strain. Henceforth, the established in vitro assays can be further used to characterize potential peptides and drug candidates for TGT inhibition. In conclusion, serendipitous discoveries served as a foundation for the projects discussed in this thesis. It was demonstrated that accidental findings in basic research can be used and acted upon to uncover novel mechanisms of action or for the design of new small molecule fragments and peptides as starting points with the common goal of modulating challenging protein–protein interactions.

In recent years, high-throughput screenings of large libraries of chemical compounds for the discovery of new biologically active substances have become increasingly important for the industrial research. The compounds of those libraries show a high diversity to cover a large chemical space. One disadvantage is, that these compounds mostly have similar molecular weights compared to approved drugs. Since different effects of the individual substituents occur, they cannot be considered separately from each other, so that the effect of the substituents and thus the further optimisation can only be estimated with difficulty. In the fragment-based approach, on the other hand, small molecules are found which can subsequently be adapted to the target protein. Fragments adopt perfect orientations to their target protein, because they only have a few numbers of possible interaction sites and no overlayed effects influence these findings. An example of the consecutive expansion of a fragment to a ligand with nanomolar affinity to PKA is given in chapter 7. Previous studies already showed some possible drug candidates with high affinities to PKA. However, these compounds were only obtained as racemic mixtures, so that the measured affinities do not represent the final values of the individual compounds. Therefore, a stereoselective synthesis was done to obtain the R- and S-enantiomers separated from each other. Surprisingly only the S-configured compound was found in the different crystal structures of the protein-ligand complexes. This indicates a contamination of the supposedly stereoselectively prepared R-configured compound with the S-configured one, which seems to be more potent. Further studies did not resolve, if this could be due to a partial racemisation favoured by the applied synthesis conditions. Finally, from the X-ray crystallographic results, the S-configured β-amino acid derivative is supposed to be the compound with the highest affinity to PKA. Another expansion of fragments was performed in another project (chapter 6). Here, fragments were chosen from an initial in silico screen of a fragment library and expanded follow-up compounds were studied. The fragment library represents an alternative to conventional libraries, as the fragments are derived from natural products. The aim was to find new lead structures for protein kinase A. In a FRET-based assay nine out of 22 follow-up compounds were found to have an inhibitory effect on PKA. However, crystallographic attempts to accommodate the ligands in the active pocket of the PKA using the soaking method have failed. One reason for this could be the steric requirement of the molecules, which prevents diffusion through the solvent channels. Therefore, cocrystallisation experiments were started, which should enable the formation of the protein-ligand complex. For each ligand one cocrystallisation set was prepared, from which crystals could be obtained in seven cases. X-ray crystallographic measurements and the analysis of the data resulted in one hit. Furthermore, adjustments of the crystallisation conditions can still be made to obtain more crystals of the protein-ligand complexes. So far, one protein-ligand complex could be found from an X-ray crystallographic experiment. In the other projects, fragments series were studied to get different informations. For example, in chapter 2, the characteristics of the ATP-binding pocket of protein kinase A could be described by studying the interactions between the chosen fragments with the hinge region of the kinase. This study shows that a carboxylic acid and carboxamide group as well as an amidino group in the uncharged state accomplish the H-bonding pattern of the hinge region. However, this requires the molecule to be equipped with a suitable electron-pushing or pulling group to ensure the protonation state needed. In order to predict such electronic properties, elaborate quantum mechanical calculations are required, which are not yet routinely feasible. In the meantime, the results of this project can be used in addition to existing concepts to serve as a guide for the expansion of initial lead structures. Chapter 3 compares the concept of cocrystallisation with that of soaking. For this, protein-ligand complexes with different ligands were compared by both methods. Different orientations of the structures obtained by both methods were found. For ligands with more degrees of freedom, larger differences were observed. Thus, soaking appears to be well suited for fragments, because of its time- and cost-effectiveness. Compounds with more degrees of freedom should be cocrystallized to present the more reliable picture. X-ray crystallographic screenings of libraries by soaking is very time-consuming. This is especially the case, if the evaluation and interpretation of the data is not fully automated. A method to indicate the binding of chemical compounds to the hinge region of a PKA-crystal is developed and validated in chapter 4. One advantage to see fragment binding by simple means is, that the recording of X-ray crystallographic data can be redundant, if the compounds to be studied actually fails to bind. The applied method is based on a fluorescent reporter ligand, which is first of all populated in the binding pocket of the PKA crystal via soaking. From this time on, the crystal shows a fluorescence emission. By displacement of the reporter ligand, the fluorescence emission should be extinguished. Thus, in the absence of the fluorescence the protein-fragment complex structure to be studied should be measured by X-ray crystallography. In this work, aminofasudil was found to be a suitable reporter ligand and could be displaced by staurosporine and isoquinoline. In the experiment with isoquinoline the crystal unfortunately still emitted fluorescence. Nevertheless, the fluorescence spectrum changed, which could also be used as an indicator for the successful binding of the fragment/ligand of interest. The fragments studied in chapter 5 are based on the natural substrate of PKA (ATP) and an approved drug (Fasudil). The aim was to characterise the binding of these fragments at PKA by isothermal titration calorimetry and X-ray crystallography and to look for possible differences. The smallest compound in this series, isoquinoline, surprisingly shows a high affinity to the target protein. Compared to Fasudil, this molecule binds in an alternative binding pose, even though isoquinoline is a motife in Fasudil. This short example shows, that a development of a drug, based on the crystal structure with isoquinoline, might have resulted in an alternative expansion strategy. On the basis of these findings, an extension in the 6-position instead of the chosen 5-position might have been chosen. In this chapter it is also shown that a bivalent binding motife at the hinge region does not lead to a gain in affinity. This motife is mainly present in the binding event of the weaker binding fragments., In den letzten Jahren kommt in der industriellen Forschung der Hochdurchsatz-Musterung von großen Molekülbibliotheken zur Findung neuer biologisch aktiver Substanzen eine immer größere Bedeutung zu. Diese Bibliotheken zeichnen sich durch eine hohe Diversität aus, sodass ein möglichst großer chemischer Raum abgedeckt wird. Bezüglich ihres Molekulargewichts gleichen die untersuchten Moleküle oftmals dem eines finalen Wirkstoffs. Da hier eine Überlagerung verschiedener Effekte der einzelnen Substituenten auftritt, können diese nicht separat voneinander betrachtet werden, sodass die Wirkung der einzelnen Substituenten und somit die weitere Optimierung nur schwer abgeschätzt werden kann. Beim Fragment-basierten Ansatz hingegen werden kleine Moleküle gefunden, welche in Folge besser an das Zielprotein angepasst werden können. Das ist damit zu begründen, dass Fragmente relativ ungestört mit optimaler Orientierung an das Zielprotein binden können. Ein Beispiel für die sukzessive Erweiterung eines Fragments hin zu einem Binder im nanomolaren Affinitätsbereich ist in Kapitel 7 gegeben. Die vorangegangenen Untersuchungen zeigten bereits verschiedene Wirkstoffkandidaten mit hoher Affinität zu der Proteinkinase A. Allerdings wurden die Verbindungen lediglich als racemische Gemische erhalten, sodass das affinste Derivat in einer neuen Synthese stereoselektiv hergestellt wurde. Allerdings wurde im Zuge dieser Arbeit erneut nur die S-konfigurierte Verbindung in verschiedenen Protein-Ligand-Komplexstrukturen gefunden. Dieses deutet auf eine Verunreinigung der vermeintlich stereoselektiv hergestellten Verbindungen mit dem jeweils anderen Enantiomer hin. Dabei konnte nicht festgestellt werden, ob eine teilweise Racemisierung durch die erforderlichen Synthesebedingungen erfolgte. Abschließend wird aus den röntgenkristallographischen Ergebnissen vermutet, dass das S-konfigurierte β-Aminosäure-Derivat die höchste Affinität zu der PKA aufweist. In einem weiteren Projekt (Kapitel 6) erfolgte ebenfalls eine Erweiterung der Strukturen, welche aus einer initialen in silico Durchmusterung einer Fragment-Bibliothek als Treffer identifiziert wurden. Die Fragment-Bibliothek stellt hierbei eine Alternative zu üblichen Bibliotheken dar, da die Fragmente aus Naturstoffen abgeleitet sind. Mit dieser wurde die Hoffnung verknüpft neue Leitstrukturen für die Proteinkinase A zu finden. Aus 22 Folgeverbindungen konnten in einer Versuchsreihe mit einem FRET-basierten Assay neun Verbindungen gefunden werden, welche eine inhibitorische Wirkung auf die PKA haben. Dieses entspricht einer Trefferquote von 41%. Allerdings sind bisher die kristallographischen Versuche, die Liganden mithilfe der Soaking-Methode in der aktiven Tasche der PKA zu populieren, gescheitert. Ein Grund für das Ausbleiben einer Bindung nach der Soaking-Methode, könnte der sterische Anspruch der untersuchten Moleküle darstellen, welcher die Diffusion durch die Lösungsmittelkanäle verhindert. Daher wurden Kokristallisationsversuche gestartet, welche eine Bildung der Protein-Ligand-Komplexe ermöglichen sollte. Für jeden Liganden wurde je ein Kokristallisationsansatz angefertigt, von dem in sieben Fällen Kristalle erhalten werden konnten. Die röntgenkristallographischen Messungen und die Interpretation der Daten ergaben einen Treffer. Weiterhin können noch Anpassungen der Kristallisationsbedingungen vorgenommen werden, um weitere Kristalle der Protein-Ligand-Komplexe zu erhalten. Bisher konnte ein Protein-Ligand-Komplex röntgenkristallographisch beobachtet werden. In den weiteren Projekten wurden Fragmente untersucht, die noch nicht erweitert wurden. So konnten in Kapitel 2 die Merkmale der ATP-Bindetasche der Proteinkinase A ausgeleuchtet werden, indem hier für eine Reihe von Fragmenten die Wechselwirkungen mit der Scharnierregion der Kinase untersucht wurden. Diese Studie zeigt, dass sowohl eine Carbonsäure- und Carboxamidgruppe als auch eine Amidinogruppe im ungeladenen Zustand das H-Brückenbindungsmuster der Scharnierregion erfüllt. Allerdings muss hierfür das Molekül mit einer geeigneten elektronenschiebenden oder -ziehenden Gruppe ausgestattet werden, um den notwendigen Protonierungszustand sicherzustellen. Um solche elektronischen Eigenschaften vorherzusagen, werden allerdings aufwendige quantenmechanische Berechnungen benötigt, die noch nicht routineweise durchführbar sind. Solange können die in diesem Projekt erhaltenen experimentellen Informationen, neben den bestehenden Konzepten, als Anhaltspunkte für Überlegungen zur Erweiterung von initialen Leitstrukturen dienen. In Kapitel 3 wurde das Konzept der Kokristallisation mit dem des Soakings verglichen, indem Strukturen mit verschiedenen Liganden nach beiden Methoden erhalten wurden. Es zeigten sich unterschiedliche Orientierungen der nach beiden Methoden erhaltenen Strukturen. Diese traten vor allem bei Liganden mit mehr Freiheitsgraden auf. Demnach erscheint das Soaking für Fragmente gut geeignet, zumal das die zeit- und ressourcensparende Methode darstellt. Für größere Verbindungen mit mehr Freiheitsgraden erscheint die Kokristallisation die Methode der Wahl, da sie das zuverlässigere Bild darzustellen scheint. Diese Vermutung wurde durch NMR-Studien bekräftigt, sodass wir uns über unsere Aussage im untersuchten Fall sicher sind. Eine röntgenkristallographische Durchmusterung von Bibliotheken chemischer Verbindungen nach der Soaking-Methode stellt vor allem bei der nicht vollständig automatisierten Auswertung und Interpretation der Daten einen großen Aufwand dar. In Kapitel 4 wird eine Methode entwickelt, um die Bindung von chemischen Verbindungen an die Scharnierregion der PKA im Proteinkristall anzuzeigen. Dadurch wird eine unnötige Aufnahme der röntgenkristallographischen Daten im Falle einer ausbleibenden Bindung der zu untersuchenden Verbindungen vermieden. Das Prinzip beruht auf einen fluoreszierenden Reporter-Liganden, welcher zuvor in der Bindetasche des PKA-Kristalls populiert wird. Dieser Kristall zeigt eine Fluoreszenzemission, welche durch das Verdrängen des Reporter-Liganden ausgelöscht werden sollte. Das Auslöschen der Fluoreszenz zeigt eine Bindung des Test-Liganden an, sodass die Vermessung des Kristalls an einer Strahlenquelle sinnvoll ist. In dieser Arbeit konnte Aminofasudil als ein Reporter-Ligand gefunden werden, welcher von Staurosporin und Isochinolin verdrängt werden konnte. Allerdings wies der Kristall im Fall der Verdrängung mit dem Fragment Isochinolin weiterhin eine Fluoreszenzemission auf, die allerdings eine Änderung des Emissionsspektrums hervorrief. Diese Änderung könnte für das Anzeigen einer erfolgreichen Verdrängung und somit für eine erfolgreiche Bindung des zu untersuchenden Liganden genutzt werden. Vermutet wird, dass diese Änderung auf das Verdrängen des Reporter-Liganden aus der Bindetasche der PKA resultiert, welcher vermutlich weiterhin in den Lösungsmittelkanälen des Kristalls vorhanden ist und das veränderte Fluoreszenzemissionsspektrum bewirkt. Die in Kapitel 5 untersuchten Fragmente basieren auf dem natürlichen Substrat ATP der PKA und dem bekannten Wirkstoff Fasudil. Das Ziel war die thermodynamische und kristallographische Bindungscharakterisierung dieser Fragmente an der PKA und die Klärung möglicher Unterschiede. Interessant ist vor allem die kleinste Verbindung der Serie Isochinolin, welche eine unerwartet hohe Affinität zum Zielprotein zeigt. Außerdem bindet diese, im Vergleich zu dem Wirkstoff Fasudil, in einer alternativen Bindungspose, das Isochinolin als Grundgerüst enthält. Diese Untersuchungen zeigen unter anderem, dass die Entwicklung eines Wirkstoffs auf Grundlage von der Kristallstruktur mit Isochinolin eine alternative Erweiterungsstrategie zur Folge gehabt hätte. Eine Erweiterung wäre demnach in 6-Position anstelle der gewählten 5-Position naheliegend gewesen. Außerdem zeigt sich, dass eine bivalente Bindungsweise an der Scharnierregion zu keiner Affinitätsverbesserung führt und diese vor allem bei den schwächer bindenden Fragmenten vorliegt.

Die hierin vorgestellten Daten zeigen, dass verschiedene Geometrien eines para-Alkylsubstituenten eines Benzolsulfonamidgerüsts einen deutlichen Einfluss auf die thermodynamischen und kinetischen Bindungsparameter haben können und deuten darauf hin, dass die Feinabstimmung der Komplementarität der Molekülgeometrie des Liganden auf die des aktiven Zentrums des Proteins zu einer verlangsamten Dissoziationskinetik des Protein-Ligand Komplexes und somit zu einer längeren Blockade des aktiven Zentrums führen kann. Zusätzlich wurde festgestellt, dass die mit isothermer Titrationskalorimetrie extrahierten kinetischen Daten mit Daten aus Experimenten mit Oberflächenplasmonenresonanz für eine Teilmenge von Verbindungen korrelieren, trotz eines bisher nicht zu erklärenden Unterschieds von einer Größenordnung. Darüber hinaus zeigte die Untersuchung von fluorierten Benzolsulfonamidliganden komplexe strukturthermodynamische und strukturkinetische Beziehungen, die hierin nicht vollständig aufgeklärt werden konnten, aber darauf hindeuten, dass die selektive Fluorierung einer meta-Position des aromatischen Rings hohe Assoziations- als auch niedrige Dissoziationsraten begünstigt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass hochgradiger fluorierte Analoga nicht notwendigerweise einen Vorteil für das thermodynamische oder kinetische Bindungsprofil oder die Affinität selbst haben. Darüber hinaus deuten strukturell ähnliche Liganden mit nur einem para-Substituenten, aber unterschiedlichen Aciditäten darauf hin, dass eine erhöhte Acidität des Liganden erhöhte Assoziationsraten begünstigt. Ein neues Messprotokoll für mikrokalorimetrische Messungen wurde auf seine Präzision hin analysiert und mit anderen möglichen Messprotokollen verglichen und zeigte, dass es sich am besten für die zuverlässige gleichzeitige Ermittlung von thermodynamischen und kinetischen Daten mittels Mikrokalorimetrie eignet. Die mikrokalorimetrische Untersuchung eines bereits bekannten und vermeintlich sehr potenten Carboanhydraseinhibitors zeigte ein unerwartetes zweistufiges Bindungsverhalten, das eine reine 2 : 1 Bindung von Inhibitor und Protein jedoch ausschließt. Zeitabhängige Experimente lassen den Schluss zu, dass der Bindungsvorgang zwischen Protein und Ligand zu einem thermodynamisch und einem kinetisch bevorzugten Komplex führt. Die Untersuchung eines chiralen heterocyclischen Carboanhydraseinhibitors konnte nicht abschließend klären, ob auch das kristallografisch scheinbar nicht bindende Enantiomer auch inhibitorische Wirkung zeigt. Mikrokalorimetrische Untersuchungen weisen jedoch darauf hin, dass unter den experimentellen Bedingungen Racemisierung Auftritt, was die Klärung der ursprünglichen Frage deutlich erschwert. Das Tränken von Carboanhydrasekristallen in Lösungen unterschiedlicher Konzentrationen eines Liganden zeigte, dass die Besetzung einer zweiten Bindestelle zu schwach war, um kristallographisch modelliert zu werden, was die angestrebte Untersuchung der Konzentrationsabhängigkeit der Besetzung unmöglich machte. Konzentrationsunterschiede sorgten jedoch für unterschiedliche Besetzungen des aktiven Zentrums. Ein kristallografisches Modell, das auf Neutronenbeugungsdaten der humanen Carboanhydrase II im Komplex mit Saccharin basiert, wurde nicht erhalten. Es wurde jedoch versucht, den Protonierungszustand von Saccharin an der aktiven Stelle des Enzyms mit Hilfe von hochaufgelösten Röntgenbeugungsdaten durch experimentelle Phasierung zu beurteilen. Die Fortsetzung eines Fragment-Screenings zeigte die Bindung weiterer Kleinmoleküle in Carboanhydrasekristallen. Eine Analyse mit dem Pan-Dataset Density Analysis Programm lässt darauf schließen, dass Elektronendichtekarten stark von der Zeit der Tränkung des Kristalls abhängig sind., The data presented here show that different geometries of para-alkyl substituents of a benzenesulfonamide scaffold can have a significant influence on the thermodynamic and kinetic binding parameters and suggest, that the fine-tuning of the ligand geometry to match the geometry of the active site leads to a reduced dissociation rate of the protein-ligand complex and thus to a prolonged binding in the active site. In addition, it was found that the kinetic data extracted by isothermal titration calorimetry correlate with data from experiments with surface plasmon resonance for a subset of compounds, despite a difference of one order of magnitude that could not be explained so far. Furthermore, the investigation of fluorinated benzenesulfonamide ligands revealed complex structural-thermodynamic and structural-kinetic relationships, which could not be fully elucidated herein, but suggest that fluorination of a meta-position of the aromatic part of the benzenesulfonamide backbone favors high association as well as small dissociation rates. In addition, it has been shown that a higher degree of fluorination does not necessarily have an advantage for the thermodynamic or kinetic binding profile or affnity itself. Furthermore, structurally similar ligands with only one para-substituent but different acidities indicate that the association rate of complex formation benefits from increased acidity. A new measurement protocol for microcalorimetric measurements was analyzed for its precision and compared with other possible measurement protocols and showed that it is best suited for the reliable simultaneous determination of thermodynamic and kinetic data by microcalorimetry. The microcalorimetric investigation of an already known and supposedly very potent Carbonic Anhydrase inhibitor showed an unexpected two-step binding behavior, which, however, excludes a 2 : 1 binding of inhibitor and protein. Time-dependent experiments suggest that the binding process between protein and ligand leads to a thermodynamically and kinetically preferred complex. The investigation of a chiral heterocyclic Carbonic Anhydrase inhibitor could not conclusively clarify, whether the crystallographically apparently non-binding enantiomer also shows inhibitory activity. However, microcalorimetric investigations allow the conclusion that racemization occurs under experimental conditions, which makes the clarification of the original question considerably more difficult. Soaking of Carbonic Anhydrase crystals in solutions of different concentrations of a ligand showed, that the occupancy of a second binding site was too weak to allow modeling of the ligand, which made it impossible to investigate the concentration dependence of the occupancy in this binding site. Concentration differences, however, resulted in different occupancies of the active site. A crystallographic model based on neutron diffraction data of human Carbonic Anhydrase II in complex with saccharin was not obtained. However, an attempt was made to assess the protonation state of saccharin in the active site of the enzyme by experimental phasing using high-resolution X-ray diffraction data. The continuation of a fragment screening showed the binding of further small molecules in Carbonic Anhydrase crystals. An analysis with the Pan-Dataset Density Analysis program suggests, that electron density maps are strongly dependent on the time of soaking of the crystals.

The rapid development of antimicrobial resistance is one of the major challenges facing the global healthcare system. Today, many bacterial species already develop pronounced resistance to a variety of antibiotics. Due to neglected antibiotic research, the development pipeline of novel antibacterial agents has not yielded any innovative lead structures so far. An alternative class of substances are antimicrobial peptides, in particular those with intracellular targets and specific effects. A molecule cluster within this substance class is represented by proline-rich antimicrobial peptides, so-called PrAMPs. Due to their specific intracellular effects such as the inhibition of protein biosynthesis, this group moved into the focus of research. A new proline-rich antimicrobial peptide in salivary excretion of the medicinal leech was identified and characterized. Initially, the sequence obtained by de novo sequencing was synthesized by solid-phase peptide synthesis and its antimicrobial activity was verified. Both gram-groups showed significant inhibitions against reference organisms and up to 50 % growth inhibition against multi-resistant Klebsiella isolates including carbapenem resistance genes and ESBL. The proteolytic activity of the lead structure has also been investigated. In particular, a high stability in human serum and simulated gastric fluid could be demonstrated. Preliminary in vivo data for HP01 were generated in an infection model with Galleria mellonella. The median survival rate of 80 % after seven days post infectum at a drug dose of 10.3 nM was shown, whereas after the same incubation period a lethality of 100 % occurred in the untreated control group. Further work packages generated a large number of derivatives in order to increase the antimicrobial activity of the lead structure. The modified sequences were selected using rational design methods based on already published data from known PrAMPs and defined design rules. Thereby, the main focus was on physicochemical parameters such as net charge and amphiphilicity. After completing the studies on the structure-activity relationships of the derivatives, both the dose-activity profile and the parameters IC50 and MIC, which are important for further development, were significantly improved. Following modification, a MIC of 3.82 nM was reported. Furthermore, investigations were carried out on the cytotoxic potential of the lead structure and its derivatives. The first cell damaging effects for the lead structure could be detected at 14 times the IC50 value in in vitro cell culture models with HeLa cells. For the optimized derivatives, an increase in tolerability could be achieved. Cytotoxic effects only occurred after 50 times the effective concentration. Finally, studies on the mode of action and target identification of the lead structure and its derivatives were carried out. The cellular uptake was studied by confocal laser scanning microscopy. Surface plasmon resonance was used investigating the interaction and binding of the lead structure and its derivatives with the 70S ribosome of gram-negative bacteria. After covalent immobilization of the ribosomes on the sensor chip surface, specific binding constants in the low nM range could be detected. Thereby, the 70S ribosome of gram-negative pathogens could be identified as a possible intracellular target for the identified proline-rich lead structure of salivary excretion of the medicinal leech., Die rasante Entwicklung antimikrobieller Resistenzen stellt eine der größten Herausforderungen für das globale Gesundheitssystem dar. Bereits heute existieren gegenüber vielen Wirkstoffen unterschiedlicher Antibiotikaklassen bereits ausgeprägte Resistenzen vieler bakterieller Spezies. Die Entwicklung neuer antibakterieller Wirkstoffe liefert aufgrund vernachlässigter Antibiotikaforschung bisher keine neuen innovativen Leitstrukturen. Eine alternative Substanzklasse stellen antimikrobielle Peptide dar, insbesondere diese mit intrazellulären Targets und spezifischer Wirkung. Eine Molekülgruppe innerhalb dieser Klasse wird durch prolinreiche antimikrobielle Peptide, so genannte PrAMPs, repräsentiert. Diese Gruppe rückt aufgrund ihrer spezifischen intrazellulären Wirkungen, wie der Hemmung der Proteinbiosynthese in den Fokus der Forschung. Innerhalb dieser Arbeit konnte ein neues prolinreiches antimikrobielles Peptid im Speichel des medizinischen Blutegels identifiziert und charakterisiert werden. Zunächst wurde die durch De-novo- Sequenzierung ermittelte Sequenz über chemische Festphasensynthese synthetisiert und deren antimikrobielle Aktivität verifiziert. Hier konnten signifikante Hemmungen gegenüber Referenzkeimen beider Gramgruppen gezeigt werden, sowie bis zu 50 % Wachstumsreduktion gegenüber multi-resistenten Klebsiella-Stämmen mit Carbapenem- und ESBL-Resistenzgenen. Ebenso wurden Untersuchungen zur proteolytischen Aktivität der Leitstruktur durchgeführt. Insbesondere konnte eine hohe Stabilität in Humanserum und künstlichem Magensaft gezeigt werden. Erste In-vivo-Daten für HP01 wurden in einem Infektionsmodell mit Galleria mellonella generiert. Bei einer Wirkstoffmenge von 10,3 nM konnte sieben Tagen post infectum eine mittlere Überlebensrate von 80 % gezeigt werden, bei der unbehandelten Kontrollgruppe trat hingegen eine Letalität von 100 % auf. In einem weiterem Arbeitspaket wurde eine Vielzahl an Derivaten erzeugt, um die antimikrobielle Aktivität der Leitstruktur zu optimieren. Die Auswahl der modifizierten Sequenzen erfolgte durch rationale Designansätze anhand bereits publizierter Daten bekannter PrAMPs und festgelegter Designregeln. Hauptaugenmerk lag dabei auf physikochemischen Parametern wie Nettoladung und Amphiphilie. Nach Abschluss der Untersuchungen zu Struktur-Wirkungs-Beziehungen der Derivate konnten sowohl das Dosis-Wirkungsprofil als auch die für eine Weiterentwicklung wichtigen Parameter IC50 und die minimale Hemmkonzentration MIC signifikant verbessert werden. Nach Abschluss der Modifikationen konnte eine MIC von 3,82 nM nachgewiesen werden. Desweiteren wurden Untersuchungen zum zytotoxischen Potential der Peptide durchgeführt. Im Zellkulturmodell mit HeLa-Zellen zeigte die Leitstruktur erst ab einer 14-fachen Wirkkonzentration des IC50-Wertes erste zellschädigende Effekte. Für die optimierten Derivate konnte eine Steigerung der Verträglichkeit erreicht werden. Erste zytotoxische Effekte traten erst ab dem 50-fachen der Wirkkonzentration auf. Zuletzt erfolgten Untersuchungen zum Wirkmechanismus und der Targetidentifizierung der Peptide. Es wurde die zelluläre Aufnahme mittels konfokaler Laserscanning-Mikroskopie untersucht. Zur Untersuchung der Wechselwirkung und Bindung der Leitstruktur und aller Derivate mit dem 70S-Ribosom aus gramnegativen Bakterien wurde die Methode der Oberflächenplasmonresonanz eingesetzt. Nach kovalenter Immobilisierung der Ribosomen auf der Sensorchipoberfläche konnten spezifische Bindungskonstanten im einstelligen nM-Bereich nachgewiesen werden. Somit konnte das 70S Ribosom gramnegativer Organismen als mögliches intrazelluläres Target für die identifizierte prolinreiche Leitstruktur aus der Saliva des medizinischen Blutegels identifiziert werden.

Im ersten Teil der vorliegenden Arbeit (Kapitel 1-7) wird ein Syntheseprojekt einer kongenerischen Serie von D-Phe/D-DiPhe-Pro-basierenden Inhibitoren für Thrombin und Trypsin sowie deren biophysikalischen Charakterisierung vorgestellt. Beide Proteine sind strukturell hochgradig verwandte Serinproteasen, die Unterschiede in ihrer Substraterkennung aufweisen. Thrombin ist Arg-spezifisch, während Trypsin Peptidketten nach Lys und Arg spaltet. Sie erkennen die basischen Substratkopfgruppen über Asp189, das sich am Boden der S1-Tasche befindet. Die synthetisierten Inhibitoren werden sowohl kristallographisch für beide Serinproteasen analysiert als auch thermodynamisch über isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) untersucht, um ihre Bindungseigenschaften in der S1-Tasche zu beschreiben und zu vergleichen. Ein enzymkinetischer Fluoreszenzassay unterstützt zudem die biophysikalische Charakterisierung dieser Verbindungen gegenüber beiden Proteinen. Insbesondere steht dabei die Untersuchung von Protonierungseffekten in der S1-Tasche im Vordergrund, um die Selektivitätseigenschaften von Thrombin und Trypsin genauer aufzuklären. Obwohl beide Proteasen eine sehr ähnlich aufgebaute S1-Tasche haben, deuten die Ergebnisse auf einen Unterschied in den elektrostatischen Eigenschaften von Asp189 hin, welcher mit der Substratselektivität korrelieren könnte. Es ist überraschend, dass ein Ligand aus dieser Serie im protonierten Zustand mit seiner P1-Kopfgruppe an Trypsin bindet, während dieser im Komplex mit Thrombin unprotoniert bleibt. Für diesen Liganden wird ein leichter Unterschied bezüglich seiner Solvatationsmerkmale beobachtet. Unsere Daten zeigen, dass diese Unterschiede durch die spezifische Natriumbindestelle verursacht werden können, die nur in Thrombin vorhanden ist, aber in Trypsin fehlt. Während die Unterschiede außerdem durch das geladene Glu192 am Rand der S1-Tasche in Thrombin ausgeprägt werden können, werden sie durch das ungeladene Gln192 in Trypsin nicht beeinflusst. Dabei spielt die Berücksichtigung der verschiedenen pKa-Werte der beteiligten funktionellen Gruppen ebenfalls eine wesentliche Rolle. Weiterhin werden in diesem Teil verschiedene Fragmente sowie D-Phe-Pro-Derivate im Komplex mit beiden Proteinen vorgestellt, deren Bindungseigenschaften in der S1-Tasche charakterisiert und verglichen werden. Im zweiten Teil dieser Arbeit (Kapitel 8-12) wird die Synthese von Aldose-Reduktase-Inhibitoren mit einem 2-Arylcarbamoylphenoxyessigsäure-Gerüst durch die Einführung von verschiedenen Benzylgruppen mit m-ständigen elektronenziehenden Gruppen (hier: Sulfoxid und Boronsäure) vorgestellt. Sie dienen zur Untersuchung der transienten Spezifitätstasche in der Aldose-Reduktase. Elektronenarme aromatische Systeme können eine Öffnung der Spezifitätstasche auslösen und zu bevorzugten Wechselwirkungen mit Trp111 führen. Um den Öffnungsmechanismus dieser transienten Bindetasche genauer zu verstehen, sollten diese synthetisierten Verbindungen auch in verschiedenen Mutationsstudien eingesetzt werden. Unsere ersten kristallographischen Ergebnisse sowie ITC-Experimente zeigen bisher keine eindeutige Interpretation dieses Mechanismus. Unterschiedliche Desolvatationseigenschaften der Inhibitoren können einen Einfluss auf den Mechanismus haben. Der dritte Teil dieser Arbeit (Kapitel 13-17) präsentiert eine weitere synthetische Untersuchung einer Serie von p-alkylierten Benzensulfonamiden und deren Etherderivaten als humane Carboanhydrase II (hCAII)-Inhibitoren, die schrittweise in ihrer Alkylkettenlänge variiert wurden. Während die Sulfonamidgruppe anionisch an Zn2+ bindet, adressiert die aliphatische Alkylkette die hydrophobe Tasche im aktiven Zentrum. Die Bindungsprozesse dieser Verbindungen an diesem Protein wurden kristallographisch, kinetisch und thermodynamisch über ITC analysiert. Es konnten Konformationsänderungen festgestellt werden, deren Effekte die Bedeutung der Formkomplementarität für die Struktur-Bindungsbeziehung aufdecken. Zusätzlich wird in diesem Teil die Synthese von perfluorierten Derivaten vorgestellt, die ein anderes Bindungsmuster in hCAII aufweisen. Sowohl eine kinetische als auch thermodynamische Untersuchung wurde ebenfalls analog zur Studie der nicht-fluorierten Serie durchgeführt. Die Acidität der Sulfonamidgruppe ist durch die stark elektronenziehenden Effekte der Fluorsubstituenten beeinflusst, die vermutlich zum unterschiedlichen Bindungsverhalten des aromatischen Systems im aktiven Zentrum des Proteins führen., The first part of this thesis (chapters 1-7) presents a synthetic and biophysical study of a congeneric series of D-Phe/D-DiPhe-Pro based inhibitors for thrombin and trypsin. Both proteins are structurally highly related serine proteases which show differences in their preferred substrate recognition. Thrombin is Arg-specific, whereas trypsin cleaves peptide chains after Lys and Arg. They recognize the basic substrate head group via Asp189, located at the bottom of the S1 pocket. The synthesized inhibitors are crystallographically analyzed for both serine proteases and thermodynamically investigated by isothermal titration calorimetry (ITC) to describe and compare their binding properties in the S1 pocket. An enzyme-kinetic fluorescence assay also supports the biophysical characterization of these compounds toward both proteins. In order to elucidate selectivity characteristics of thrombin and trypsin more precisely, the protonation effects were investigated in the S1 pocket. Although both proteases have a highly similar S1 pocket, our results suggest a difference in the electrostatic properties of Asp189 which may correlate with their selectivity in substrate recognition. It is surprising that one ligand of the series binds to trypsin in protonated state at its P1 head group while it remains unprotonated in case of thrombin. For this ligand, a slight difference in the residual solvation structures is observed. Our data show that these differences may be caused by the specific sodium binding site which is only present in thrombin, but absent in trypsin. This may be further pronounced by the charged Glu192 at the rim of the S1 pocket in thrombin and is not affected by the uncharged Gln192 in trypsin. Here, the consideration of different pKa values of the involved functional groups also play an essential role. Furthermore, various fragments as well as D-Phe-Pro derivatives are presented in both proteins whose binding properties in the S1 pocket are characterized and compared. The second part of this thesis (chapters 8-12) is a synthetic study of aldose reductase inhibitors with a (2-arylcarbamoyl-phenoxy)-acetic acid scaffold by varying benzyl moieties with different m-substituted withdrawing groups (here: sulfoxide and boronic acid). They are prepared for the investigation of the transient specificity pocket in aldose reductase. Electron-deficient aromatic systems can trigger an opening of the specificity pocket thus lead to favored interactions with Trp111. In order to understand the opening mechanism of this transient binding pocket, these synthesized compounds should be also used in mutagenesis studies. Our first crystallographic results and ITC experiments did not reveal any clear interpretation regarding this mechanism so far. Different desolvation properties of the inhibitors may also have an impact on this mechanism. The third part of this thesis (chapters 13-17) is another synthetic study of a series of p-alkylated benzenesulfonamides and their ether derivatives as human carbonic anhydrase II (hCAII) inhibitors which are varied in their alkyl chain length. While the sulfonamide group binds anionically to Zn2+, the aliphatic alkyl chain addresses the hydrophobic pocket in the active site. The binding events of these compounds in hCAII were investigated crystallographically, kinetically and thermodynamically by ITC. The results demonstrate the conformational changes and reveal effects of the importance of shape complementarity for the structure-binding relationship. Additionally in this part, the synthesis of perfluorinated derivatives are presented which exhibit a different binding pattern in hCAII. A kinetic and thermodynamic study was also performed analogously according to the investigation of the non-fluorinated series. The acidity of the sulfonamide group is influenced by the strongly electron-withdrawing effects of the fluorine substituents which lead to putative different binding characteristics of the aromatic system in the active site of this protein.

Most biomolecular interactions occur in aqueous environment. Therefore, one must consider the interactions between proteins and water molecules when developing a drug molecule against a target protein. The study of these interactions is challenging using experimental techniques alone, therefore computer simulations are commonly used to study the molecular details of protein-water or ligand-water interactions. In the first study presented in this doctoral dissertation (Chapter 2), the development, parameterization and testing of an approach is presented that can be used to calculate the solvation contribution in protein-ligand binding thermodynamics. The approach uses an extensive amount of molecular dynamics trajectories in conjunction with GIST calculations in order to obtain models that can predict relative protein-ligand solvation thermodynamics. In order to validate the approach, the model system thrombin is investigated using a set of 53 ligands with experimentally characterized protein-ligand structures and ITC profiles. We found that the binding thermodynamics of 186 congeneric pairs of ligands can be accurately described using our solvation-based models. The relative free energy of binding for these 186 pairs can be calculated from the desolvation free energy of the ligand molecules alone. Furthermore, complete thermodynamic profiles for protein-ligand binding reactions (i.e. free energy, enthalpy and entropy of binding) are accurately predicted by incorporating GIST solvent data from the unbound ligand as well as the protein-ligand complex. In Chapter 3, the aforementioned approach is applied to develop a strategy that enables to equip drug molecules with a desired set of solvation thermodynamics properties. For this purpose, the thrombin ligands (same ligand series as in previous Chapter 2) and the corresponding GIST integrals are decomposed into smaller building block molecules. In the next step, the solvation thermodynamics for the building blocks in the ligand molecule as well as the solvation thermodynamics for the isolated building block in aqueous solution are calculated. We found greatly varying solvation thermodynamics for the different building blocks, demonstrating their potential to design ligands with a wide range of solvation characteristics. Also, we found that the building block decomposition of ligand molecules and the corresponding GIST integrals can be readily used to understand remote solvent structuring effects. These effects occur in the unbound ligand molecule and describe the enhanced solvent structuring on a building block in the ligand molecule due to the presence of another building block at a distal site of the ligand. Furthermore, we demonstrated that the fluorination of building blocks leads to an increased unfavorable desolvation free energy and thus disfavors binding for the presented dataset. The research presented in Chapter 2 and Chapter 3 was accomplished with the computer program Gips that was developed as part of this doctoral dissertation. In the following Chapter 4, the mechanism and time scale of desolvation is being analyzed for the protein-ligand dissociation reaction of trypsin and thrombin in complex with benzamidine and N amidinopiperidine. The analysis is carried out using umbrella sampling free energy calculations and LoCorA calculations. The LoCorA approach is a method for the analysis of residence times of water molecules on the surface of amino acids. It was found that water molecules reside approximately 1.3 ns in the binding pocket of thrombin, whereas in trypsin they are residing one order of magnitude shorter (0.3 ns). This difference is explained with special solvent channels that connect the interior of the binding pocket to bulk solvent environment. The solvent channels are present in thrombin but not in trypsin. Furthermore, the selectivity profiles of benzamidine and N amidinopiperidine are related to a solvent-mediated free energy barrier that is present in thrombin but not trypsin. Also due to the presence of the solvent channels, the water molecules show similar residence time for both complexes in the case of thrombin but differing residence times in the case of the two trypsin complexes. The LoCorA approach is implemented in the computer program LoCorA (same name as the approach itself), which was developed as part of this doctoral dissertation. In the course of this doctoral dissertation, further computational studies were carried out in combination with experimental ones. These can be found in chapter 5 of this dissertation. Each of these studies is preceded by a separate abstract and a statement concerning the author contribution., Die meisten biomolekularen Interaktionen finden im wässrigen Medium statt. Daher ist es wichtig die Interaktionen zwischen Proteinen und Wassermolekülen in der Wirkstoff-Forschung zu berücksichtigen. Die Untersuchung dieser Interaktionen mittels experimenteller Methoden ist anspruchsvoll, daher werden häufig Computer-Simulationen verwendet um die molekularen Details von Protein-Wasser oder Ligand-Wasser-Interaktionen zu studieren. Im zweiten Kapitel der vorliegenden Doktorarbeit wird die Entwicklung, Parametrisierung und Erprobung eines Ansatzes vorgestellt, der zur Berechnung der Solvatations-Beiträge in Protein-Ligand Bindungsreaktionen verwendet werden kann. Der Ansatz verwendet eine umfassende Menge an Trajektorien aus Moleküldynamik-Simulationen in Kombination mit GIST Berechnungen um Modelle zu erhalten, mit welchen die relativen Beiträge zur Protein-Ligand Solvatations-Thermodynamik vorhergesagt werden können. Um den Ansatz zu validieren wurde das Model System Thrombin mit einem Satz von 53 Liganden mit bekannter Kristallstruktur und ITC Profilen untersucht. Dabei wurde herausgefunden, dass die Bindungs-Thermodynamik von insgesamt 186 Paaren von Liganden genau vorhergesagt werden kann. Die relative Freie Energie der Bindung für diese 186 Paare kann dabei schon alleinig aus der Desolvatation des freien Liganden ermittelt werden. Im Weiteren werden vollständige thermodynamische Profile für Protein-Ligand Bindungsreaktionen korrekt vorhergesagt. Im dritten Kapitel wird der zuvor vorgestellte Ansatz verwendet um eine Strategie zu entwickeln die es ermöglicht Wirkstoffe mit gewünschter Solvatations-Thermodynamik auszustatten. Für diesen Zweck werden die Thrombin-Liganden (gleiche Liganden Serie wie im vorrangegangenen Kapitel 2) in kleinere molekulare Bausteine zerlegt. Im nächsten Schritt wird die Solvatations-Thermodynamik eines jeden Bausteins im Liganden ebenso wie für den isolierten Baustein in wässriger Lösung berechnet. Dabei wurden sehr diverse Eigenschaften für die verschieden Bausteine gefunden, was deren Potential zum Entwurf von Liganden mit einer großen Bandbreite von Solvatations-Charakteristika ermöglicht. Ebenso wurden Fernstrukturierungseffekte von Wassermolekülen entdeckt. Diese Effekte konnten nur durch die Zerlegung der Liganden und der korrespondierenden GIST-Integrale in einzelne Bausteine ermöglicht werden. Die Fernstrukturierungseffekte treten im ungebundenen Liganden auf und beschreiben die verstärkte Strukturierung von Solvens-molekülen auf einer Baueinheit bedingt durch das Vorhandensein einer anderen Baueinheit auf einer entfernten Seite des Liganden. Im Weiteren wurde gezeigt, dass die Fluorierung von Baueinheiten zu erhöhten unvorteilhaften Desolvatationseigenschaften führt. Die Fluorierung führt daher zu einer reduzierten Bindungsaffinität. Die Forschungsarbeiten aus Kapitel 2 und 3 wurden mit Hilfe des Computerprograms Gips durchgeführt, welches im Zuge dieser Doktorarbeit entwickelt wurde. In Kapitel 4 wird der Mechanismus und die Zeitskala der Desolvatation für eine Protein-Ligand Dissoziationsreaktion für die von Trypsin und Thrombin im Komplex mit Benzamidin und N amidinopiperidin untersucht. Die Untersuchung wird durchgeführt mittels „Umbrella Sampling“ und LoCorA Rechnungen. LoCorA ist eine Methode zur Analyse von Besetzungszeiten von Wassermolekülen auf der Oberfläche von Aminosäuren. Damit wurde herausgefunden, dass Wassermoleküle ungefähr 1.3 ns in der apo Bindetasche von Thrombin verweilen, wohingegen sie in der apo Bindetasche von Trypsin um eine Größenordnung kürzer verweilen (0.3 ns). Dieser Unterschied wird mit Solvens-Kanälen im Falle von Thrombin, und mit einem Solvens-Reservoir im Falle von Trypsin erklärt. Die Solvens-Kanäle bedingen, dass Wassermoleküle die gleichen Besetzungszeiten für beide Komplexe zeigen im Falle von Thrombin. Durch das Fehlen dieser Kanäle in Trypsin gibt es hier jedoch unterschiedliche Besetzungszeiten für die beiden Komplexe. Der LoCorA Ansatz ist implementiert in das Computerprogram LoCorA (gleicher Name wie der Ansatz selbst), welches im Zuge dieser Doktorarbeit entwickelt wurde. Weitere Studien die im Zuge dieser Doktorarbeit durchgeführt und mit experimentellen Untersuchungen kombiniert wurden, sind in Kapitel 5 dieser Dissertation zu finden. Zu jeder dieser Studien ist eine separate Zusammenfassung und Erläuterung bezüglich der Eigenanteile vorangestellt zu finden.

Trypanosoma brucei (T. brucei) ist der Erreger der Afrikanischen Trypanosomiasis, einer vernachlässigten Krankheit mit einem endemischen Auftreten in 36 Subsahara-Ländern. Da derzeitige Behandlungmöglichkeiten eine geringe Wirksamkeit und starke Nebenwirkungen aufweisen, sind neue verbesserte Medikamente dringend erforderlich. Stickstoffhaltige Bisphosphonate, die derzeit bei Knochenerkrankungen eingesetzt werden, blockieren das Wachstum der T. brucei Parasiten durch Hemmung der Farnesylpyrophosphat-Synthase (FPPS), sind aber aufgrund ihrer speziellen pharmakokinetischen Eigenschaften nicht für die parasitäre Therapie geeignet. Vor kurzem wurde im humanen FPPS eine zusätzliche allosterische Tasche entdeckt, die basierend auf einer Sequenzanalyse wahrscheinlich auch in T. brucei FPPS vorhanden ist. Die hohe medizinische Notwendigkeit in Kombination mit der Entdeckung einer potenziellen neuen Bindungstasche führte zu einem fragmentbasierten Ansatz zur Entwicklung von neuen nicht-Bisphosphonat-basierten Verbindungen für T. brucei FPPS, welcher in dieser Arbeit vorgestellt wird. Kristallographisches und NMR-basiertes Fragmentscreening wurde durchgeführt. Zu diesem Zweck wurde ein robustes T. brucei FPPS Kristallisationssystem etabliert, das die High throughput Bestimmung von Kristallstrukturen mit einer Auflösung von bis zu 1,67 Å ermöglicht. Strukturelle Überlagerungen zeigten, dass die auf dem humanen FPPS gefundene allosterische Tasche, tatsächlich in T. brucei FPPS existiert. Diese Entdeckung ermöglichte anschließende NMR- und Kristallisationsxperimente mit etablierten humanen FPPS-Verbindungen, die zu drei Protein-Liganden-Komplexstrukturen mit gebundenen Fragmenten in der bisher unbekannten allosterischen Tasche führten. Für die meisten der getesteten Verbindungen lag der durch SPR (Surface plasmon resonance) bestimmte Kd-Wert für T. brucei auβerhalb des experimentellen Testbereichs. Nur für eine Verbindung wurde der Kd-Wert auf T. brucei FPPS bestimmt und war um drei Größenordnungen höher als der IC50 Wert auf dem humanen FPPS. Die Kristallstrukturanalyse ergab unterschiedliche Bindungsmodi auf den beiden FPPS Enzymen und zeigte reduzierte Protein-Ligand-Interaktionen auf T. brucei FPPS, wodurch die deutlich unterschiedliche Bindungsaffinität erklärt werden kann. Ermutigt durch die Entdeckung erster Verbindungen die in der allosterischen Tasche auf T. brucei FPPS binden, wurden Fragment-Pools durch Ligand-NMR im Screen getestet und identifizierte Hits durch Experimente mit einzelnen Verbindungen in Liganden-NMR und Protein NMR weiterverfolgt. Dadurch wurden 25 validierte Fragmente auf T. brucei FPPS entdeckt, die durch Soaking- und Ko-kristallisationsexperimente weiterverfolgt wurden. Kristalldaten wurden mit PanDDA (Pan-Dataset Density Analysis) analysiert und sieben Protein Liganden-Komplexstrukturen wurden gelöst. Von den sieben Fragmenten waren vier Fragmente in der katalytischen Tasche gebunden, ein Fragment wurde in der allosterischen Tasche entdeckt, die als Teil dieser Arbeit identifiziert wurde, und zwei Fragmente waren an Bindungsstellen an der Oberfläche gebunden. Insbesondere ein Fragment mit einem vieratomigen flexiblen Linker, das in der katalytischen Tasche gebunden war, war orthogonal zu den anderen drei Liganden und entlang der Helix αD gebunden. Sechzehn Fragmentanaloge des länglichen flexiblen Fragmentes in der katalytischen Tasche wurden zur Optimierung der Struktur-Aktivitätsbeziehung getestet und eine Kristallstruktur mit einem Fragmentanalogen in der allosterischen Tasche wurde gelöst. Zusätzlich wurden Fragment-Screens durch Kristallisation bei XChem (Diamond, UK) und am EMBL/ESRF (Grenoble, FR) durchgeführt, die zu sieben Protein-Ligand-Strukturen führten. Ein Fragment war in der katalytischen Tasche gebunden, drei Fragmente in der allosterischen Tasche, zwei Fragmente in einer kryptischen Tasche zwischen den Helices αI und αH und ein Fragment auf der gegenüberliegenden Seite der allosterischen Tasche nahe den Helices αG und αF. Die Fragmentbindung wurde zusätzlich in Protein-NMR validiert. Da Fragmente typischerweise eine geringe Bindungsaffinität bis in den mM-Bereich aufweisen, wurde eine strukturbasierte Fragment-Optimierung durch Medizinalchemie durchgeführt. Insgesamt wurden zehn Verbindungen synthetisiert und in Protein-NMR und in Kristallisationsexperimente getestet. Auffallend war ein fusioniertes Fragment basierend auf T. brucei und T. cruzi FPPS Verbindungen. Dieses Fragment ist in einer neuen Bindungsstelle nahe dem zweiten DDxxD Motiv gebunden. Zusammenfassend stellt diese Arbeit hochauflösende Kristallstrukturen von T. brucei FPPS vor und zusätzlich wurden 19 Verbindungen entdeckt, die an sieben verschiedene Bindungsstellen der T. brucei FPPS binden. Dadurch wurde der Weg für zukünftige Studien zur Entdeckung von hochaffinen Nicht-Bisphosphonat-Inhibitoren mit pharmakokinetischen Eigenschaften für parasitäre Indikationen auf T. brucei FPPS geebnet., Trypanosoma brucei (T. brucei) is the causative agent of the Human African Trypanosomiasis (HAT), which is a neglected disease with an endemic occurrence in 36 sub-Saharan African countries. The current standard of care suffers from low efficacy and severe side effects. Therefore, new drugs with better safety and efficacy profiles are urgently needed. Nitrogen-containing bisphosphonates, a current treatment for bone diseases, have been shown to block the growth of the T. brucei parasites by inhibiting farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS); however, due to their particular pharmacokinetic properties they are not well suited for parasitic therapy. Recently, an additional allosteric site was discovered at the surface of human FPPS that, based on sequence analysis, is likely also present in T. brucei FPPS. The high unmet medical need combined with the discovery of a potential new target site prompted a fragment-based drug discovery approach to identify non-bisphosphonate binders on T. brucei FPPS, which is presented in this work. Fragment screening was performed by NMR and X-ray crystallography. To this end, a robust T. brucei FPPS crystallization system was established enabling high-throughput determination of crystal structures up to 1.67 Å resolution. Structural superimpositions revealed that the allosteric site found on human FPPS is in fact present in T. brucei FPPS. This observation enabled subsequent protein-observed NMR and crystal soaking experiments with established human FPPS binders resulting in three protein-ligand complex structures with bound fragments in the previously unknown allosteric site. For most of the tested binders, Kd by SPR was outside of experimental range for T. brucei FPPS and only for one fragment the Kd on T. brucei FPPS was determined three orders of magnitude higher than the IC50 value on human FPPS. Crystal structural analysis revealed a different binding mode on human and T. brucei FPPS with reduced protein-ligand interactions on T. brucei FPPS, which explains the significantly reduced binding affinity. Encouraged by the detection of first allosteric binders on T. brucei FPPS, fragment pools were screened by ligand-observed NMR and identified hits were followed-up by single compound ligand observed NMR and protein-observed NMR resulting in 25 validated fragment hits for T. brucei FPPS. Validated hits were followed-up by crystal soaking and co-crystallization experiments and seven protein-ligand complex structures were solved using PanDDA. Out of the seven fragments, four fragments were bound in the active site, one fragment was detected in the allosteric site that was identified as part of this thesis, and two fragments were bound in surface exposed binding sites. Notably, an active site bound fragment with a four atom long flexible linker adopted an orthogonal binding mode along αD when compared to the other three ligands. Sixteen fragment analogues of the elongated flexible active site fragment were tested by SAR using additional test compounds retrieved from catalogue and archive, and one crystal structure with a fragment analogue was solved and was surprisingly found in the allosteric site. In addition to the NMR fragment screen, an X-ray screen was performed at XChem (Diamond, UK) and at EMBL/ESRF (Grenoble, FR) resulting in seven protein-ligand structures. One fragment was positioned in the active site, three fragments in the allosteric site, two fragments in a cryptic site between helices αI and αH and one fragment at the opposite side of the allosteric site close to αG and αF. Fragment binding was further validated in protein-observed NMR. As fragments identified by such screening approaches typically exhibit low binding affinities usually in µM to mM range, structure-based fragment optimisation based on a fragment merging and growing approach was performed. In total, ten compounds were synthesised and subjected to protein observed NMR and X-ray structural analysis. Strikingly, a fragment merger based on T. brucei and T. cruzi active-site binders bound in a new binding site close to the SARM instead to the active site. Taken together, this work presents high-resolution structures of T. brucei FPPS and identified 19 compounds binding to seven different sites thereby paving the way for future studies aiming to identify high-affinity non-bisphosphonate inhibitors for T. brucei FPPS with pharmacokinetic properties that are suitable for parasitic indications.

Es gibt mehrere biophysikalische Methoden, um schwach bindende Fragmente an einem Zielprotein schnell zu identifizieren. Als eine Methode darunter liefert die Röntgenkristallographie strukturelle Informationen, die für die Optimierung von Fragmenten entscheidend sind. Dabei gibt es mehrere Kriterien, die für ein erfolgreiches Fragmentscreening erfüllt sein müssen, einschließlich der aufwändigen Herstellung von durchtränkbaren („soakable“) und gut streuenden Kristallen. Daher wäre es äußerst vorteilhaft, eine zuverlässige Kaskade von Screening-Methoden zu haben, die vor der arbeitsintensiven Röntgenkristallographie zur Vorselektion eingesetzt werden können. Diese würden das Aussortieren (oder Filtern) von Verbindungen im Laufe des Screenings ermöglichen, sodass nur die vielversprechendsten Treffer übrigblieben. Aber welche Methode sollte diejenige sein, mit der die Screening-Kaskade gestartet wird? In dieser Arbeit wurden verschiedene Varianten von Fragmentbibliotheken gegen drei verschiedene Proteine durchgemustert, und zwar tRNA-Guanin- Transglykosylase (TGT), ein wichtiges Zielprotein bei Shigellose, das membranassoziiertes Protein Peroxin 14 (PEX14) von T. Brucei und Endothiapepsin (EP), eine repräsentative Aspartylprotease, um zu untersuchen, ob verschiedene Screening-Methoden ähnliche Gruppen von vermeintlich bindenden Substanzen aufdecken können. Die detaillierte vergleichende Analyse der Ergebnisse der verschiedenen Methoden wird in dieser Arbeit diskutiert. Die Shigellose, eine akute bakterielle Infektion des Darms, wird durch die Gram-negativen Shigella- Bakterien verursacht. Ihre Pathogenität hängt von Virulenzfaktoren (VirF) ab, deren ungestörte Funktion für die Invasion von Epithelzellen erforderlich ist. Die Expression dieser VirFs wird durch das Enzym TGT moduliert. Zu den Strategien, die zur Hemmung von TGT entwickelt wurden, gehören potente Inhibitoren des aktiven Zentrums, welche die Bindung von tRNA blockieren und so die Transkription der Virulenzfaktoren verhindern. Unsere 96-Fragment-Bibliothek wurde, wie in Kapitel 2 beschrieben, mittels SPR, NMR und Röntgenkristallographie auf TGT untersucht. Insgesamt 81 Fragmente wurden mit der SPR-Methode in einem „Direct Binding Assay“-Ansatz untersucht, was eine Trefferquote von 12% ergab. Insgesamt 77 Fragmente wurden mittels NMR untersucht, was zu einer Trefferquote von 29% führte. Hochauflösende Kristallstrukturen wurden auch für die gesamte Fragmentbibliothek durch Tränken der Kristalle mit den entsprechenden Fragmentlösungen ermittelt, was eine Trefferquote von 8% ergab. Beim Vergleich aller gefundenen Fragment-Treffer wurden keine übereinstimmenden Treffer für alle drei Methoden gefunden. Dafür sind mehrere Faktoren verantwortlich, wie z.B. der Ausschluss mancher Fragmente von einzelnen Screens aus technischen Gründen. Im Einzelnen wurden vier Röntgentreffer aus dem SPR- und NMR-Screening ausgeschlossen, zwei SPR-Treffer aus dem NMR-Screening verworfen und fünf NMR-Treffer wurden nie mit in das SPRScreening einbezogen. SPR und NMR sind derzeit die am häufigsten angewandten primären Fragment- Screening-Techniken, aber unsere Ergebnisse deuten darauf hin, dass sie, wenn sie als einleitende Methoden einer Screening-Kaskade angewandt worden wären, drei potentiell bindende Substanzen übersehen hätten, die von einem später angewandten, aufwändigeren kristallographischen Filter entdeckt wurden. Die Röntgenkristallographie ermöglicht die Detektion spezifisch bindender Substanzen, die allerdings zu schwach binden, um durch SPR und NMR detektiert zu werden. Sie liefern aber dennoch valide Strukturinformationen, um geeigneten Ansatzpunkten für eine Leitstruktur- Entwicklung abzugeben. Darüber hinaus haben MD-Simulationen des apo-Wildtyp TGTs die Öffnung einer transienten Nebentasche oberhalb der Guanin/preQ1-Tasche vorhergesagt. Basierend darauf wurde eine Strategie zur Ausrichtung dieser neuen Bindungsstelle für das Design neuer Inhibitoren gegen TGT nach einem strukturbasierten Wirkstoffdesign-Konzept entwickelt, welches in Kapitel 2.3 diskutiert wird. Die humane afrikanische Trypanosomiasis (HAT), auch bekannt als Schlafkrankheit, ist eine vektorübertragene parasitäre Krankheit, die durch T. brucei verursacht und durch Stiche der Tsetsefliege auf den Menschen übertragen wird. T. brucei fehlt es an einer rückgekoppelten allosterischen Regulation der frühen Schritte in der Glykolyse, sie verfügen aber über die relevanten Enzyme in abgetrennten Organellen, die Glykosome genannt werden. PEX14, ein Peroxinprotein, welches für die Biogenese der Glykosome essenziell ist, bildet eine wichtige Protein-Protein- Interaktion mit PEX5, einem Importrezeptor, der zytoplasmatische glykosomale Enzyme in das Organell transportiert. Die Störung der PEX14/PEX5-Interaktion führt zur Anhäufung von glykosomalen Enzymen im Zytosol, damit zum Abbau von ATP, zur Glukosetoxizität, zum metabolischen Zusammenbruch und am Ende zum Tod von T. brucei. Diese Unterbrechung der Interaktion kann durch kleine Moleküle erreicht werden, die an PEX14 binden, und so die Bindung von PEX5 an PEX14 verhindern. Ein initiales NMR-Screening einer Fragmentbibliothek führte zu Fragment-Treffern, die an die N-terminale Domäne (NTD) von T. brucei PEX14 binden. In der vorliegenden Arbeit wurde versucht, die NMR-Treffer durch Röntgenkristallographie durch Tränkexperimente zu validieren, um die räumlichen Wechselwirkungen der Fragmente sichtbar zu machen. Die vielversprechenden Fragment- Treffer könnten dann zu potenteren Leitsubstanzen optimiert werden. Die Kristallisation des NTD PEX14 mit einer mutierten Variante im ersten Rest (E1W) zeigte blockierte Bindetaschen, wie in Kapitel 3 beschrieben wird. Das hineinmutierte Tryptophans diente dem Zweck, das kurze NTD-Konstrukt mit fluoreszierende Eigenschaften zu versehen, denn dem nativen Protein fehlen fluoreszierende Aminosäuren. Es wurde jedoch festgestellt, dass dieses angefügte Tryptophan die Bindungstaschen seiner benachbarten Kristallpartner im Proteinkristall blockiert, was diese Kristallform für die Tränkungsversuche ungeeignet macht. Versuche, neue Kristallformen mit freien Taschen zu finden, blieben erfolglos, da die geringe Größe des Proteins und die hydrophobe Natur des Tryptophans dicht gepackte Proteinkristalle entstehen lässt, die wechselseitig die Bindungstaschen benachbarter Kristallpartner blockierten. Virtuelles Screening zur Entdeckung neuartiger Liganden für die Co- Kristallisation ergab einen Liganden, der die Kristallisation der E1W PEX14-Variante in eine leicht geänderte Packung unter Erhalt der Raumgruppensymmetrie überführt. Dadurch entstand eine Kristallform, die sich für die Tränkungsexperimente in Fragment-Lösungen geeignet erwies. Sie erlaubte die Bindung von zwei weiteren Fragment-Treffern in anderen Bindetaschen. Weiterhin konnte die Wildtypform von PEX14 kristallisiert werden, welcher der Tryptophanrest fehlt und welche somit in der Packung unbesetzte Bindungstaschen aufweist. Dies ermöglichte das Eindiffundieren eines bereits zuvor synthetisch dargestellten Leitstrukturvorschlags. Es wurde eine Kristallstruktur des Komplexes bei einer Auflösung von 1,8 Å erhalten, in der der Ligand mehrere Taschen der PEX5- Bindestelle besetzt. Dies unterstreicht die Machbarkeit von Wildtyp-PEX14-Kristallen und deren Eignung für ein weiteres Fragmentscreening. Endothiapepsin ist ein Mitglied der pepsinähnlichen Aspartylproteasen, die für die hydrolytische Spaltung von Peptidsubstraten verantwortlich sind. Aufgrund seiner hohen Ähnlichkeit mit anderen pharmakologisch relevanten Aspartylproteasen dient es als Modellenzym für die Untersuchung ihres Mechanismus und das Auffinden erster Leitstrukturen. In früheren Arbeiten anderer Mitglieder unserer Arbeitsgruppe zur Identifizierung und Charakterisierung von Endothiapepsin-bindenden Fragmenten wurde die Röntgenkristallographie als primäre Screening-Methode herangezogen und ihr Potenzial zu identifizieren von Treffern mit mehreren biochemischen und biophysikalischen Screening- Methoden verglichen. Die untersuchte Fragmentbibliothek wurde für ein allgemeines Screening konzipiert und enthielt 361 Einträge. Der Vergleich der Trefferraten der verschiedenen Methoden mit denen der Röntgenkristallographie ergab eine nur geringe Überschneidung, wobei die RDA die höchste Überschneidung bei 7% und MS die niedrigste Überschneidung bei 1% aufweist, gefolgt von STD NMR mit 3%. Um die Gründe für die geringen Überschneidungen zu verstehen, wurden zwei dieser Screening-Techniken für eine genauere Analyse ausgewählt, wie in Kapital 4 beschrieben. Dazu wurden die 71 röntgenkristallographisch detektierten Fragment-Treffer selektiert und mit STD-NMR unter leicht unterschiedlichen Pufferbedingungen sowie mit WaterLOGSY NMR-Experimenten erneut durchmustert. Dieser zweite STD NMR Screen erkannte fast die doppelte Anzahl von Treffern als die erste, und der Water LOGSY Screen hatte mit 69% die höchste Korrelation zwischen den NMR Methoden und den Vorschlägen aus der Kristallographie. Diese vergleichende Analyse zeigte auch, dass Fragmente durch den Einsatz so genannter Reporterliganden nicht, wie gewünscht, räumlicher verdrängt sondern teilweise verschoben werden und dass nicht-deuteriertes Wasser in STD NMR zu falschen Negativen führen kann. Die gesamte 361 Fragment-Bibliothek wurde mittels SPR unter Invertieren des Messprinzips (so genannter „inhibition solution assay“) durchgemustert und als weitere biophysikalische Methode unserer vergleichenden Analyse hinzugefügt. Die erlaubt uns einen weiteren Einblick zu erkennen, welche Bedingungen beim Transfer zwischen verschiedenen Techniken unbedingt eingehalten werden müssen. Die resultierende Trefferrate aus SPR betrug 34%, was einer Überlappung von 11% mit den kristallographischen Treffern entspricht – somit der höchsten Korrelation zwischen den bisher von uns eingesetzten Screeningverfahren. Schließlich haben wir auch die Fragmenttreffer-Erkennung im Rahmen des so genannten „Cocktailing“ für Ergebnisse mit der Kristallographie im Vergleich zu der NMR-Methode untersucht. Dabei ergab sich, dass das „Cocktailing“ in der Kristallographie zu falschen negativen Treffern aufgrund der Kompetition von Fragmenten um den gleichen Bindeplatz führen kann oder abweichende Bindungsmodi für ein bestimmtes Fragment anzeigt werden als diese bei Einzelbestimmungen ermittelt wird. Was die NMRMethode betrifft, so ist trotz der Fähigkeit, konkurrierende Bindungen von Fragmenten im dynamischen Prozess als Bindupngsereignisse nebeneinander zu beobachten, nicht immer gewährleistet. In ca. 20% der von uns untersuchten Beispiele lieferte diese Parallelbindung keine korrekten Hinweise. Weiterhin kann die Erkennung von Fragmenten in der NMR-Methode aus einem Fragment-„Cocktail“ auch davon abhängen, wie der „Cocktail“ zusammengesetzt war., There are several biophysical methods developed to rapidly identify weakly binding fragments to a target protein. X-ray crystallography provides structural information that is crucial for fragment optimization, however there are several criteria that must be met for a successful fragment screening including the production of soakable and well-diffracting crystals. Therefore, having a reliable cascade of screening methods to be used as pre-screens prior to labor-intensive X-ray crystallography would be extremely beneficial. This would allow the filtering of compounds as the screening progresses so that only the most promising hits remain. But which method should be the one to start the screening cascade? In this work, various sets of fragment libraries were screened against three different proteins; namely tRNA guanine transglycosylase (TGT) an important protein in Shigella, membrane associated protein peroxin 14 (PEX14) of T. Brucei, and endothiapepsin (EP), to investigate whether different screening methods will reveal similar collections of putative binders. The detailed comparative analysis of the findings obtained by the different methods is discussed in this thesis. Shigellosis, an acute bacterial infection of the intestine, is caused by the gram-negative Shigella bacterium whose pathogenicity is reliant on virulence factors (VirF) required to invade epithelial cells. The expression of these VirF is modulated by TGT. Strategies developed to inhibit TGT include potent active-site inhibitors to block the binding of tRNA, thereby preventing the transcription of the virulence factors. Our 96-fragment library was screened against TGT using SPR, NMR, and X-ray crystallography, as described in Chapter 2. A total of 81 fragments were screened in SPR using a direct binding assay approach, revealing a hit rate of 12%. A total of 77 fragments were screened in NMR revealing a hit rate of 29%. High-resolution crystal structures were also collected for the entire fragment library by soaking, revealing a hit rate of 8%. Upon comparison of all discovered fragment hits no overlaps from all three methods were found. Several factors are responsible for this finding such as exclusion of fragments from individual screens due to technical reasons. In detail, four X-ray hits were excluded from the SPR and NMR screens, two SPR hits were discarded from the NMR screen, and five NMR hits were never subjected to the SPR screen. SPR and NMR are currently the most commonly applied primary fragment screening techniques, however, our results suggest that if they would have been applied as incipient methods of a screening cascade, they would have missed three binders discovered by a subsequently applied, more elaborate crystallographic screen. X-ray crystallography allows the detection of specific binders that may be too weak binders to be detected by SPR and even by NMR but can still provide valid structural information to support the search for appropriate starting points in lead discovery. Additionally, MD simulations of the apo wild type TGT have predicted the opening of a transient sub-pocket located above the guanine/preQ1 pocket, which suggested a strategy to target this new binding site for the design of new inhibitors against TGT following a structure- based drug design concept which is also discussed in section 2.3. The human African trypanosomiasis (HAT), also known as the sleeping sickness, is a vector-borne parasitic disease caused by T. brucei and transmitted to humans by bites of the tsetse fly. T. brucei lacks feedback allosteric regulation of early steps in glycolysis but compartmentalizes the relevant enzymes within organelles called glycosomes. PEX14, a peroxin protein essential for biogenesis of glycosomes, forms an important protein-protein interaction with PEX5, an import receptor that transports cytoplasmic glycosomal enzymes into the organelle. Disrupting the PEX14/PEX5 interaction leads to the accumulation of glycosomal enzymes in the cytosol, depletion of ATP, glucose toxicity, metabolic collapse and death of T. brucei. This disruption can be achieved through small molecules that bind to and block PEX14, preventing PEX5 binding. A previous NMR screening of a fragment library resulted in fragment hits that bind to the N-terminal domain (NTD) of T. brucei PEX14. In this project, we attempted to validate these hits through X-ray crystallography by soaking, to allow visualization of the fragment interactions. The promising fragment hits would then be optimized into more potent lead compounds. Crystallization of the NTD PEX14 with a mutation in the first residue (E1W) revealed blocked binding pockets, as described in Chapter 3. The purpose of the added tryptophan was to render fluorescent properties to the short NTD construct which lacked fluorescent amino acids. However, this tryptophan was found to block the binding pockets of its neighboring crystal mates in the protein crystal, rendering a crystal form impossible to use for soaking. Attempts to find new crystal forms with free pockets were unsuccessful, as the small size of the protein and the hydrophobic nature of tryptophan rendered tightly packed protein crystals that block the binding pockets of neighboring crystal mates. Virtual Screening to discover novel ligands for co-crystallization revealed a ligand that aids the crystallization of the E1W PEX14 variant in the same space group but with a slightly different packing. This produced a crystal form that proved successful for fragment soaking as it enabled the binding of two additional fragment hits binding to further protein pockets. Additionally, the wild type form of PEX14 which lacks the tryptophan residue and thus has free binding pockets was crystallized. This enabled the soaking of a previously designed lead compound in different pockets of the PEX5 binding site. By obtaining a crystal structure of this complex at a resolution of 1.8 Å, the feasibility of using wild type PEX14 crystals for further fragment screening has been demonstrated. Endothiapepsin is a member of the pepsin-like aspartic proteases responsible for the hydrolytic cleavage of peptide substrates. Owing to its high degree of similarity to other pharmacologically relevant aspartic proteases, it has served as the model enzyme for studying their mechanism and to discover first lead structures. In previous work done by other members from our group to identify and characterize endothiapepsin binders, X-ray crystallography was consulted as a primary fragment screening method and its hit identification potential was compared to several biochemical and biophysical screening methods. The fragment library screened was designed for general purposes and contained 361 entries. Comparison of the overlap in the hit rates of the different methods to that of X-ray crystallography revealed a low overlap, with the RDA having the highest overlap at 7% and MS having the lowest overlap at 1% followed by STD NMR at 3%. To understand the reason behind the low overlap, two of these screening techniques were prioritized for closer analysis as described in Chapter 4. The 71 X-ray detected fragment hits were selected and rescreened again with STD NMR under slightly different buffer conditions, in addition to WaterLOGSY NMR experiments. The second STD NMR screen detected almost double the amount of hits as the initial one, and the Water LOGSY screen had the highest correlation from the NMR methods to the X-ray hits at 69%. This comparative analysis also revealed the phenomena of active site fragment displacement by use of so-called reporter ligands and that non-deuterated water in STD NMR may lead to false negatives. The entire 361 fragment library was also screened with SPR using an inhibition in solution assay, adding another biophysical method for our comparative analysis to give us further insight of which conditions are crucial to maintain while transferring across different techniques. The resulting hit rate from SPR was 34%, correlating to an overlap of 11% with the X-ray hits - the highest correlation between screening methods reported by us thus far. Finally, we also studied fragment detection and cocktailing in crystallography in comparison to fragment cocktailing in NMR. From this we concluded that cocktailing in crystallography can also lead to false negatives due to fragment competitive behavior and can reveal a different binding mode for a given fragment compared to the adopted geometry found when soaked individually. As for NMR, despite the ability to detect competitive binding of fragments due to the temporary binding and unbinding events, the parallel binding and thus detection of fragments is not always guaranteed as seen in 20% of the fragments we screened, in addition to our observation that the detection of fragments in cocktail NMR may also depend on the comparison of the cocktail set they are a part of.

Trypanosoma cruzi (T. cruzi) is the causative agent of Chagas disease (CD), which mostly affects underprivileged populations in South and Central America. The current standard of care for this disease are the two empirically discovered drugs benznidazole and nifurtimox. They show low efficacy, difficulties in administration and severe side effects. Moreover, there are T. cruzi strains that have formed resistances. Thus, the development of a safe and efficient drug is urgently needed. T. cruzi is dependent on isoprenoid biosynthesis as ergosterol and other 24 alkylsterols are essential metabolites that cannot be acquired by other mechanisms. Therefore, it was hypothesised that enzymes along this pathway are promising drug targets. A number of compounds targeting these enzymes were tested and have been shown to inhibit parasite growth. Among those enzymes is farnesyl pyrophosphate synthase (FPPS), a key branch-point enzyme in the isoprenoid pathway, which is in the focus of this work. It catalyses the synthesis of farnesyl pyrophosphate (FPP), a C15 building block in sterol biosynthesis and in protein prenylation of signalling proteins. Bisphosphonates (BPs) are known active site directed FPPS inhibitors, which exhibit ideal pharmacokinetics to target bone mineral and are used to treat bone diseases. BPs can also combat T. cruzi flagellates but are not ideal to treat CD due to their pharmacokinetics. In the search for new chemotypes, several non-BP inhibitors that bind to another pocket were found for human FPPS (hFPPS) by fragment based screening (FBS). Recently, it was shown that the product of FPPS, farnesyl pyrophosphate (FPP), can bind to this pocket and locks the enzyme in an open and inactive state, thus showing the allosteric character of this pocket. The current work aims at the discovery of non-BP inhibitors of T. cruzi FPPS (TcFPPS), which could be starting points for the development of a treatment against CD. Towards this goal, recombinant expression in E. coli cells and purification by means of IMAC and SEC yielded pure und homogenous TcFPPS (chapter 5.1). This includes unlabelled, 13C15N labelled and in vivo biotinylated avi-tagged TcFPPS. Furthermore, a novel, reliable, highly reproducible, and well diffracting crystallization system was established. The system exhibits excellent properties for FBS as it was compatible with different types of 96-well plates. Apo crystals were stable for up to 24 h in 15% DMSO and allowed collection of data sets with a diffraction limit of around 1.6 Å. The best achieved diffraction limit was 1.28 Å for a soaked TcFPPS crystal (PDB ID 6R09). The allosteric region in TcFPPS was investigated by means of sequence analysis and structural superimposition of various orthologous FPPSs (chapter 5.2). This revealed that the allosteric region is less conserved than the active site. Differences among residues in equivalent positions that form the allosteric site were observed, which is surprising if it is assumed that all FPPSs can be product inhibited as hFPPS. A remarkable finding is that residue Phe50 in TcFPPS is an exception in an otherwise highly conserved position. It causes steric hindrance of the pocket in TcFPPS. An attempt to reposition established allosteric inhibitors of hFPPS showed binding affinity to TcFPPS but the two obtained crystal structures demonstrated their binding to sites on the protein surface (sites S1 and S2, PDB IDs 6R08 and 6R07, respectively). The Novartis core and fluorine library (1336 and 482 compounds) were screened on TcFPPS, which resulted in 63 and 45 validated fragment hits, respectively (chapter 5.3). Performing the same screen with T. brucei FPPS (TbFPPS), the causative agent of African sleeping sickness, and counter screening on hFPPS led to unique, pairwise and triple binders demonstrating selectivity at the early stage of FBS. Strikingly, TcFPPS has generally more binders than TbFPPS, and TcFPPS has many unique hits when compared to TbFPPS. Subsequent crystallization experiments with the core library hits resulted in 3D structures of two TcFPPS complexes. One ligand binds to the homodimer interface (site S12) and the other one in the active site. The latter was identified by using the statistical analysis tool Pan-Dataset Density Analysis (PanDDA). FBS by X-ray crystallography at the XChem facility in Harwell, UK, and the HTXlab in Grenoble, France, were conducted (chapter 5.4). The XChem screen identified 35 fragment binders (PDB IDs 5QPD – Z, 5QQ0 – 9, 5QQA – C) in binding sites that were distributed over the entire protein. This includes the active site, the allosteric site, the homodimer interface, sites on the surface and a new site in close proximity to the active site. Strikingly, the first two fragments binding to the allosteric site of TcFPPS in its open state were identified. Rotation of the phenyl side chain of Phe50 led to opening of the former closed pocket. The HTXlab screen identified additional binders for the active and allosteric site. In total 1244 data sets were collected and analysed. This process was accelerated using PanDDA. The first fragment-to-lead optimization by means of virtual screening using the web-based platform ANCHOR.QUERY was based on fragment hit LUY (chapter 5.5). Compounds were synthesised using one-pot one-step multi-component reactions. Synthesis of 11 compounds (MCR 1 – 11) was successful, but poor solubility was detrimental in subsequent testing on TcFPPS and crystallization experiments did not lead to a structural model of a complex. A second fragment to lead optimization using a fragment merging approach for chemical optimization was based on the active site directed binders AWM, LVV, LUY, LDV and AWV (chapter 5.6). A library of 12 compounds (MCN 1 – 12) was synthesised by reductive amination. X-ray structures revealed unexpected binding modes for compounds MCN-1, -4 and -8. Instead of retaining the binding site of the fragment, the merged compounds bind to the surface directed binding site S1 (PDB IDs 6R09, 6R0A, 6R0B). Nevertheless, the 50 new crystal structures of TcFPPS fragment complexes discussed in this work will pave the way for future drug discovery campaigns for CD. The large diversity of the fragments’ scaffolds and different binding sites are potential starting points for inhibitors with different physicochemical properties and a novel mode of action that might help to overcome the limitations related to the BP scaffold., Ziel dieser Arbeit war die Entdeckung von Substanzen, die an T. cruzi FPPS (TcFPPS) binden und nicht der Stoffklasse der Bisphosphonate angehören. Zu diesem Zwecke wurde reines und homogenes TcFPPS durch rekombinante Expression in E. coli Bakterien und anschlieβende Aufreinigung mittels IMAC und SEC erhalten (Kapitel 5.1). Darüber hinaus konnte ein zuverlässiges, reproduzierbares Kristallisationssystem etabliert werden, das Kristalle mit guten Diffraktionseigenschaften liefert. Das System weist ausgezeichnete Eigenschaften für Fragment-basiertes Screening (FBS) auf, da es mit verschiedenen Kristallisationsplatten kompatibel war und Apo Kristalle lieferte, die bis zu 24 h in 15% DMSO stabil waren und die Aufnahme von Datensätzen mit einer Auflösung von etwa 1,6 Å erlaubten. Die höchste erreichte Auflösung für einen TcFPPS Kristall lag bei 1,28 Å (PDB ID 6R09). Die allosterische Tasche in TcFPPS wurde mittels Sequenzanalyse und struktureller Überlagerung verschiedener FPPS Homologe untersucht (Kapitel 5.2). Dabei zeigte sich, dass die allosterische Region in FPPS weniger konserviert ist als das aktive Zentrum. Unterschiede zwischen Aminosäuren an äquivalenten Positionen, die die allosterische Region bilden, wurden festgestellt. Dies ist überraschend, wenn man davon ausgeht, dass dieses Enzym produktinhibiert ist, wie für das humane FPPS (hFPPS) gezeigt werden konnte. Ein interessante Beobachtung war, dass die Aminosäure Phe50 in TcFPPS eine Ausnahme in einer ansonsten hochkonservierten Position ist. Es scheint die Tasche durch sterische Hinderung zu blockieren. Allosterische Inhibitoren von hFPPS wiesen zwar Bindungsaffinität zu TcFPPS auf, aber die beiden erhaltenen Kristallstrukturen zeigten, dass diese an der Proteinoberfläche binden (Bindungsstelle S1 und S2, PDB IDs 6R08 bzw. 6R07). Die Novartis Haupt- und Fluor-Fragmentbibliotheken (1336 und 482 Verbindungen) wurden auf TcFPPS getestet, was zu 63 bzw. 45 validierten Fragmentbindern führte (Kapitel 5.3). Die Durchführung des gleichen Screenings mit T. brucei FPPS (TbFPPS), dem Erreger der Afrikanischen Schlafkrankheit, und Gegenkontrolle auf hFPPS zeigte, dass einige Verbindungen selektiv an nur eines, oder zwei der Proteine binden. Auffallend war, dass TcFPPS im Allgemeinen mehr Binder hatte als TbFPPS, und auch mehr selektive Binder im Vergleich zu TbFPPS. Nachfolgende Kristallisationsexperimente mit den Bindern der Haupt-Fragmentbibliothek führten zu 3D Strukturen von zwei TcFPPS-Komplexen. Ein Ligand bindet an die Grenzfläche des Homodimers und der andere im aktiven Zentrum. Letzterer wurde mit Hilfe des Tools Pan Dataset Density Analysis (PanDDA) identifiziert. FBS mittels Röntgenkristallographie wurden im XChem Labor in Harwell, Großbritannien, und im HTX Labor in Grenoble, Frankreich, durchgeführt (Kapitel 5.4). Der XChem Screen identifizierte 35 Fragmentbinder (PDB IDs 5QPD – Z, 5QQ0 – 9, 5QQA – B) in Bindungsstellen, die über das gesamte Protein verteilt waren. Dazu gehören das aktive Zentrum, die allosterische Bindungsstelle, die Homodimer-Grenzfläche, Bindungsstellen an der Oberfläche und eine neue Tasche in unmittelbarer Nähe des aktiven Zentrums. Erstmals wurden Fragmente identifiziert, die an die allosterische Bindungsstelle von TcFPPS im offenen Zustand binden. Eine Drehung der Phenyl-Seitenkette von Phe50 führte zur Öffnung dieser vorherig geschlossenen Tasche. Der Screen im HTX Labor identifizierte acht weitere Fragmentbinder für die aktive und allosterische Tasche. Die ersten Optimisierungversuche eines Fragments zu einer Leitstruktur erfolgten mittels virtuellem Screening mit dem webbasierten Tool ANCHOR.QUERY. Sie ging von dem Fragmentbinder LUY aus (Kapitel 5.5) und mittels Eintopf-Mehrkomponentenreaktionen wurden 11 Verbindungen synthetisiert (MCR 1 – 11). Allerdings war deren schlechte Löslichkeit in nachfolgenden Tests abträglich, und Kristallisationsexperimente führten nicht zu einem Strukturmodell eines Komplexes. Danach wurde der Ansatz des Fusionierens der Fragmente AWM, LVV, LUY, LDV und AWV für die chemische Optimierung gewählt (Kapitel 5.6). Eine Bibliothek von 12 Verbindungen (MCN 1 – 12) wurde durch reduktive Aminierung synthetisiert. Kristallstrukturen mit den Verbindungen MCN-1, -4 und -8 zeigten unerwartete Bindungsmodi. Anstatt an der Bindungsstelle der Ausgangsfragmente, binden die fusionierten Substanzen an die auf der Proteinoberfläche befindliche Bindungsstelle S1 (PDB IDs 6R09, 6R0A, 6R0B). Die 50 neuen Kristallstrukturen von TcFPPS-Fragment Komplexen, die in dieser Arbeit beschrieben sind, werden neue Impulse für die Medikamentenentwicklung für CD geben. Die große Vielfalt der chemischen Strukturen der Fragmente und die unterschiedlichen Bindungsstellen sind potenzielle Ansatzpunkte für Inhibitoren mit unterschiedlichen physikalisch chemischen Eigenschaften und einer neuartigen Wirkungsweise, die helfen könnten, die mit den Bisphosphonaten verknüpften Einschränkungen zu überwinden.

In der vorliegenden Arbeit wurden unterschiedliche Methoden des computergestützten strukturbasierten Wirkstoffdesigns in verschiedenen Projekten zur Anwendung gebracht. // Es wurden dabei fünf verschiedenen Zielproteine in drei Targetklassen untersucht. (1) Aus der Superfamilie der Aldo-Keto-Reduktasen wurden zwei Mitglieder der Familie 1 untersucht: Zum einen Aldosereduktase, die auf Grund ihrer Beteiligung an diabetischen Komplikationen im fortgeschrittenen Stadium dieser Erkrankung von Interesse ist, zum anderen das Mitglied AKR1B10 dieser Familie, dessen Überexpression mit verschiedenen Krebsarten assoziiert ist. (2) PRMT4 und PRMT6, die als epigenetische Zielproteine ein aktuelles und zukunftsträchtiges Themengebiet darstellen. (3) Ein bakterielles Target in dieser Arbeit stellte die tRNA-Guanin Transglykosylase (TGT) dar, die auf Grund ihrer initialen Funktion in der Aktivierungskaskade des pathogenen Phänotyps von Shigella flexneri ein interessantes Target für die Behandlung der durch Shigellen ausgelösten Bakterienruhr darstellt. //// Aldosereduktase // Die AR gehört zu der Superfamilie der Aldo-Keto-Reduktasen. Als NAD(P)(H)-abhängige Oxidoreduktase ist sie in erster Linie für die Umwandlung von Glukose zu Sorbitol im Polyolweg bekannt. Darüber hinaus leistet sie durch die Reduktion von giftigen Aldehyden und Carbonylen einen wichtigen Beitrag zur Entgiftung des Organismus. Die Aldosereduktase wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Diederich (Marburg) und GE Healthcare Bio-Sciences AB untersucht. Der Fokus dieses Projekts lag auf der Charakterisierung einer Ligandenserie und Untersuchung des Bindungsverhaltens dieser Liganden in Hinblick auf das Öffnungsverhalten der transienten Spezifitätstasche des Proteins. Der Beitrag dieser Dissertation war die Untersuchung der Proteindynamik im Bezug auf diese Tasche und die Analyse und Beschreibung eines möglichen Öffnungsmechanismus. Die Daten für diese Analysen wurden durch molekulardynamische Simulationen gewonnen. Ein weiterer Beitrag war die Durchführung von MM-GBSA-Berechnungen zur Evaluierung der Bindungspräferenz zweier ähnlicher Liganden in Bezug auf die Spezifitätstasche. // AKR1B10 // In diesem Kooperationsprodukt wurden vergleichende Simulationen eines Liganden (JF0064) durchgeführt, um (1) die röntgenkristallographisch beobachtete Protonierung des Liganden im Komplex mit dem Protein zu validieren und (2) strukturelle Einblicke in die Bindungskonformation des Liganden im Komplex mit dem Wildtyp-Protein zu bieten. Die molekulardynamischen Simulationen boten hier einen Einblick in die Struktur des Wildtyp:JF0064-Komplexes, dessen röntgenkristallographische Aufklärung nicht möglich war. // Protein-Arginin-Methyltransferasen // In diesem Kapitel wurden verschiedene Verfahren verwendet, um zwei Aufgabenstellungen umzusetzen. (1) In Kooperation mit der Arbeitsgruppe Bauer wurde ein Homologiemodell für die Gallus gallus PRMT4 erstellt. Bisher wurde in Vögeln, als einziger Klasse der Wirbeltiere, kein PRMT4-Homolog nachgewiesen. Hannah Berberich gelang erstmalig der Nachweis einer putativen Gallus gallus PRMT4 (ggPRMT4). Der Anteil dieser Dissertation war die Erstellung eines plausiblen in silico Modells der ggPRMT4. Dafür wurden verschiedene in silico Methoden miteinander kombiniert. Im Rahmen dieses Projekts wurde zur Erstellung des ggPRMT4-Modells eine Homologiemodellierung kombiniert mit einem Protein-Protein-Docking durchgeführt. Die Validierung und Untersuchung der Dynamik des modellierten Komplexes erfolgte durch ergänzende molekulardynamische Simulationen. (2) Im Rahmen eines Dockings von organischen Kleinmolekülen wurden die beiden Proteine PRMT4 und PRMT6 – ausgehend von bekannten Kristallstrukturen – als Targets adressiert. Diesen Dockingläufen schloss sich die visuelle Inspektion der durch Scoring-Funktionen vorselektierten Moleküle an. Anschließend wurden interessante Verbindungen kommerziell erworben und in Kooperation mit der Arbeitsgruppe Bauer von Antje Repenning in einem Assay getestet. Dabei konnten aktive Substanzen gefunden werden, die nun weiter untersucht werden und als Ausgangspunkte für rationales Wirkstoffdesign dienen können. // tRNA-Guanin Transglykosylase // Dieses Target wurde im Rahmen von zwei Studien untersucht. In (1) wurde zunächst die Dynamik einer bei röntgenkristallographischen Untersuchungen neu entdeckten Subtasche unter der beta1alpha1-Schleife untersucht. Dabei erfolgte die Untersuchung erst mit Hilfe molekulardynamischer Simulationen. Im zweiten Schritt wurde diese Tasche dann in einem Docking mit organischen Molekülen adressiert. In (2) wurde das Öffnungsereignis der transienten erweiterten Guanin/preQ1-Bindetasche durch molekulardynamische Simulationen analysiert., In this thesis different methods of computer-aided drug design have been applied to diverse problems in several projects. // Five different target proteins from three distinct target classes have been investigated. (1) From the super family of aldo-keto reductases, two members of the subfamily 1 have been examined. Firstly, aldose reductase which is of special interest due to its role during complications in advanced states of diabetes. Secondly, another member of the same family: AKR1B10 which is associated with various cancers. (2) Protein arginine methyltransferase 4 (PRMT4) and PRMT6 that represent an up-to-date and seminal topic due to their epigenetic function. (3) A bacterial target represented by tRNA-guanin transglycosylase (TGT). This protein fulfills an initial function in the activation cascade of the pathogenic phenotype of Shigella flexneri and, therefore, serves as an interesting target for the treatment of shigella induced bacillary dysentery. //// Aldose reductase // AR belongs to the super family of aldo-keto reductases. It is a NAD(P)(H) dependent oxidoreductase and, hence, mostly known for the conversion of glucose to sorbitol in the polyol pathway. Furthermore, it contributes to the detoxification of the organism by reducing toxic aldehydes and carbonyls. The Investigations on aldose reductase were conducted in cooperation with the Diederich group (Marburg) and GE Healthcare Bio-Sciences AB. The project was focused on characterizing a ligand series and examining the binding properties of these ligands with regard to opening events of a transient specificity pocket in this protein. This thesis contributed to this via an investigation of protein dynamics related to the pocket and an analysis and description of possible opening mechanisms. The necessary data for the analysis was obtained by conducting molecular dynamics simulations. Furthermore, MM-GBSA calculations were performed to evaluate binding preferences of two similar ligands to the specificity pocket. // AKR1B10 // In this cooperation project, comparative simulations of a ligand (JF0064) were executed to achieve two goals. (1) Validate the protonation state of the ligand in complex with the protein that has been observed in the x-ray structure. (2) Gaining structural insights on the binding conformation of the ligand to the wildtype protein. Since structure determination of the wildtype:JF0064 complex with x-ray crystallography was not possible, these molecular dynamic simulations allowed us to gain an insight on its structure. // Protein arginine methyltransferases // In this project several methods were used to accomplish two different tasks. (1) In cooperation with the Bauer group an homology model of Gallus gallus PRMT4 was built. To date, birds were the only class of vertebrates without experimental proof for an PRMT4 homologue. Hannah Berberich succeeded as the first to prove the existence of putative Gallus gallus PRMT4 (ggPRMT4). This thesis contributed by generating a feasible in silico model of ggPRMT4. Several in silico methods have been used in combination to accomplish this goal. To generate the ggPRMT4 model, homology modeling was combined with protein-protein docking. Furthermore, molecular dynamics simulations were used to validate the model and analyze the dynamics of the modeled complex further. (2) PRMT4 and PRMT6 were addressed as targets in a docking study using small organic molecules and known crystal structures of both proteins. All dockings were further evaluated by visual inspection subsequent to pre-selecting the molecules with a scoring function. Afterwards, interesting compounds were purchased and in cooperation with the BAUER group tested in a biological assay by Antje Repenning. As a result of this process, active compounds were identified. These compounds will now be further characterized and may be used as a starting point for rational drug development. // tRNA-guanin transglycosylase // This target was analyzed in two studies. (1) The dynamics of a, by x-ray crystallographic methods newly discovered, sub-pocket underneath the beta1alpha1-loop were analyzed. Therefore, firstly the pocket was examined via molecular dynamics methods. In a second step, the pocket was addressed by docking with organic molecules. (2) The opening event of the transient extended guanin/preQ1 binding pocket was analyzed with molecular dynamics simulations.

Das primäre Ziel dieser Doktorarbeit war die kristallographische Untersuchung der beiden Kinasen Pim1 und PKA im Komplex mit kleinen Fragment-Molekülen, um ein mögliches Binden solcher Fragmente in den Proteinbindetaschen zu detektieren. In dem ersten größeren Teilprojekt dieser Arbeit wurden vor allem charakteristische Gemeinsamkeiten und Unterschiede zwischen den beiden Kinasen herausgestellt. Die Fragmente für diese Untersuchung stammten aus einer hauseigenen Bibliothek mit 361 Einträgen. Diese Fragmente wurde mittels einer Vorauswahl durch den Thermal Shift Assay auf ihre potentiellen Bindungseigenschaften an beide Kinasen untersucht. Diese Vorauswahl lieferte 31 potentielle Bindungs-Kandidaten für die PKA und in 52 für die Pim1. Die anschließende kristallographische Analyse dieser Treffer ergab, dass bei der PKA 15 Fragmente und bei der Pim1 13 gebunden hatten. Gemessen an den gesammelten Datensätzen für beide Proteine (31 PKA / 15 Pim1) ergab sich eine Trefferquote von 48% für die PKA und eine von 87% für die Pim1. Bedingt durch die Auswahl des Auswahlverfahrens und dem schwierigen Kristallisation-Verfahrens der Pim1-Kinase wurden lediglich drei der 361 Fragmente bei beiden Proteinen gemeinsam gefunden und dann kristallographisch untersucht. Lediglich das Fragment F222 wurde für beide Kinasen als Hit identifiziert. Der Bindungsmodus dieses Fragmentes ist bei beiden Proteinen sehr ähnlich. Dennoch verweist dieser Vergleich auf drei wesentliche Unterschiede in den ATP Bindetaschen, welche die Protein-Ligand-Interaktionen beeinflussen. Die Pim1 weist an der so genannten Hinge-Region Pro123 auf, wodurch ein Wasserstoffbrücken-Donor weniger in der Bindetasche zur Verfügung steht. Die PKA hat durch Thr183 eine weitere polare Seitenkette in der Bindetasche, wogegen die Pim1 dort ein hydrophobes Ile185 aufweist. Zusätzlich besitzt die PKA eine lange C-terminale Schleife, die an der Bindetasche entlang verläuft. Die Seitenkette des dort anliegenden Phe327 ragt aus dieser Schleife in die Bindetasche der PKA hinein, verringert dadurch das zur Verfügung stehende Volumen und verengt den Eingangsbereich. Diese markanten Unterschiede zeigen sich auch an einem leicht unterschiedlichem Bindemodus von F222 in beiden Kinasen. Der TSA hat als Vor-Testverfahren gezeigt, dass eine Anreicherung von kristallographischen Treffern bei den beiden Kinasen erreicht werden kann, da eine stichprobenartige kristallographische Analyse weiterer Kandidaten außerhalb der TSA-Trefferliste eine geringere Trefferquote von 20% aufzeigte. Ebenfalls deutet das Ergebnis der TSA-Analyse auf eine gewisse Selektivität der Fragmente zwischen PKA und Pim1 hin. Im Vergleich zu bereits publizierten PKA- und Pim1-Bindern konnten bekannte sowie neue Gruppierungen für die Proteininteraktionen detektiert werden. In dem zweiten größeren Teilprojekt dieser Arbeit wurde die PKA einer ausschließlich direkten röntgenkristallographischen Durchsuchung mit Fragmenten unterzogen. Eine Bibliothek von 96 Fragment-Verbindungen wurde mittels „Soaking“ auf dieser Kinase getestet. Von 96 gesammelten Datensätzen enthielten 30 einen kristallographisch bestätigten Binder. Dies entspricht einer Treffer-Quote von 31%. Dabei wurden 43 Fragmente einer PKI-gebundenen und 53 Fragmente einer PKI-freien Kristallform der PKA unterworfen. Die entdeckten 30 Treffer teilten sich hälftig in 15 Komplexe der PKI-haltigen und 15 Komplexe der PKI-freien Form auf. Es wurden 24 Fragmente gefunden, welche in der ATP Bindetasche gebunden hatten. Da einige Fragmente mehrfach aufgenommen wurden, konnten 15 Fragmente außerhalb dieser Tasche detektiert werden, sodass insgesamt 39 unterschiedliche Bindeposen detektiert wurden. Die Fragmente in der Bindetasche wurden je nach aufgetretenen Interaktionsmuster klassifiziert. Unterschieden wurde zwischen direkten (12) sowie Wasser-vermittelten (2) „Hinge“-Bindern bzw. direkten (16) oder Wasser-vermittelten (4) DFG-Schleifen-Bindern (4). Die außerhalb der ATP-Bindetasche bindenden Fragmente wurden hinsichtlich ihrer vergrabene Oberfläche mit weiteren in der Packung nahestehenden PKA Molekülen untersucht, um abzuklären, ob der beobachtete Bindungsmodus nur in der Festkörperpackung auftritt und unter Bedingungen in Lösung als Artefakt zu bezeichnen wäre. Insgesamt 5 dieser 15 Fragmente wiesen eine vergleichsweise hohe vergrabene Oberfläche mit Nachbar-Proteinmolekülen auf. Wegen der recht hohen Anzahl an Bindern in der ATP Bindetasche wurde eine topologische Auswertung dieser Tasche angefertigt, in der die detektierten Strukturelemente den verschiedenen Teilregionen dieser Tasche zugeordnet wurden. Im Vergleich mit einer anderen Fragment-basierten Studie aus der Saxty Gruppe an PKA/PKB fielen drei Fragmente aus der vorliegenden Untersuchung auf, die in Struktur und Bindungsmodus Ähnlichkeiten zu einem Inhibitor dieser Studie aufzeigten, der nM Binding aufweist. Diese drei Fragmente legen die Entwicklung eines „zusammengeführten-Liganden“ nahe. Im Laufe dieses Teilprojektes konnte eine neue Kristallform der PKA entwickelt werden, die ohne den Substratinhibitor PKI gewonnen wurde (s. oben). Diese PKA Kristalle zeichneten sich durch eine längere Wachstumsphase aber auch ein verbessertes Streuvermögen aus. Im Durchschnitt hatten die PKI-freien Strukturen eine verbesserte Auflösung von 0,25 Å. Zudem war bei diesen Kristallen die Peptid-Bindestelle zugänglich für Fragmente, was auch durch die Arg-ähnlichen Fragmente J72 und J77 genutzt wurde. Das dritte Teilprojekt dieser Arbeit umfasst einen Teil eines Kooperationsprojektes mit der AG Kolb und der AG Diederich. Hierbei wurden im ersten Schritt Fragment-Moleküle gesucht, die mit den Aminosäuren Glu121 und Lys67 der Pim1 Kinase interagieren. Geeignete Fragmente sollen mit weiteren Synthesebausteinen kombiniert werden, um eine Interaktion mit Asp128 und Glu171 zu erhalten. Für die virtuelle Trefferidentifikation wurde die Datenbank SCUBIDOO verwendet. Die Suche nach geeigneten Fragmenten resultierte in drei Verbindungen, die durch Docking, Ähnlichkeit-Untersuchungen und einer „FCFP4 fingerprint“ - Untersuchung der „Chembridge fragment library“ extrahiert wurden. Ein aufgefundenes Fragment wurde bereits 2012 von Good et. al. in Komplex mit Pim1 publiziert. Wir konnten mit unserem Verfahren dessen Auswahl und Bindung bestätigen und somit auch unser Verfahren auf dessen Funktionalität und Zuverlässigkeit überprüfen. Die Verbindung 4012413 wurde ebenfalls mit der Pim1 kristallisiert. Die resultierende Elektronendichte der vermessenen Kristallstruktur zeigte, dass die Verbindung vermutlich in der Bindetasche gebunden hatte. Allerdings war die Dichte aufgrund der schlechten Qualität des Datensatzes nicht ausreichend für eine zuverlässige Einpassung des Fragmentes. Durch die TSA-Analyse konnten ebenfalls Hinweise erhalten werden, die andeuten, dass die Fragmente an Pim1 binden. Eine erneute Kristallisation der Verbindungen 4012413 und 4012414 stehen in Aussicht. Das vierte Teilprojekt dieser Arbeit beschäftigt sich mit Verbindungen aus der ZINC Datenbank, welche als potentielle Binder der Pim1 Kinase durch Docking identifiziert wurden. Eine Auswahl von 6 Verbindungen zeigten einen vielversprechenden Bindungsmodus im Docking. Eine Analyse der Liganden im TSA hinsichtlich Pim1 ergab, dass mit einer Ausnahme alle Verbindungen einen stabilisierenden Effekt auf Pim1 nehmen. Drei dieser Verbindungen wurden kristallographisch getestet. Zwei zeigten eine Bindung an das Protein. Die Verbindung ZINC08880252 konnte nicht als Binder identifiziert werden und zeigte auch keinen stabilisierenden Effekt im TSA. Die beiden Verbindungen ZINC72154357 und ZINC09314085 ergaben kristallographisch einen anderen Bindungsmodus als in der Docking-Vorhersage. Die Verbindung ZINC09314085 wurde nur teilweise in der Differenzelektronendichte entdeckt. Die Gründe für dieses Verhalten werden im weiteren Fortgang des Projektes geklärt. Die Hydrolyse der zentralen Carbonsäure-Ester Verknüpfung der Verbindung wäre eine mögliche Erklärung. Auch kann der nicht charakterisierte Teil des Liganden ungeordnet oder mit hoher Restmobilität vorliegen und sich daher nicht in der Differenzelektronendichte abzeichnen. Um diese Ansätze zu verfolgen wurde der Ersatz der Esterbindung durch eine Amid-Gruppe, sowie eine massenspektroskopische Analyse initiiert., The primary aim of this thesis was the crystallographic analysis of PKA and Pim1 crystals in complex with small fragment-like molecules to identify potential fragment binders in the protein kinase binding pockets. In the first subproject of this thesis, the similarities and differences between both kinases are highlighted. The fragments used for this study were extracted as a part of an in-house library comprising 361 entries. These fragments were analyzed by TSA as a pre-screening method to evaluate their potential binding to both kinases. This pre-screening resulted in 31 putative binding candidates for the PKA, whereas 52 were identified for Pim1. The subsequent crystallographic analysis of these candidates revealed that 15 fragments had bound to PKA and 13 to Pim1. Referred to the number of collected datasets of each protein (31 PKA / 15 Pim1) this led to a hit rate of 48% for PKA and of 87% for Pim1. Due to the efficient pre-screening selection and the difficult crystallisation of Pim1 complexes, only three of the 361 fragments were commonly studied by protein crystallography with both kinases. Fragment F222 was the only one, which bound to PKA and Pim1. The binding mode of this fragment is similar in both proteins. Nevertheless, three striking differences were detected in the ATP-binding pocket, which influences protein-ligand interactions. Pim1 contains Pro123 in the hinge region, which reduces the number of H-bond donors in the ATP-binding pocket by one. PKA contains the hydrophilic side chain of Thr183 in the binding pocket, whereas Pim1 exposes the hydrophobic Ile185 at the same position. Additionally, PKA exhibits a long C-terminal loop, which is located close to the ATP-binding pocket. The side chain of Phe327 penetrates into the binding pocket of PKA and thus reduces the available space of the pocket and narrows the entrance. These differences in the binding pocket also affect the deviating binding modes of F222 in both kinases. As a pre-screening method, TSA had shown that enrichment of crystallographic hits could be achieved with both kinases, as an additional X-ray analysis of randomly picked test candidates outside the TSA hit list revealed a lower hit-rate of 20%. The overall results of the TSA analyses also provide some ideas about required selectivity features of the fragments between PKA and Pim1. In comparison with already published PKA and Pim1 binders, we could detect either known but also new structural scaffolds for the interactions with the protein. In the second subproject of this thesis, complexes of PKA and fragments were analyzed by direct exposure of soaked crystal to X-ray analysis. A full library with 96 entries was tested. Of these 43 were soaked into a PKI containing crystal form and 53 into a PKI free one. There were 30 crystallographic hits found out of 96 collected data sets. This results in a hit-rate of 31%. The obtained hits were split into 15 PKI-containing and 15 PKI-free complex structures. There were 24 fragments detected to bind in the ATP-binding pocket. Since several fragments bound multiple times in one structure, 15 fragments were detected in a remote position leading overall to 39 different binding poses. The binders of the binding pocket were further classified in terms of their interaction motifs. They were sorted into groups such as direct hinge binders (12), water-mediated hinge binder (2), direct DFG-loop binders (16) and water-mediated DFG-loop binders (4). Remote binding fragments were analyzed in terms of the buried surface area with respect to the proximate PKA molecules to obtain some figures-of-merits, whether binding only occurs in the crystallographic packing and would turn out as ‘artefacts’ during an analysis by a method focussing on conditions in the solute phase. Five of these 15 fragments revealed a relatively high percentage of buried surface area with a neighbouring PKA molecule. Due to the high amount of ATP-pocket binders, a topological map of the pocket was drafted, giving some ideas where the detected structural motifs of the fragments assembled in the different sub-pockets. In comparison with another fragment-based study of the Saxty group with PKA/PKB, three fragments of the current study were conspicuous, which showed similarities in structure and binding mode to a nanomolar inhibitor found in their study. These three fragments indicate how a merged ligand could be formed. In the course of this sub-project, a new crystal form of PKA without the bound peptide inhibitor PKI was obtained (s. above). Growing these PKA crystals required a longer time span, but showed better diffraction properties. In relation to PKI-bound structures, mean improvement in resolution of 0.25 Å could be achieved. Additionally, these new crystals allowed the binding of fragments to the peptide binding site, which was successfully documented by the Arg-mimicking fragments J72 and J77. The third sub-project of this thesis is part of a cooperation project with AG Kolb and AG Diederich. Here, the first step to identify fragment molecules that interact with the amino acids Glu121 and Lys67 of the Pim1 kinase was accomplished. Suitable fragments will be combined with another component to achieve additional interactions with Asp128 and Glu171. We used the database tool SCUBIDOO to identify virtual screening hits. The search for suitable fragments resulted in three compounds, which were detected by docking, similarity search and an FCFP4 fingerprint analysis based on the “Chembridge building block library” (4012413, 4012414 and 5175110). The latter fragment was already published in 2012 by Good et al. in complex with Pim1. We could simultaneously confirm the retrieval and subsequently the binding of this fragment by our procedure and the reliability of our strategy. The compound 4012413 was crystallised with Pim1. The electron density resulting from analysis of the dataset revealed that the ligand had presumably bound in the ATP-binding pocket. However, the observed difference electron density was too poorly defined to assign the ligand precisely into the structure. Testing all three fragments by TSA, suggested binding of all three fragments. Further crystallisation of fragment 4012413 and 4012414 is still pending. The forth subproject of this thesis was focused on compounds extracted from the ZINC databank. They were identified as potential Pim1 binders by docking experiments. A sample of six promising ligands was identified and selected showing a promising binding in the docking prediction. An analysis of these ligands by TSA revealed that all compounds, excluding one, had a stabilizing effect on Pim1, which indicates their binding. Three of these ligands were analyzed crystallographically. Two ligands showed a binding to the protein. The compound ZINC08880252 could not be detected as a binder, and it was the only one lacking any stabilizing effect in TSA. Although the two ligands ZINC72154357 and ZINC09314085 showed a binding, their binding modes deviate from the docking prediction. The ligand ZINC09314085 is only partly represented by the difference electron density. An explanation for this incompletely defined binding is still under investigation. Hydrolysis of its central ester group could be a possible reason or a pronounced partial disorder, or residual mobility is in operation. To investigate this, an exchange of the ester by an amide bond has been initiated, and a mass spectrometric analysis is currently performed.

In der präklinischen Phase einer Wirkstoffentwicklung wird häufig die Affinität einer Verbindung im thermodynamischen Gleichgewicht in Form eines IC50, Kd oder ΔG° Wertes als Referenzparameter für ihre Effektivität als möglicher Wirkstoffkandidat verwendet. Einige der Faktoren, die auf molekularer Ebene zur Affinität einer Verbindung beitragen sind Wasserstoffbrückenbindungen, van der Waals Interaktionen, elektrostatische Wechselwirkungen, sowie hydrophobe Effekte. Mit Hilfe Struktur-basierter Methoden können diese Wechselwirkungen häufig den strukturellen Motiven eines Wirkstoffkandidaten zugeordnet werden. Dadurch kann die gezielte Konstruktion von Molekülen mit gewünschten Eigenschaften ermöglicht werden. Bindungsaffinität kann mithilfe des kinetischen Terms Kd als Quotient der Geschwindigkeitskonstanten von Dissoziation (kd) und Assoziation (ka) ausgedrückt werden. Der thermodynamische Ausdruck ΔG° lässt sich in einen enthalpischen (ΔH°) und einen entropischen Beitrag (–TΔS°) aufteilen. In beiden Fällen sind die molekularen Mechanismen, die die Bindungskinetik definieren oder zur Kompensation von Enthalpie und Entropie beitragen, nur unvollständig verstanden. Das Ziel der vorliegenden Arbeit ist eine detaillierte Untersuchung der molekularen Prozesse, die die Interaktion von Proteinen und ihren Liganden ausmachen. Ein besonderes Augenmerk liegt dabei auf der Aufspaltung thermodynamischer und kinetischer Größen in ihre jeweiligen mikroskopischen Elemente. Hierfür wird die Metalloprotease Thermolysin (TLN) als Modellsystem verwendet. Dieses Protein ist gut charakterisiert und zeichnet sich daher als ein robustes Testsystem mit exzellenten kristallografischen Eigenschaften und einer bekannten Klasse von Inhibitoren aus. In der ersten Publikation (Kapitel 2) wird eine verbesserte Strategie für die Synthese und Aufreinigung von peptidischen Phosphonamidaten vorgestellt, die als potente Inhibitoren von TLN bekannt sind. Die inhärente Labilität der Phosphor–Stickstoff Bindung dieser Substanzklasse erschwert die Einführung polarer funktioneller Gruppen in das Inhibitor-Grundgerüst. Mit Hilfe einer neuen synthetischen Methode kann die Hydrolyse der Verbindungen während der Peptidkupplung, Entschützung und Aufreinigung durch die Verwendung einer Allyl-basierten Schutzgruppenstrategie und einer Festphasenextraktionsmethode auf ein Minimum reduziert werden. Dadurch wird die Darstellung von TLN-Inhibitoren mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen in hoher Reinheit ermöglicht. Die zweite Publikation (Kapitel 3) befasst sich mit einer Methode für den Entwurf neuer Inhibitoren, die auf dem gezielten Design des einen Protein–Ligand Komplex umhüllenden Wassernetzwerks basiert. Basierend auf den Ergebnissen einer vorangegangenen Studie wird die Form eines hydrophoben Teils des TLN-Liganden solcherart verändert, dass eine begünstigte Stabilisierung von Wassermolekülen in der Hydrathülle des Komplexes ermöglicht wird. Unterstützt durch Molekulardynamiksimulationen wird eine Serie diastereomerer Inhibitoren synthetisiert und deren Bindungseigenschaften mittels Röntgenkristallstrukturanalyse, isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) untersucht. Die Optimierung der apolaren P2‘-Gruppe des Inhibitors resultiert in einer 50-fachen Verbesserung der Affinität im Vergleich mit dem ursprünglichen Methyl-substituierten Liganden. Dieser Gewinn wird hauptsächlich durch einen vorteilhaften enthalpischen Term bedingt, der aus einer Stabilisierung polygonaler Wasserstrukturen in der ersten Hydratationsschicht entstammt. In der Folgestudie in Kapitel 4 wird die Binding einer Serie von Inhibitoren untersucht, die eine polare und geladene Gruppe in die Lösungsmittel-exponierte S2‘ Tasche von TLN platzieren. Eine terminale Ammonium-Funktionalität wird hierbei kontinuierlich tiefer in die hydrophobe Umgebung des Proteins gezogen. Die Untersuchung der Kristallstrukturen zeigt, dass die polaren Liganden, im Vergleich mit unpolaren Analoga, keine verstärkte Nahordnung in der umgebenden Wasserstruktur bewirken. Der Beitrag für die partielle Desolvatation der geladenen Gruppe in Kombination mit der Abwesenheit eines starken Wassernetzwerks hat einen empfindlichen Verlust an Bindungsaffinität, hauptsächlich bedingt durch einen ungünstigen enthalpischen Term, zufolge. Die tiefe, hydrophobe S1‘ Tasche von TLN bedingt die Substratspezifität der Protease und wird häufig von potenten Inhibitoren adressiert. Vorangegangene Experimente legen nahe, dass diese Bindetasche in Abwesenheit eines Interaktionspartners jedoch nur unvollständig hydratisiert ist. Die Studie in Kapitel 5 stellt eine experimentelle Untersuchung des Solvatationszustandes der S1‘ Tasche vor. Hierfür wird ein spezieller Inhibitor entwickelt, der die Proteintasche abdeckt. Die so entstandene Kavität bietet weiterhin genug Platz um die Bindung mehrerer Wassermoleküle zu ermöglichen. Die Analyse einer experimentell phasierten Elektronendichtekarte zeigt jedoch, dass die Kavität nicht solvatisiert, und somit vollständig leer ist. Vielversprechend für die Ausnutzung solch unvollständig hydratisierter Taschen für die Entwicklung neuer Arzneistoffe ist die Beobachtung, dass die Platzierung einer iso-Pentyl Gruppe in der P1‘ Position des Liganden eine dramatische, enthalpiegetriebene Erhöhung der Affinität um den Faktor 41.000 zur Folge hat. Eine detaillierte Analyse der Kristallstrukturen einer Serie von chemisch unterschiedlichen TLN-Inhibitoren ermöglicht die Untersuchung der Kinetik des Protein–Ligand Bindungsprozesses in Kapitel 6. Anhand der kinetischen Daten aus SPR Experimenten wird ersichtlich, dass die Art der funktionellen Gruppe in der P2‘-Position des Liganden einen erheblichen Einfluss auf die Dissoziationskinetik aufweist. Diese Eigenschaft kann auf die Interaktion der jeweiligen Funktionalität des Inhibitors mit Asn112, einer Aminosäure, die dafür bekannt ist, ein Substrat für die Peptidspaltung in der Bindetasche auszurichten, zurückgeführt werden. Die Seitenkette dieser Gruppe erfährt eine signifikante Konformationsänderung wenn das Protein aus seiner geschlossenen Form in die offene Konformation übergeht, aus der ein Ligand dissoziieren kann. Eine Beeinflussung dieses Mechanismus durch starke Wasserstoffbrückenwechselwirkungen zu einem Inhibitor führen zu einer Verlangsamung des Dissoziationsprozesses. Aus dem Fall des bekannten Inhibitors ZFPLA wird ersichtlich, dass eine zusätzliche Behinderung der Bewegung von Asn112 durch eine sterische Barriere in der P1-Position des Liganden die Geschwindigkeitskonstante der Dissoziation um einen Faktor von 74.000 verringern kann. Die Fragment-basierte Suche nach neuen Leitstrukturen hat sich als eine potente Strategie für die Entwicklung neuer Wirkstoffe erwiesen. Die niedrige Affinität der Fragmente und die in den initialen Assays häufig verwendeten hohen Konzentrationen begünstigen jedoch das Auftreten falsch positiver Ergebnisse. Die Verfolgung einer solchen „falschen Fährte“ kann mit einem erheblichen Verlust von Zeit und Ressourcen verbunden sein. In Kapitel 7 wird die Affinität eines Moleküls, das in einem Fragment-basierten Screening gegen die Aspartylprotease Endothiapepsin als hochpotenter Binder aufgefallen war, als falsch-positives Ergebnis identifiziert. Umfangreiche Kristallografie-, HPLC- und MS-Experimente zeigen, dass die Bindungseigenschaften, die in mehreren unabhängigen Methoden detektiert wurden, tatsächlich einer anderen Verbindung zugeordnet werden können. Dieses Molekül wird aus der initial eingesetzten Substanz in einer Reaktionskaskade gebildet, die mit einer massiven Umlagerung des heterozyklischen Grundgerüsts einhergeht. Unterstützt durch quantenmechanische Berechnungen und NMR-Experimente wird ein Mechanismus für die Bildung der Verbindung postuliert und deren Bindungsmodus mittels Röntgenkristallografie aufgeklärt., In the pre-clinical development stages of most drug design campaigns, the equilibrium binding affinity of a prospective lead candidate, in the form of an IC50, Kd or ΔG° value, is the most commonly employed benchmark parameter for its effectiveness as a putative drug. Hydrogen bonding, van der Waals and electrostatic interactions, as well as hydrophobic effects are among the most prominent factors that contribute to binding. In structure based design approaches, these interactions can routinely be linked to a structural motif of a drug molecule, which can greatly assist in the construction of compounds with a desired set of properties. Equilibrium binding affinity can also be expressed in terms of kinetics, were the steady-state constant Kd is defined as the ratio of the rate constants of dissociation (kd) and association (ka). The thermodynamic expression ΔG° can be subdivided into an enthalpic (ΔH°) and an entropic (–TΔS°) term. In either case, the molecular mechanisms that define the kinetics of binding or the compensation of enthalpic and entropic contributions are not fully understood. The goal of this dissertation is the in-depth investigation of the molecular processes that drive protein–ligand interactions. A special focus is set on the partitioning of thermodynamic and kinetic parameters into their respective microscopic elements. For this, the metalloprotease thermolysin (TLN) is used as a model system. This protein is well characterized and represents a robust system with excellent crystallographic properties and a thoroughly documented inhibitor class. The first publication (Chapter 2) presents an improved strategy for the synthesis and purification of phosphonamidate peptides that are known as potent inhibitors of TLN. Due to the inherent instability of the phosphorous–nitrogen bond, the introduction of polar functional groups into the inhibitor scaffold is quite challenging. Here, a synthetic strategy is presented that minimizes the amount of hydrolysis during peptide coupling, deprotection and purification through the use of an allyl-based protection system and a solid-phase extraction (SPE) protocol for the final purification step. This allows the synthesis of highly pure TLN inhibitors incorporating a variety of functional groups for use in biophysical experiments. In the second publication (Chapter 3), a strategy for the design of inhibitors is highlighted, which relies on the targeted design of water networks that are formed around a protein–ligand complex. Based on information from a previous study, the shape of a hydrophobic portion of a TLN ligand is altered in a way that allows a beneficial stabilization of water molecules in the first solvation layer of the complex. Supported by molecular dynamics simulations, a series of diastereomeric inhibitors is synthesized and the binding process is characterized by X-ray crystallography, isothermal titration calorimetry (ITC) and surface plasmon resonance spectroscopy (SPR). The optimization of the hydrophobic P2’ moiety results in a 50-fold affinity enhancement compared to the original methyl substituted ligand. This improvement is mainly driven by a favorable enthalpic term that originates from the stabilization of water polygons in the solvation shell. In the follow-up study in Chapter 4, the binding signature of a series of inhibitors that place a charged and polar moiety in the solvent exposed S2’ pocket of TLN is investigated. Here, a partially hydrated ammonium group is gradually retracted deeper into the hydrophobic protein environment. From the crystal structures it is evident that the polar ligands do not recruit an increased amount of water molecules into their solvation layer when compared to related analogues that feature a purely aliphatic residue at the solvent interface. The penalty for the partial desolvation of the charged functional group, in combination with the lack of a strongly ordered water network, results in a severe affinity decrease that is driven by an unfavorable enthalpic term. The deep, hydrophobic S1’ pocket of TLN determines the substrate specificity of the protease and is commonly addressed by high affinity inhibitors. Experimental evidence from previous studies suggests, however, that this apolar crevice is only poorly solvated in the absence of an interaction partner. With the study in Chapter 5, an attempt for the experimental analysis of the hydration state of the S1’ pocket is presented. For this, a special inhibitor is designed that transforms the protein pocket into a cavity, while simultaneously providing enough empty space for the accommodation of several water molecules. A detailed analysis of an experimentally phased electron density map reveals that the cavity remains completely unsolvated and thus, vacuous. As an intriguing prospect for the exploitation of such poorly hydrated protein pockets in drug design, the placement of an iso-pentyl moiety in the ligand’s P1’ position results in a dramatic, enthalpically driven gain in affinity by a factor of 41 000. With a detailed structural analysis of a series of chemically diverse TLN inhibitors, the kinetics of the protein–ligand binding process are investigated in Chapter 6. From the SPR derived kinetic information, it becomes apparent that the nature of the functional group in the P2’ position of a thermolysin inhibitor has a significant impact on its dissociation kinetics. This property can be linked to the interaction between the respective functionality of a ligand and Asn112, a residue that lines the active site of the protease and is commonly believed to align a substrate for proteolytic cleavage. This residue undergoes a significant conformational change when the protein transitions from its closed state to its open form, from which a ligand is released. Interference with this retrograde induced-fit mechanism through strong hydrogen-bonding interactions to an inhibitor results in a pronounced deceleration of the dissociation process. The case of the known inhibitor ZFPLA demonstrates that a further restriction of the rotation of Asn112 by a steric barrier in the P1 position of a ligand, can reduce the rate constant of dissociation by a factor of 74 000. Fragment-based lead discovery has become a popular method for the generation of prospective drug molecules. The weak affinity of fragments and the necessity for high concentrations, however, can result in false-positive signals from the initial binding assays that routinely plague fragment-based screening. The pursuit of such a “red herring” can lead to a significant loss of time and resources. In Chapter 7, a molecule that emerged as one of the most potent binders from an elaborate fragment screen against the aspartic protease endothiapepsin is identified as a false-positive. Detailed crystallographic, HPLC and MS experiments reveal that the affinity detected in multiple assays can in fact be attributed to another compound. This entity is formed from the initially employed molecule in a reaction cascade that results in a major rearrangement of its heterocyclic core structure. Supported by quantum chemical calculations and NMR experiments, a mechanism for the formation of the elusive compound is proposed and its binding mode analyzed by X-ray crystallography.

Water molecules participate besides protein and ligand as an additional binding partner in every in vivo protein–ligand binding process. The displacement of water molecules from apolar surfaces of solutes is considered the driving force of the hydrophobic effect. It is generally assumed that the mobility of the water molecules increases through the displacement, and, as a consequence, entropy increases. This explanation, which is based on experiments with simple model systems, is, however, insufficient to describe the hydrophobic effect as part of the highly complex protein–ligand complex formation process. For instance, the displacement of water molecules from apolar surfaces that already exhibit an increased mobility before their displacement can result in an enthalpic advantage. Furthermore, it has to be considered that by the formation of the protein–ligand complex a new solvent-exposed surface is created, around which water molecules have to rearrange. The present thesis focuses on the impact of the latter effect on the thermodynamic and kinetic binding properties of a given ligand. A congeneric ligand series comprised of nine ligands binding to the model protein thermolysin (TLN) was analyzed to determine the impact of the rearrangement of water molecules around the surface of a newly formed protein–ligand complex on the thermodynamic binding properties of a ligand. The protein–ligand complexes were characterized structurally by X-ray crystallography and thermodynamically by isothermal titration calorimetry (ITC). The only structural difference between the ligands was their strictly apolar P2’ substituent, which changed in size from a methyl to a phenylethyl group. The P2’ group interacts with the flat, apolar, and well-solvated S2’ pocket of TLN. Depending on the bound ligand, the solvent-exposed surface of the protein–ligand complex changes. The ITC measurements revealed strong thermodynamic differences between the different ligands. The structural analysis showed ligand-coating water networks pronounced to varying degrees. A pronounced water network clearly correlated with a favorable enthalpic and less favorable entropic term, and overall resulted in an affinity gain. Based on these results, new P2’ substituents were rationally designed with the aim to achieve stronger stabilization of the adjacent water networks and thereby further increase ligand affinity. First, the quality of the putative water networks was validated using molecular dynamics (MD) simulations. Subsequently, the proposed ligands were synthesized, crystallized in complex with TLN, and analyzed thermodynamically. Additionally, a kinetic characterization using surface plasmon resonance (SPR) was performed. The crystallographically determined water networks adjacent to the P2’ substituents were in line with their predictions conducted by MD simulations. The ligands showed increasingly pronounced water networks as well as a slight enthalpy-drive affinity increase compared to the ligands from the initial study. The ligand with the highest affinity showed an almost perfect water network as well as a significantly reduced dissociation constant. To analyze the influence of the ligand-coating water networks on the kinetic binding properties of a ligand, seventeen congeneric TLN ligands exhibiting different P2’ groups were kinetically (by SPR) and crystallographically characterized. The different degree of the water network stabilization showed only a minor influence on the binding kinetic properties. By contrast, the strength of the interaction between the ligand and Asn112 proved crucial for the magnitude of the dissociation rate constant. A strong interaction resulted in a considerably prolonged residence time of the ligand by hindering TLN to undergo a conformational transition that is necessary for ligand release. In the last study, the reason for the exceptionally high affinity gain for addressing the deep, apolar S1’ pocket of TLN with apolar ligand portions was investigated. Therefore, a congeneric TLN ligand series substituted with differently large apolar P1’ substituents (ranging from a single hydrogen atom to an iso-butyl group) was analyzed. The exchange of the hydrogen atom at the P1’ position with a single methyl group already results in a 100-fold affinity increase of the ligand. To elucidate the molecular mechanism behind this considerable affinity gain, the solvation state of the S1’ pocket was carefully analyzed. The results strongly indicate that the S1’ pocket is completely free of the presence of any water molecules. Thus, the huge affinity gain was attributed to the absence of an energetically costly desolvation step. The data presented in this thesis show that to describe the thermodynamic signature of the hydrophobic effect it is necessary to explicitly consider the change of the thermodynamic properties of every involved water molecule. Solely considering the buried apolar surface area and assigning an entropic term to it is not sufficient. The increasing stabilization of the water network adjacent to the protein-bound ligand represents a promising approach — quite independent of specific properties of the target protein — to optimize the thermodynamic profile of a given ligand. This approach also allows fine-tuning of the kinetic binding parameters., Wassermoleküle nehmen neben Protein und Ligand als zusätzlicher Bindungspartner an jedem in vivo Protein–Ligand Bindungsprozess teil. Die Verdrängung von Wassermolekülen von apolaren Oberflächen gelöster Moleküle in die umgebende flüssige Phase wird als treibende Kraft des hydrophoben Effekts angesehen. Die gängige Annahme ist, dass die Beweglichkeit der Wassermoleküle durch ihre Verdrängung erhöht wird, was einen Anstieg der Entropie zur Folge hat. Diese Erklärung, die auf Experimenten mit einfachen Modellsystemen beruht, reicht jedoch nicht aus, um den hydrophoben Effekt als Teil eines hochgradig komplexen Protein–Ligand Komplexbildungsprozesses zu beschreiben. So kann zum Beispiel die Verdrängung von Wassermolekülen von apolaren Oberflächen, die bereits vor der Verdrängung eine erhöhte Beweglichkeit aufweisen, zu einem enthalpischen Vorteil führen. Desweiteren muss berücksichtigt werden, dass durch die Bildung des Protein–Ligand Komplexes eine neue, zur Wasserphase hin exponierte Oberfläche ausgebildet wird, um die sich Wassermoleküle neu anordnen müssen. Diese Arbeit behandelt den Einfluss dieses Effektes auf die thermodynamische und kinetische Bindungseigenschaft eines Liganden. Um den Einfluss der Neuanordnung von Wassermolekülen um die Oberfläche eines neu gebildeten Protein–Ligand Komplexes auf das thermodynamische Bindungsprofil eines Liganden zu ermitteln, wurde eine homologe Serie aus neun Liganden, die an das Modellprotein Thermolysin (TLN) binden, analysiert. Die Protein–Ligand Komplexe wurden strukturell mittels Röntgenkristallographie und thermodynamisch mittels isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) charakterisiert. Der einzige strukturelle Unterschied zwischen den Liganden stellte deren strikt apolarer P2‘ Substituent dar, dessen Größe von einer Methylgruppe bis zu einer Phenylethylgruppe variiert wurde. Die P2‘ Gruppen adressieren die flache, apolare und gut solvatisierte S2‘ Tasche von TLN. Je nach gebundenem Ligand ändert sich die Form der wasserexponierten Oberfläche des Protein–Ligand Komplexes. Die ITC Messungen ergaben starke thermodynamische Unterschiede zwischen den einzelnen Liganden. Die strukturelle Analyse zeigte eine unterschiedlich starke Ausprägung der die gebundenen Liganden überziehenden Wassernetzwerke. Ein ausgeprägtes Wassernetzwerk korrelierte deutlich mit einem günstigen enthalpischen und einem ungünstigen entropischen Beitrag, und insgesamt mit einem Affinitätsanstieg. Auf diesen Ergebnissen aufbauend wurden zusätzliche P2‘ Substituenten rational entworfen mit dem Ziel eine stärkere Stabilisierung der angrenzenden Wassernetzwerke zu erreichen und dadurch die Ligandaffinität weiter zu erhöhen. Zunächst wurde die Qualität der putativen Wassernetzwerke mittels molekulardynamischer (MD) Simulationen validiert. Anschließend wurden die vorgeschlagenen Liganden synthetisiert, im Komplex mit TLN kristallisiert und thermodynamisch analysiert. Eine kinetische Charakterisierung mittels Oberflächenplasmonresonanzspektroskopie (SPR) wurde ebenfalls durchgeführt. Die an die P2‘ Substituenten angrenzenden, kristallographisch bestimmten Wassernetzwerke entsprachen den Vorhersagen der MD Simulationen. Die Liganden zeigten ausgeprägtere Wassernetzwerke sowie eine leichte, enthalpiegetriebene Affinitätserhöhung im Vergleich zu den Liganden der ersten Studie. Der Ligand mit der höchsten Affinität zeigte ein nahezu perfektes Wassernetzwerk sowie eine signifikant reduzierte Dissoziationskonstante. Um den Einfluss der ligandüberziehenden Wassernetzwerke auf die kinetischen Bindungseigenschaften eines Liganden zu untersuchen, wurden 17 homologe TLN Liganden mit unterschiedlichen P2‘ Gruppen kinetisch mittels SPR und kristallographisch charakterisiert. Die Wassernetzwerkstabilisierung zeigte nur einen geringen Einfluss auf die Bindungskinetik. Im Gegensatz dazu erwies sich die Stärke der Interaktion zwischen Ligand und Asn112 als bestimmend für die Größe der Dissoziationskonstante. Eine starke Wechselwirkung führte zu einer deutlichen Verlängerung der Aufenthaltszeit des Liganden durch die Erschwerung einer konformativen Änderung von TLN, die jedoch notwendig für die Freisetzung des Liganden ist. In der letzte Studie wurde die Ursache für den außergewöhnlich großen Affinitätsanstieg bei einer Adressierung der tiefen, apolaren S1‘ Tasche von TLN mit apolaren Ligandgruppen untersucht. Dafür wurde eine homologe TLN Ligandserie mit unterschiedlich großen, apolaren P1‘ Gruppen (von einem Wasserstoffatom bis zu einem Isobutylrest) analysiert. Bereits der Austausch des Wasserstoffatoms an der P1‘ Position durch eine Methylgruppe führte zu einem 100-fachen Affinitätsanstieg des Liganden. Um den molekularen Mechanismus hinter dieser Affinitätssteigerung aufzuklären, wurde die S1‘ Tasche genau auf ihren Solvatationszustand hin untersucht. Die Ergebnisse sprechen deutlich dafür, dass die S1‘ Tasche komplett frei von Wassermolekülen ist. Die Affinitätssteigerung wurde deshalb auf das Fehlen eines energetisch kostspieligen Desolvatationsschrittes zurückgeführt. Die im Rahmen dieser Arbeit diskutierten Daten legen dar, dass für die thermodynamische Beschreibung des hydrophoben Effekts die Änderung des thermodynamischen Zustandes jedes einzelnen involvierten Wassermoleküls explizit berücksichtigt werden muss. Die alleinige Berücksichtigung der vergrabenen Oberfläche und die Zuweisung eines entropischen Beitrags ist nicht ausreichend. Die Erhöhung der Stabilisierung der Wasserstruktur, die angrenzend an einen proteingebundenen Liganden ausgebildet wird, stellt ein generelles und planbares — und vom Zielprotein relativ unabhängiges — Konzept dar, um das thermodynamische Profil eines gegebenen Liganden zu optimieren. Zu gewissem Maße kann dadurch auch Einfluss auf die Bindungskinetik genommen werden.

The work focuses on the evaluation and comparison of different fragment-based approaches, for which purpose the model system Endothiapepsin (EP) has been used. The enzyme belongs to the family of aspartic proteases. We used the 361-entry in-house fragment library compiled with physico-chemical properties similar to the rule-of-three. We applied six different techniques to screen the fragment library: saturation-transfer difference NMR (STD-NMR), thermal shift assay (TSA), reporter-displacement assay (RDA), microscale thermophoresis (MST), fluorescence-based biochemical assay (HCS), and native mass spectrometry (MS). Alarmingly, the overlap between the hits produced by all six methods was very low. While only 41 out of all 361 fragment library entries could be identified by at least two methods, only 3 were identified by five methods, and no single fragment was identified as hit by all six methods taken together (chapter 2). We thus performed X-ray crystallography with individual fragments soaked to beforehand prepared apo EP crystals. For this purpose very high fragment concentrations of 90 mM were used. Intriguingly, we were able to identify 71 fragment hits as bound to EP, corresponding to 20% hit rate. Worryingly, only 30% of the 71 hits were predicted by only one of the beforehand applied screening techniques, clearly emphasizing that any screening strategy comprising at least two prescreening methods would have been able to identify only 19 (27%) of the 71 crystallographic hits. We divided the hits into two main groups: catalytic dyad binders and remote binders. Chapter 3 deals with the catalytic dyad binders. Therein we describe a variety of warheads which address the catalytic aspartates either directly or via the catalytic water molecule W501, while occupying the S1 and S1’ binding pockets. Furthermore, we found fragments, which occupied both pockets simultaneously, offering an optimal platform for further optimization strategies into both directions. The very useful information regarding preferred spots of binding remote from the catalytic dyad is described in detail in chapter 4. The so called hot spots represent key pocket residues, which have to be addressed in an optimization procedure in order to achieve optimal ligand binding. The high-throughput potential of X-ray crystallography (chapters 3 and 4) compared to the other six prescreening techniques presented in chapter 2 is still very low. Because of this, a lot of effort has been invested in academia and industry to extend the method’s applicability as a primary screening technique. Whenever used as such, practitioners exposed protein crystals to a mixture of compounds to accelerate the hit identification. However, we cannot recommend the use of cocktail experiments with clear conscience as we believe that parameters such as compound solubility, chemical reactivity, and crystal damage, often resulting in reduced ligand occupancy, diffuse electron density, or deviating fragment binding poses are provoked by the presence of multiple compounds in a mixture. These issues are exemplified in chapter 5 where we directly compared the difference electron density in the binding pocket of EP between singly soaked fragments and cocktails prepared those. For example, many of the fragments used in a mixture of two failed to be identified as hits, whereas clear density around those fragments could be observed in the single soaking experiments. Moreover, the clear assignment of a fragment to diffuse electron density usually requires additional experiments, which confirm the binding site. When considering this, even more time has to be spent, which extremely slows down the hit identification procedure. The only plausible reason to use several compounds in a mixture is when the reaction between those is aimed. This is an approach named dynamic combinatorial chemistry (DCC) and described in chapter 6. The compounds, hydrazides and aldehydes, chosen for the mixtures react with one another with dehydration to larger acylhydrazones. The formation of the strongest binders among others, acylhydrazones (S)-H4-A4 and (R)-H3-A5, was induced by the natural selection by the target protein EP. Moreover, in a follow-up optimization project, which started based on the binding modes of the two acylhydrazones, the combination of a bis-aldehyde with hydrazides resulted in the natural selection of a bis-acylhydrazone by EP, with an 240-fold improved potency compared to the initial acylhydrazones., Die Arbeit beruht auf der Auswertung und dem Vergleich verschiedener, fragmentbasierter Verfahren, für welche Zwecke das Modelprotein Endothiapepsin (EP) verwendet wurde. Das Enzym gehört zu der Familie der Aspartylproteasen, deren Vertreter in die Pathogenese schwerer Krankheiten wie Malaria, Alzheimer, AIDS, Bluthochdruck, und Pilzinfektionen involviert sind. Eine interne Fragmentbibliothek wurde verwendet, die 361 Fragmente enthält und die auf der Grundlage von physikalisch-chemischen Eigenschaften ähnlich der Astex rule-of-three basiert. Um diese zu durchmustern, wurden sechs verschiedene Screeningmethoden angewendet: Sättigungstransferdifferenz mit Kernspinresonanz (STD-NMR), thermal shift Assay (TSA), Reporterverdrängungsassay (RDA), Thermophorese (MST), ein fluoreszenzbasierter biochemischer Assay (HCS), und Massenspektrometrie (MS). Im Allgemeinen haben die RDA und HCS Assays eine vergleichbare Anzahl an Hits gezeigt (50 (RDA) gegenüber 56 (HCS)). Jedoch ist die Anzahl der Hits für die TSA und MS Assays drastisch geringer (25 (TSA) gegenüber 8 (MS)), obwohl die Gesamtzahl der verwendeten Fragmente in allen vier Assays sehr ähnlich war (325 (RDA), 358 (HCS), 330 (TSA), und 342 (MS)). Auffällig ist allerdings die geringe Überlappung der Hits, die von jeder der sechs Methoden detektiert wurden. Während nur 41 von 361 Fragmenten in der Bibliothekdatenbank von mindestens zwei Methoden detektiert werden konnten, waren es nur drei, die von fünf Methoden und kein einziges Fragment, welches von allen Methoden gleichzeitig detektiert wurde (Kapitel 2, Abb. 2.1). Aus diesem Grund wurde jedes der 361 Fragmente einzeln in apo EP-Kristalle diffundiert um mit den hieraus erhaltenen Daten eine Röntgenstrukturanalyse durchzuführen. Hierfür wurde eine sehr hohe Fragmentkonzentration von 90 mM verwendet. Interessanterweise konnten 71 gebundene Fragmente detektiert werden, was einer Hitrate von 20% entspricht. Auffallend war allerdings die Tatsache, dass nur 30% der 71 Hits von maximal einer der sechs zuvor durchgeführten Screeningmethoden detektiert werden konnten. Dies stellt deutlich heraus, dass jede Screeningkaskade, bestehend aus mindestens zwei Methoden, nur 19 (27%) der 71 kristallographischen Hits detektiert hätte. Dies hätte zur Folge gehabt, dass 73% der 71 kristallographischen Hits nicht als solche erkannt worden wären. Die Treffer wurden in zwei Hauptkategorien aufgeteilt: direkt- und fernbindende Fragmente. In Kapitel 3 wurden die Direktbinder behandelt. Dort wurde eine Vielzahl von Kopfgruppen beschrieben, die die katalytische Dyade entweder direkt oder über das katalytische Wasser W501 adressieren, während sie die S1 und S1‘ Bindetaschen besetzen. Darüber hinaus wurden Fragmente gefunden, die beide Bindetaschen gleichzeitig besetzen, was eine optimale Grundlage für Optimierungsstrategien in die benachbarten Taschen auf jeder Seite der katalytischen Aspartate bietet. Bindestellen abseits der katalytischen Dyade wurden in Kapitel 4 beschrieben. Die so genannten „hot-spots“ stellen wichtige Aminosäuren dar, die in einem Optimierungsprozess adressiert werden sollen, um optimale Ligandbindung zu erzielen. Das Durchsatzpotenzial der Röntgenstrukturkristallographie (Kapitel 3 und 4) verglichen mit den anderen sechs in Kapitel 2 beschriebenen Screeningverfahren, ist noch sehr gering. Es wird oft eine Mischung aus Verbindungen in Proteinkristalle diffundiert um die Hitidentifizierung zu beschleunigen. Dieses Verfahren können wir jedoch nicht empfehlen, da wir glauben, dass Parameter wie Löslichkeit, Reaktivität zwischen den Verbindungen, kompetitive Bindungsposen, und Kristallschäden durch die Mehrzahl an Verbindungen in einer Mischung stark beeinflusst werden. Probleme solcher Art sind in Kapitel 5 dokumentiert, in dem die Differenzelektronendichte zwischen einzeln gesoakten Fragmenten und Cocktails aus diesen direkt miteinander verglichen werden. Der einzig plausible Grund für die Verwendung mehrerer Verbindungen in einem Cocktail ist eine beabsichtigte Reaktion zwischen einzelnen Komponenten. Dieses Verfahren wird dynamische kombinatorische Chemie (DCC) genannt und in Kapitel 6 beschrieben. Als Verbindungen für die Mischung wurden Hydrazide und Aldehyde gewählt, die in einer Kondensationsreaktion zu Acylhydrazonen reagieren. Die Bildung der stärksten Liganden, die Acylhydrazone (S)-H4-A4 und (R)-H3-A5, wurde durch natürliche Selektion veranlasst, da das Zielprotein EP solche potenten Binder aus dem Mischungsgleichgewicht zieht. In einer Folgestudie erfolgte basierend auf den Bindungsmodi der zwei Acylhydrazone die Kombination von einem bis-Aldehyd mit Hydraziden und hieraus die natürliche Selektion eines bis-Acylhydrazones durch EP. Das auf diese Weise identifizierte bis-Acylhydrazon wies eine 240-fach höhere Affinität im Vergleich zu den ursprünglichen Acylhydrazonen auf, resultierend in einem zweistellig nanomolaren Binder.

FXIII belongs to the family of transglutaminases, mainly catalyzing the cross-linking of proteins by formation of an isopetide bond between a glutamine and a lysine side chain. FXIII represents the last enzyme of the blood coagulation cascade providing final stability to the blood clot by cross-linking of fibrin fibers. Consequently, inhibition of FXIII would still allow the formation of a weak blood clot, most likely resulting in a lower bleeding risk by using a FXIII blocker compared to other anticoagulants. The primary goal of the thesis was to obtain a crystal structure of factor XIII in its active conformation (FXIIIa) and subsequently to use the gained information about the chemical composition of the active site for the development of FXIIIa blockers. In collaboration with the biotech company Zedira GmbH FXIIIa° could be crystallized in complex with the covalently-attached inhibitor ZED1301. The crystal structure shows that an enormous conformational change occurs during the transition from the inactive to the active state, whereby two β-barrel domains move out of space exposing the active site for inhibitors or substrates. The inhibitor ZED1301 binds covalently by its warhead (α,β-unsaturated carboxylic ester) to Cys 314 of the active site. The binding of the ligand induces the formation of a hydrophobic tunnel by rotation of the indole ring of Trp 370. The natural function of this tunnel is most likely the shielding of the intermediately formed thioester from hydrolytic cleavage. The substrate binding site can be subdivided into three areas: The catalytic site, an area located N-terminal named α-space as well as an area located C-terminal named β-space. In the β-space a hydrophobic pocket is formed, presumably induced by the tryptophan indole ring of the inhibitor. Apart from the usage for the structure-based development of FXIIIa-blockers, the crystal structure of FXIIIa° provides mechanistic insights at atomic level that in turn are of fundamental importance for the development of inhibitors for FXIIIa and other human transglutaminases. In the crystal structure of transglutaminase 2 in complex with a covalent inhibitor (named TG2a*) published in 2007, the enzyme adopts an active state, as in case of FXIIIa°, however not with a globular but linear conformation. Based on the new structural and mechanistic insights obtained by the crystal structure of FXIIIa° and further experimental data from the literature, it has been attempted to explain the occurrence of two different active conformations adopted by FXIII and TG2. First, at closer inspection of the crystal structure of TG2a*, strand III of the three-stranded β-sheet of the β-barrel 1 domain is displaced, forming a five-stranded β-sheet out of the four-stranded β-sheet of the β-barrel 1 domain and strand II of the original three-stranded β-sheet. The displaced strand III now adopts an α-helical structural element in the region of the β-space which thus is enormously reduced in size. Remarkably, amino acids forming the α-helix belong to calcium binding site 2. Consequently, occupancy of calcium binding site 2 does not allow a linear domain arrangement because the β-barrel 1 domain would clash with the three-stranded β-sheet. Since only the occupancy of calcium binding site 2 enables the formation of the catalytic dyad, the linear state should not exhibit transamidase activity. By use of a homology model based on the crystal structure of FXIIIa°, it could be shown that TG2 can adopt a conformation equivalent to FXIII in the active state (FXIIIa°). This is in accordance with the observation that some FXIII inhibitors of the α(wh)xxxPW-type have the same affinity against FXIII and TG2. However, due to their size these inhibitors should not be able to bind to the active site of the linear state of TG2 (TG2a*) since they would clash with the α-helix in β-space. Inhibitors of the α(wh)xxxPW-type bind most likely only to the globular active conformation of TG2 as suggested in the present thesis. Consequently, the inhibitor seems to determine if TG2 adopts the linear or globular active state. This is also indicated by FRET measurements performed by the Keillor lab in Canada showing that, depending on the inhibitor, the enzyme adapts to different conformational states. One state corresponds to the linear conformation, the other state to a more compact conformation. The measurement of the distances between the N- and the C-terminus of the inactive and the active globular state shows that the distances between the N- and the C-terminus decrease during the transformation to the active conformation. Thus, the compact state found by the FRET experiment corresponds most likely the globular active state. Transferring these findings to the endogenous biochemical function of transglutaminase 2, the complementarity of substrates binding to the linear or the globular active state determines whether the linear active state is formed and the glutamine residue is hydrolyzed in the catalytic center (deamidation) or the globular active state is formed and the glutamine residue is cross-linked with the lysine residue of a co-substrate by formation of an iso-peptide bond. The hypothesis of the substrate-induced chemoselectivity could give an explanation that simultaneously particular glutamine residues of a protein become deamidated whereas other glutamine residues of the same protein become transamidated. Whether a substrate is deamidated or transamidated can also be affected by the chemical environment (i.e. pH value). Analysis of the crystal structures also shows that the calcium concentration might impair the ratio of the linear (TG2a*) to the globular (TG2a) state, since the occupancy of calcium binding sites presumably does not allow the formation of the linear state. Consequently, with increasing calcium concentration the adoption of the globular state should be preferred. However, at this point it cannot be determined which influencing factor (substrate complementary or calcium concentration) plays the prominent role concerning the chemoselectivity. Nevertheless, an investigation of the transamidation of FXIII substrates of different sizes by Siebenlist and co-workers shows that the higher the molecular weight the lower the calcium concentration which is required for substrate turnover. It appears that the calcium concentration is less mandatory in case of binding of macromolecular substrates to FXIII. This indicates that calcium shifts the equilibrium from the inactive state to a pre-active species where the catalytic center becomes exposed subsequently to a conformational change of the two β-barrel domains. Thus, at high calcium concentrations even low molecular weight substrates with minor affinity might bind to FXIII. At this point it should be mentioned that FXIII exists in the inactive state as a dimer and calcium might also shift the equilibrium between the dimeric and the monomeric state. As already described, the substrate induces depending on its structural and chemical constitution the formation of the linear or globular active state. Reversely, also the present conformation of the active TG2 (TG2a* or TG2a) might determine which inhibitors are potently bound. If the hypothesis that the enzyme adopts the globular active state depending on certain influencing factors turns true, a potential inhibitor of the linear active state could exhibit a strikingly lower affinity in the organism under certain conditions as the in-vitro experiment suggested. Therefore, it might be useful to develop both, TG2-blockers active on the linear and the globular state. Consequently, drugs might result for diseases where the deamidase or the transamidase activity is disease relevant., FXIII gehört zur Proteinklasse der Transglutaminasen, deren Hauptfunktion die Quervernetzung von Proteinen durch die Ausbildung einer Isopeptidbindung zwischen Glutamin- und Lysinseitenketten darstellt. FXIII ist das letzte Enzym der Blutgerinnungskaskade und verleiht durch Quervernetzung der Fibrinfasern dem Blutgerinnsel seine finale Stabilität. Dies bedeutet letztendlich, dass sich bei der Inhibierung von FXIII noch ein schwaches Blutgerinnsel ausbilden könnte, wodurch das Blutungsrisiko bei einem FXIII-Blocker geringer im Vergleich zu allen anderen Antikoagulantien sein sollte. Primäres Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Kristallstruktur des Faktors XIII in der aktiven Konformation (FXIIIa) zu erhalten, um anschließend die Information bezüglich der chemischen Beschaffenheit des aktiven Zentrums für die Entwicklung von FXIIIa-Blockern nutzen zu können.

Die 17β-Hydroxysteroid Dehydrogenase Typ 14 (17β-HSD14) ist des zuletzt identifizierte Subtyp der 17β-HSDs. In vivo oxidiert dieses Enzym die Hydroxyl-Gruppe von Estradiol (E2) und 5 Androstendiol (5-Diol) an Position 17 in Gegenwart des Kofaktors NAD+. Es existieren zwei Isoformen dieses zytosolischen Proteins, die sich ausschließlich in der Sequenzposition 205 unterscheiden: S205 und T205. Bis her wurde das Protein noch nicht gründlich und im Detail untersucht und seine physiologische Rolle ist noch unbekannt. Vor der Durchführung dieser Doktorarbeit war das 17β-HSD14 Apoenzym (S205) bereits kristallisiert worden. Die gelöste Struktur zeigt ein sehr weites und offenes aktives Zentrum sowie die konservierte katalytische Triade zusammen mit dem Rossmann-Faltungsmotiv. Jedoch waren alle C-terminalen Enden und bei einigen Ketten auch Aminosäuren der flexiblen Schleife (189-212) in dem funktionalen Tetramer nicht in der Elektronendichte definiert. Darüber hinaus ist es unmöglich, Informationen hinsichtlich eines potentiellen Substrats von dieser Apostruktur abzuleiten. Deshalb war die erneute Strukturbestimmung des 17β-HSD14 Apoproteins sowie seiner Komplexe mit Kofaktor und Substrat von größter Wichtigkeit. Nach erfolgreicher Etablierung der Expressions- und Aufreinigungsprotokolle für 17β-HSD14 wurden die beiden Isoformen (S205 und T205) biochemisch charakterisiert. Die Strukturen des S205 Apoenzyms und der binären Komplexe beider Isoformen mit NAD+ wurden aufgeklärt. In diesen Strukturen nimmt die flexible Schleife eine einzigartige geschlossene Konformation ein, die sich von der Apostruktur unterscheidet. Die Bindung des Kofaktors geht einher mit einer Verschiebung der flexiblen Schleife und des C-terminalen Tyr253’ des benachbarten Monomers, wodurch die Größe des aktiven Zentrums vermindert wird. Der ternäre Komplex des Enzyms mit Estron (E1) und NAD+ wurde ebenfalls aufgeklärt. E1 bindet auf untypische Weise in das aktive Zentrum, so dass sein A-Ring und nicht die enzymatisch modifizierte Position 17 nahe dem Nikotinamid-Baustein des NAD+ zu liegen kommt. Enzyminhibitoren sind nützliche Werkzeuge, um die Konsequenzen einer Enzymhemmung in vivo zu studieren. Dies erlaubt zu klären, ob dieses Enzym als neues Arzneistofftarget für bestimmte Krankheiten interessant sein könnte. Außerdem könnten potente und selektive 17β HSD14 Inhibitoren auch helfen, die Selektivitätsproblematik anderen 17β-HSDs zu verstehen. Da vor dieser Studie kein 17β-HSD14 Inhibitor bekannt war, war das Ziel die Identifizierung und Optimierung nicht-steroidaler 17β-HSD14 Inhibitoren. Dafür wurden 17β-HSD1 und 17β-HSD2 Inhibitorbibliotheken gegen 17β-HSD14 durdgemustert. Der vielversprechendste Treffer wurde als Startpunkt für weitere chemische Modifizierung unter Anwendung eines ligandbasierten Ansatzes verwendet. Neu entworfene Verbindungen wurden synthetisiert und anschließend auf ihre inhibitorische Aktivität gegen 17β HSD14 getestet. Vor dieser Doktorarbeit waren keine Strukturen einer humanen 17β-HSD im Komplex mit einem nicht-steroidalen Liganden veröffentlicht. Die Kristallstrukturen bestätigten, dass die Inhibitoren an die Substratbindestelle binden und ermöglichten die hohe Affinität dieser Inhibitoren zu erklären. Anschließen wurden zwei unterschiedliche Strategien zum Inhibitordesign verfolgt. Die ersten strukturbasierten Modifikationen des ursprünglichen Pyridin-Grundgerüstes führten zu 10 fach potenteren Inhibitoren. Das Ziel der zweiten strukturbasierten Optimierungsstrategie war die Erweiterung des zentralen Pyridin Kerns, um eine Interaktion mit der unbesetzten Tasche neben den Steroid-Ringen A und B zu gewährleisten. Der vorhergesagte Bindungsmodus wurde durch Kokristallstrukturen verifiziert und die niedrig-nanomolare Affinität durch biophysikalische Charakterisierung bestätigt. Die neuen Kristallstrukturen offenbarten, wie kleine Änderungen der Inhibitoren den eingenommenen Bindungsmodus beeinflussen. Die Charakterisierung der vielversprechendsten 17β HSD14 Inhibitoren bezüglich 17β HSD1, 17β-HSD2 und 17β HSD10 offenbarte unterschiedliches Ausmaß an Selektivität. Zusätzlich zeigten einige dieser Inhibitoren eine sehr niedrige Zytotoxizität und keine Wechselwirkung mit dem Multidrug-Resistance-Protein Pgp, was darauf hindeutet, dass diese Verbindungen nicht aus dem Gehirn ausgeschleust werden, was das Risiko möglicher Nebenwirkungen erniedrigt. Dies legt die Verwendung dieser Inhibitoren als Werkzeuge für weitere in vivo Untersuchungen nahe. Um die Selektivitätsprofile dieser Liganden hinsichtlich 17β HSD14 und anderen 17β HSDs zu erklären, führten wir einen strukturellen Vergleich durch. Die typische V-ähnliche Form der Bindetasche von 17β HSD14 wird durch His93 und Gln148 bestimmt; Aminosäuren, die in 17β HSD1, 17β HSD8 and 17β HSD10 fehlen. Zusätzlich haben diese drei Enzyme eine eher flache Bindetasche. Dies legt nahe, dass eine Anpassung an die charakteristischen dreidimensionalen Anforderungen von 17β-HSD14 und wahlweise die Adressierung von His93 und/oder Gln148 die Selektivität für diese Zielstruktur erhöhen werden. Solche Inhibitoren wurden durch Docking einer Bibliothek von 400 17β-HSD1 und 17β-HSD2 Inhibitoren mit GOLD vorhergesagt, gefolgt von einem in vitro Screening der Docking Hits und verwandter Verbindungen. Bemerkenswerterweise waren die vorhergesagten Bindemoden kaum Übereinstimmung mit den später ermittelten Kristallstrukturen, was auf die Anpassungsfähigkeit der Bindetasche durch die flexible Schleife zuruck zu führen ist. Schließlich wurde eine großangelegte röntgenkristallographische Fragment-Screening Kampagne durchgeführt, mit dem Ziel neue Inhibitor-Grundgerüste, die an 17β HSD14 binden, zu entdecken. Dies führte zu zwei Fragmenten die deutlich in der Elektronendichte zu identifizieren waren. Jedoch zeigten diese Fragmente keine signifikante Inhibition von 17β HSD14. Um ihre Affinität zu erhöhen, wurden Strategien zum Fragment-Wachstum und zur Fragment-Kopplung (growing und linking) aufgegriffen, was zu zwei neuen Inhibitoren mit gegenüber den Start-Fragmenten erhöhter Affinität führte. Zusammengefasst wurden beide Isoformen von 17β-HSD14, S205 und T205, biochemisch und strukturell charakterisiert, was zu vier neuen Kristallstrukturen führte. Die ersten beiden Klassen von Inhibitoren dieser Enzyme wurden entdeckt und gründlich charakterisiert. Zusätzlich wurden zum ersten Mal für diese Familie, die Strukturen von 12 nicht-steroidalen Inhibitoren im Komplex mit dem Protein ermittelt. Das Fragment-Screening durch die Bestimmung der Struktur von 96 mit Fragmenten getränkten Kristallen führte zu zwei Fragment Treffern, die erfolgreich optimiert und zu zwei Inhibitoren mit gegenüber den Vorgänger-Fragmenten erhöhter Aktivität entwickelt werden konnten., 17β-Hydroxysteroid dehydrogenase type 14 (17β-HSD14) is the latest identified subtype of 17β HSDs. In vivo this enzyme oxidizes the hydroxyl group at position 17 of estradiol (E2) and 5 androstenediol (5-diol) in the presence of NAD+ as cofactor. Two isoforms of this cytosolic protein exist that differ only in sequence position 205: S205 and T205. So far, the protein has not been thoroughly investigated in detail and its physiological role remains unknown. Prior to this thesis, the 17β-HSD14 apoenzyme (S205) had already been crystallized. The determined structure revealed a very broad and open active site and the conserved catalytic triad and the Rossmann fold motif. However, all C-terminal tails and for some chains also amino acids in the flexible loop (189-212) were not defined in the electron density. Moreover, it is impossible to derive information regarding a potential substrate from this apo structure. Therefore, the renewed structural determination of the 17β-HSD14 apo protein as well as in complex with its cofactor and substrate was of utmost importance. After successful establishment of the expression and purification protocols for 17β HSD14 protein, the two enzyme isoforms (S205 and T205) were characterized biochemically. The structures of the S205 apoenzyme and the binary complexes with NAD+ of both isoforms were determined. In these complex structures the flexible loop adopts a unique closed conformation differing from the apo structure. Binding of the cofactor is accompanied by a shift of the flexible loop and of the C-terminal Tyr253’ of the adjacent monomer, thereby reducing the size of the active site. The ternary complex of the enzyme with estrone (E1) and NAD+ was also determined. E1 binds to the active site in an atypical fashion, in so far as its A-ring and not the enzymatically modified position 17 close to the nicotinamide moiety of NAD+. Enzyme inhibitors are useful tools to study the consequences of enzyme inhibition in vivo. This allows to clarify whether this enzyme may be interesting as a new drug target for a certain disease. In addition, potent and selective 17β HSD14 inhibitors may help understand the selectivity issue with other 17β HSDs. As no 17β HSD14 inhibitor was known prior to this study, the goal was to identify and optimize nonsteroidal 17β-HSD14 inhibitors. To that, a library of 17β-HSD1 and 17β HSD2 inhibitors was screened against 17β-HSD14. The most promising hit was taken as the starting point for further chemical modification applying a ligand based approach. Newly designed compounds were synthesized and subsequently tested for their 17β HSD14 inhibitory activity. Prior to this thesis, no human 17β HSD structure in complex with a nonsteroidal ligand was published. The crystal structures confirmed that the inhibitors bind to the substrate binding site and allowed to rationalize the strong affinity of these inhibitors. Subsequently, two different structure-based strategies were pursued for inhibitor design. The first structure based modifications of the initial pyridine-based scaffold led to a ten-fold more potent inhibitor. The goal of the second structure based optimization strategy was to extend the central pyridine core to interact with the empty binding pocket adjacent to the steroid A and B-ring. The predicted binding mode was verified by co-crystal structures and the low nanomolar potency was confirmed by biophysical characterization. The new crystal structures revealed how small changes of the inhibitors affect the adopted binding mode. The characterization of the most promising 17β HSD14 inhibitors against 17β HSD1, 17β-HSD2, and 17β HSD10 revealed varying degrees of selectivity. In addition, some of these inhibitors showed very low cytotoxicity and did not interact with the multi-drug resistance protein Pgp, indicating these compounds might not be effluxed from the brain and that the risk of potential side effects is reduced. This suggests these inhibitors as tool compounds for further investigation in vivo. To explain the selectivity profiles of the ligands towards 17β HSD14 and other 17β HSDs we conducted a structural comparison. The typical V-like shape of the binding pocket of 17β HSD14 is determined by His93 and Gln148, which are not present in 17β HSD1, 17β HSD8 and 17β HSD10. In addition, the latter three enzymes have a rather flat binding pocket. This suggests that matching the characteristic three-dimensional requirements of 17β-HSD14 and optionally addressing His93 and/or Gln148 will increase the selectivity toward this target. Such inhibitors were predicted by docking a library of about 400 17β-HSD1 and 17β-HSD2 inhibitors with GOLD followed by in vitro screening of docking hits and related compounds. Remarkably, predicted binding modes were in poor agreement with the subsequently determined crystal structures due to the adaptability of the binding pocket caused by the flexible loop. Finally, a large fragment screening campaign by X-ray crystallography with the aim to discover new inhibitor scaffolds bound to 17β HSD14 was performed. This resulted in two fragments that could be clearly identified in the electron density. However, these fragments did not significantly inhibit 17β HSD14. In order to enhance affinity, fragment growing and fragment linking strategies were applied, resulting in two new inhibitors with better affinity than the starting fragments. In summary, both isoforms of 17β-HSD14, S205 and T205, were characterized biochemically and structurally resulting in four new crystal structures. The first two classes of inhibitor for this enzyme were discovered and the ligands were thoroughly profiled. In addition, the structures of 12 nonsteroidal inhibitors in complex with the protein were elucidated for the first time for this protein family. The fragment screening by determining 96 fragment-soaked structures, resulted in two fragment hits that were successfully optimize culminating in two inhibitors more active than their precursor fragments.

Zwei pathologisch relevante Proteine, die humane Aldose Reduktase und die humane Carboanhydrase, wurden als Modellproteine studiert um Einblick in den Prozess der molekularen Erkennung von Protein und Ligand zu gewinnen. The Thermodynamik und die Kinetik vo dem Bildungsprozess des Protein-Ligand-Komplexes wurden studiert., Two pathological relevant proteins, human aldose reductase and human carbonic anhydrase, were used as model proteins to get insights into the process of molecular recognition. The thermodynamics and kinetics of the formation process of protein ligand complex formation were studied.

In dieser Arbeit wird das strukturbasierte Design von Wirkstoffen am Beispiel drei ver-schiedener Zielproteine beschrieben: Der HIV-1 Protease und der humanen Proteine Transglutaminase 2 und Blutgerinnungsfaktor XIII. Ziel der Arbeit war, die jeweiligen Proteine im Komplex mit ihren Inhibitoren zu kristallisieren und die dreidimensionale Struktur der Komplexe mittels Röntgenstrukturanalyse zu bestimmen. Die erhaltenen Informationen über den Bindungsmodus der Inhibitoren sollten für das Design neuer Moleküle und die Optimierung der Bindungseigenschaften, zum Beispiel der Affinität zum Protein, genutzt werden, um somit einen Beitrag zur Entwicklung neuer Arznei-stoffe zu leisten. Inhibitoren der HIV-1 Protease sind potentielle Arzneistoffe zur Therapie von HIV-infizierten Menschen. Sie können helfen, die Zeit bis zum Ausbruch der Immunschwä-che-Krankheit AIDS zu verlängern sowie deren Symptomatik zu lindern. Auch wenn bereits einige Arzneistoffe zur Behandlung zur Verfügung stehen, erfordert die zuneh-mende Resistenzbildung der Viren und die Entwicklung von AIDS zu einer weltweiten Pandemie eine kontinuierliche Weiterentwicklung der Therapie. Die humane Transglu-taminase 2 ist unter anderem an der Pathogenese der Zöliakie beteiligt, zu deren Thera-pie zur Zeit keine Arzneimittel zur Verfügung stehen. Ein Medikament mit einem Inhi-bitor der Transglutaminase 2 könnte Patienten, die von dieser Gluten-Unverträglichkeit betroffen sind, ermöglichen, ihre strikte Diät aufzulockern, und somit ihre Lebensquali-tät beträchtlich erhöhen. Auch der Faktor XIII gehört zu der Familie der Transglutami-nasen. Durch seine Funktion in der Blutgerinnung stellt er einen Angriffspunkt für eine antikoagulative Therapie dar. Inhibitoren des Proteins sind daher potentielle Arzneistof-fe und eine neue Option zur Prophylaxe und Behandlung verschiedenster Herz-Kreislauf-Erkrankungen, wie zum Beispiel von Thrombosen und Embolien. In Abschnitt 2.3 dieser Arbeit werden Kristallstrukturen von Komplexen der HIV-1 Protease mit verschiedenen Inhibitoren vorgestellt, die als Grundstruktur ein sekundäres Amin besitzen. Zunächst wird in Abschnitt 2.3.1. gezeigt, wie innerhalb einer Serie strukturell sehr ähnlicher Inhibitoren grundlegend verschiedene Bindungsmodi zum Protein beobachtet werden konnten, die in Zusammenhang mit der Kristallform und der Raumgruppe des Kristalls stehen. Dass der gleiche Inhibitor in Kristallen mit unter-schiedlicher Raumgruppe sowohl C2-symmetrisch als auch asymmetrisch an die HIV-1 Protease binden kann, wird in Abschnitt 2.3.2 beschrieben. Der Zusammenhang zwi-schen Bindungsmodus des Inhibitors, Symmetrie und Raumgruppe wird dort noch ein-mal ausführlich diskutiert. In Abschnitt 2.3.3 und 2.3.4 wird beschrieben, wie Moleküle mit Fulleren- und Piperidin-Grundgerüst durch enzymkinetische Messungen als neue Inhibitoren der HIV-1 Protease charakterisiert werden konnten. Strukturelle Informatio-nen über den Bindungsmodus dieser Inhibitoren konnten jedoch nicht erhalten werden. Jedoch konnte der Bindungsmodus einer Serie dreiarmiger, nicht symmetrischer Pyrro-lidinderivate durch Co-Kristallisation und Röntgenstrukturanalyse bestimmt werden, wie in Abschnitt 2.3.5 gezeigt wird. Eine Weiterentwicklung der Amin-basierten Inhibi-toren stellen die bizyklischen Pyrrolidinderivate dar, deren Bindungseigenschaften in Abschnitt 2.3.6 vorgestellt werden. Kristallstrukturen von Komplexen mit diesen Inhibi-toren stellten auch die Grundlage für ein Fragment-basiertes Design dar, welches in Abschnitt 2.3.7 beschrieben wird. Die Transglutaminase 2 wurde, wie in Abschnitt 3.3 beschrieben, im Komplex mit ko-valent bindenden Inhibitoren in der offenen Konformation des Proteins kristallisiert. Die Kristallisierbarkeit dieser Komplexe erwies sich als stark abhängig vom verwendeten Inhibitor. Es gelang jedoch schließlich, Kristallstrukturen von drei verschiedenen Kom-plexen zu bestimmen. Die Strukturaufklärung vermittelte wertvolle Informationen über über den Bindungsmodus der Inhibitoren, die von dem Kooperationspartner in diesem Projekt, der ZEDIRA GmbH, als Grundlage für das Design weiterer Moleküle auf dem Weg zu einem geeigneten Arzneistoff genutzt werden konnten. Vergleichbar zu den Arbeiten mit der Transglutaminase 2, sollte auch der Faktor XIIIa im Komplex mit einem kovalent bindenden Inhibitor kristallisiert und anschließend erstmals die dreidimensionale Struktur des Proteins in einer offenen Konformation be-stimmt werden. Wie in Abschnitt 4.3 beschrieben, konnte das Protein zunächst erfolg-reich in der geschlossenen Konformation kristallisiert werden. Anschließend wurden zahlreiche Komplexe des Faktor XIIIa mit kovalent gebundenen Inhibitoren in umfang-reichen Screenings eingesetzt, um Kristallisationsbedingungen für das inhibierte Protein zu finden. Am Ende dieser Arbeit konnten erste Kristalle eines Komplexes erhalten und auf ihr Diffraktionsvermögen getestet werden, so dass ein großer Schritt auf dem Weg zur Kristallstruktur getan wurde.

The design and development of a drug is complex and usually extends over many years. Different approaches can facilitate lead optimization. This work focuses on specific aspects that could lead to advances in drug discovery. After an introduction to drug design and the two studied target proteins, the first section of this thesis (Chapter 2) deals with the analysis and understanding of the function of transient binding pockets and the resulting perspective to improve the optimization of a lead structure. For this project, the already well-studied specificity pocket of human aldose reductase (ALR-2) was chosen. This enzyme is considered a key player of the polyol pathway. When glycolysis, an important degradation pathway of energy metabolism, is saturated, e.g., due to increased glucose levels in diabetics, the mechanism of the polyol pathway is activated. As a result, ALR-2 is stimulated to convert D-glucose to D-sorbitol. A series of inhibitors with low steric demand and functional groups of different electronic nature at the terminal aromatic moiety or terminal substituent, as well as their structural and thermodynamic properties, were studied in detail by isothermal titration calorimetry (ITC) and X-ray crystallography. In addition, the electrostatic potentials and charge distribution at the terminal aromatic groups of the inhibitors and their effects on binding to the transient pocket were analyzed by electronic surface potential (ESP) calculations. These analyses confirmed the previously established theory that terminal aromatic systems of the inhibitors with an electron-deficient aromatic group can trigger the opening of the specificity pocket and lead to preferential π-interaction with the electronrich indole moiety of W111. The results also indicate that a certain volume of inhibitor seems to be a prerequisite for pocket opening, since too small substituents lead to more complex binding positions with increased residual mobility. It was further shown that a shift in pH between pH 5 and 8 has no effect on the binding position of the inhibitors in the crystal with respect to the opening of the specificity pocket. This allows a comparison between thermodynamic and crystallographic data obtained at different pH values. The following chapter of this thesis (Chapter 3) focuses on the strategy of preorganization used in latestage drug design for ligand optimization without having to resort to a completely different scaffold. Here, the S1 pocket of the also well-studied serine protease thrombin, whose conversion of fibrinogen to fibrin plays an important role in blood clotting, served as a model. In this work, we first present a series of congeneric thrombin ligands with a variety of functional groups that trigger preorganization prior to binding. The resulting structural fixation of a ligand in its bioactive conformation, either by fixation of the bound conformation in a suitable ring system or by fixation via intramolecular hydrogen bonds (H-bonds), has positive effects on affinity for entropic reasons. Fixation in solution and complex formation were characterized by crystallography, ITC, and molecular dynamics (MD) simulations. Clearly, these preorganizational modifications do not affect the overall binding mode, provided that the required bound conformation of the molecule with the archetypal binding mode is well reproduced by the modified molecules in the bound state. Thus, the most important interactions are preserved. However, the results of this study also show that the presence of an additional intramolecular contact, preferably in the form of a dominantly populated conformer, is equally important to achieve the expected affinity enhancement. At worst, the modified scaffold in solution adopts a new, strongly preferred conformation, and the preorganization effect, expected to enhance the affinity for the target, is lost. Based on these results, it can be shown that the thermodynamics of preorganization are largely governed by enthalpy rather than entropy. Furthermore, in this work, an important salt bridge is shielded by actively reducing its surface exposure, resulting in an improved enthalpic binding profile. Part three of this thesis (Chapter 4) discusses the selectivity-determining features in the S1 pockets of the serine protease thrombin, the previously described blood clotting factor, and the related enzyme trypsin, which is responsible for digestion. Human trypsin is a proteolytic enzyme produced by the duodenum whose function is to degrade larger proteins into smaller components in the intestine. Thus, it represents one of the most important digestive enzymes. In these studies, a series of ligands were evaluated for their selectivity toward both peptidases using X-ray and neutron crystallography along with ITC. The results revealed that the local geometry of the two S1 pockets is highly conserved. However, thrombin cleaves peptide chains only after arginine, whereas trypsin cleaves after lysine and arginine. Thrombin has a Na+ binding site near D189 which is not present in trypsin. This suggests that simple steric features cannot explain the selectivity difference. Although the E192Q exchange at the edge of the S1 pocket has very little effect on the steric and dynamic properties of ligand binding and the local geometry of the two serine proteases, the different partitioning into enthalpy and entropy contributions is a clear indication of a given difference. The analyses of this study suggest that E192, together with the thrombin-specific sodium ion, contribute to generate an electrostatic gradient in the S1 pocket. This feature is not present in trypsin and is therefore important, together with the differences in solvation patterns in the S1 pocket, for the selectivity of both enzymes. The observation of protonation effects induced in this context is the first evidence for significant charge attenuation at the carboxylate group of D189 in thrombin compared to trypsin. From these studies, it appears that this phenomenon is one of the most important selectivity-determining features between the two proteases and thus influences and controls the other selectivity-distinguishing features that are less obvious at first glance, such as the differences in the solvation pattern and in the arrangement of water molecules in the two enzymes. In summary, it can be deduced from this work that it is not straightforward to assign the selectivity-determining features in the S1 pockets of thrombin and trypsin to a single dominant factor. The last part of the thesis (Chapter 5) is an abbreviated subproject and deals with eight thrombin inhibitors that differ in the P1 residue. Due to the lack of time, only the crystal structures obtained by X-ray crystallography were used to analyze the binding behavior of the inhibitors. Their analysis shows that a P1 thiophene changes its binding behavior in the S1 pocket of thrombin once a halogen substituent is attached. The comparably electron-rich sulfur of a pure thiophene residue turns toward the inhibitor's own P2 and P3 carbonyl groups. In contrast, the sulfur of a P1-thiophene, which is rather electron-poor due to the halogen substituents, can serve as an H-bond acceptor and thus interact water-mediated with the π-system of Y228. However, a halogen atom in a P1-furan is not capable of recruiting such a water. Due to the shallower angle of oxygen compared to sulfur and the resulting change in geometry, the distance between the halogen and the ring of Y228 is optimized for a direct halogen-π-interaction. While a methoxy substituent in the para-position of a P1 6-ring does not exhibit a particularly strong interaction, the same substituent in the metha-position can also interact directly with Y228. However, compared to other P1 6-rings, this ring occupies a slightly different position. A hydroxy group in the ortho-position forms a water-mediated interaction with the π-system of Y228. Due to lack of time and the late takeover of data analysis by a former PhD student, additional thermodynamic and kinetic measurements of the binding process were not possible in the present work. Therefore, no definitive conclusions on the affinity and selectivity of thrombin can be derived based on this chapter., Die Entwicklung von Arzneimitteln ist komplex und erstreckt sich in der Regel über viele Jahre. Verschiedene Ansätze können die Optimierung von Leitstrukturen erleichtern. Diese Arbeit konzentriert sich auf bestimmte Aspekte, die zu Fortschritten in der Arzneimittelforschung führen könnten. Nach einer Einleitung in das Thema Wirkstoffdesign und die Vorstellung der beiden Zielproteine, befasst sich der erste Abschnitt dieser Arbeit (Chapter 2) mit der Analyse und dem Verständnis der Funktion von transienten Bindetaschen und der daraus resultierenden Perspektive zur Verbesserung der Optimierung einer Leitstruktur. Für dieses Projekt wurde die bereits gut untersuchte Spezifitätstasche der menschlichen Aldose Reduktase (ALR-2) gewählt. ALR-2 gilt als Schlüsselenzym des Polyolweges. Ist die Glykolyse, ein zentraler Abbauweg des Energiestoffwechsels, beispielsweise durch erhöhte Glukosespiegel bei Diabetikern überlastet, wird der Mechanismus des Polyolweges in Gang gesetzt. Auf diese Weise wird ALR-2 dazu angeregt, D-Glukose in D-Sorbit umzuwandeln. Zunächst wurde eine Reihe von Inhibitoren mit geringen sterischen Anforderungen und funktionellen Gruppen unterschiedlicher elektronischer Natur am terminalen aromatischen Teil oder terminale Substituenten sowie ihre strukturellen und thermodynamischen Eigenschaften mittels isothermaler Titrationskalorimetrie (ITC) und Röntgenkristallographie eingehend untersucht. Darüber hinaus erfolgte eine Analyse der elektrostatischen Potenziale und der Ladungsverteilung an den terminalen aromatischen Gruppen der Inhibitoren und deren Auswirkungen auf die Bindung in die transiente Tasche durch Berechnungen des elektronischen Oberflächenpotenzials (ESP). Diese Analysen bestätigten die zuvor aufgestellte Theorie, dass terminale aromatische Systeme der Inhibitoren mit einer elektronenarmen aromatischen Gruppe eine Öffnung der Spezifitätstasche auslösen und zu einer bevorzugten π-Wechselwirkungen mit der elektronenreichen Indoleinheit der Aminosäure W111 führen können. Außerdem deuten die Ergebnisse darauf hin, dass ein bestimmtes Volumen des Inhibitors eine Voraussetzung für die Taschenöffnung zu sein scheint, da zu kleine Substituenten zu komplexeren Bindungspositionen mit erhöhter Restmobilität führen. Es hat sich weiterhin erwiesen, dass eine Verschiebung des pH-Werts zwischen pH 5 und 8 keine Auswirkungen auf die Bindungsposition der Inhibitoren im Kristall in Bezug auf die Öffnung der Spezifitätstasche hat. Dies ermöglicht einen Vergleich zwischen thermodynamischen und kristallographischen Daten, die bei verschiedenen pH-Werten erhoben wurden. Das folgende Kapitel dieser Arbeit (Chapter 3) befasst sich mit der Strategie der Vororganisation, die in der späten Phase des Wirkstoffdesigns zur Liganden Optimierung eingesetzt wird, ohne auf ein komplett anderes Gerüst zurückgreifen zu müssen. In diesem Fall diente die S1 Tasche der ebenfalls gut untersuchten Serinprotease Thrombin, die durch die Umwandlung von Fibrinogen in Fibrin eine wichtige Rolle bei der Blutgerinnung spielt, als Modell. In dieser Arbeit wird zunächst eine Reihe kongenerischer Thrombin Liganden mit einer Vielzahl funktioneller Gruppen vorgestellt, die vor der Bindung eine Vororganisation auslösen. Die daraus resultierende strukturelle Fixierung eines Liganden in seiner bioaktiven Konformation, entweder durch Fixierung der gebundenen Konformation in einem geeigneten Ringsystem oder durch Fixierung über intramolekulare Wasserstoffbrückenbindungen (H-Bindungen), hat aus entropischen Gründen positive Auswirkungen auf die Affinität. Die Fixierung in Lösung und die Komplexbildung wurden durch Kristallographie, ITC und Molekulardynamiksimulationen (MD) charakterisiert. Es wird deutlich, dass diese präorganisatorischen Modifikationen den gesamten Bindungsmodus nicht beeinträchtigen, sofern die erforderliche gebundene Konformation des Moleküls mit dem archetypischen Bindungsmodus durch die modifizierten Moleküle im gebundenen Zustand gut reproduziert wird. Die wichtigsten Wechselwirkungen bleiben somit erhalten. Die Ergebnisse dieser Studie verdeutlichen jedoch auch, dass das Vorhandensein eines zusätzlichen intramolekularen Kontakts, vorzugsweise in Form eines dominant besiedelten Konformers, ebenso wichtig ist, um die erwartete Affinitätsverbesserung zu erzielen. Im ungünstigsten Fall nimmt das modifizierte Gerüst in Lösung eine neue, stark bevorzugte Konformation an, und der Präorganisations-Effekt und damit die dadurch gewonnene Affinität für das Target geht verloren. Anhand dieser Ergebnisse lässt sich demonstrieren, dass die Thermodynamik der Präorganisation weitgehend von der Enthalpie und weniger von der Entropie dominiert wird. Darüber hinaus wird in dieser Arbeit eine wichtige Salzbrücke durch aktive Verringerung ihrer Oberflächenexposition abgeschirmt, was zu einem verbesserten enthalpischen Bindungsprofil führt. Abschnitt drei der vorliegenden Arbeit (Chapter 4) befasst sich mit den selektivitätsbestimmenden Merkmalen in den S1 Taschen des bereits beschriebenen Blutgerinnungsfaktor Thrombin und der für die Verdauung verantwortliche Serinprotease Trypsin. Das menschliche Trypsin ist ein proteolytisches Enzym, das vom Zwölffingerdarm produziert wird und dessen Aufgabe es ist, größere Eiweißverbindungen im Dünndarm in kleinere Bausteine zu zerlegen. Damit stellt es eines der wichtigsten Verdauungsenzyme dar. Im Rahmen dieser Studien wurde eine Reihe von Liganden auf ihre Selektivität bezüglich beider Peptidasen mittels Röntgen- und Neutronenkristallographie sowie ITC untersucht. Die Ergebnisse zeigen, dass die lokale Geometrie der beiden S1 Taschen in hohem Maße konserviert ist. Allerdings spaltet Thrombin Peptidketten nur nach Arginin, während Trypsin nach Lysin und Arginin spaltet. Thrombin verfügt über eine Na+-Bindungsstelle in der Nähe von D189, die bei Trypsin nicht vorhanden ist. Daraus ergibt sich die Schlussfolgerung, dass einfache sterische Merkmale den Selektivitätsunterschied nicht erklären können. Obwohl der E192Q-Austausch am Rand der S1 Tasche nur einen sehr geringen Einfluss auf die sterischen und dynamischen Eigenschaften der Ligandenbindung und der lokalen Geometrie beider Serinproteasen hat, ist die unter-schiedliche Aufteilung in Enthalpie- und Entropiebeiträge ein starker Hinweis auf einen gegebenen Unterschied. Die Analysen dieser Studie legen nahe, dass E192 zusammen mit dem Thrombin-spezifischen Na+-Ion dazu beiträgt, einen elektrostatischen Gradienten in der S1 Tasche zu erzeugen. Diese Eigenschaft ist in Trypsin definitiv nicht vorhanden und ist daher zusammen mit Unterschieden im Solvatationsmuster in der S1 Tasche für die Selektivität beider Enzyme von Bedeutung. Die Beobachtung der in diesem Zusammenhang induzierten Protonierungseffekte stellt den ersten Hinweis auf eine signifikante Ladungsabschwächung an der Carboxylatgruppe von D189 in Thrombin im Vergleich zu Trypsin dar. Aus den Studien geht hervor, dass diese Eigenschaft eines der wesentlichen selektivitätsbestimmenden Merkmale zwischen den beiden Proteasen ist und somit die anderen, auf den ersten Blick weniger offensichtlichen Selektivitätsunterscheidungsmerkmale, wie die Unterschiede im Solvatationsmuster und der Anordnung der Wassermoleküle in den beiden Enzymen, beeinflusst und steuert. Schlussendlich geht aus dieser Arbeit hervor, dass es nicht ohne weiteres möglich ist, die selektivitätsbestimmenden Merkmale in den S1 Taschen von Thrombin und Trypsin einem einzigen dominanten Faktor zuzuordnen. Der letzte Abschnitt dieser Arbeit (Chapter 5) stellt ein verkürztes Teilprojekt dar und beschäftigt sich mit acht Thrombininhibitoren, die sich im P1-Rest unterscheiden. Aus Zeitgründen wurden nur die mittels Röntgenkristallographie erhaltenen Kristallstrukturen zur Analyse des Bindungsverhaltens der Inhibitoren herangezogen. Ihre Analyse zeigt, dass ein P1-Thiophen sein Bindungsverhalten in der S1-Tasche von Thrombin ändert, sobald ein Halogensubstituent angefügt wird. Der vergleichsweise elektronenreiche Schwefel eines reinen Thiophen-Restes wendet sich den Inhibitoren eigenen Carbonylgruppen P2 und P3 zu. Im Gegensatz dazu kann der Schwefel eines P1-Thiophens, der aufgrund der Halogensubstituenten eher elektronen-arm ist, als H-Brückenakzeptor dienen und somit dem π-System von Y228 wasservermittelt interagieren. Ein Halogenatom in einem P1-Furan ist jedoch nicht in der Lage, ein solches Wasser zu rekrutieren. Aufgrund des flacheren Winkels des Sauerstoffs im Vergleich zum Schwefel und der daraus resultierenden Änderung der Geometrie ist der Abstand zwischen dem Halogen und dem Ring von Y228 für eine direkte Halogen-π-Wechselwirkung optimiert. Während ein Methoxysubstituent in der para-Position eines P1-6-Rings keine sonderlich starke Interaktion auszubilden scheint, ist derselbe Substituent in metha-Position ebenfalls in der Lage, direkt mit Y228 zu interagieren. Im Vergleich zu anderen P1-6-Ringen nimmt dieser Ring damit jedoch eine etwas andere Position ein. Eine Hydroxygruppe in ortho-Position bildet eine wasservermittelte Wechselwirkung mit dem π-System von Y228. Aufgrund von Zeitmangel und der späten Übernahme der Datenanalyse durch einen ehemaligen Doktoranden in diesem Kapitel waren zusätzliche thermodynamische und kinetische Messungen des Bindungsprozesses in der vorliegenden Arbeit nicht möglich. Daher können auf der Grundlage dieses Abschnitts keine endgültigen Schlussfolgerungen zur Affinität und Selektivität von Thrombin gezogen werden.

Das erste Kapitel dieser Dissertation (Kapitel 2) pr��sentiert eine Mutationsstudie, die an der 17��-Hydroxysteroid-Dehydrogenase Typ 14 (17��-HSD14) S205-Variante durchgef��hrt wurde. Daf��r wurden f��nf Aminos��uren mutiert, von denen man annimmt, dass sie eine wesentliche Rolle bei der Enzymaktivit��t und dem struckturen Aufbau spielen. Die f��nf mutierten Aminos��uren sind: His93Ala, Gln148Ala, Lys158Ala, Tyr253Ala und Cys255Ala. Alle mutierten Aminos��uren befinden sich im aktiven Zentrum des Enzyms (His93, Gln148 und Lys158) oder auf der flexiblen Schleife, die sich ��ber dem aktiven Zentrum befindet (Tyr253 und Cys255). Die R��ntgenkristallographie ist die Methode der Wahl, die in dieser Studie verwendet wird, um die Kristallstruktur jeder Variante zu erhalten. Ein nicht-steroidal potenter 17��-HSD14-Inhibitor (Inhibitor 1) wurde in einem Komplex mit dem Wildtyp kristallisiert, der zur ��berpr��fung der Bindungsf��higkeit des mutierten Enzyms verwendet wurde. Mit jeder Variante wurde ein enzymatischer Assay durchgef��hrt, um die Aktivit��t der einzelnen Varianten zu vergleichen. ��strogen (��stradiol) und Androgen (5-Diol) wurden als Substrat im Enzymkinetik-Assay mit NAD��� als Co-Faktor verwendet. Der zweite Teil der Arbeit (Kapitel 3) konzentriert sich auf einen neuen Kristallprobenhalter (The Roadrunner I Chip), der in der seriellen R��ntgenkristallographie (SSX) eingesetzt wird. Der Roadrunner I-Chip ist ein mikrostrukturierter Probenhalter aus monokristallinem Silizium (Waiver-Technologie) mit Mikroporen. Das Ziel der Verwendung des Roadrunner I-Chips ist es, einen Probenhalter zu haben, der Hunderte bis Tausende von Kristallen dem hochintensiven R��ntgenstrahl pr��sentieren kann, ohne das Beugungsmuster zu st��ren. In dieser Studie wurde Thermolysin (TLN) als Protein verwendet, um die Grenzen dieser neuen Methode zu testen. Thermolysin-Kristalle wurden bei kryogener Temperatur gez��chtet, gewaschen, in Ligandl��sungen eingeweicht und eingefroren, ohne sie vom Chip zu entfernen. Nachdem alle Kristallhandhabungsschritte durchgef��hrt worden waren, wurden Datens��tze von TLN-Kristallen gesammelt, w��hrend sie auf dem Chip lokalisiert sind. Der experimentelle Teil dieser Studie wurde am Deutschen Elektronen-Synchrotron (DESY), Hamburg, an der PETRA III P11-Strahllinie in Zusammenarbeit mit assoziierten Labors der Anlage durchgef��hrt. Der dritte Teil dieser Arbeit (Kapitel 4) befasst sich mit Cyclodextrinen (CDs) und ihrer F��higkeit, die L��slichkeit hydrophober Verbindungen in w��ssrigen L��sungen zu verbessern. Das Zielprotein in dieser Studie ist wieder 17��-HSD14. Viele Verbindungen wurden f��r diese Studie zusammengestellt, wie z.B. eine Fluorverbindungsbibliothek, hydrophobe Medikamente und Sexualhormone. Das Ziel dieser Studie war es, eine Verbindung zu erhalten, die an das Enzym bindet, indem es als Verbindung/CD-Komplex eingef��hrt wird. Die meisten der in dieser Studie verwendeten Verbindungen wurden bereits mit 17��-HSD14 ohne die Verwendung von CDs getestet, aber aufgrund ihrer geringen L��slichkeit war es nicht m��glich, sie in das Enzym einzubringen. Die aus dieser Studie gewonnenen Daten zeigen die Wirkung des Verbindungs-CD/Komplexes, wie er ��ber die Co-Kristallisationsmethode in das Enzym eingebracht wird. Der vierte Teil dieser Arbeit (Kapitel 5) konzentriert sich auf das Fragmentscreening. Eine Bibliothek von 96 Fragmenten wurde mittels R��ntgenkristallographie gegen Trypsin gescreent. Diese Studie konzentriert sich auf den Unterschied zwischen den durch das Fragmentscreening erhaltenen Treffern und Teiltreffern. Das Fragmentscreening wurde an zwei Kristallformen (trigonal und orthorhombisch) durchgef��hrt. Die aus dieser Studie gewonnenen Daten zeigen den Unterschied zwischen den einzelnen Screeningergebnissen und den Einfluss der Packung, der Kristallsymmetrie und der Fragmentabgabe auf die Trefferquote. Viele Aspekte wurden in dieser Studie ber��cksichtigt, wie z.B. der Unterschied in der Elektronendichte, das Volumen der Bindungstasche, anomale Peaks und Wasserkan��le., The first topic of this thesis (Chapter 2) presents a mutational study performed on 17��-hydroxysteroid dehydrogenase type 14 (17��-HSD14) S205 variant. Five different mutations were done with respect to five amino acids which are believed to have an essential role in the enzyme activity and assembly. The five variants are: His93Ala, Gln148Ala, Lys158Ala, Tyr253Ala and Cys255Ala. The mutated amino acids are located in the active site of the enzyme (His93, Gln148 and Lys158) or on a flexible loop of the enzyme, which is located above the active site (Tyr253 and Cys255). X-ray crystallography is the method utilized in this study to obtain a 3D crystal structure of each variant. A non-steroidal potent 17��-HSD14 inhibitor (inhibitor 1) has been crystallized in complex with each variant, that has been used to verify the binding capability of the mutated enzyme. Enzymatic assays have been performed with each variant to compare the activity of each one. Estrogen (estradiol) and androgen (5-diol) have been used as a substrate in the enzyme kinetics assay with NAD��� as a cofactor. The second part of this thesis (Chapter 3) is focused on a new crystal sample holder (the Roadrunner I chip) which is used in Serial Synchrotron X-ray Crystallography (SSX). The Roadrunner I chip is a micro-patterned sample holder from single crystalline silicon (waiver technology) with micropores. The aim of using the Roadrunner I chip is to have a sample holder that can present hundreds to thousands of crystals to the high intensity PETRA III beam line P11 (DESY ��� Hamburg) without interfering with the diffraction pattern. In this study, Thermolysin (TLN) is the protein used to test the limit of this new method. Thermolysin crystals were grown, washed, soaked and frozen at cryogenic temperature without removing them from the chip. Data sets were collected of TLN crystals while they are located on the chip. The experimental part of this study was performed at Deutsches Electronen-Synchrotron (DESY), Hamburg at PETRA III P11 beamline in collaboration with associated laboratories at the facility. The third part of this thesis (Chapter 4) discusses cyclodextrins (CDs) and their ability to enhance hydrophobic compounds solubility in aqueous solutions. The targeted protein in this study is 17��-HSD14. Many compounds were assembled for this study, such as a fluorine-compound library, hydrophobic drugs and sex hormones. The aim of this study is to obtain a compound that binds to the enzyme by introducing it as a compound/CD complex. Most of the compounds used in this study have already been tested with 17��-HSD14 without the use of CDs, but due to their low solubility it was not possible to introduce them in crystallization samples of the enzyme. The data obtained from this study show the effect of the compound/CD complex, as it is introduced to the enzyme via co-crystallization method. The fourth part of this thesis (Chapter 5) focuses on a fragment screening. A 96-fragment library is screened against trypsin using X-ray crystallography. This study focuses on the difference of hits and partial hits obtained from the fragment screening. Fragment screening has been performed on two trypsin crystal form (trigonal and orthorhombic). The data obtained from this study show the different results from each screen and how the crystal form and the fragment delivery method influence the hit ratio. Many aspects were considered in this study, such as the difference in electron density, volume of the binding pocket, anomalous peaks and water channels.

In the present work, accelerated methods for the comparison of protein binding sites as well as an extended procedure for the assessment of ligand poses in protein binding sites are presented. Protein binding site comparisons are frequently used receptor-based techniques in early stages of the drug development process. Binding sites of other proteins which are similar to the binding site of the target protein can offer hints for possible side effects of a new drug prior to clinical studies. Moreover, binding site comparisons are used as an idea generator for bioisosteric replacements of individual functional groups of the newly developed drug and to unravel the function of hitherto orphan proteins. The structural comparison of binding sites is especially useful when applied on distantly related proteins as a comparison solely based on the amino acid sequence is not sufficient in such cases. Methods for the assessment of ligand poses in protein binding sites are also used in the early phase of drug development within docking programs. These programs are utilized to screen entire libraries of molecules for a possible ligand of a binding site and to furthermore estimate in which conformation the ligand will most likely bind. By employing this information, molecule libraries can be filtered for subsequent affinity assays and molecular structures can be refined with regard to affinity and selectivity.

In modern drug design, lead optimization is usually performed in a step- wise fashion by adding and replacing functional groups at a given lead scaffold. Promising lead scaffolds with systematically varied substituents are synthesized and the structural variations are correlated with observed trends in binding affinity. Assigning contributions to particular functional groups, to estimate by how much an added group will enhance the binding affinity, is on first sight a very pragmatic but often misleading approach and does not follow simple additivity rules. The resulting structure–activity relationships frequently do not reflect the expected gradual changes in a congeneric ligand series. Often enough, the thermodynamic binding profiles of such ligands are modulated or can switch unpredictably and unexpected candidates surprisingly turn out to be the highest affinity binders of a series. The binding affinity to be optimized is a Gibbs free energy, which is the sum of an enthalpic and an entropic contribution, which usually cannot be factorized into simple additive functional group contributions. Regarding the complexity of the protein-ligand complex formation, one must consider that changes in ∆G, ∆H and T∆S reflect how the system is modified as a whole. Often such effects on binding affinity are not obvious, as they are frequently masked by a mutual compensation of binding enthalpy and entropy resulting in only a minor change in the Gibbs free energy. Nevertheless, a thoroughly combined analysis of both, thermodynamic terms along with structural information, as presented in many studies described in this thesis, provides profound insights into the underlying structure–activity relationships. In the present thesis two aspects have been studied that are recognized as increasingly import for rational computer-aided drug design. The first aspect relates to the influence of water on the non-additivity of functional group contributions to the binding affinity and it is important to elucidate the driving forces behind the so-called hydrophobic effect. Using high resolution crystal structures allowed us to explain and correlate observed changes in the thermodynamic binding profiles with changes in the local solvation structure on the molecular level. As a model system to investigate the influence of water on thermodynamic binding profiles we used the zinc metalloprotease thermolysin (TLN). Because the TLN has itself a rather rigid geometry and because the studied congeneric ligands differ only slightly, many important aspects of the binding process, e.g. ligand desolvation and differences in ligand conforma- tional properties can be assumed as virtually identical in the comparison of the protein-ligand binding event. The most important observation is the fact that water molecules do not interact with the solutes as separate and independent particles, but rather as “supramolecular assemblies” reflecting repeatedly occurring geometric arrangements. These local assemblies are parts of a large hydrogen-bonded network. Undoubtedly, the completeness and quality of the formed local network influences binding entropy and enthalpy in a systematic manner. This suggests that, rational approaches will have to incorporate concepts how to regard and optimize solvent exposure of molecular surfaces. For this purpose, we developed a molecular dynamics (MD) simulation protocol, with which we successfully predicted the detailed solvation structure around different TLN-inhibitor complexes. In reality, however, most proteins are more flexible than TLN, for which the factorization of the thermodynamic profile correlates remarkably well with high resolution crystal structures. Thus, in the second part of this thesis, it was investigated whether such correlations can also be observed for more flexible proteins. Therefore, the properties of several lin-benzopurine derivatives binding to the tRNA-modifying enzyme tRNA-guanine transg- lycosylase (TGT) were investigated. In a straight-forward computer-aided drug design procedure, e.g. docking, the protein part is regarded as virtually rigid while the ligands are flexible. More sophisticated docking methods take protein side chain flexibility into account, to reflect, e.g. an induced-fitting upon ligand binding. But such methods are not capable to describe the highly dynamic changes as observed for TGT. To inhibit TGT, which is only active as a homodimer, we followed different concepts by either blocking the active site (Chapter 7), but also by destabilizing the protein-protein interface of the homodimer. We demonstrated that ligands differing merely by an exocyclic amino group trigger large-scale rearrangements in the protein structure. Therefore, changes in the thermodynamic profile, which relate to the entire protein-ligand binding process and the involved protein flexibility, prevent that individual contributions can be assigned to single interactions or individual binding steps. Despite of the available high-resolution crystal structure of TGT and its complexes, some uncertainties in the models remain. For example, active-site ligands that insert a needle-like rigid substructure into the protein-protein interface, to perturb certain hot spot regions in order to destabilize the homodimer, are not fully visible in the crystal structures due to an ill-defined electron density. By use of different modeling techniques such as MD simula- tions we provide a model in agreement with experimental data. The simulations reveal how a loop region in TGT, despite its high flexibility, prevents solvent access of the residues forming the protein-protein interface. The research in the present thesis about the two aspects — the influence of water and protein flexibility — allow for a better understanding of funda- mental aspects of protein-ligand binding. Taking such aspects into account will make computational simulations more complex, but hopefully better in predicting ligand-binding affinity, as well as the molecular recognition process.

ITC-Verdrängungstitrationen und direkte ITC-Titrationen bei niedrigen c-Werten können als zuverlässige Technik verwendet werden kann, um schwache Wechselwirkungen zu untersuchen, wie sie üblicherweise für die Bindung von Fragmenten an ein Zielprotein vorkommen. Hierfür müssen jedoch einige Grundbedingungen erfüllt werden. Zuallererst ist für ITC Verdrängungstitrationen wichtig, dass das untersuchte Fragment mit einem Teil der Proteinbindetasche interagieren muss, der mit dem Bindungsbereich des verwendeten Referenzliganden überlappt. Zweitens muss der ausgewählte Referenzligand eine signifikant höhere oder niedrigere Bindungsenthalpie besitzen, so dass eine Wärmedifferenz zu dem untersuchten Fragment gemessen werden kann. Ferner ist zu beachten, dass bei jeder ITC-Verdrängungstitration, alle Fehler, die für die Referenzliganden ermittelt wurden, einen Einfluss auf die Genauigkeit der für das Fragment erhaltenen Parameter haben. Schließlich kann, wenn kein geeigneter Referenzligand zur Verfügung steht und das Fragment enthalpisch genug bindet, eine direkte Titration bei niedrigen c-Werten als Alternative verwendet werden. In diesem Fall ist jedoch ein gewisses Vorwissen über die zu erwartende Bindungsaffinität des Fragments nötig, um die erforderliche Überschuss Konzentration des Fragments am Ende der Titration abschätzen zu können. Die Löslichkeit des Fragments und des Proteins sind ebenfalls wichtige Aspekte bei der Titration mit niedrigen c-Werten, da hohe Konzentrationen des Fragments in der Injektionsspritze erforderlichen sind, um in der Probenzelle eine Konzentration des Fragments zu erreichen, die den KD-Wert des Fragments überschreitet. Daher ist eine Messung des KD-Werts des Fragments in einem unabhängigen Experiment sehr zu empfehlen, um die erforderliche Konzentration des Fragments abzuschätzen. Letztlich ist er sehr wichtig, dass die unter den verschiedenen Versuchsbedingungen gemessen Bindungsenthalpien nicht quantitativ verglichen werden sollten, sondern nur relativ zueinander durch Verwendung eines sorgfältig ausgewählten Messprotokolls. Es ist bemerkenswert, dass mit verschiedenen Referenzliganden, die für die Verdrängung der Fragmente verwendet wurden, abweichende enthalpische Signale beobachtet wurden. Wahrscheinlich wird dies durch Unterschiede in der Wasserstruktur der verschiedenen Liganden in der Bindetasche verursacht. Die Betrachtung der relativen Enthalpiedifferenzen in den verschiedenen Verdrängungsexperimenten zeigte dagegen eine konsistente relative Differenz. Dies ermöglicht es, die untersuchten Fragmente relativ zueinander zu charakterisieren. Die detaillierte Interpretation der enthalpischen Signaturen erfordert jedoch einen Vergleich der Kristallstrukturen der Fragmente. Röntgenkristallstrukturen von sechs Fragmenten, die die S1 Tasche von Thrombin adressieren und der Referenzliganden wurden bestimmt und in Bezug auf die thermodynamischen Bindungsprofile analysiert. Die Bindungsaffinität eines Liganden wird nicht nur durch die Eigenschaften des gebildeten Protein-Ligand-Komplexes bestimmt, sondern auch durch die Unterschiede von Liganden in wässriger Lösung vor Proteinbindung. Konformativ eingeschränkte Liganden können einen signifikanten Bindungsvorteil gegenüber flexiblen Liganden haben, wenn in einem rigiden Ligandgrundgerüst eine Geometrie bereits präorganisiert ist, die dem Liganden in gebundenem Zustand ähnlich ist. Ein neuer vom 3-Amidinophenylalanin abgeleiteter Matriptase Inhibitor wurde in Thrombin kristallisiert und die Röntgenkristallstruktur eines repräsentativen, verwandten Inhibitortyps in Matriptase mit dieser überlagert. Aus der Überlagerung dieser Strukturen konnten Informationen hinsichtlich der in dieser Studie beobachteten Selektivitätsprofile zu anderen Serinproteasen gezogen werden. Durch die große Homologie der mit dem Inhibitor interagierenden Aminosäuren in der Bindetasche von Thrombin und Matriptase können zudem zuverlässige Vorhersagen über den möglichen Bindungsmodus in Matriptase getroffen werden.

The present thesis deals with the characterization and improvement of selective antibiotics targeting the enzyme tRNA–guanine transglycosylase. Recently, the lin-benzopurine scaffold was introduced as promising starting point for the structure-based design of TGT inhibitors. Two classes, namely the lin-benzoguanines and lin-benzohypoxanthines, were found to inhibit the target enzyme in the nanomolar range. However, the analyzed molecules did not show ideal drug metabolism and pharmacokinetic features since firstly they showed poor permeation through cell membranes and secondly their attached 2-substituents were poorly defined in the difference electron density in crystal structures complicating the establishment of a structure–activity relationship. In a comprehensive study the protonation inventory of lin-benzopurines is addressed. Initial ITC measurements performed with lin-benzoguanine-type ligands suggested the uptake of one proton by the ligand. This protonation takes place at the basic guanidine moiety of the aminopyrimidinone structure of the scaffold. The lin-benzohypoxanthines do not show this behavior. pKa Calculations support the observations. While the lin-benzohypoxanthines bind to a TGT conformation closely similar to the apo enzyme interacting with only one aspartate within the G34 recognition site, addition of the exocyclic amino functional group in case of the lin-benzoguanines induces the rotation of a second aspartate towards the binding pocket. The negatively charged environment of both aspartates in short distance provokes a pKa shift in case of the lin-benzoguanines strong enough to induce the uptake of a proton. The hypothesis is proofed by studies using site-directed mutagenesis. Considering the binding affinities across the series of lin-benzopurines, a rather flat structure–activity relationship is observed. Therefore, additional insight into the driving forces of binding was gained by factorizing the free binding energy into enthalpy–entropy contribution. As expected, bindings of both series were found to be enthalpy-driven. Thereby, the lin-benzohypoxanthines exhibit a less pronounced enthalpic term due to their missing interaction to Asp102, which can be partly compensated by a crystallographically conserved water cluster located at the bottom of the G34 recognition site. While the thermodynamic profiles of the lin-benzohypoxanthines remain nearly unchanged, data for the lin-benzoguanines are found to be quite diverse. Obviously, the structural changes triggered by Asp102 in case of the lin-benzoguanines enable a cross-talk between U33 subpocket addressed by the 2-substituent and the G34 recognition site occupied by the parent scaffold. Based on elevated temperature factors, a high flexibility of the 2-substituent of the lin-benzoguanines was assumed. Therefore, we tested whether a binder with high residual mobility can avoid a loss in binding affinity in case of resistant mutations compared to a binder adopting one ordered binding mode. After identification of an appropriate mutation site, different mutants were expressed and crystallized. The derived binding affinities of various 2-amino-lin-benzoguanines could be related to the binding of the parent scaffold inducing disorder of the protein in proximal distance to the mutation site rather than to the different 2-substituents. Only marginal differences could be ascribed to the properties of the substitution pattern, most likely due to electrostatic attractions and repulsions, respectively. In further experiments MD-simulations were used to predict the binding modes of extended 2-amino-lin-benzoguanines. Subsequent crystal structure analyses unravelled novel aspects important for the further design and characterization of TGT inhibitors: Firstly, we were able to spot the 2-subsituent of the extended 2-amino-lin-benzoguanines, which bind to the ribose-32 subpocket that has never been occupied before. Secondly, the results emphasize the importance of the applied crystallization conditions. Poorly defined electron density does not always indicate ligands or substituents exhibiting high mobility in the protein-bound state. The applied crystallization protocol takes a major impact on the derived difference electron density and has to be considered in the discussion of the obtained structures. The class of 5-azacytosines was investigated as a novel scaffold to inhibit TGT. Similarly as the lin-benzopurines, also the 5-azacytosines are deduced from the natural substrate guanine and establish similar binding features, however, the key interaction to Asp102 that was proven to be of utmost importance for substrate recognition, ligand protonation, and pocket crosstalk is poorly established. Different from all known TGT inhibitors, they do not bind to the protein in a planar fashion. In consequence, the compared to lin-benzoguanines low pKa cannot be shifted into a window appropriate for ligand protonation and binding affinity drops., Die vorliegende Arbeit behandelt die Charakterisierung und Optimierung selektiver Antibiotika gegen das Enzym tRNA-Guanin Transglykosylase. Kürzlich wurde das lin-Benzopurin-Grundgerüst als Ausgangspunkt für das strukturbasierte Wirkstoffdesign eingeführt. Zwei Klassen wurden als potente TGT-Inhibitoren identifiziert, lin-Benzoguanine und lin-Benzohypoxanthine. Allerdings zeigen diese Liganden keine idealen Eigenschaften in Bezug auf Metabolismus und Pharmakokinetik: Zum einen weisen sie eine geringe Permeation durch Zellmembranen auf. Zum anderen ist ihr 2-Substituent nur schwach durch Differenzelektronendichte in Kristallstrukturen definiert. Dies erschwert eine Struktur–Wirkungsbeziehung aufzustellen. In einer umfassenden Studie wurde der Protonierungszustand der lin-Benzopurine untersucht. Mit lin-Benzoguaninen durchgeführte ITC-Messungen suggerierten die Aufnahme eines Protons durch den Liganden. Diese Protonierung erfolgt am basischen Stickstoff der Guanidinstruktur im Aminopyrimidinonteil des Grundgerüstes. lin-Benzohypoxanthine weisen dieses Verhalten nicht auf. pKa-Berechnungen stützen diese Beobachtung. Während die lin-Benzohypoxanthine an eine dem Apo-Enzym ähnelnde Konformation der TGT binden, bei der die Liganden mit nur einem Aspartat in der G34-Tasche interagieren, induziert die zusätzliche Aminogruppe der lin-Benzoguanine die Rotation einer zweiten Aspartatseitenkette zur Bindetasche. Nur die negativ geladene Umgebung beider Aspartate in kurzer Distanz induziert eine pKa-Wertänderung der lin-Benzoguanine, die stark genug ist, um eine Protonenaufnahme zu begünstigen. Diese Hypothese konnte durch Mutationsstudien abgesichert werden. Unter Berücksichtigung der gemessenen Bindungsaffinitäten war eine flache Struktur–Wirkungsbeziehung der lin-Benzopurine zu beobachten. Daher wurden zusätzliche Einblicke in treibende Kräfte der Bindung über die Aufspaltung von ∆G in ∆H und -T∆S gewonnen. Wie erwartet, binden beide Ligandserien enthalpisch. Dabei weisen die lin-Benzohypoxanthine eine weniger ausgeprägte Enthalpie auf, da die Interaktion zum zweiten Aspartat in der G34-Tasche fehlt. Diese kann teilweise durch ein kristallographisch konserviertes Wassernetzwerk am Grunde der Tasche kompensiert werden. Während die thermodynamischen Profile der lin-Benzohypoxanthine fast unverändert bleiben, sind die Daten der lin-Benzoguanine divers. Offensichtlich ermöglichen strukturelle Änderungen induziert durch die Rotation des Aspartatrestes im Falle der lin-Benzoguanine eine Kommunikation zwischen U33-Tasche, die vom 2-Substituenten adressiert wird, und G34-Tasche, die das Grundgerüst besetzt. Weiterhin wurde am Beispiel der 2-Amino-lin-Benzoguanine getestet, ob ein Ligand mit hoher residualer Beweglichkeit einen Bindungsverlust im Falle einer Resistenzentwicklung eher vermeiden kann als ein Ligand mit geordnetem Bindungsmodus. Nach Identifizierung einer geeigneten Mutationsstelle folgten Expression und Kristallisation verschiedener TGT-Mutanten. Die für unterschiedliche 2-Amino-lin-Benzoguanine bestimmten Bindungsaffinitäten konnten eher in Zusammenhang mit dem Grundgerüst gebracht werden, das Unordnung seitens des Proteins in naher Umgebung zur Mutationsstelle verursacht, als mit den verschiedenen 2-Substituenten. Marginale Unterschiede konnten den Eigenschaften der Substituenten zugeschrieben werden, die auf elektrostatische Anziehungs- und Abstoßungskräfte zurückzuführen sind. Weitere Experimente nutzten MD-Simulationen, um den Bindungsmodus neuartiger 2-Amino-lin-Benzoguanine vorauszusagen. Anschließend verfeinerte Datensätze deckten neuartige Aspekte für das weitere Design und die Charakterisierung von TGT-Inhibitoren auf: Erstens konnte den 2-Substituenten Differenzelektronendichte in der Ribose-32-Tasche zugeordnet werden, die zuvor noch nie durch Inhibitoren besetzt wurde. Zweitens unterstreichen die Ergebnisse die Wichtigkeit der verwendeten Kristallisationsbedingungen. Schlecht definierte Elektronendichte deutet nicht notwendigerweise auf Liganden oder Substituenten hin, die eine hohe Beweglichkeit im proteingebundenen Zustand besitzen. Das verwendete Kristallisationsprotokoll beeinflusst die erhaltene Differenzelektronendichte maßgeblich und muss in entsprechenden Diskussionen berücksichtigt werden. Die Substanzklasse der 5-Azacytosine wurde als neuartiges Grundgerüst für TGT-Inhibitoren untersucht. Ähnlich den lin-Benzopurinen sind auch diese vom natürlichen Substrat Guanin abgeleitet. Sie zeigen daher vergleichbare Bindungseigenschaften, jedoch ist die Interaktion zu Asp102 schwach ausgebildet, die sich als äußerst wichtig für Substraterkennung, Ligandprotonierung und Kommunikation zwischen den Bindetaschen herausgestellt hat. Anders als alle bekannten TGT-Inhibitoren binden sie nicht planar an das Protein. In Folge wird der im Vergleich zu den lin-Benzoguaninen niedrigere pKa-Wert nicht in ein Fenster geeignet für die Ligandprotonierung verschoben und die Liganden brechen in der Affinität ein.

In this thesis different methods of structure-based drug design have been applied to develop TGT inhibitors suiting the manifold purposes of the tackled projects. TGT is not only a putative target for the treatment of Shigellosis, but additionally represents a well-accessible model system to study more general aspects of drug design. The presented results are mostly received from X-ray crystallography and binding affinity measurements. For the latter determinations, a new method - microscale thermophoresis - has been introduced. To characterize binding of TGT ligands, the newly established protocol largely replaces the expensive and time-consuming kinetic assay based on radioactive labeled guanine. The experimental perspective has been further expanded by a point mutation study, methods of computational chemistry and non-covalent nanoESI mass spectrometry. The latter technique provided crucial information about the dimer stability of TGT in solution and upon the impact of ligands, designed to perturb the anticipated hot spot interactions of the dimer interface (section 2). For the first time, a dimer destabilization in solution has been verified induced by needle-type decorated ligands which spike into the interface region. However, these ligands were not able to fully disrupt the dimer which questions the importance of the targeted substructures for dimer stability. A detailed crystal structure analysis of three TGT-ligand complexes complemented with collected affinity data could unravel the role of the targeted helix-loop-substructure, assumed to be crucial for dimer stability due to preceding mutation studies. Despite the involvement of this substructure in several, crystallographically conserved directed interactions between the monomer mates this helix-loop-motif is most likely flexible in solution and just conveyed into a well-ordered arrangement upon crystallization. Supported by molecular modeling and MD-simulations it was possible to provide an explanation for the discrepancy between the discovered minor importance of these helix-loop associated directed interactions and the observed ligand-induced dimer destabilization in solution. In section 3 two series of TGT inhibitors have been developed - each corresponding to another variation of the lin-benzoguanine scaffold. The lin-benzohypoxanthines - lacking the exocyclic amino function at C(6) - and the C(6)-N-alkylated lin-benzoguanines have been analyzed with respect to their membrane permeability, pKa-profile, binding mode in crystal structures and binding affinity. Finally these characteristics have been compared to the parental lin-benzoguanines studied in previous works. For the pyrimidine portion of lin-benzohypoxanthines a shift of ca. two pKa units to increased acidity could be achieved compared to the analog lin-benzoguanines. However, despite the reduced tendency to be charged, lin-benzohypoxanthines showed no improved membrane permeability. The lin-benzohypoxanthines exhibit strongly reduced binding affinities in the micromolar range which could be reasoned by the loss of two H-bonds formed between the exocyclic amino function of parental lin-benzoguanines and two aspartates of the binding pocket. A water cluster was identified as a crystallographically conserved arrangement being picked up upon binding of lin-benzohypoxanthines. This cluster experiences several favorable interactions to the protein and to the ligand and was partially found also in the apo structure. Despite this water cluster cannot compensate the loss in affinity for lin-benzohypoxanthines, the potential large impact of favorable water-protein interactions on the ligand´s binding affinity could be demonstrated by crystal structure analysis of two C(6)-N-alkylated lin-benzoguanines. In section 4, a series of disubstituted lin-benzoguanines and lin-benzohypoxanthines has been characterized in terms of their binding mode and affinity. The combination of substituents simultaneously targeting the ribose33- and ribose34-pocket yielded the first TGT inhibitor exhibiting picomolar binding affinity. However, the comparison of disubstituted compounds with their monosubstituted analogs revealed that the overall binding affinity is not necessarily improved by sidechain combination to result in additivity of affinity contributions. The results presented in section 2 concerning the flexibility of a dimer interface-associated helix-loop substructure also affect the interpretation of crystal structures in section 4. In section 4, a more rigid, crystallographically defined binding mode within the ribose33-pocket could be obtained for the C(2)-substituents of three compounds of the analyzed series. In section 5, a mutationally introduced asparagine within the TGT recognition pocket can be used as a model for a permanently protonated aspartate, which is involved in ligand binding and catalysis.

Protein-Protein-Interactions are commonly known as part of a regulatory network within cells and organisms. The homodimer tRNA-guanine transglycosylase (TGT) catalyzes a base exchange reaction and is therefore crucial to the pathogenicity of Shigella bacteria. By placing a ligand directly in the contact region of the two enzyme partners, the complex is supposed to collapse. In this thesis, the contact area was first analyzed in detail by molecular dynamics simulations. As a major finding a hot-spot-network was identified, consisting of Trp326, Tyr330, His333, and Phe92’ respectively. These four amino acids are in contact with each other by stacking and also interact with acceptor functionalities on the opposite side of the other dimer partner. Furthermore, mutagenesis studies were able to underline this result by inducing monomerization of the permanent and obligate homodimer of TGT. Structure solution by X-ray crystallography showed the monomers to tend to assemble crystallographic dimers in the same manner as the wildtype forms its homodimers (space group C2). Interestingly enough, the structure of each monomer is stable. Also when a disulfide bridge via the introduced cysteine 330 (C330-C330’) is formed and induces a completely different packing in space group P6(5)22, only a small part of the interface is found to be flexible. In some conformations, loop 46 to 52 opens possible pockets in which putative ligands could be placed. First attempts to focus on protein-protein-interface-inhibitors started in silico with docking and molecular dynamics simulations and in vitro by using the tethering approach combined with mass spectrometry. Further experiments might succeed in a way to new PPI-Inhibitors of the homodimeric enzyme TGT., Protein-Protein-Kontakte stellen eine reiche Vielfalt an Interaktionsmöglichkeiten der Polypeptide mit regulatorischen Funktionen innerhalb lebender Organismen dar. Das homodimere Enzym tRNA-Guanin Transglykosylase(TGT) katalysiert z. B. eine Basenaustauschreaktion, die essentiell für die Pathogenität der Shigella Bakterien ist. Durch einen geeigneten Liganden, der an die Kontaktfläche der beiden Monomere bindet, könnte die Ausbildung des aktiven Komplexes unterdrückt werden. In dieser Arbeit wurde deshalb zunächst das Interface mittels Molekulardynamik-Simulationen ausführlich und eingehend charakterisiert. So konnte ein zentraler Hot-Spot, bestehend aus den aromatischen Aminosäuren Trp326, Tyr330, His 333 und Phe92‘, identifiziert werden. Sie stehen am Interface durch Stacking miteinander in Kontakt und bilden zusätzlich ein Netzwerk von Wasserstoffbrückenbindungen zu Akzeptorfunktionalitäten am Dimerpartner aus. Durch umfassende Mutagenesestudien konnte gezeigt werden, dass Veränderungen innerhalb dieses Clusters zur Monomerisierung des sonst permanenten, obligaten Homodimers führen. Die Aufklärung mittels Röntgenstrukturbestimmung ließ, bei stabiler Tertiärstruktur, einen klaren Trend zum Erhalt eines kristallographischen Dimers in analoger Weise zum Wildtypprotein erkennen (RG C2). Durch eine Disulfidbrücke C330-C330‘ konnte die Variante TGT Y330C jedoch auch in einer geänderten geometrischen Anordnung kristallisiert werden (RG P6(5)22). In allen Strukturen zeigte sich ein am Interface beteiligter Loop (AS 46-52) als besonders flexibel, wobei sich nach ersten Analysen durch verschiedene Konformationen Bindetaschen mit der Möglichkeiten zur Interaktion von geeigneten Protein-Protein-Interface-Liganden öffnen. Hier könnte ein Schlüsselmechanismus für einen möglichen Wirkstoff gefunden worden sein. Erste Versuche, einen potentiellen Liganden zu platzieren, bedienten sich in silico der Molekulardynamik und des Dockings, in vitro eines MS-gekoppelten Fragment-Tetherings. Weitere, vertiefende Experimente könnten den Durchbruch für einen neuen Protein-Protein-Interface-Inhibitor am Homodimer der TGT bedeuten.

Im Zyklus der rationellen Arzneimittelentwicklung werden Affinität und Selektivität von potentiellen Wirkstoffen intensiv erforscht. Da diese beiden Eigenschaften keine lineare Abhängigkeit zueinander aufweisen, führt höhere Affinität nicht gezwungenermaßen auch zu einer höheren Selektivität. Computer-basierte Verfahren spielen eine immer größere Rolle für die Analyse und Vorhersage von Selektivitätsprofilen. Da die meisten erfolgreich eingesetzten niedermolekularen Arzneistoffe in Vertiefungen auf Proteinoberflächen binden, spielen physiko-chemische Eigenschaften von Bindetaschen eine zentrale Rolle in der Erkennung und damit auch der Bindung von Liganden. Cavbase ist eine Methode, die es ermöglicht Bindetaschen anhand der physiko-chemischen Eigenschaften dort exponierter Aminosäuren zu beschreiben und unabhängig von ihrer Proteinsequenz und Faltungsgeometrie zu vergleichen. Die Bindetaschen-basierte Klassifizierung von Proteinen ist ein effektiver Ansatz, um relevante Informationen für Selektivitätsanalysen zu extrahieren, die durch Anwendung von Clustermethoden erreicht werden kann. In der vorliegenden Arbeit wurde ein neuartiger Arbeitsablauf zur Untersuchung von wichtigen Parametern einer Clusterung entwickelt. Für einen Datensatz von Proteinen wird eine Ähnlichkeitsmatrix berechnet und anschließend dem entwickelten Arbeitsablauf übergeben. Dieser Ansatz wurde erfolgreich an zwei unterschiedlichen Datensätzen getestet. Die vorhergesagte Anzahl der Cluster, die am besten geeignete Clustermethode und die anschließende Clusterstruktur waren in Übereinstimmung mit den Referenzklassifikation der Proteine. Im Falle der Protease-Proteinfamilie führte die Bindetaschen-basierte Klassifizierung zur einer signifikanten Gruppierung von Proteineinträgen, die unabhängig von Sequenzinformation entstanden. Damit konnte auf struktureller Ebene die Kreuzreaktivität zwischen dem Protein Calpain-1 und Cysteincathepsinen detektiert werden, die bis jetzt nur auf Basis von Liganddaten beschrieben wurde. Im weiteren Verlauf wurden elf unterschiedliche Serinproteasen untersucht, indem die Topologie der Liganden, Bindetaschen- und Sequenzinformationen miteinander verglichen wurden. Die entstandenen Cluster zeigen einen Korrelationstrend zwischen der Ähnlichkeit im Liganden- und Bindetaschenraum. Eine steigende Anzahl von Resistenzen auf derzeitig angewandte antiparasitäre und antibakterielle Arzneistoffe erfordert die Entwicklung neuartiger Antiinfektiva. Für den Parasiten Plasmodium falciparum, den Erreger der Malaria, wurde das Schlüsselenzym der Fettsäuresynthese Typ-2, Enoyl ACP Reduktase (ENR), als potentielle Zielstruktur vorgeschlagen. In einem virtuellen Screening einer virtuellen Datenbank von fragmentartigen Kleinmolekülen konnten acht vielversprechende Strukturen ausfindig gemacht werden. Ein Salicylsäureamidderivat zeigte in einem zellulären Assay inhibitorische Wirkung im erythrozytären Stadium. Diese Verbindung wurde in weiteren Schritten optimiert, in dem Struktur-Aktivitäts-Beziehungen und kombinatorisches Docking für Salicylamide analysiert wurden. Aus dieser Studie konnten zwei potente Verbindungen hervorgehen, die eine niedrige Zytotoxizität aufweisen und in einstellig mikromolarer Konzentration sowohl im erythrozytären als auch im prä-erythrozytären Stadium ihre hemmende Wirkung entfalten. Die Wirkung im prä-erythrozytären Stadium zeigte sich der Wirkung von Primaquin überlegen. Die Biosynthese der Tetrahydrofolsäure ist ein essenzieller Stoffwechselweg für fast alle Organismen. Das Enzym Pyruvoyltetrahydropterin Synthase im Plasmodium falciparum (PfPTPS) übernimmt in diesem Stoffwechselweg die Katalyse einer Reaktion, die gewöhnlich von Dihydroneopterin Aldolase katalysiert wird, das jedoch im Plasmodium Genom fehlt. Die Einbettung des Enzyms PfPTPS in den Folatstoffwechsel qualifiziert es als eine potentielle Zielstruktur zur Entwicklung neuartiger Antifolate. Eine spezielle auf dieses Zielprotein hin aufgearbeitete Bibliothek weist Kleinmoleküle mit zink-bindenden funktionellen Gruppen auf. Die Durchführung eines virtuellen Screenings führte zur Auswahl von neun Molekülen für die Synthese, die anschließend auf ihre biologische Wirkung evaluiert werden sollen. Eine Vielzahl pathogener Mikroorganismen sind auf die Synthese der Isoprenoide aus dem Methylerithritolphosphatweg (MEP-Weg) angewiesen, daher eignet sich die Inhibition dieses Stoffwechselweges als eine sinnvolle Strategie für die Wirkstoffentwicklung. IspD ist eines der Enzyme des MEP-Weges und wurde als Modellprotein zur Untersuchung der bestimmenden Faktoren für eine strukturbasierte Wirkstoffentwickung ausgewählt. Ein Datensatz von leitstrukturartigen Kleinmolekülen aus der ZINC Datenbank wurde für ein virtuelles Screening benutzt, das zur Auswahl von sieben Kandidaten führte. Sechs Verbindungen konnten kommerziell erworben und getestet werden. Für drei Verbindungen konnte eine Proteinbindung gemessen werden.

In context of the present work, a scoring function for protein-ligand complexes has been developed, not aimed at affinity prediction, but rather a good recognition rate of near native geometries. The developed program DSX makes use of the same formalism as the knowledge-based scoring function DrugScore, hence using the knowledge from crystallographic databases and atom-type specific distance-dependent distribution functions. It is based on newly defined atom-types. Additionally, the program is augmented by two novel potentials which evaluate the torsion angles and (de-)solvation effects. Validation of DSX is based on a literature-known, comprehensive data-set that allows for comparison with other popular scoring functions. DSX is intended for the recognition of near-native binding modes. In this important task, DSX outperforms the competitors, but is also among the best scoring functions regarding the ranking of different compounds. Another essential step in the development of DSX was the automatical assignment of the new atom types. A powerful programming framework was implemented to fulfill this task. Validation was done on a literature-known data-set and showed superior efficiency and quality compared to similar programs where this data was available. The front-end fconv was developed to share this functionality with the scientific community. Multiple features useful in computational drug-design workflows are also included and fconv was made freely available as Open Source Project. Based on the developed potentials for DSX, a number of further applications was created and impemented: The program HotspotsX calculates favorable interaction fields in protein binding pockets that can be used as a starting point for pharmacophoric models and that indicate possible directions for the optimization of lead structures. The program DSFP calculates scores based on fingerprints for given binding geometries. These fingerprints are compared with reference fingerprints that are derived from DSX interactions in known crystal structures of the particular target. Finally, the program DSX_wat was developed to predict stable water networks within a binding pocket. DSX interaction fields are used to calculate the putative water positions.

Diese Arbeit befasst sich unter anderem mit den Folgen von Desolvationseffekten, die bei der Protein-Ligand-Wechselwirkung auftreten. In allen Komplexen mit Thrombin und den untersuchten Pyridin-Liganden werden Wassermoleküle entdeckt, die in unterschiedlicher Art so gut es geht den ursprünglichen Solvatationszustand zu konservieren versuchen. Die damit verbundenen entropischen Verluste sind immens. In zwei Ligandkomplexen finden sich sogar ungeordnete Ligandbestandteile in der S1 Tasche als Folge von Desolvatationseffekten. Der Preis für die Desolvatation einer geladenen Aminosäure ist einfach zu groß, um in diesem Fall eine komplette Verdrängung des Wassermoleküls zu gewährleisten. Die Komplexstrukturen zeigen zudem, dass die geladenen Methylpyridinium-Derivate nicht optimal das am Boden lokalisierte negativ geladene Asp189 adressieren können. Entweder lässt sich aus sterischen Gründen kein kurzer Abstand erreichen oder die Methylgruppe bietet einen zu guten Schutz, um über eine kurze Entfernung mit dem negativen Asp189 zu interagieren. Daher kann die Energie für die Desolvatation nicht durch die freiwerdende Energie aus der Interaktion zwischen dem Methylpyridinium und dem Asp189 aufgebracht werden. Zudem wurden Wassereffekte bei der hydrophoben Wechselwirkung in Thrombin und Thermolysin untersucht. Die thermodynamische Charakterisierung zeigt einen hydrophoben Effekt in Thrombin, der eindeutig entropisch getrieben ist. In dieser Studie ist die S3/4 Tasche mithilfe der immer größer werdenden hydrophoben Modifizierungen schrittweise desolvatisiert worden. In beiden Serien verbessert sich die Bindungsaffinität um das 40-fache. Ausgehend von einer nanomolaren Aktivität ist die Bindungsaffinität in den niedrigen pikomolaren Bereich hydrophob optimiert worden. Die Benzamidin-Derivate sind sogar durch einen Bindungsmodus mit zwei gebundenen Liganden gekennzeichnet. Überraschenderweise zeigt dieser Bindungsmodus eine bemerkenswerte Ähnlichkeit mit dem Bindungsmodus von Fibrinopeptid A. Die S2‘ Tasche von Thermolysin ist dagegen weniger gut geformt, aber dafür wegen ihrer Lage auf der Oberfläche optimal solvatisiert. Die Liganden für die S2‘ Tasche unterscheiden sich nur durch eine terminale Carboxylat- und/oder eine Methylgruppe. Eine überraschende Nicht-Additivität von Beiträgen einer Carboxylat- und/oder Methylgruppe ist festgestellt worden. Das Hinzufügen einer Methylgruppe bewirkte eine kleine Zunahme in der Freien Energie mit kleinen Änderungen in der Enthalpie/Entropie, während das im nächsten Schritt carboxylierte Derivat mit einem starken Affinitätssprung und großen Änderungen in der Enthalpie/Entropie begleitet war. Wurde das Carboxylat jedoch zuerst und dann erst die Methylgruppe eingefügt, wurden umgekehrte Effekte beobachtet: jetzt war die saure Gruppe von geringfügigen Effekten begleitet, während die zusätzliche Methylgruppe enorme Veränderungen verursachte. Die Carboxylat-Gruppe stört in beiden Komplexen das lokale Wassernetzwerk. Die zusätzliche Methylgruppe bietet dagegen günstige Wechselwirkungen für zusätzliche Wassermoleküle an. In fast allen Komplexen wird ein zusammenhängendes Wassernetzwerk zwischen den funktionellen Gruppen des Proteins und des Liganden beobachtet. Bei der Komplexstruktur mit dem carboxylierten Liganden fehlt die endständige Methylgruppe und dadurch bricht das Wassernetzwerk zusammen. Dieser Zusammenbruch der Wasserkette ergibt die überraschende thermodynamische Signatur mit nur geringen Affinitätsunterschieden bei dem carboxylierten Liganden, dem die Methylgruppe fehlt. Eine zusätzliche Methylgruppe dagegen hat günstige Interaktionsstellen für Wassermoleküle geschaffen und das Netzwerk wurde wieder hergestellt, begleitet von starken Affinitätsänderungen und einer enormen Änderung in der Enthalpie/Entropie. Die Adressierung der S2‘ Tasche zeigt ebenfalls ein entropisch dominiertes Signal. Die vorliegende Reihe von eng verwandten Liganden zeigt, dass beide thermodynamischen Parameter betroffen sind und dass viele kleine strukturelle Änderungen das thermodynamische Profil bestimmen. Wenn ein zusammenhängendes Wassernetzwerk zusammenbricht, zeigen sich deutliche Verluste in der Enthalpie, während die Entropie stark zunimmt. Insbesondere bei der Bindung von Liganden in offene hydrophobe Taschen, die leichten Zugang zu Wasser haben, können sich neue Bindestellen für Wassermoleküle ergeben, wenn Ligandenbereiche zur Wasserphase ausgerichtet sind. In unserer Studie wurde zum Beispiel ein zusätzliches Wassermolekül über dem Carboxylat (capping position) und an der Seite des Benzolrings entdeckt. Abschließend kann man feststellen, dass die hydrophobe Interaktion weder als entropisch noch enthalpisch beschrieben werden kann. Kleine strukturelle Veränderungen auf molekularer Ebene bestimmen darüber, welche treibenden Kräfte hinter der Bindung von hydrophoben Bindungspartnern stehen., The aim of this work is to investigate the impact of desolvation effects on protein-ligand interactions. In all complex structures with thrombin and pyridine, it is evident that preserving the original solvation state of Asp189 is a crucial and a common feature upon binding of the pyridine inhibitors. However, the associated entropic losses are immense. In two ligand complexes even disordered ligand portions are found in the S1 pocket, which evade full desolvation of Asp189 compared with the apo form of thrombin. The price for the desolvation of a charged amino acid is simply too large to ensure in this case a complete displacement of all waters. The determined complex structures reveal that the charged methylpyridinium derivatives do not optimally address the negatively charged Asp189 at the bottom of the S1 pocket. A short distance to the deprotonated Asp189 cannot be achieved either due to steric reasons or the bulky methyl group provides a good protection to interact in a proper way with the negatively charged Asp189. The optimal interaction geometry to Asp189 cannot be realized in this series. Therefore, the energy released from the suboptimal interaction between methylpyridinium and Asp189 is not high enough to compensate for the large desolvation price required for the charged ligands. Additionally, water effects have been studied in hydrophobic interactions in thrombin and thermolysin. The thermodynamic characterization shows a hydrophobic effect in thrombin which is clearly entropically driven. In the study, the S3/4 pocket has been gradually desolvated using increasing hydrophobic modifications in P3. In both series, the binding affinity improved by about 40-fold. The binding affinity has been optimized hydrophobically from nanomolar to low picomolar affinity. The benzamidine derivatives are even characterized by a binding mode showing two ligands to be bound simultaneously. Surprisingly, the additionally bound ligand traces remarkable well the recognition area that accommodates fibrinopeptide A (cleavage product of fibrinogen). In contrast, the examined S2' pocket of thermolysin is less well shaped, but ideally solvated because of its exposure to the protein surface. The ligands differ only by a terminal carboxylate and/or methyl group. A surprising nonadditivity of functional group contributions for the carboxylate and/or methyl groups is detected. Adding first the methyl and then the carboxylate group results in a small Gibbs free energy increase and minor enthalpy/entropy partitioning for the first modification, whereas the second involves strong affinity increase combined with huge enthalpy/entropy changes. Adding however first the carboxylate and then the methyl group yields reverse effects: now the acidic group attachment causes minor effects whereas the added methyl group provokes huge changes. The added COO- groups perturb the local water network in both carboxylated complexes and the attached methyl groups provide favorable interaction sites for water molecules. In all complexes, apart one example, a contiguously connected water network between protein and ligand functional groups is observed. In the complex with the carboxylated ligand, still lacking the terminal methyl group, the water network is unfavorably ruptured. This results in the surprising thermodynamic signature showing only minor affinity increase upon COO- group attachment. Since the further added methyl group provides a favorable interaction site for water, the network can be re-established and strong affinity increase with huge enthalpy/entropy signature is then detected. Addressing the S2' pocket of thermolysin with hydrophobic molecule portions generates also an entropically dominated signal similarly to the thrombin series. The present series of closely related thermolysin complexes shows that both thermodynamic properties are involved and many detailed structural phenomena determine the final signature. If a contiguously connected water network ruptures, an enthalpic loss and entropic gain is experienced. Particularly, in case of accommodation of ligand portions in pockets opening to the bulk solvent and exposing parts of the placed ligand to the water phase, new binding sites for water molecules can be generated, e.g. as in our study at the capping position above the carboxylate group or the site on top of the benzyl ring. Also such phenomena contribute on the molecular level to the finally determined hydrophobic effect. In summary, there are no arguments why the hydrophobic effect should be predominantly entropic or enthalpic. Small structural changes on the molecular level determine whether hydrophobic binding to hydrophobic pockets results in a more enthalpy or entropy-driven signature.

The aim of this work was to develop a tool to optimize insilico generated protein-ligand complexes according to DrugScore (DS) potentials. DS is typically used to rescore ligand geometries that were generated by docking. Thus, these poses are optimized according to the scoring function used by the selected docking algorithm. Applying DS to such a geometry does not necessarily guarantee reliable and relevant scoring. Considering the steepness of the DS potentials, even small variations in the atomic positions can lead to large differences in the resulting scores. Thus, a local optimization with respect to DS is strongly recommended in this case. In 2009, O’Boyle et al. stated, that a local optimization is always constrained to the energy well on the potential surface in which the original pose resides. So there may be even deeper wells nearby which are not considered in the local optimization but would be equally valid. The new tool MiniMuDS, developed in this thesis, should account for this problem. On the other hand, MiniMuDS is not intended to perform a global optimization since this would, at the end, result in a new docking algorithm. Instead, the new algorithm is supposed to stay close to the pose generated by the original docking engine and simply adapts it to the DS function, a task typically addressed by local search methods. MiniMuDS was to combine these two tasks by avoiding a strictly local optimization without extending to a fully global search at the same time. Therefore, a strategy was implemented, that contains elements of a global optimization, but is still restricted to a local part of the search space. Simply speaking, the applied algorithm can overcome small hills on the potential surface, but only if the following valley is deeper than the current one. Thus, major energetic barriers between basically different conformations will not be passed. In the validation of MiniMuDS several important properties were shown: 1. The optima of the applied energy model correspond impressively well to the experimentally determined native states of the evaluated complexes. This was shown by the optimization of the original crystal structures, which resulted in an average rmsd of about 0.5Å, a value much smaller than the one observed in case of in-silico generated geometries. This deviation has to be seen in light of the positional accuracy estimated for experimental structure determination. The observed deviations virtually fall into the same range. 2. The aim of conserving the given binding modes was achieved. The presented method allows for modifications up to 2Å rmsd compared to the input geometry. Remarkably, not even 5% of the optimized docking poses fully exploited this available space. On average a modified geometry shows an rmsd of about 1Å to the input structure. 3. MiniMuDS improves a given docking solution by about 0.1Å on average. The best performance was observed for well docked poses between 1 and 2Å rmsd which could be improved by up to 0.3Å on average. 4. It was shown that an optimization exceeding the restrictions of a strictly local search can improve the resulting ranking. Up to 4.7% better success rates at a 2Å cutoff and an improvement of up to 9.3% at the 1Å level were received when comparing MiniMuDS to a local optimization. 5. Taking into account not only the top ranked solution but the whole ranking, it was shown that MiniMuDS strongly improves the discrimination between near-native and misplaced poses. Geometries with lower rmsd values to the crystal structure are more likely to be placed within the first positions of the ranking. 6. The inclusion of additional flexible components into the optimization is easy to manage while results can strongly benefit. This was shown using the example of protein side chain flexibility and binding relevant water molecules. 7. Considering computational efforts, it was shown that it is sufficient to only subject the 10 top-ranked docking solutions to an optimization. This consistently yielded slightly better ranking results for all applied protocols compared to an optimization of all generated docking solutions. At 80% less computational effort, up to 4.7% higher success rates at 2Å and 2.1% higher once at a 1Å cutoff were recorded. Especially the last aspect confirms that it is advisable to focus only on those docking poses that were already ranked high by another scoring function. This way, only poses that score well with respect to two different scoring functions are considered, taking thereby advantage of some kind of consensus effect. In light of these findings, the usage of at least a local optimization has to be strongly recommend before applying DS for rescoring purposes. Beyond that, the application of a more sophisticated search strategy like the one implemented in MiniMuDS is suggested. In particular, when dealing with small, lead-like structures, the presented method showed to substantially improve the results., Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Programms zur Optimierung in-silico generierter Protein-Ligand Komplexe auf Grund von DrugScore (DS) Potentialen. Die Funktion DS wird typischerweise für die Nachbewertung von Ligandgeometrien genutzt, die durch Docking erzeugt wurden. Daher sind diese Geometrien zunächst für die intern verwendete Scoringfunktion des gewählten Docking Algorithmus optimiert. Wird DS auf eine solche Geometrie angewandt, ist nicht automatisch eine aussagekräftige Bewertung garantiert. Bedenkt man die Steilheit der DS Potentiale, so können bereits kleine Abweichungen der Atompositionen zu großen Unterschieden in der Bewertung führen. Daher wird eine lokale Optimierung in diesem Fall ausdrücklich empfohlen. 2009 führten O’Boyle et al. aus, dass eine lokale Optimierung grundsätzlich auf das Tal der Potentialoberfläche beschränkt ist, in dem sich die Ausgangspose befindet. Es könnte aber tiefere Täler in der Nähe geben, die bei einer lokalen Optimierung nicht berücksichtigt werden, obwohl sie ebenso zulässige Lösungen darstellen. Das in dieser Arbeit entwickelte Programm MiniMuDS soll diesem Problem gerecht werden. Andererseits soll keine globale Optimierung durchgeführt werden, da dies zu einem neuen Docking Algorithmus führen würde. Stattdessen soll MiniMuDS nahe an der ursprünglich erzeugten Pose bleiben und diese nur an die DS Funktion anpassen. Um beide Anforderungen zu erfüllen, wurde eine Suchstrategie implementiert, die Elemente einer globalen Suche enthält, sich aber dennoch auf einen abgegrenzten Teil des vollständigen Suchraums beschränkt. Einfach ausgedrückt kann der Algorithmus kleine Hürden auf der Potentialoberfläche überwinden, jedoch nur wenn sich direkt dahinter auch ein tieferes Tal befindet. Größere energetische Barrieren zwischen grundsätzlich unterschiedlichen Konformationen können so nicht passiert werden. Durch die Validierung von MiniMuDS konnten verschiedene wichtige Eigenschaften gezeigt werden: 1. Die Optima der angewandten Zielfunktion stimmen beeindruckend genau mit experimentell bestimmten Komplexstrukturen überein. Dies wurde durch die Optimierung von original Kristallstrukturen gezeigt, die in einer mittleren Abweichung von etwa 0,5Å resultierten. Dies sind deutlich kleinere Abweichungen als im Fall von in-silico generierten Geometrien. Darüber hinaus fallen diese Abweichungen etwa in den Bereich der geschätzten Genauigkeit experimenteller Strukturaufklärung. 2. Das Ziel den vorgegebenen Bindemodus beizubehalten wurde erreicht. MiniMuDS erlaubt Modifikationen bis zu 2Å rmsd gegenüber der Ausgangspose. Bemerkenswerterweise nutzten nicht einmal 5% der optimierten Docking Lösungen diesen Raum aus. Sie zeigten durchschnittliche Abweichungen von etwa 1Å auf. 3. Bezogen auf den rmsd zur Kristallstruktur verbessert MiniMuDS eine gegebene Konformation um etwa 0,1 Å. Die besten Ergebnisse wurden für bereits gut gedockte Posen mit einem ursprünglichen rmsd zwischen 1 und 2Å beobachtet, die im Mittel um bis zu 0,3Å verbessert wurden. 4. Es wurde gezeigt, dass durch die Überwindung der Einschränkungen einer rein lokalen Suche die erzielte Rangliste verbessert wurde. Im Vergleich zu einer lokalen Optimierung wurden bis zu 4,7% bessere Erfolgsraten bei der Erkennung nativ-ähnlicher Posen unter 2Å rmsd auf Rang 1 erzielt. Für Posen unter 1Å lag die Verbesserung bei 9,3 %. 5. Betrachtet man nicht nur die bestbewertete Lösung, sonder die gesamte Rangliste, so wurde gezeigt, dass MiniMuDS die Trennung zwischen nativ-nahen und falsch platzierten Posen deutlich verbessert. Geometrien mit niedrigen rmsd Werten tauchen häufiger auf den vorderen Positionen der Rangliste auf. 6. Die Berücksichtigung zusätzlicher flexibler Komponenten in der Optimierung ist mit MiniMuDS leicht zu bewältigen, wodurch die erzielten Ergebnisse deutlich verbessert werden können. Dies wurde am Beispiel von flexiblen Protein Seitenketten und an der Bindung beteiligter Wasser Moleküle gezeigt. 7. Es wurde gezeigt, dass es ausreichend ist, die zehn besten Lösungen eines Docking Experiments zu Optimieren. Dadurch wurden durchgängig etwas bessere Ergebnisse erzielt als bei der Optimierung aller fünfzig erzeugten Lösungen. Bei 80% geringerem Rechenaufwand wurden so bis zu 4,7% bessere Erfolgsraten erzielt. Besonders der letzte Punkt bestätigt, dass es empfehlenswert ist, sich auf solche Posen zu konzentrieren, die bereits von einer anderen Scoringfunktion gut bewertet wurden. So kann zusätzlich von einem Konsensus Effekt profitiert werden. Mit Blick auf die erzielten Ergebnisse muss die Anwendung zumindest einer lokalen Optimierung dringend Empfohlen werden, bevor DS für Nachbewertungen herangezogen wird. Allerdings wird die Verwendung einer darüber hinausgehenden Suchstrategie wie sie in MiniMuDS implementiert wurde nahe gelegt. Insbesondere bei kleineren Leitstrukturen verbesserte die vorgestellte Methode die Nachbewertungsergebnisse deutlich.

In den letzten Jahren wurden vermehrt Fragment-basierte Verfahren verwendet, um neue Leitstrukturen zu identifizieren. Fragmente werden anhand der Astex-Dreier-Regel definiert. SPR, NMR, sowie biochemische Assays und Röntgenstrukturanalyse sind effiziente Verfahren um Fragmente zu entdecken. Diese Methoden müssen auf eine bestehende Fragmentbibliothek angewendet werden. Wir haben unsere eigene Fragmentbibliothek entwickelt. Während des Designs der Fragmentbibliothek haben wir die Astex-Dreier-Regel modifiziert. Es wurde kein strikter physiko-chemischer Filter verwendet. Im letzen Schritt wurden sie visuell inspiziert, was zu einer Bibliothek mit 364 Fragmenten führte. Um die Güte der Bibliothek zu überprüfen, haben wir diese gegen Endothiapepsin getestet. Als Ergebnis erhielten wir 55 aktive Fragmente. Diese wurden kristallographisch untersucht, wobei elf Kristallstrukturen bestimmt werden konnten. Das Programm HotspotsX kann aufgrund von wissensbasierten Potentialen die Aufenthaltswahrscheinlichkeit von einem definierten Atomtyp in einer bestimmten Umgebung der Bindetasche des Zielenzyms vorhersagen. Mit Hilfe der elf Fragmentkristallstrukturen haben wir das Programm HotspotsX validiert. Durch die chemische Diversität und die diversen Posen der Fragmente erhielten wir Hinweise auf aromatische, Donor, Akzeptor, Doneptor und hydrophobe Binder. Die berechneten HotspotsX Karten passen hervorragend zu den experimentell ermittelten Bindungsposen der Fragmente. Das Programm HotspotsX wurde ebenfalls an Kristallstrukturen von Sonden-Molekülen wie Phenol, Harnstoff und Methylharnstoff getestet. Die Bindungsposen dieser Sonden konnten in verschiedenen Zielenzymen mit Hilfe von Röntgenstrukturanalysen ermittelt werden. Die meisten experimentell bestimmten bevorzugten Bindungsregionen passten hervorragend mit den computer-vorhergesagten Positionen überein. Beginnend mit der Sondenstruktur von Phenol in der cAMP abhängigen Protein Kinase A (PKA) haben wir Fragment-basierte Prinzipien angewendet. Sie beruhen auf dem Wachstum von inital entdeckten Fragmenten. In der Kristallstruktur findet man drei Phenolmoleküle, wobei zwei die ATP-Bindestelle besetzen und das andere auf der Glycin-reichen Schleife (G-Schleife) sitzt. Eine computer-basierte Suche wurde durchgeführt. Es wurden Phenol-artige Strukturen vorgeschlagen und für eine konnte eine Kristallstruktur bestimmt werden. Diese Struktur wurde verwendet, um die bevorzugten Bindungsregionen der Bindungstasche auszuleuchten. Das Programm schlug vor, den Liganden in Richtung der G-Schleife zu wachsen, in dieser Region eine aromatische Gruppe zu platzieren und Lys72 mit einer Akzeptorgruppe zu adressieren. Die erste Testverbindung hatte einen Inhibitionswert von 70µM. Im folgenden ersten Design-Zyklus konnte die Affinität auf 6.5µM gesteigert werden. Im zweiten Zyklus wurde eine zusätzliche Aminogruppe an die Leitstruktur synthetisiert, was das Verhältnis Schweratome zu Affinität auf 0.38 anhob. Im letzten Zyklus wurden eine bzw. zwei Methylen-Gruppen als Brücken für die Aminogruppe synthetisiert. Die Affinität für das synthetisierte Diastereomerengemisch zeigte eine Affinität von ca. 110nM. Die Struktur des Phenol-PKA Komplexes zeigte eine mögliche allosterische Bindetasche. Die G-Schleife in diesem Komplex liegt in einer eingeklappten Konformation vor. Diese Konformation könnte durch eines der drei Phenolmoleküle, das auf der G-Schleife sitzt, erzwungen werden. Mehrere Moleküldynamik (MD) Berechnungen wurden durchgeführt, wobei verschiedene Kombinationen bezüglich der Besetzung der drei Phenolmoleküle ausprobiert wurden, um einen Einblick in erste Schritte bei dem Öffnen der Schleife zu bekommen. Die MD Simulation, bei welcher das Phenolmolekül auf der Schleife fehlte, zeigte erste Anzeichen für ein Öffnen der Schleife, was die ersten Schritte eines kaskadenartigen Öffnens darstellen könnte. In einem weiteren Projekt wurde eine virtuelle Suche nach neuen Leitstrukturen der Aldose Reduktase durchgeführt. Von den besten Leitstrukturen wurden fünf Verbindungen synthetisiert und die Affinität gemessen. Unter diesen Leitstrukturen war eine Verbindung, die eine Affinität von 920nM aufwies. Die etablierten Affinitäts-Testsysteme sind, um Fragmente als Binder zu finden, noch nicht ausreichend. Die Herausforderungen liegen in der schwachen Affinität und der schlechten Löslichkeit der Fragmente. Daher wurde der bekannte Temperatur-Stabilitäts-Test auf Fragmente angewendet. Um die Methode zu etablieren, wurden verschiedene Mutanten von EctD charakterisiert. Im letzten Projekt wurden Bindungsposen von Arachidonsäurederivaten in einem K+ Kanal erzeugt, um eine Vorstellung zu bekommen, wie die Bindung aussehen könnte. Eine genaue Bindungspose konnte nicht bestimmt werden, es konnte allerdings gezeigt werden, dass nur ein einzelnes Arachidonsäuremolekül die innere Pore des Kanals blockieren kann., In recent years, fragment screening has become a popular approach to identify new lead structures. Fragments are usually defined by the Astex ‘rule of three’ (RO3). Surface Plasmon Resonance (SPR), Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy (NMR), biochemical assays and X-ray crystallography are efficient screening techniques to discover prospective fragments as binders. However, these methods need an assembled fragment library. We designed an in-house fragment library, starting from approx. 380,000 commercially available fragments. During library design, we modified the RO3 and we did no strict filtering of physico-chemical properties during fragment enumeration (e.g. twice the number of H-bond acceptors was allowed). The fragments were stepwise reduced to 4,000 compounds. The last step was a visual inspection of the candidates, which lead to a final fragment library of 364 fragments. To validate the quality of the library, we screened it against endothiapepsin. The biochemical screening suggested 55 hits, which were entered into a crystallographic screen. Eleven complex crystal structures were determined, pointing out the remarkably high hit rate of the designed library. HotspotsX is a program which predicts (based on knowledge-based potentials) the probability of a certain atom type at a certain position in the binding pocket of a target enzyme. The eleven crystal structures obtained before were used to validate the program HotspotsX. Due to chemical diversity and the different binding modes of the fragments observed for the library examples we obtained binding through aromatic- , H-bond donor- , acceptor- , doneptor- and hydrophobic interactions. The calculated HotspotsX maps coincide remarkably well with the crystallographically determined fragment positions inside the binding pocket. The program HotspotsX has also been validated with crystal structures of molecular probes like phenol, urea and methylurea. Crystal structures of these molecular probes were determined with different targets. Overall, the experimental hotspot analysis coincided well with the computed contour maps. Thus, the calculated maps by HotspotsX have an excellent predictive power. Based on the binding modes of the molecular probe phenol to the cAMP-dependent protein kinase A (PKA), we started a fragment growing approach. In the latter complex, three phenol molecules are bound. Two are occupying the ATP binding site and one is sitting on top of the glycine-rich loop (G-loop). A virtual screening, using the hinge binding phenol as constraint, suggested a phenol derivative for which a crystal structure could be determined. Starting from this hit, a hotspot analysis was performed. This analysis indicates that growth in the direction of the G-loop, placing an aromatic portion under the G-loop and an acceptor functionality capable to address Lys72 is desired. The first compound of this de novo design had an affinity of 70 µM. In the following first design cycle, we were able to enhance the affinity to 6.5 µM. In the second design cycle an additional amino function was introduced, which did not improve affinity dramatically, but enhanced ligand efficiency to 0.38. In the last cycle, a spacer of one and two methylene groups was introduced and the affinity could be increased to about 110 nM for a diastereomeric mixture of four compounds. The phenol-PKA complex provides a putative allosteric site of PKA. The G-loop in this structure is in a closed state which is stabilized by two H-bonds. This G-loop conformation is probably induced by the phenol molecule sitting on top of the G-loop. Therefore, several molecular dynamics (MD) studies were performed, lacking different phenol molecules, to get insights into the G-loop opening. The MD studies suggest that after removal of the phenol sitting on top of the G-loop some first side chain movements are initiated that can indicate the first steps of the G-loop opening cascade. In a different project, a virtual screening approach was used to find new inhibitors for aldose reductase. A pre-filtered subset of the ZINC database was used as ligand dataset. For the best hit, a series of five compounds was synthesized. Among them one compound displayed an inhibition of 920 nM. The available assays to detect fragment hits are currently not sufficient. The challenges are the low affinity of the fragments and their poor solubility. Therefore, the known thermal shift assay was applied and adapted to detect fragment hits. To validate the method, it was used to characterize variant mutations of EctD. Lastly, a modeling study was used to get ideas about possible binding modes of arachidonic acid derivatives in a K+ ion channel. One predominant binding pose could not be suggested. The study proposes, however, that one arachidonic acid molecule can occupy the inner pore cavity, which is consistent with experimental data.

In this thesis a variety of quite different fragment-based lead discovery approaches have been applied to the target protein carbonic anhydrase II. The different projects were strongly supported and methodologically tailored towards protein crystallography; a method which is currently emerging as a routine analytical tool. This maturation mainly results from improved radiation sources and enhanced computing power. About 200-250 datasets were collected in due course of this thesis answering miscellaneous questions in the context of several ambitious projects to be answered by structural biology. How can interactions of proteins with small molecules be exploited for drug development? Are we able to, e.g. monitor in situ reactions using protein crystallography? Will a tethering approach fixing weak initial binders increase the success rate of fragment-based drug discovery? In order to cover this broad scope of diverse projects access to large amounts of CA II is a prerequisite. Therefore, the gene coding for CA II was cloned into a high-level expression system, the GST-tagged gene fusion system. The expression system was optimized yielding target protein of up to 30 mg from 1 L of original cell culture. Several CA II mutants were produced via site-directed mutagenesis and a mercury-free protein crystallization protocol had to be established for either the wild type and all mutants. Initial goal of the first project of this thesis was the accomplishment of a prominent click chemistry reaction, the Huisgen reaction – a Cu+ catalyzed 2+3 dipolar cycloaddition – within or next to the active site of CA II. Therefore, an artificial copper center had to be introduced at the surface of CA II which subsequently should be used by azide and alkyne building blocks to catalyze triazole formation. Unfortunately, the embarked rational design strategy remained unsuccessful which underlines that our still rather limited understanding of amino acid exchanges on the architecture of proteins might provoke unpredictable effects while tampering with complex biological systems such as a highly functionalized proteins. Finally, more by serendipity than design the formation of an artificial Cu center at the surface of CA II could be achieved. In parallel to the formerly described metal center design, the click chemistry project was also promoted by a new tether-assisted approach. By covalently attaching one building block to the protein surface and linking the second reactant via a reversible sulfonamide anchor to the active site Zn2+ ion, both components were brought into vicinity favorable to undergo cycloaddition reaction. The reaction could be induced by either the exposure to Cu+ ions or the steric constraints of the environment of CA II, respectively. Remarkably, by the protein environment the triazole formation was executed with regio- and stereoselectivity. The 1,5-S-triazole was selectively formed from a racemic building block mixture. Apart from this click chemistry approach, the tethering method was also applied to fragment-based lead discovery of CA II. Tethering allows the identification of fragments with rather weak affinity to the target protein. Suitable candidates for covalent fixation are extracted from a library of thiole containing compounds under reducing conditions. A computational docking study was applied to screen a virtual library and select a feasible number of compounds for synthesis. The "in solution" experiments monitored by HPLC-MS revealed many candidate fragments with promising affinity to CA II. The crystallographic analysis of several CA II-H64C tethered complexes showed that the Saccharin binding pocket at the protein surface could be successfully addressed by the tethering approach. Also a second surface exposed binding area, known from CA II activators could be screened. In an alternative fragment-based lead discovery approach, four novel head groups for zinc coordination have been tested on CA isoforms. A complex structure of CA II and 1,2-HOPTO revealed a novel Zn2+ binding mode with favorable interactions to Thr199 and Thr200. The fragment which is perfectly coordinated by a water network suggests a new class of putative CA inhibitors. The binding affinity can be improved by adding substituents to occupy to the hydrophilic and hydrophobic portion of the CA II binding pocket., Im Rahmen dieser Dissertation wurde eine Auswahl recht verschiedene Ansätze zur Fragment-basierten Leitstruktursuche (fragement-based lead discovery) mit dem Zielprotein Carboanhydrase II durchgeführt. Die verschiedenen Projekte wurden entscheidend durch die Protein Kristallographie unterstützt und methodisch gelenkt. Durch Verbesserung von Strahlungsquellen und der Rechenleistung von Computern hat sich die Protein-Kristallographie in den letzten Jahren zu einem Analytik Instrument entwickelt, welches routinemäßig zur Strukturaufklärung eingesetzt werden kann. Circa 200 bis 250 Datensätze wurden im Rahmen dieser Arbeit gesammelt um Fragestellungen der verschiedenen ambitionierten Projekte mit Focus auf die Strukturbiologie zu beantworten. Wie kann die Wechselwirkung zwischen Proteinen und kleinen Substanzen für Wirkstoffentwicklungen ausgenutzt werden? Ist es möglich, z.B. Reaktionen die in situ ablaufen, durch Protein-Kristallographie zu verfolgen? Kann die Erfolgsquote von Fragment-basierter Kristallographie durch einen Tethering-Ansatz, welcher schwach bindende Fragmente am Protein fixiert, erhöht werden? Die Verfügbarkeit großer Mengen an CA II ist die Grundvoraussetzung um solch eine Bandbreite sehr verschiedener Projekte durchführen zu können. Daher wurde das CA II Gen in das GST gene fusion System kloniert, ein System welches Gen Expression auf sehr hohem Niveau ermöglicht. Das Expressionssystem wurde hinsichtlich der Proteinausbeute optimiert und stellt 30 mg Protein aus 1 L Zellkultur bereit. Etliche CA II Mutanten wurden durch ortsgerichtete Mutation hergestellt und eine Quecksilber-freie Protein-Kristallisation für den Wildtyp und die Mutanten erstellt. Die Durchführung einer prominenten Click-Chemie-Reaktion, der Huisgen Reaktion – eine Cu+ katalysierte 2+3 dipolare Cycloaddition – in der Bindetasche der CA II war das anfängliche Ziel des ersten Projektes dieser Dissertation. Dafür sollte ein künstliches Kupfer-Zentrum an der Oberfläche der CA II eingeführt, und dieses neue katalytische Zentrum für die Bildung von Triazolen aus Alkinen und Aziden ausgenutzt werden. Leider verblieben diese Versuche eines rationalen Designs erfolglos. Dies zeigt auf, dass unser derzeitig noch begrenztes Verständnis über den Zusammenhang zwischen Aminosäure-Mutationen und Proteinarchitektur in komplexen biologischen Systemen, wie z.B. in hoch entwickelten Proteinen, unvorhersehbaren Auswirkungen mit sich bringen kann. Schließlich, eher durch einen glücklichen Zufall als gezieltes Design, konnte die Bildung eines Kupfer-Zentrums an der Oberfläche der CA II zustande gebracht werden. Neben dem zuvor beschriebenen Design eines Metall-Zentrums, wurde das Click-Chemie-Projekt ebenso durch einen neuartigen Tethering-unterstützten Ansatz vorangetrieben. In diesem Ansatz wird eine Reaktionskomponente kovalent an die Proteinoberfläche gebunden, während die zweite Komponente durch einen Sulfonamid-Anker an das Zink-Ion im aktiven Zentrum bindet. Die Reaktion konnte entweder durch Cu+ Ionen oder aber durch die Proteinumgebung ausgelöst werden. Bemerkenswerterweise erfolgte die Protein-induzierte Triazolbildung mit ausgeprägter Regio- sowie Stereoselektivität. Aus dem racemischen Alkingemisch wurde selektiv das 1,5-S-Triazol gebildet. Die Tethering Methode wurde abgesehen von diesem Click-Chemie-Ansatz ebenso für ein Fragment-Screening in Hinblick auf die CA II angewandt. Der Tethering-Ansatz ermöglicht die Identifizierung von Fragmenten mit eher schwacher Affinität zum Zielprotein. Durch einen computerbasierten Docking-Ansatz wurde eine virtuelle Bibliothek von Fragmenten getestet um so eine überschaubare Anzahl an Substanzen für die Synthese auszuwählen. Durch HPLC-MS Messungen konnten viele Fragmente mit einer vielversprechenden Affinität zu CA II identifiziert werden. Einige dieser Substanzen wurden im kovalenten Komplex mit CA II kristallographisch untersucht und zeigten, dass eine Saccharin-Bindetasche an der Protein-Oberfläche mit diesem Tethering-Ansatz erfolgreich untersucht werden kann. Zusätzlich konnte eine zweite Bindetasche an der Oberfläche, bekannt für die Bindung von CA II Aktivatoren, untersucht werden. In einem weiteren Ansatz zur Fragment-basierten Leitstruktursuche wurden vier neue Zink-koordinierende Kopfgruppen an CA Isoenzymen getestet. Eine Komplexstruktur von CA II mit 1,2-HOPTO zeigte einen neuartigen Zn2+ koordinierenden Bindungsmodus mit Wechselwirkungen zu Thr199 und Thr200. Das Fragment, welches zusätzlich perfekt durch ein Wassernetzwerk koordiniert ist, verspricht eine neue Klasse von CA Inhibitoren. Durch die Addition von Substituenten, die mit den hydrophilen und lipophilen Bereichen der CA II Bindetasche wechselwirken, kann die Bindungsaffinität verbessert werden.

In dieser Arbeit sind die zwei neuen Computer-Methoden DrugScore Fingerprint (DrugScoreFP) und GARLig in ihrer Theorie und Funktionsweise vorgestellt und validiert worden. DrugScoreFP ist ein neuartiger Ansatz zur Bewertung von computergenerierten Bindemodi potentieller Liganden für eine bestimmte Zielstruktur. Das Programm basiert auf der etablierten Bewertungsfunktion DrugScoreCSD und unterscheidet sich darin, dass anhand bereits bekannter Kristallstrukturen für den zu untersuchenden Rezeptor ein Referenzvektor generiert wird, der zu jedem Bindetaschenatom Potentialwerte für alle möglichen Interaktionen enthält. Für jeden neuen, computergenerierten Bindungsmodus eines Liganden lässt sich ein entsprechender Vektor generieren. Dessen Distanz zum Referenzvektor ist ein Maß dafür, wie ähnlich generierte Bindungsmodi zu bereits bekannten sind. Eine experimentelle Validierung der durch DrugScoreFP als ähnlich vorhergesagten Liganden ergab für die in unserem Arbeitskreis untersuchten Proteinstrukturen Trypsin, Thermolysin und tRNA-Guanin Transglykosylase (TGT) sechs Inhibitoren fragmentärer Größe und eine Thermolysin Kristallstruktur in Komplex mit einem der gefundenen Fragmente. Das in dieser Arbeit entwickelte Programm GARLig ist eine auf einem Genetischen Algorithmus basierende Methode, um chemische Seitenkettenmodifikationen niedermolekularer Verbindungen hinsichtlich eines untersuchten Rezeptors effizient durchzuführen. Zielsetzung ist hier die Zusammenstellung einer Verbindungsbibliothek, welche eine benutzerdefiniert große Untermenge aller möglichen chemischen Modifikationen Ligand-ähnlicher Grundgerüste darstellt. Als zentrales Qualitätskriterium einzelner Vertreter der Verbindungsbibliothek dienen durch Docking erzeugte Ligand-Geometrien und deren Bewertungen durch Protein-Ligand-Bewertungsfunktionen. In mehreren Validierungsszenarien an den Proteinen Trypsin, Thrombin, Faktor Xa, Plasmin und Cathepsin D konnte gezeigt werden, dass eine effiziente Zusammenstellung Rezeptor-spezifischer Substrat- oder Ligand-Bibliotheken lediglich eine Durchsuchung von weniger als 8% der vorgegebenen Suchräume erfordert und GARLig dennoch im Stande ist, bekannte Inhibitoren in der Zielbibliothek anzureichern., This thesis describes the theory, development, application and validation of two new chemoinformatic tools to find new drugs named DrugScoreFP and GARLig. DrugScoreFP is an extension of the well-known scoring function DrugScoreCSD. The method can be used for rescoring docking solutions by adding structural information from a user-defined set of protein-ligand complexes resulting in a tailor-made protein-specific scoring function. The new method demonstrates significant improvements in finding near-native poses in comparison to 12 established scoring functions. Using the in-house investigated protein structures trypsin, thermolysin and tRNA-guanin transglycosylase (TGT), we identified six fragment-sized molecules which were found to inhibit these targets and one thermolysin crystal structure in complex with one of the predicted fragments. GARLig is a library design tool based on docking and a self-adaptive genetic algorithm for structure-based sidechain-optimization of small molecule skeletons. Multiple scoring functions such as AutoDock4 Score, GOLDScore and DrugScoreCSD can be applied to the search procedure as possible decision criteria for potential library candidates. The program has been validated on trypsin, thrombin, factor Xa, plasmin and cathepsin D. GARLig was able to find natural substrates and known binders by validating less than 8% of large combinatorial libraries, meanwhile outperforming other search strategies such as a random search and a Monte Carlo Sampling.

Diese Arbeit trägt zum tieferen Verständnis der grundlegenden Prinzipien bei, die bei der Bindung eines kleinen Moleküls an ein makromolekulares Protein relevant sind. Um im Detail die attraktiven Kräfte zu beschreiben, die in einer „molekularen Erkennung“ beider Moleküle resultieren, wurde eine Serie von 96 systematisch variierten Thrombininhibitoren biophysikalisch charakterisiert. Insbesondere die Kombination von struktureller Information aus der Röntgenkristallographie mit mikrokalorimetrisch gewonnenen thermodynamischen Daten erlaubte es, relative Unterschiede in den Bindungseigenschaften der Inhibitoren zu deuten. Durch diese systematische und kleinschrittige Variation der Inhibitoren war es möglich, zuverlässige Rückschlüsse auf den Beitrag einzelner funktioneller Gruppen oder Atome zur Bindungsaffinität zu machen, da die außerordentliche Komplexität der affinitätsbestimmenden Parameter auf den direkten Vergleich sehr ähnlicher Enzymliganden reduziert werden konnte. Dabei wurde durchweg die Reorganisation des Lösungsmittel bei der Inhibitorbindung in die Diskussion der stark variierenden Bindungsaffinitäten mit einbezogen., The presented study contributes to the fundamental understanding of molecular recognition of small molecules by a macromolecular host protein. The biophysical properties of a large set of systematically varied thrombin inhibitors were anatomized in detail. In particular the combination of structural information from X-ray crystallography with thermodynamic data from microcalorimetry allowed following the thermodynamically relevant differences resulting in the binding process. The approach of systematically varying biophysical properties of protein inhibitors in small steps permits conclusive statements on the contribution of individual functionalities to binding affinity, as the outstanding complexity of the binding thermodynamics could be reduced to the comparison of closely related inhibitors. Reorganization of solute molecules was explicitly considered in all discussions of the factors determining the widely varying binding affinity of the inhibitors to their target.

In this thesis multiple computer aided methods of structure based drug design along with X-ray crystallography and kinetic measurements were used to investigate inhibitors of tRNA-guanine transglycosylase (TGT) a putative target for a new specific antibiotic against Shigella bacteria. Within a year about 160 million infections are reported leading to approximately 1 million deaths, predominantly in developing. The crystallization of Z. mobilis TGT, which offers a nearly identical active site as TGT from S. flexneri, was successfully performed in previous studies. Several scaffolds based on pyridazinones, pteridines, and quinazolinones were discovered with binding affinities in the micro molar range. In addition, a “stretched” guanine with an inserted central six-membered ring, leading to lin-benzoguanine (3 µM), was discovered and further evaluated in this thesis. During the optimization process of the lin-benzoguanine skeleton two often neglected aspects of ligand binding to a protein are highlighted: (i) pKa shifts are studied once the inhibitor is transferred from aqueous solution to a protein environment and (ii) the influence of residual solvation of amino acids in the active site are investigated during the site chain design of the parent skeleton. The decoration of the lin-benzoguanine with new side chains delivered binding affinities in the low nano molar range (best 2 nM). In addition, the constitution of the catalytic active complex of TGT and its substrate-tRNA was studied, applying site directed mutagenesis, kinetic measurements and nanoESI-MS experiments. Based on a crystal structure of TGT with a tRNA-stem loop we suggested that TGT is active as a homo dimer and can bind one tRNA molecule for catalysis. The obtained results confirmed that TGT is a homo dimer and binds one tRNA molecule.

Im Rahmen dieser Arbeit wurden neuartige Leitstrukturen für die Inhibition von Aspartylproteasen, insbesondere der HIV-1-Protease, unter Verwendung strukturbiologischer Methoden entwickelt. Als Startpunkt diente die Kristallstruktur eines Komplexes der HIV-1-Protease mit einem 3,4-Dimethylenamino-pyrrolidin-Derivat. Ausgehend von der Beobachtung starker Proteinverzerrung und einer unbefriedigenden Taschenbesetzung in dieser Struktur wurden Verbindungen entwickelt, die nur die essentiellen Pharmacophor-Erfordernisse für einen HIV-Protease-Inhibitor in sich vereinen. Die symmetrischen Pyrrolidindiester-Derivate, ausgestattet mit einer zyklischen sekundären Aminofunktion zur Adressierung der katalytischen Aspartate, zwei hydrophoben Resten für die Besetzung der Erkennungstaschen und zwei Akzeptorfunktionen zur Adressierung der flexiblen Flapregion, zeigten einstellig mikromolare Inhibitionswerte. Die Kristallstrukturanalyse eines Derivates im Komplex mit der Protease offenbarte eine einzigartige Bindungssituation, in der zwei Inhibitormoleküle an ein Protease-Dimer in der geöffneten Konformation binden. Parallel zu diesem Ansatz wurden Verbindungen auf Basis eines 3S,4S-Diamino-pyrrolidin-Gerüstes entwickelt, die über vier Reste zur Adressierung der Subtaschen verfügen. Auch hier zeigten die ersten Verbindungen einstellig mikromolare Inhibition. Aus dem mittels Röntgenkristallographie aufgeklärten Bindungsmodus wurden drei Strategien zur Affinitätssteigerung postuliert und umgesetzt. Alle drei Strategien führten zu Inhibitoren mit einem deutlichen Affinitätsgewinn. Mindestens ein Vertreter jeder Strategie wurde anschließend im Komplex mit der HIV-Protease kristallisiert und analysiert. Aus den beobachteten Bindungsmodi wurden die beiden vielversprechendsten Strategien zur Kombination ausgewählt und in dem finalen Inhibitor vereint. Dieser wies mit 74 nM eine weitere deutliche Affinitätssteigerung auf, und die Analyse der Kokristallstruktur bestätigte den methodischen Ansatz. Mit den deutlich affineren Substanzen wurden kinetische Untersuchungen an zwei ausgewählten, klinisch relevanten Punktmutanten der HIV-Protease durchgeführt. Während ein Affinitätsverlust im Falle der Ile50Val-Mutation zu beobachten ist, zeigen die Verbindungen eine erhebliche Affinitätssteigerung im Falle der Ile84Val-Mutation. Zwei Verbindungen, bei denen dieses Phänomen besonders zu Tage tritt, wurden anschließend im Komplex mit den Protease-Varianten strukturell untersucht. Aus der Analyse ergab sich, dass im Falle der Ile84Val Mutation eine Kombination aus mehreren Faktoren zur beobachteten Affinitätssteigerung beiträgt. Besonders die Beobachtung veränderter physikochemischer Eigenschaften in der Kontaktregion zur Aminosäure 84 ist hierbei von erheblicher Relevanz für die Entwicklung zukünftiger Generationen von HIV-Protease-Inhibitoren, mit einer wahrscheinlich deutlich geringeren Empfindlichkeit gegen diese Mutation. Aus den kinetischen Studien ergab sich zudem, dass Verbindungen mit kleineren Alkylresten ein deutlich verändertes Aktivitätsprofil gegenüber den Mutanten aufweisen. Bei dem Versuch, diese Beobachtung strukturell zu untersuchen, wurden Kokristalle eines in der Zusammensetzung identischen Protein-Ligand Komplexes in zwei verschieden Raumgruppen erhalten. In der orthorhombischen Kristallform ist ein Bindungsmodus vergleichbar zu den vorher untersuchten Verbindungen zu beobachten, wohingegen in der hexagonalen Kristallform ein Bindungsmodus zu beobachten ist, der sich fundamental von diesem unterscheidet. Eine uneinheitliche Struktur-Aktivitäts-Beziehung in Bezug auf die Protease-Varianten legt ein paralleles Vorliegen dieser beiden Bindungsmodi nahe. Anhand der in den Projekten gesammelten Erfahrungen wurde ein genereller Ansatz für die Leitstrukturfindung für Aspartylprotease-Inhibitoren auf der Basis eines Oligoamin-Grundgerüstes entwickelt und umgesetzt. Eine 11 Verbindungen umfassende Bibliothek wurde gegen sechs ausgewählte Proteasen (HIV-1 Protease, Plasmepsin II, Plasmepsin IV, Renin, BACE-1 und Pepsin) getestet und es konnten eine Vielzahl von mikromolare Inhibitoren identifiziert werden. Mit der Hilfe der Kokristallstrukturen zweier Derivate im Komplex mit der HIV-Protease konnte eine generelle Bindungssituation für die untersuchten Aspartylproteasen postuliert und mit Affinitätsdaten bestärkt werden. In dieser Arbeit wurden vielfältige Ansätze für die Entwicklung sekundärer Amine als Aspartylprotease-Inhibitoren erarbeitet. Besonders hervorzuheben ist die Entwicklung von Verbindungen, die an die geöffnete Konformation der HIV-Protease binden und somit die Entwicklung einer neuen Klasse von Inhibitoren ermöglichen. Zudem ist es gelungen, eine neue, potente Klasse von Inhibitoren zu etablieren, die im Vergleich zu den literaturbekannten Inhibitoren über einzigartige Eigenschaften gegenüber der Ile84Val Punktmutation verfügt., As novel promising scaffold for HIV protease inhibition pyrrolidine-derived inhibitors have recently been reported. In this thesis the stepwise improvement of this compound class to potent inhibitors of wildtype as well as selected mutant proteases utilizing rational drug discovery methods is reported. Based on the crystal structure of a (rac)-3,4-dimethyleneamino-pyrrolidine in complex with HIV-1 protease symmetric pyrrolidine-diesters possessing the same stereochemistry were synthesized following a chiral-pool approach. The most potent compounds of the series achieve one-digit micromolar inhibition towards wild type as well as two mutant proteases (Ile50Val and Ile84Val). The cocrystal structure of one derivative in complex with the Ile84Val HIV protease revealed that two inhibitor molecules are bound in the large active site cavity comprising an area encompassed by the catalytic dyad and the flaps in the open conformation. This is the first HIV protease cocrystal structure in which the open-flap conformation of the enzyme is stabilized by an inhibitor that concomitantly addresses the catalytic dyad. As an alternative approach towards HIV protease inhibitors, the development of symmetric 3,4-bis N-alkyl sulfonamide-pyrrolidines is described. The initial lead structure possessing benzene sulfonamide groups and benzyl substituents exhibited a Ki of 2.2 µM. The X-ray structure in complex with the HIV protease enabled the rational design of a second series of inhibitors and revealed three promising symmetric substitution patterns for further lead optimization: (A) Elongation of the P1/P1’-benzyl moieties with hydrophobic substituents in para-position, (B) ortho-substitution at the P2/P2’-phenyl ring systems, and (C) para-substitution at the P2/P2’-phenyl moieties. All three strategies were pursued and resulted in inhibitors with improved affinities up to 260 nM. To elucidate the underlying factors accounting for the SAR, the crystal structures of four representatives, at least one of each modification type, in complex with HIV protease were determined. These structures provided deeper insights into the protein–ligand interactions and the underlying principles of the SAR thus enabling to choose the most promising combination of substituents in the next design cycle. The combination of these substituents rendered a final inhibitor showing a significantly improved affinity of Ki = 74 nM and the cocrystal structure in complex with the HIV protease confirmed the successful application of the pursued optimization strategy. Subsequently the influence of the active site mutations Ile50Val and Ile84Val on these inhibitors is investigated by structural and kinetic analysis. Whereas the Ile50Val mutation leads to a significant decrease in affinity for all compounds in this series, they retain or even show increased affinity towards the crucial Ile84Val mutation. By detailed analysis of the crystal structures of two representatives in complex with wild-type and mutant proteases the structural basis of this phenomenon was elucidated. Inhibitors bearing smaller N-alkyl substituents revealed a selectivity profile not being explicable with the initial SAR. By cocrystallization of the most potent derivative of a small series with HIV-1 protease, astonishingly two different crystal forms, P2(1)2(1)2(1) and P6(1)22, were obtained. Structural analysis revealed two completely different binding modes, the interaction of the pyrrolidine nitrogen atom to the catalytic aspartates being the only similarity. Encouraged by the successful utilization of cyclic secondary amines as anchoring group in the development of HIV protease inhibitors, this strategy was expanded into a general approach for lead structure identification for aspartic proteases. An initial library comprising eleven inhibitors based on easily accessible achiral linear oligoamines was developed and screened against six selected aspartic proteases (HIV-1 protease, plasmepsin II, plasmepsin IV, renin, BACE-1, and pepsin). Several hits could be identified, among them selective as well as rather promiscuous inhibitors. The design concept was consecutively confirmed by determination of the crystal structure of two derivatives in complex with HIV-1 protease. The binding modes exhibit high similarity to the binding orientation of substrates as well as to that of peptidomimetic inhibitors. Using this information, a generalization of this binding situation to other aspartic proteases appears reasonable, thus providing a first insight into the observed structure-activity relationships.

Die vorliegende Arbeit beschreibt die Theorie, Entwicklung, Validierung und die Einsatzmöglichkeiten neuer computergestützter Methoden zur Bewertung und Optimierung von Protein-Ligand-Komplexen. Sie stützen sich auf wissensbasierte Atomtyp- und Distanz-abhängige Paarpotentiale, die aus Kristallstrukturdaten über Kleinmoleküle abgeleitet wurden. Die neue Bewertungsfunktion DrugScoreCSD kann als Weiterentwicklung des etablierten DrugScore bezeichnet werden und zeigt in der Erkennung nativer und nativ-nächster Ligandgeometrien die besten bislang für eine Bewertungsfunktion publizierten Ergebnisse. Auch die Bewertung von weiter vom Optimum entfernten Posen, die Korrelation mit Affinitäten, und die Geschwindigkeit sind verbessert worden. Die neue Visualisierung von Atom-bezogenen Wechselwirkungen erlaubt das schnelle und intuitive visuelle Erfassen günstiger und ungünstiger Beiträge in Protein und Ligand. Die neue Online-Anwendung DrugScoreONLINE erlaubt die Verwendung von DrugScoreCSD und DrugScore und stellt die Visualisierung zur Verfügung. Zur Optimierung von Geometrie und Bewertung durch DrugScoreCSD eignet sich der neue Minimierer auf der Basis modifizierter Paarpotentiale und einem PSS-Verfahren (potential surface smoothing). Durch artifizielle Terme für kurze repulsive und weiter reichende attraktive Wechelwirkungen werden die wissensbasierten Paarpotentiale derart modifiziert, dass sie zur Modellierung nichtbindender Wechselwirkungen in einem Minimierer eingesetzt werden können. Das verwendete PSS-Verfahren generiert während eines Minimierungslaufs lokale Minima, die für eine externe Nachbewertung zur Verfügung stehen. Durch die Minimierung von Ligandgeometrien mit dem neuen Minimierer werden neben der Erzeugung überwiegend besserer Geometrien (der nativen Geometrie ähnlichere Geometrien) Verbesserungen in der Bewertung durch DrugScoreCSD, der Korrelation mit Affinitäten und der Prädiktivität von 3D-QSAR-Modellen beobachtet. Weiterhin wird gezeigt, dass DrugScoreCSD bei der Zuweisung von Atomtypen oder Protonierungszuständen in Protein-Ligand-Komplexen als Hilfestellung eingesetzt werden kann., This thesis summarizes the theory, development, validation, and application of new computer-aided methods to score and optimize protein-ligand complexes. These methods make use of atom-type and distance-dependent pair potentials that were derived from small molecule crystal data. The new scoring function DrugScoreCSD improves the established DrugScore and identifies native and near-native ligand geometries at the best rate reported so far. Furthermore, the scoring of more deviating poses, correlation with affinities, and computation time were subject to improvement. The new visualization of per atom interactions allows to easily and intuitively evaluate both attractive and repulsive contributions in the protein or ligand. With the new online application DrugScoreONLINE, the scoring functions DrugScoreCSD and DrugScore as well as the visualization are made available to the public. Optimizations of scores and geometries can be achieved by the new minimizer. The pair potentials are modified by introducing artificial terms which model short range repulsive and long-range attractive non-bonding interactions. During the course of one minimization run, the PSS algorithm used here (PSS = potential surface smoothing) generates several local minima which can be rescored externally. This new minimizer generates more relevant ligand geometries, improves scoring by DrugScoreCSD, improves affinity correlation, and predictivity of 3D-QSAR models. Finally, this work shows that DrugScoreCSD successfully assigns atom types and protonation states to protein ligand complexes.

In the work presented, the crystal structures of Plasmodium falciparum glutamate dehydrogenase (GDH) and of Trypanosoma cruzi Lipoamide dehydrogenase (LipDH) were determined to a resolution of 2.7 and 1.9 Angstroms, respectively. Both are targets for the design of novel antiparasitic drugs, because they are involved in the parasites defense against oxidative stress or in the production of reactive oxygen species (in the case of lipoamide dehydrogenase). The work also deals with the similarities and differences of the two parasite enzymes compared to closely related proteins and the respective proteins of the human host. The results provide a starting point for further studies with the aim to find selective inhibitors of P. falciparum GDH and improved so-called subversive substrates of T. cruzi LipDH with methods of structure-based drug design., In der vorliegenden Arbeit wurden die Kristallstrukturen der Glutamatdehydrogenase des Malariaerregers Plasmodium falciparum und der Liponamiddehydrogenase von Trypanosoma cruzi, dem Erreger der Chagas-Krankheit, aufgeklärt. Beide Enzyme sind validierte bzw. mögliche Zielmoleküle für das rationale Design neuer antiparasitärer Wirkstoffe. Durch die erfolgte Strukturaufklärung besteht nun die Möglichkeit, die Enzyme mit Methoden des computergestützten Drug Designs weiter zu bearbeiten.

The modern drug development process is usually divided into the phase of lead discovery and lead optimization. This thesis provides contributions to both aspects. The first part of this work deals with the establishment and validation of computer models for prediction of affinity and selectivity, thus it supports the area of lead optimization. Selectivity aspects are a major concern in drug development since they influence the risk of undesired side effects. QSAR approaches have been used for prediction of affinity and selectivity parameters using carbonic anhydrases (CAs) as model system. CAs are zinc containing hydrolases which catalyze the reversible hydration of carbon dioxide to bicarbonate and a proton. They are thus involved into various (patho)physiological processes and constitute interesting drug targets. The binding pockets of the numerous isozymes are rather similar in terms of physicochemical properties making the development of selective inhibitors quite difficult. The investigations were especially focused on 3D-QSAR models. Statistically highly significant and robust models could be established in order to predict affinity and selectivity of sulfonamide inhibitors toward CA I, II, and IV. The investigations revealed that the minor differences in the alignments in the three binding pockets produce only small differences in the statistical outcome. The best models were obtained using the CA II pocket as basis of the alignment, irrespective of the variable to be modeled. Probably the large number of X-ray structures available for CA II is responsible for this effect making the alignment more reliable. The isocontour maps obtained enable an interpretation of the models in terms of physicochemical properties important for affinity/selectivity. The comparison to qualitative protein-based contour maps underlines the complementary character of both approaches: The ligand based QSAR methods on the one hand implicitly reflect the structure of the binding site partially, on the other hand their outcome depends on the peculiarities of the training set. Protein-based approaches, however, also provide information about regions of the binding pocket which are not occupied by any of the training set ligands. Another objective was the utilization of QSAR models for database screening. This would allow one to identify the most interesting (i.e. potent/selective)compounds of a database as candidate for synthesis in the context of lead optimization. First, a protocol for automation of ligand alignment had to be developed and validated for 3D-QSAR. The ligand-based alignment procedure applied turned out to yield results comparable to the manual protein-based alignment. The 3D models performed superior to 2D fragment-based or 1D property-based models. As a practical example of application a virtual compound library composed by several thousand entries was designed and ranked using the most predictive models. The second part of the thesis covered a virtual screening for novel inhibitors of peptide deformylases (PDFs) hence being a task of lead discovery. PDFs are (mostly) ferrous ion containing enzymes cleaving off the formyl group from proteins synthesized in mitochondria, plastids, and eubacteria. 3D-Pharmacophore models have been established and validated using X-ray structures of potent PDF-inhibitors. These pharmacophores were able to identify structurally diverse inhibitors known from literature (sufficient sensitivity) and to strongly reduce the database to be screened (sufficient specificity). The pharmacophore models were used for screening databases of commercially available druglike compounds. By additional application of docking and scoring eleven out of approximately two million compounds have been identified and purchased. These molecules will be subjected to biological testing. First testing results show that at least two of the selected compounds are potent inhibitors against PDF1B from E. coli exhibiting IC50-values of 60 nM and 190 nM, respectively. This can be considered as a proof of the quality and suitability of the employed models and the screening protocol. PDF inhibitors could be used as herbicides, antibiotics, and antimalarial therapeutics., In der modernen Arzneistoffentwicklung unterscheidet man die Phasen der Leitstrukturfindung und der Leitstrukturoptimierung. Die vorliegende Dissertationsschrift beinhaltet Beiträge zu beiden Bereichen. Der erste Teil der Arbeit befasst sich mit der Entwicklung und Evaluierung von Computermodellen zur Vorhersage von Affinität und Selektivität und entstammt daher dem Bereich der Leitstrukturoptimierung. Selektivitätsaspekte spielen eine wichtige Rolle, da sie das Risiko von Nebenwirkungen maßgeblich beeinflussen. Zur Modellierung und Vorhersage von Affinitäts- und Selektivitätsparametern wurden QSAR-Methoden angewendet. Das Modellsystem stellten Carboanhydrasen (CAs) dar; diese zinkhaltigen Hydrolasen katalysieren die reversible Hydratisierung von Kohlendioxid zu Bicarbonat und einem Proton. Sie sind daher in eine Vielzahl (patho)physiologischer Prozesse involviert und stellen interessante therapeutische Targets dar. Die zahlreichen Isoenzyme der CAs besitzen im Bereich der Bindetasche hohe Ähnlichkeiten in Bezug auf physikochemische Eigenschaften, so dass die Entwicklung selektiver Inhibitoren kein triviales Problem darstellt. Im Mittelpunkt der Untersuchungen standen insbesondere 3D-QSAR-Verfahren. Es wurden statistisch hochsignifikante und robuste Modelle abgeleitet, um Affinität und Selektivität von Sulfonamidinhibitoren bezüglich der Isoenzyme CA I, II und IV vorherzusagen. Es zeigte sich, dass die geringen Unterschiede im strukturbasierten Alignment unter Verwendung der drei Bindetaschen nur geringen Einfluss auf die statistischen Parameter besitzen und dass bessere Ergebnisse erzielt werden, wenn für alle Isoenzyme das auf CA II basierende Alignment benutzt wird anstelle des Alignments in der jeweiligen Bindetasche. Ursache hierfür ist wahrscheinlich die Vielzahl an Kristallstrukturen, die für CA II existieren und damit das Alignment verlässlicher machen. Die erhaltenen Isokonturkarten erlaubten eine Interpretation der Modelle im Hinblick auf die Bedeutung physikochemischer Eigenschaften für die Affinität/Selektivität. Der Vergleich zu qualitativen proteinbasierten Isokonturkarten unterstreicht den komplementären Charakter beider Methoden: Während die ligandbasierten QSAR-Verfahren implizit teilweise die Struktur der Bindetasche widerspiegeln, aber auch von den Eigenheiten des Trainingsdatensatzes abhängen, vermögen die proteinbasierten Analysen auch Informationen über Bereiche der Bindetasche zu geben, die keine Interaktionen mit Liganden des Trainingsdatensatzes ausbilden. Ein weiteres Ziel bestand darin, QSAR-Methoden für das Screening größerer Datenbanken zu verwenden. Dies erlaubt die Identifizierung besonders interessanter (d.h. affiner/selektiver) Kandidaten zur Synthese im Sinne einer Leitstrukturoptimierung. Für 3D-QSAR-Methoden musste zunächst ein Protokoll zur Automatisierung des Alignments entwickelt und validiert werden. Es zeigte sich hierbei, dass ein ligandbasiertes Alignment vergleichbare Ergebnisse zu manuellen stukturbasierten Alignmentmethoden erzielt. Die 3D-Modelle erwiesen sich als überlegen im Vergleich zu fragmentbasierten 2D-Methoden oder insbesondere zu den eigenschaftsbasierten 1D-Methoden. Als praktisches Anwendungsbeispiel der entwickelten Modelle wurde eine mehrere tausend Einträge umfassende virtuelle Ligandbibliothek aufgebaut und mit den leistungsfähigsten Modellen bewertet. Der zweite Teil der Arbeit beinhaltet ein virtuelles Screening nach neuartigen Inhibitoren der Peptiddeformylasen (PDFs) und gehört somit in den Bereich der Leitstrukturfindung. PDFs sind (meist) eisenhaltige Enzyme, die die Deformylierung von in Mitochondrien, Plastiden oder Bakterien synthetisierten Proteinen katalysieren. Ausgehend von Kristallstrukturen potenter PDF-Inhibitoren wurden 3D-Pharmakophormodelle entwickelt und validiert. Diese waren in der Lage, strukturell diverse, aus der Literatur bekannte Inhibitoren zu identifizieren (hinreichende Sensitivität) und gleichzeitig die zu durchsuchenden Datenbanken stark zu reduzieren (hinreichende Spezifität). Die Pharmakophormodelle wurden zum Screening von Datenbanken kommerziell erhältlicher Moleküle mit wirkstoffartigen Eigenschaften benutzt. Durch Docking und Scoring wurden schließlich aus etwa zwei Millionen Verbindungen elf Substanzen identifiziert und erworben, die einer biologischen Testung unterzogen werden sollen. Erste vorliegende Messergebnisse zeigen, dass mindestens zwei der Substanzen mit einem IC50-Wert von 60 nM bzw. 190 nM potente Inhibitoren der PDF1B aus E. coli sind. Dies belegt die Güte der Modelle und des angewendeten Screening-Protokolls. Inhibitoren der PDF könnten Anwendung als Herbizide, Antibiotika und Antimalaria-Therapeutika finden.

Das Enzym Aldose Reduktase (ALR2) stellt ein wertvolles Testsystem dar, um strukturelle und thermodynamische Eigenschaften der Inhibitorbindung zu charakterisieren und ist darüber hinaus ein geeignetes Zielenzym für eine Arzneistoff-Intervention. Zudem ist das Enzym ein hervorragendes Testsystem für Strategien zur Leitstrukturfindung, da es aufgrund der hohen Mobilität der Aminosäure-Reste in der Bindetasche in der Lage ist, verschiedene Konformere einzunehmen und sich ausgesprochen vielseitig an Liganden anzupassen. Zu Beginn dieser Arbeit wird die Strukturbestimmung der Bindungsmoden von durch Virtuelles Screening identifizierten Liganden ergänzt durch Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC), um Einblicke in die Triebkräfte des Bindungsprozesses zu erhalten. In Kapitel 3 werden die Kristallstrukturen eines neuartigen Sulfonyl-Pyridazinons im Komplex mit ALR2 beschrieben. Der Inhibitor besetzt mit seiner Pyridazinon-Kopfgruppe die katalytische Tasche, während der chlor-substituierte Benzofuran-Teil die Spezifitätstasche belegt. Die hochaufgelöste Struktur legt nahe, dass die Pyridazinon-Gruppe in deprotoniertem, negativ geladenem Zustand bindet, während das benachbarte Histidin einen ungeladenen Zustand einnimmt. In Kapitel 4 wird die Bindetasche der ALR2 mit einer neuartigen Strukturklasse von Inhibitoren sondiert, um mögliche neue Adaptationsvorgänge des Enzyms sowie den Bindungsmodus der Liganden zu bestimmen und deren Struktur-Wirkungs-Beziehungen zu verstehen. Zwei Kristallstrukturen mit einem Liganden der kürzlich veröffentlichten Naphtho[1,2-d]isothiazol-essigsäuren wurden bestimmt. Im Gegensatz zur ursprünglichen Designhypothese zeigt sich die Spezifitätstasche in den Strukturen in geschlossenem Zustand. Der potentere der beiden Liganden erweitert die katalytische Tasche durch Öffnung einer neuen Subtasche. Der zweite Ligand unterscheidet sich vom ersten nur durch einen angefügten Glycolsäure-Teil, mit dem eine der Carboxylgruppen des Liganden verestert ist. Trotz dieser nur geringfügigen Modifikation unterscheidet sich der Bindungsmodus in dramatischer Weise von dem des zuerst untersuchten Liganden. In Kapitel 5 wird der Bindungsprozess von Inhibitoren an ALR2 im Hinblick auf Änderungen von Protonierungszuständen untersucht. Die durchgeführten ITC-Messungen legen eine Protonenaufnahme bei der Bindung von Liganden des Carbonsäure-Typs nahe. Zur weiteren Interpretation werden in diesem Kapitel pKa-rechnungen zusammen mit ortsspezifischer Mutagenese und thermodynamischen Messungen eingesetzt. Diese lassen ein in der katalytischen Tasche befindliches Tyrosin (Tyr 48) für die Protonenaufnahme bei der Ligandbindung als wahrscheinlich erscheinen, da diese Seitenkette im NADP+-gebundenen Zustand zu bemerkenswertem Ausmaß deprotoniert vorliegt. In diesem Zusammenhang wird die Bindung von IDD 388, IDD 393, Tolrestat, Sorbinil und Fidarestat diskutiert. In Kapitel 6 werden selektivitätsbestimmende Eigenschaften identifiziert, die die Bindung von Liganden an ALR2 energetisch günstiger erscheinen lassen als an die konkurrierende Isoform Aldehyd Reduktase (ALR1). Die zu diesem Zweck erstellten mutierten ALR2-Konstrukte wurden mit Hilfe von Kristallstrukturbestimmung und ITC auf ihre Einflussnahme bezüglich der Ligandenselektivität untersucht. Dazu diente ein Ligandensatz, der aus Zopolrestat, einem verwandten Uracil-Derivat, IDD 388, IDD 393, Sorbinil, Fidarestat und Tolrestat zusammengestellt wurde. Es konnte gezeigt werden, dass das Auftreten von Anpassungsvorgängen in der mutierten Bindetasche essentiell für die Einpassung der Liganden ist. Dieses lässt Rückschlüsse auf das Selektivitätsverhalten der Liganden zu. In vielen Fällen ist die Kristallstrukturbestimmung als schlussendlicher Beleg für die spezifische Wechselwirkung des Liganden mit dem Zielmolekül angesehen, da sie das genaue Wechselwirkungsmuster beider Bindungspartner repräsentiert. Diese weit verbreitete Vorgehensweise beruht auf der Annahme, dass eine Kristallstruktur eines gegebenen Protein-Ligand-Komplexes einzigartig und unabhängig von dem Protokoll ist, die zur Erzeugung der komplexierten Kristalle diente. In Kapitel 7 werden zwei Beispiele diskutiert, die zeigen, dass diese Annahmen nicht allgemein gültig sind., The TIM-barrel folded enzyme Aldose reductase (ALR2) is a valuable model system to study structural and thermodynamic features of inhibitor binding and, furthermore, represents an excellent drug target. To prevent diabetic complications derived from enhanced glucose flux via the polyol pathway the development of aldose reductase inhibitors (ARIs) has been established as a promising therapeutic concept. Its attraction as a test system consists furthermore in the high mobility and adaptivity properties of its active site residues, giving rise to various distinct binding pocket conformers and pronounced induced-fit adaptations upon ligand binding. In chapter 2, we combine a structural characterization of the experimental binding modes observed for two virtual screening hits with isothermal titration calorimetry (ITC) measurements providing insights into the driving forces of inhibitor binding. The nitro group binds to the bottom of the specificity pocket and provokes remarkable induced-fit adaptations. Identically constituted ligands, lacking this nitro group, exhibit an affinity drop of one order of magnitude. In addition, thermodynamic data suggest a strongly favourable contribution to binding enthalpy in case the inhibitor is equipped with a nitro group at the corresponding position. As these data suggest, the nitro group provokes the enthalpic contribution, in addition to the H-bond mentioned above, by accepting two “non-classical” H-bonds donated by the aromatic tyrosine side chain. In chapter 3, we report on the crystal structures of a novel sulfonyl-pyridazinone inhibitor in complex with aldose reductase. The inhibitor occupies with its pyridazinone head group the catalytic site whereas the chloro-benzofurane moiety penetrates into the opened specificity pocket. The high resolution structure provides some evidence that the pyridazinone group binds in a negatively charged deprotonated state whereas the neighboring His 110 residue most likely adopts a neutral uncharged state. In chapter 4, we probed the ALR2 binding site with a novel structural class of inhibitors in order to identify putative pocket adaptations. We elucidated two ALR2 crystal structures, each complexed with a member of the recently described naphtho[1,2-d]isothiazole acetic acid series. In contrast to the original design hypothesis based on the binding mode of tolrestat, both inhibitors leave the specificity pocket in closed state. Unexpectedly, the more potent ligand extends the catalytic pocket by opening of a novel subpocket. The second studied inhibitor differs from the first only by an extended glycolic ester functionality added to one of its carboxylic groups. However, despite this slight structural modification, its binding mode differs dramatically from that of the first inhibitor. The two ligand complexes represent an impressive example, how the slight change of a chemically extended side chain at a given ligand scaffold can result in a dramatically altered binding mode. In addition, our study emphasizes the importance of crystal structure analysis for the translation of affinity data into structure-activity relationships. In chapter 5, we study the binding process of inhibitors to ALR2 with respect to changes of the protonation inventory upon complex formation. As the protonation event will strongly contribute to the enthalpic signal recorded during ITC experiments, knowledge about the proton-accepting and -releasing functional groups of the system is of utmost importance. Here, we present pKa calculations complemented by mutagenesis and thermodynamic measurements suggesting a tyrosine residue located in the catalytic site (Tyr 48) as likely candidate to act as proton acceptor upon inhibitor binding, as it occurs deprotonated to remarkable extent if only the cofactor NADP+ is bound. Binding thermodynamics of IDD 388, IDD 393, tolrestat, sorbinil, and fidarestat are discussed in the context of substituent effects. In chapter 6, the ALR2 binding site is probed for selectivity determining features, which make binding of certain ligands to ALR2 more attractive than to the concurrent isoform aldehyde reductase (ALR1). The resulting mutational constructs of ALR2 are probed for their influence towards ligand selectivity by X-ray structure analysis of the corresponding complexes and ITC. Accurate crystal structure-determination of protein-ligand complexes is the starting point for further design hypotheses to predict novel leads with improved properties. This widely accepted practise relies on the assumption that the crystal structure of a given protein-ligand complex is unique and independent of the protocol applied to produce the crystals. In chapter 7, we present two examples indicating that this assumption is not generally given.

In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Ansätze zur Erstellung von Ligandbibliotheken untersucht. Als etablierte Modelle dienten dabei die Serinproteasen Thrombin und FaktorXa. Zunächst wurde mit einer Serie von vier Inhibitoren der Serinprotease Thrombin die verwendeten Methoden validiert. Im Bereich des computergestützten Molekular Design kamen Docking, Scoring und Minimierungstechniken zum Einsatz. Hierbei wurden zunächst die Bindungsgeometrien der vier Vertreter in der Bindetasche von Thrombin modelliert. Im Anschluss daran wurde enzymatische Kinetikassays zur Bestimmung der Bindungskonstante durchgeführt. Zusätzlich zur genaueren Beschreibung der thermodynamischen Kenngrößen Enthalpie (ΔH) und Entropie (-TΔS) wurden Isothermale Kalorimetrie (ITC) Messungen angewendet. Hierbei stellte sich für zwei Vertreter der Serie unterschiedliches Verhalten bei gleicher freier Energie (ΔG) heraus. Die beide Liganden unterscheiden sich in der Größe eines substituierten aliphatischen Ringes (fünf- und sechsgliedrig). Durch das Vorhandensein einer zusätzlichen Methylengruppe ergibt sich ein stärker Entropie-getriebenes Bindungsverhalten. Mit Hilfe der Röntgenstruktur-Kristallographie wurden die Bindungsgeometrien der beiden Liganden in Komplex mit Thrombin bestimmt. Für den fünfgliedrigen Ring wurde eine gut-definierte Differenz-Elektronendichte innerhalb der S3/S4 Spezifitätstasche beobachtet. Für den Bereich des sechsgliedrigen Ringes konnte jedoch keine Bindungsgeometrie für den Cycloheyan-Ring gefunden werden. Hier zeigte sich keine klare Differenz-Elektronendichte, die zur Lage des Ringes verwendet werden konnte. Demzufolge ist eine höhere Flexibilität des Ringes zu vermuten, welches im Einklang mit den vorgestellten ITC ist. Zusätzlich wurden zur Detektion der Ligandflexibilität Molekular Dynamik (MD) Simulationen durchgeführt. Durch die Validierung der Methoden konnten Beiträge von Protein-Ligand Wechselwirkungen beobachtet werden, die zur weiteren Generierung von vier Ligandserien zur Erweiterung der Bibliothek von Serinproteaseinhibitoren berücksichtigt wurden. Im zweiten Teil der Arbeit wurden verschiedene Methoden zur virtuellen Generierung von Ligandbibliotheken untersucht. Als erstes wurde ein Verfahren entwickelt, dass aus ähnlichen Subtaschen, Bausteine für kombinatorische Bibliotheken ableitet. Durch die virtuelle Erstellung und Bewertung der Bibliothek, konnten Erfolg versprechende Vertreter ausgewählt werden. Durch die anschließende Synthese und experimentelle Testung der Substanzen konnten Inhibitoren für die Serinprotease Thrombin im micromolaren Bereich erhalten werden. Weiterhin wurden zwei etablierte Verfahren des Virtuellen Screenings (flexible dreidimensionale Pharmakophorsuchen und Protein-Ligand Docking) miteinander verglichen. Dabei wurde der Einfluss von der Art und Weise der Beschreibung von Rezeptorinformation auf die Qualität der Filterergebnisse der beiden Verfahren untersucht. Eine Prozedur zur Erstellung von Pharmakophoren aus Proteininformation wurde mit Hilfe der Programme FTrees und DrugScoreCSD entwickelt. Durch die Umwandlung von günstigen Wechselwirkungsfeldern in so genannte „HotSpot“-Kugeln konnten FTrees aus der Proteininformation erstellt werden. Die entwickelte Methode dient einerseits zur Durchführung von Ähnlichkeitssuchen für Proteine, wo nur wenige Liganden bekannt sind, aber auch zu Erweiterung von ligandbasierten FTrees für Bereiche von Bindetaschen, die bisher noch nicht von bekannten Liganden adressiert werden., Goal of this thesis was the development of tools for structure-based design of combinatorial libraries of putative inhibitors. Successful automated computational ligand design requires, however, rigorous validation with respect to the predicted binding geometries. As a starting point, different computational as well as experimental techniques were applied to assess the predictive power of docking tools in generating binding geometries for structure-based library design. Combining experimental data and computer-generated geometries provides solid ground for the design of an expanded series of inhibitors for serine proteases. The serine proteases Thrombin, Trypsin and FactorXa were used as well established model systems. In the second part of the thesis different methods for lead generation were developed and two standard techniques of virtual screening protocols were compared. The first method, KNOBLE (KNOwledge Based Ligand Enumeration), is a new strategy to assemble a focused combinatorial library in silico using a structure-based approach. Starting point for the design of such a focused combinatorial library is the selection of a central fragment equipped with appropriate linker groups allowing the introduction of various substituents, well suited to address the key interactions of the conserved recognition pattern of the respective target enzyme via routine synthetic chemistry. Putative building blocks for synthesis are selected and virtually assembled in the computer. The actual retrieval of suitable substituents and the selection of appropriate decoration patterns are guided by the exposed physicochemical properties of the target protein. As a case study to probe this new strategy, we selected the family of serine proteases. Subsequent to computational selection and optimization, some selected library members were synthesized and subjected to biological testing showing promising activity in the micromolar range. Recent improvements in both, software and hardware, principally allow the usage of docking methods in a high-throughput mode as a tool for virtual screening without prior application of sophisticated pharmacophore filters. Therefore, a direct comparison of the results either based on a UNITY pharmacophore search or with docking by means of FlexX performed within the environment of the Docking DataBase (DDB) was drawn. Finally, an approach for the generation of protein-derived pharmacophores was developed using the programs FTrees and DrugScoreCSD. Via the translation of computationally generated contour maps favorable binding regions are detected for multiple chemical probes and transformed into “HotSpot”-spheres. These were exploited to derive protein-based FTrees that served for subsequent searches of putative ligand candidates.

Aldose Reductase (AR) is the ist das erste Enzym des „Sorbitol-Stoffwechselweges“. Es reduziert unter Verbrauch von NADPH als Kofaktor verschiedene Aldehyde zu den entsprechenden Alkoholen. Um diese Aufgabe effizient durchführen zu können, zeigt seine Bindetasche eine intrinsische Flexibilität. Diese geht im wesentlichen von einem kleinen Bereich der Bindetasche aus, dessen Bewegungen es erlauben, eine sog. „Spezifitätstasche“ zu öffnen oder zu schließen. Der erste Teil der Arbeit zeigt die Auswirkungen einer flexiblen Bindetasche auf die Zuverlässigkeit von Dockingexperimenten. Die Experimente wurden für zwei Moleküle durchgeführt, die ursprünglich für einen bestimmten Bindungsmodus entworfen wurden. Durch Docking in mehrere bekannte Bindetaschenkonformationen konnte gezeigt werden, dass der ursprünglich intendierte Bindungsmodus nicht als der energetisch günstigste vorausgesagt wurde. Diese Hypothese konnte durch die später erhaltenen Kristallstrukturen der jeweiligen Komplexe bestätigt werden. Trotz dieser guten Ergebnisse, waren die Vorhersagen nicht zufriedenstellend. Der Bindungsmodus des einen Moleküls ist inkompatibel mit allen bekannten Bindetaschekonformationen, daher stand für eine bessere Vorhersage kein geeignetes Templat zur Verfügung. Beim experimentell bestimmten Bindungsmodus des zweiten Moleküls spielt Wasser eine wichtige Rolle, dessen Wechselwirkungen beim Docken nur unzureichend berücksichtigt werden. Im zweiten Teil der Arbeit wurde ein kürzlich neu vorgestelltes Dockingverfahren im Zusammenhang mit Proteinflexibilität getestet. Hierbei handelt es sich um „in-situ cross-docking“. Anstatt Dockingexperimente in mehrere Bindetaschen sequentiell durchzuführen, werden bei diesem Verfahren multiple Proteinkonformationen simultan adressiert. Während des Dockings wird bei AutoDock das rigide Protein in Form eines Satzes von vorberechneten Energiegittern repräsentiert. Beim „in-situ cross-docking“ werden mehrere Gittersätze aneinander gereiht und somit eine Art „Super-Gitter“ erzeugt. Der nächste Teil dieser Arbeit untersucht detailliert das Ausmaß der Flexibilität der einzelnen Aminosäuren der AR Bindetasche. Es konnte gezeigt werden, dass lediglich einige wenige Aminosäuren für den Hauptteil der Anpassung an verschiedene Liganden verantwortlich sind. Zusätzlich wurde ein genauer Vergleich der Bindungsmoden verschiedener Liganden durchgeführt, die die Spezifitätstasche adressieren. Als Ergebnis konnte festgehalten werden, dass trotz großer Ähnlichkeiten zwischen den einzelnen Bindungsmoden, subtile Unterschiede festzustellen sind. Um den dem Enzym zugänglichen Konformationsraum weiter abzudecken, wurden ausgehend von den jeweiligen Kristallstrukturen zehn Molekulardynamik (MD) Simulationen durchgeführt. Dabei wurde eine gute generelle Übereinstimmung zwischen den Simulationen und der Kristallstrukturanalyse festgestellt. Dennoch verhielten sich einige Aminosäuren in den Simulationen anders, als nach der Analyse der Kristallstrukturen zu erwarten war: Phe 122, Trp 219 und Tyr 309. Diese wurden weitergehend untersucht. Ein weiterer Teil dieser Dissertation beschäftigt sich mit der Fragestellung, ob MD Simulationen genutzt werden können, um die an der „induced-fit“ Anpassung beteiligten Energien quantifizieren zu können. Zu diesem Zweck wurde die Methode MM-PBSA gewählt, welches die freie Bindungsenergie eines Komplexes aus MD Trajektorien berechnet, anstatt nur eine einzige Kristallstruktur dafür zu verwenden. Betrachtet man den enormen Zeit- und Rechenaufwand, so hat sich im Falle der AR MM-PBSA trotz intensiver Tests verschiedener Varianten als nicht zuverlässig herausgestellt. Im letzten Abschnitt dieser Arbeit wird eine zweiteilige Studie präsentiert. Der erste Teil beschäftigt sich mit mit einem weiteren Aspekt der Flexibilität des Bereiches, der für die „induced-fit“ Adaptionen verantwortlich ist. In einer kombinierten Studie aus MD Simulationen und mehreren Kristallstrukturen, konnte gezeigt werden, dass zwischen mehreren Strukturen des gleichen Protein-Ligand-Komplexes signifikante Unterschiede zu sehen waren. Eine exzellente Übereinstimmung zwischen den Befunden der Kristallstrukturen und den MD Simulationen wurde gefunden. Im zweiten Teil dieses Abschnittes geht es um die unerwartete Bindung mehrerer Ligandmoleküle in und in der Nähe der Bindetasche. Insgesamt vier Tolrestat-Moleküle konnten deutlich in der Elektronendichte lokalisiert werden. Die Bindung dieser zusätzlichen Liganden ging mit konformationellen Änderungen in weiten Teilen des Proteins einher, die in dieser Form vorher noch nicht beobachtet wurden. Insgesamt hat sich diese Arbeit am Beispiel der AR mit einer Reihe von Aspekten der Proteinflexibilität beschäftigt. Dabei hat sich AR als wertvolles Testsystem herausgestellt, um solche Phänomene mit unterschiedlichen Methoden zu untersuchen., Aldose Reductase (AR) is the first enzyme of the 'sorbitol pathway'. It is an NADPH dependent enzyme and catalyzes the reduction of various aldehydes to the corresponding alcohols. Its binding pocket shows intrinsic flexibility which is mainly mediated by a small loop region. A specificity pocket can be opened or closed via this loop stretch. In the first part of this work the relevance of considering protein flexibility in structure-based drug design was highlighted. Docking experiments were carried out for two inhibitors which were originally designed to mimic a certain binding mode. By carrying out separate docking simulations for each known major binding pocket conformation, it was shown that the intended binding mode was not predicted to be the most favorable. This hypothesis could later be verified by X-ray crystallography. However, the predictions were by no means perfect. One of the compounds induced a new conformation to the binding pocket. Thus, no appropriate crystal structure was available as template for the docking experiments. For the second molecule the importance of considering water during docking was emphasized. In the second part of this thesis a new method to simplify the tedious process of docking to multiple targets was evaluated in the context of protein flexibility: in-situ cross-docking. With this method, instead of performing sequential docking experiments of multiple ligands into multiple protein structures, several protein conformations can be addressed at once. In the next part of this thesis the flexibility of the AR binding pocket was examined in detail. It was shown that with respect to the binding pocket, flexibility is limited to only a handful amino acids close to the specificity pocket. It was elucidated how the enzyme performs its 'induced-fit' binding mechanism. To further explore the conformational space available to the AR binding pocket, multiple MD simulations were carried out. Good overall agreement between the results from the MD simulations and the crystal structure analysis was found. Residues which exhibited elevated levels of flexibilities in the MD simulations showed in most cases also differences between the single crystal structures. However, a few residues showed unexpected behavior in the MD simulations: Phe 122, Trp 219, and Tyr 309. The behavior of these residues were examined in great detail. In a further project, the generated MD trajectories were used to energetically analyze the process of 'induced-fit' adaptation. The method MM-PBSA was chosen for this purpose. Considering the enormous amount of computational power required to perform the necessary calculations and the remarkable time needed to analyze the results, MM-PBSA did not turn out to be a cost-effective method to predict binding free energies for the dataset of AR inhibitors used in this study. In the final section of this thesis a study was presented where in the first part aspects of flexibility of the C-terminal loop of AR were examined. In a combined study using MD simulations and multiple crystal structures, it was shown that there are clear differences between individual crystal structures of the same protein-ligand complex in this region of the enzyme. A nice agreement between the observations made in the MD and multiple crystal structures derived from different experimental crystallization conditions was found. In the second part of this section the unexpected occurrence of multiple ligands in and close to the binding pocket of AR was described. In summary, this study has dealt with many aspects of protein flexibility using AR as a test case. AR has proves to be a valuable test system to investigate protein flexibility with different methods.

Recent hardware development increase the computing power, in consequence many biological and chemical processes can now be successfully modelled in a way which was not to imagine 20 years ago. Examples of such processes are molecular dynamics studies of large biomolecules, the prediction of free energy of binding for protein-ligand complexes, investigations of reaction paths in enzymes, to mention only a few. One issue which is still unresolved concerns the accurate estimation of protonation states in protein-ligand complexes. In this thesis, we present the development of a novel charge assignment procedure named PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimized for Poisson-Boltzmann calculations), which represents a method for the assignment of atomic partial charges. It works reliably with both proteins and small organic molecules using a consistent approach. Such charges are a key parameter in Poisson-Boltzmann (PB) calculations, which are a well-established method for pKa calculations of proteins. The development of the PEOE PB charges is necessary, because no generic procedure exists to perform PB-based pKa calculations of protein-ligand complexes. The development of the PEOE PB charges is described in section 2. We adapted the PEOE formalism to optimally predict solvation free energies of small organic molecules. Modifications were performed in a heuristic manner, i.e. purely result-oriented. The changes considered exclusively parameter a of the PEOE polynomial (see section 2.2.1). In our optimization protocol, we first attempted to reproduce best solvation free energies of the polar amino acids (r2 is 0.94, RMSD is 0.84) and continued with a dataset of 80 small organic molecules (r2 is 0.78, RMSD is 1.57). The latter step underlines the generic character of our PEOE PB charges. Subsequently, we performed calculations on a dataset of nine (apo) proteins with 132 experimentally determined pKa values and obtained an overall RMSD of 0.88. The dielectric constant of the protein is set to 20. Active site residues with highly shifted pKa values are given for two enzymes of the dataset. For these, the following issues were indicated: * The value of the dielectric constant has to be lowered from 20 to 4, which can be partially explained by the degree of burial of the binding pocket. * The orientation of the tyrosine OH group was observed to have a remarkable influence on the pKa value of an active site residue (a glutamate with a highly increased pKa value). This fact emphasizes that the position of polar hydrogens can be crucial. In the final step of our PEOE PB validation study, we performed pKa calculations for three protein-ligand complexes, where experiment revealed a proton transfer. All our calculations agree with the experimental findings. In section 3, we describe pKa calculations for a series of ligands binding to the serine proteases trypsin and thrombin. For the studied complexes, we previously performed an extensive ITC and crystallographic study and were able to identify protonation changes for four complexes [22]. However, since ITC measures only the overall proton exchange, it does not provide structural insights into the functional groups involved in the proton transfer. By using Poisson-Boltzmann calculations based on our PEOE PB charges, we compute pKa values for all complexes from our previous work in order to reveal the residues with altered protonation states. The results indicate that His57, a member of the catalytic triad, is responsible for the most relevant pKa shifts resulting in the experimentally detected protonation changes. This ®nding is in contrast to our previous assumption that the observed protonation changes occur at the carboxylic group of the ligands. The newly detected proton acceptor is used for a revised factorization of the ITC data, which is necessary in cases where the protonation inventory changes upon complexation. pKa values of complexes showing no change of protonation in the ITC experiment are reliably predicted in most cases, whereas predictions of strongly coupled systems remain problematic. Such coupled systems appear if two (or more) strongly interacting titratable groups are close to each other. The HIV protease (HIVP) is a prominent example of successful structure-based drug design, and it is a well-studied system for which, as experimental evidence shows, protonation changes in the active site occur upon ligand binding (section 4). In the apo enzyme, the catalytic dyad consisting of two aspartates is in the mono-protonated state. This protonation state can be altered by ligands bearing a cyclic urea moiety. Our PEOE PB charge model reliably suggests the experimentally determined protonation states in the active site of HIVP. Furthermore, we perform pKa calculations for two HIVP complexes with novel types of inhibitors developed and synthesized in our group [115, 114]. For these complexes, no experimental knowledge on the protonation states is given. For one of the compounds, containing a central pyrrolidine ring, the calculations predict that both catalytic aspartates should be deprotonated upon ligand binding (Table 4.12 and 4.13). Such a protonation pattern has yet not been observed in any HIVP complex. Similarly to the experimental trypsin/thrombin study, a combined crystallographic and thermodynamic investigation of the ligand complexation process of human aldose reductase (hAR) was performed in our group [23]. The ITC measurements detected a proton transfer induced by the ligand binding process. Our calculations suggest an active site tyrosine residue (Tyr48) as proton acceptor, which is equivalent to a deprotonated tyrosine in the holo enzyme. This is in agreement with the ITC results for the Tyr48Phe mutant. Good quantitative agreement with the ITC experiment is obtained for the hAR complexes with inhibitors bearing a carboxylic head group. In contrast, the calculations cannot reliably predict the properties of inhibitors with a cyclic hydantoin moiety. A possible explanation for the de®ciency is the fact that the ligand shows a strong electrostatic interaction with the active site tyrosine and lysine residues. Furthermore, its pKa value in aqueous solutions falls next tothe physiological pH range which makes the system very sensitive to the actual pKa shifts. One limiting factor for the large-scale application of the pKa calculation methodology presented here concerns the ligand processing. For this purpose, we included the PEOE_PB algorithm in the PDB2PQR program. This tool serves as the input file generator for the Poisson-Boltzmann solver APBS. Besides the fully flexible ligand consideration within the PDB2PQR framework, substructure matching has been enabled for the ligand. With this technique, it is possible to automatically detect titratable groups of the ligand and assign pKa values. These pKa values originate from a database which has designed built and currently contains 348 molecules with experimentally determined pKa values., Die ständige Weiterentwicklung der Computer-Hardware und die daraus resultierende Steigerung der Rechenleistung ermöglicht heutzutage eine erfolgreiche Modellierung von chemischen und biologischen Prozessen, die vor 20 Jahren noch undenkbar war. Als Beispiele sind Molekulardynamik-Simulationen grosser Biomoleküle, die Berechnung freier Bindungsenergien von Protein-Ligand-Komplexen oder auch Untersuchungen von Reaktionswegen in Enzymen zu nennen. In einem Bereich mangelt es jedoch weiterhin an akkuraten Methoden: die Abschätzung von Protonierungszuständen in Protein-Ligand-Komplexen. In der vorliegenden Arbeit zeigen wir die Entwicklung einer neuen Methode der Ladungszuweisung, genannt PEOE_PB (Partial Equalisation of Orbital Electronegativities - optimiert für Poisson-Boltzmann Rechnungen). Diese Methode stellt eine konsistente Ladungszuweisung sowohl für Proteine als auch für kleine organische Moleküle dar. Die Ladungen sind entscheidende Parameter bei Poisson-Boltzmann (PB)- Rechnungen. PB-Rechnungen stellen eine etablierte Methode bei der Bestimmung von pKa-Werten in Proteinen dar. Die Entwicklung von PEOE_PB-Ladungen ist notwendig geworden, da es keine generische Methode gibt, PB-basierte pKa-Berechnungen in Protein-Ligand-Komplexen durchzufÃ�hren. Der PEOE-Ansatz wurde gewählt, um zunächst die freien Solvatationsenergien kleiner organischer Moleküle bestmöglich vorherzusagen. Modifikationen wurden heuristisch, d.h. ergebnisorientiert vorgenommen, wobei Änderungen lediglich den Parameter a des PEOE-Polynoms betreffen. Bei unserer Optimierung versuchten wir zunächst, die experimentell bestimmten freien Solvatationsenergien polarer AminosÃ�uren (r2 = 0.94, RMSD = 0.84) und anschliessend eines Datensatzes von 80 kleinen organischen MolekÃ�ulen (r2 = 0.78, RMSD = 1.57) zu reproduzieren. Die Verwendung des letztgenannten Datensatzes zeigt den generischen Charakter unserer PEOE_PB-Ladungen. Abschliessend führten wir Rechnungen an einem Datensatz von neun (apo-)Proteinen mit 132 experimentell bestimmten pKa-Werten durch und erzielten einen RMSD von 0.88. Die Dielektrizitätskonstante im Protein war hierbei auf 20 gesetzt. Aminosäurereste in Bindetaschen mit stark verschobenen pKa-Werten lagen bei zwei Enzymen des Datensatzes vor, in diesen FÃ�llen wurden folgende Beobachtungen gemacht: * Die Dielektrizitätskonstante wurde von 20 auf 4 gesenkt, was teilweise durch die Vergrabenheit der Bindetasche erklärt werden kann. * Die Orientierung der Hydroxylgruppe des Tyrosins hatte einen beachtlichen Einfluss auf den pKa-Wert eines Aminosäurerestes in der Bindetasche (ein Glutamat mit einem stark erhöhten pKa-Wert). Diese Tatsache unterstreicht den entscheidenden Einfluss der Orientierung polarer Wasserstoffatome. Im letzten Schritt unserer PEOE_PB-Validierung führten wir pKa-Berechnungen für drei Protein-Ligand-Komplexe (die im Experiment einen Protonentransfer zeigten) durch: in allen Fällen stimmten unsere Berechnungen mit dem Experiment überein. In einer folgenden reinen Anwendungstudie führten wir pKa-Berechnungen für eine Serie von Liganden, die an die Serin-Proteasen Trypsin und Thrombin binden, durch. An diesen Komplexen waren bereits ausführliche ITC- und Kristallographie-Studien gemacht worden und für vier dieser Komplexe konnten Ã�nderungen in den ProtonierungszustÃ�nden detektiert werden [Dullweber et al., J. Mol. Biol. 313 (2001), 593] . Da ITC-Experimente jedoch nur gesamtheitliche Ã�nderungen in der Protonierung messen, konnten diese Experimente keinen Aufschluss darüber geben, welche funktionellen Gruppen tatsächlich am Protonentransfer beteiligt sind. Um diese Gruppen identifizieren zu können, führten wir Poisson-Boltzmann-Rechnungen, basierend auf unseren PEOE_PB-Ladungen, durch. Die resultierenden pKa-Werte zeigen, dass His57 (einer der drei katalytisch aktiven Reste) für die wichtigsten pKa-Änderungen, die sich im Experiment als Ã�nderungen im Protonierungszustand zeigen, verantwortlich ist. Dies steht im Widerspruch zu unserer frÃ�heren Annahme, dass die Ã�nderungen im Protonierugszustand an der Carboxylgruppe der Liganden ablaufen. Der neuentdeckte Protonenakzeptor wurde für die Refaktorisierung der ITC-Daten eingesetzt; dies ist wichtig für Fälle, in denen sich die Protonierung während der Komplexbildung ändert. Die pKa-Werte von Komplexen, die im ITC-Experiment keine Änderung im Protonierungszustand zeigen, werden in den meisten Fällen verlässlich vorhergesagt, während dies in Fällen stark koppelnder Systeme schwierig bleibt. Solche Fälle treten auf, wenn zwei (oder mehr) interagierende titrierbare Gruppen räumlich nahe beiander liegen. Die HIV-Protease (HIVP) ist ein bekanntes Beispiel für erfolgreiches strukturbasiertes Wirkstoffdesign und ist ein gut untersuchtes System, bei dem Änderungen des Protonierungszustandes während der Ligandenbindung auftreten, wie im Experiment gezeigt wurde. Das System der HIVP stellt einen Ausgangspunkt für eine weitere Anwendungsstudie unserer PEOE_PB-Ladungen dar. Bei dem Apo-Enzym befindet sich die zwei katalytisch aktiven Reste (Aspartate) im monoprotonierten Zustand. Dieser kann sich ändern, wenn Liganden binden, die eine cylische Harnstoff-Gruppe enthalten. Unser PEOE_PB-Modell reproduziert den experimentell bestimmten Protonierungszustand. Ferner führten wir pKa-Berechnungen für zwei HIVP-Komplexe mit neuartigen Inhibitoren, die unserer Gruppe entwickelt und synthetisiert wurden [Specket et al, J. Med. Chem., 48 (2005) 6607], durch. In diesen Fällen gibt es keinerlei experimentelle Daten für die Protonierungszustände. Einer der Inhibitoren enthält ein Pyrrolidin-Ring: hier sagten die Berechnungen voraus, dass beide katalytisch aktiven Aspartate nach Ligandenbindung deprotoniert vorliegen. Solch ein Protonierungsmuster wurde bisher in keinem HIVP-Komplex beobachtet, weder experimentell noch mittels einer Berechnungsmethode. Neben den experimentellen Trypsin/Thrombin-Studien wurden auch kombinierte kristallographische und thermodynamische Untersuchungen der Ligandenbindung an humaner Aldose-Reduktase (hAR) in unserer Gruppe vorgenommen [Steuber, Doktorarbeit in Vorbereitung]. Die ITC-Messungen zeigten einen durch die Ligandenbindung induzierten Protonentransfer. Unsere Berechnungen lassen darauf schliessen, dass ein Tyrosin-Rest der Bindetasche (Tyr48) als Protonenakzeptor fungiert, was bedeutet, dass das Tyrosin im Holo-Enzym deprotoniert vorliegt. Dies ist im Einklang mit den Ergebnissen von ITC-Messungen an Tyr48Phe-Mutanten. Während bei hAR-Komplexen von Inhibitoren mit einer Carboxyl-Kopfgruppe die Berechnungen gut im Einklang mit den ITC-Experimenten waren, zeigten sich Ungenauigkeiten bei der Vorhersage von Inhibitoren mit einer cyclischen Hydantoin-Gruppe. Eine mögliche Erklärung hierfür ist die starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen Ligand und den Tyrosin bzw. Lysin-Resten der Bindetasche. Ferner liegen die pKa-Werte in wässriger LÃ�sung nahe dem physiologischen pH-Bereich, was das System sehr anfälig für kleine Ã�nderungen des pKa-Wertes macht. Ein limitierender Faktor für die breite Anwendung unserer PEOE_PB Ladungsmethode bei pKa-Rechnungen stellt die vorangehende Prozessierung der Liganden dar. Zu diesem Zweck implementierten wir den PEOE_PB-Algorithmus in das PDB2PQR-Programm (dieses erzeugt Input-Dateien für das Poisson-Boltzmann-Programm APBS). Liganden wurden in der PDB2PQR-Umgebung als voll flexibel betrachtet, und es wurde eine Suchprozedur für gemeinsame Substrukturen eingeführt. Mit dieser Technik ist es möglich, titrierbare Gruppen des Liganden automatisch zu erkennen und ihnen pKa-Werte zuzuweisen. Diese pKa-Werte stammen aus einer Datenbank, die momentan 348 Moleküle mit experimentell bestimmten pKa-Werten enthält.

In der vorliegenden Arbeit werden Ansätze zur strukturbasierten Entwicklung von Hemmstoffen der eubakteriellen tRNA – Guanin Transglykosylase (TGT) aus Zymomonas mobilis vorgestellt. In Untersuchungen an Shigella flexneri, dem Verursacher der Bakterienruhr, konnte gezeigt werden, dass die Aktivität der TGT die Pathogenität wesentlich beeinflusst. Von der S. flexneri TGT ist, im Gegensatz zu der in der Aminosäuresequenz sehr ähnlichen Z. mobilis TGT, keine Kristallstruktur verfügbar. Das Auffinden von Hemmstoffen der Z. mobilis TGT könnte zur Entwicklung eines wirksamen Antibiotikums gegen Bakterienruhr beitragen. Im ersten Teil dieser Arbeit werden funktionelle und strukturelle Untersuchungen präsentiert, die den Mechanismus der von TGT katalysierten Basenaustausch-reaktion genauer beschreiben. Aus dem Vergleich von Kristallstrukturen der eubakteriellen Z. mobilis QueTGT und der archaebakteriellen Pyrococcus horikoshii ArcTGT, jeweils im Komplex mit tRNA, wurde ein detailliertes Modell zum Verlauf der Basenaustauschreaktion entwickelt. Die Analyse der verfügbaren Strukturen deutet auf einen bei Prokaryoten und Eukaryoten hochkonservierten Reaktionsverlauf hin. Außerdem bestätigt die Analyse der beiden tRNA gebundenen Strukturen eine in der Literatur bereits vermutete Zuordnung der TGT Superfamilie zu einer Gruppe von Superfamilien, die ein spezielles Phosphatbindemotiv beinhalten. In QueTGT Kristallstrukturen zweier Organismen wurden strukturell konservierte Dimere entdeckt. Der Vergleich von TGT Sequenzen aus 21 Arten gibt, zusammen mit der tRNA gebundenen Z. mobilis TGT Kristallstruktur, deutliche Hinweise darauf, dass TGT-Dimerbildung bei Eubakterien und Eukaryoten funktionell relevant ist. Für QueTGT wurde gezeigt, dass eine für den Basenaustausch funktionell und strukturell wichtige Konformationsänderung der Bindetasche über die generelle Säure/Base Glu235 gesteuert wird. Dieses Anpassungsvermögen ermöglicht allerdings auch Substratpromiskuität. In begrenztem Umfang ist der Einbau von preQ0 möglich, dem biosynthetischen Vorläufer des natürlichen Substrates preQ1. In einer Glu235Gln- Mutationsstudie konnte gezeigt werden, dass sich die Selektivität zugunsten von preQ0 verschieben lässt. Kristallstrukturanalysen zeigten jedoch, das die preQ0 selektive Bindetasche in der Mutante auf eine unerwartete Weise stabilisiert wird. Die Erkenntnisse über Struktur und Funktion der TGT wurden im zweiten Teil dieser Arbeit in die strukturbasierte Hemmstoffentwicklung einbezogen. Alle in dieser Arbeit untersuchten Verbindungen wurden von Kooperationspartnern zur Verfügung gestellt. Zunächst wurde das zuvor etablierte Testsystem modifiziert, um in Abhängigkeit von Molekülgröße und Ähnlichkeit zu den Substratbasen kompetitive und unkompetitive Hemmbeiträge zu berücksichtigen. Es folgte eine umfangreiche kinetische Neubestimmung bereits publizierter Hemmstoffe, die der Revalidierung der Struktur – Wirkbeziehung diente. Im Anschluss daran wurden drei Ansätze zur strukturbasierten Entwicklung von Hemmstoffen genauer verfolgt. Im ersten und erfolgreichsten Ansatz wurde lin-Benzoguanin als neue Leitstruktur etabliert. Kristallstrukturanalysen zeigen, dass lin-Benzoguanine Konformations-änderungen induzieren, die die Bindetasche vergrößern. In ähnlicher Weise können diese Modifikationen auch in der tRNA gebundenen TGT Struktur beobachtet werden. Zwei strukturell wichtige Wassermoleküle sind in diesen Prozess involviert. 2- und 4-substituierte lin-Benzoguaninderivate ermöglichten es, günstige und ungünstige Beiträge zur Bindungsaffinität abzuleiten. 4-Substituierte Verbindungen verdrängen ein Wassernetzwerk im Bereich des negativ geladenen Nukleophils Asp280. Vermutlich in Folge einer Störung der Ladungskompensation ist eine leichte Affinitätsabnahme zu beobachten. 2-Substituierte Verbindungen gewinnen im Vergleich zum Grundgerüst Affinität um eine Faktor 10 und hemmen im nanomolaren Bereich. Vermutlich weisen sie einen ladungsunterstützten Bindemodus auf, der für den signifikanten Affinitätsgewinn hauptverantwortlich zu sein scheint. In einem zweiten Ansatz sollte eine aus einem virtuellen Screening stammende Leitstruktur optimiert werden, für die ein ungewöhnlicher Bindemodus vorhergesagt worden war. Serien von 1- und 5-substituierten Derivaten von Benzimidazolin-2-on/-thion zeigten Inhibitionskonstanten im Bereich von 2 – 150 µM. Da Kristallstrukturanalysen im Komplex mit TGT bislang erfolglos blieben, kann noch keine Aussage über Struktur – Wirkbeziehungen getroffen werden. Im dritten Ansatz wurden kinetische und kristallographische Untersuchungen von Apigenin-basierten Verbindungen durchgeführt, die mit der Methode des „Ligandenfischen“ aus Pflanzenextrakten isoliert worden waren. Ihre Inhibitionskonstanten liegen im Bereich von 20 – 90 µM. Auch hier waren Kristallstrukturanalysen erfolglos. Selbst das Platzieren der Verbindungen mit computerbasierten Methoden in der TGT Bindetasche ergab keine einheitlichen Resultate. So bleiben auch in diesem Fall die Struktur – Wirkbeziehungen bis auf weiteres spekulativ., In this study structure-based drug design approaches for Zymomonas mobilis tRNA - guanine transglycosylase (TGT) are presented. In Shigella sp., the causative agent of bacterial shigellosis, TGT is involved in pathogenicity. Concerning the amino acid sequence, TGTs from both genera are highly homologous, however, for the Shigella TGT no crystal structures are available. The development of inhibitors for Z. mobilis TGT could assist to develop a potent new antibiotic against shigellosis. In the first part of this study functional and structural analyses are presented providing valuable information about the base exchange reaction catalyzed by TGT. The comparison of crystal structures from the eubacterial Z. mobilis QueTGT and the archaebacterial Pyrococcus horikoshii ArcTGT, both in complex with tRNA, allowed to develop a detailed model for the base exchange reaction pathway. These analyses indicate an evolutionarily conserved mechanism in all kingdoms of life. Additionally, the tRNA bound TGT crystal structures also allow to classify the TGT superfamily into cluster of superfamilies with TIM-barrel fold sharing a standard phosphate binding motif. In QueTGT crystal structures from two species conserved TGT dimers were observed. Their similarity along with additional data of TGT amino acid sequences from 21 species indicates functional dimer formation in eubacterial and eukaryotic QueTGTs. To support the base exchange reaction in QueTGT the binding pocket has to perform a structural and functional rearrangement controlled by the general acid/base Glu235. However, this adaptability allows substrate promiscuity. In addition to the natural substrate preQ1 also incorporation of its biosynthetic precursor preQ0 is possible. A mutational study, exchanging Glu235 against Gln, resulted in the inversion of selectivity in favour of preQ0. Nevertheless, crystal structure analyses revealed that the preQ0 selective binding pocket of the mutant is stabilized by unexpected interactions. The results from the structural and functional analyses of TGT were implemented in three structure-based inhibitor design campaigns presented in the second part of this study. All tested compounds were provided by cooperation partners. In a first step the available test system had to be modified to reflect previously unconsidered competitive and uncompetitive inhibitory contributions. Therefore inhibition constants of already published compounds were redetermined to revalidate the structure affinity relationship. In the first and most successful campaign lin-benzoguanine was established as new lead structure. Crystal structure analyses revealed, that lin-benzoguanines induce conformational changes in the binding pocket extending its size. Similar changes are also observed upon binding of tRNA to TGT. Water molecules were identified to be involved in this rearrangement procedure. 2- and 4-substituted lin-benzoguanines enabled the factorization of favourable and unfavourable contributions towards binding. 4-Substituted derivatives disturb a water network adjacent to the negatively charged nucleophile Asp280 resulting in a slight affinity loss. 2-substituted derivatives exhibit nanomolar inhibition and gain affinity by a factor of 10 compared to lin-benzoguanine. Charge assisted binding resulting from the 2-substitution seems to be the key factor for the significant affinity gain. In the second approach a compound identified in a previous virtual screening campaign was optimized. For this compound an unusual binding mode was predicted, however, crystallization in complex with TGT was not successful. 1- and 5-substituted derivatives of benzimidazolin-2-one/-thione were tested exhibiting 2 – 150 µM inhibition. Crystal structure analyses of these compounds in complex with TGT were not successful. Docking experiments provide no conclusive picture about the binding mode. Thus, structure – affinity relationships still remains to be resolved. In a third approach apigenin-based compounds isolated from plant extracts by “ligand fishing” were tested kinetically and crystallographically. Inhibition constants are in the range of 20 – 90 µM. Unfortunately, crystallization in complex with TGT was not successful. Docking studies do not suggest a fully convincing specific recognition of these compounds in the active site of TGT. Therefore, the exact binding mode still remains to be elucidated.

Diese Arbeit beschreibt eine Klassifizierung von Protein-Protein Komplexen mit Algorithmen aus dem Bereich des Maschinellen Lernens (ML). Es wird die Vorhersagequalität von vier verschiedenen ML Algorithmen verglichen: Support Vector Maschinen, C4.5 Entscheidungsbäume, K-Nächste-Nachbarn und Naïve Bayes. In Kombination mit so genannten Feature-Selektionsverfahren konnte ein Datensatz von 345 Protein-Protein Komplexen (147 permanente und 198 transiente Komplexe) in einer „Leave-One-Out Cross-Validierung“ zu 93,6% richtig vorhergesagt werden. Des Weiteren wurde eine Klassifizierung von Protein-Protein Kristallkontakten gegenüber funktionellen Protein-Protein Komplexen durchgeführt. Ein Datensatz von 172 Protein-Protein Komplexen (76 funktionelle Komplexe gegenüber 96 Kristallkontakten) konnte zu 94,8% richtig klassifiziert werden. Mit Hilfe der Auswertung und Optimierung anhand Genetischer Algorithmen ließ sich ein Verfahren entwickeln, das es ermöglicht, eine quantitative Aussage über die Relevanz einzelner Deskriptoren zu treffen. Dazu werden alle so genannten Individuen des Genetischen Algorithmus evaluiert und die relative Häufigkeit der einzelnen Deskriptoren ins Verhältnis zur der Vorhersagerate gesetzt. Durch diese Analyse konnte gezeigt werden, dass beispielsweise das Verhältnis von hydrophober zu hydrophiler Oberfläche zwischen den Protein-Protein Komplexen eine für die Diskriminierung entscheidende Rolle spielt. Der zweite Teil dieser Arbeit konzentriert sich auf die Suche und das Design von Stabilisatoren für Protein-Protein Interaktionen. Obwohl ein Großteil der heute eingesetzten Arzneistoffe allosterisch fungierende Effektoren bzw. Agonisten oder Antagonisten unterschiedlichster Rezeptoren sind, ist die funktionelle Regulierung biologischer Systeme prinzipiell auch durch die Modulierung von Protein-Protein Interaktionen möglich. Das ehrgeizige Ziel kleine, arzneistoffähnliche Moleküle zu entwerfen, die in der Lage sind Protein-Protein Interaktionen zu inhibieren, führte allerdings bis heute nur in Einzelfällen zu Erfolg. Eine Modulierung von Protein-Protein Interaktionen muss allerdings nicht zwangsläufig durch eine kompetitive Inhibierung erfolgen. Mittels einer gezielten Stabilisierung, bei der kleine Moleküle im Randbereich der Proteinkontaktfläche eines Protein-Protein Komplexes binden, kann man ebenfalls die gewünschte Modulierung erzielen. Dieses Phänomen wird eindrucksvoll durch die Bindung von Fusicoccin, das die Interaktion zwischen einer pflanzlichen H+-ATPase und einem 14-3-3 Protein um nahezu den Faktor 100 verstärkt, beschrieben. Auf der Suche nach niedermolekularen Verbindungen, die ebenso wie Fusicoccin den Protein-Protein Komplex stabilisieren, wurden Datenbanken mit ca. 2 Millionen käuflich erwerbbaren Molekülen durchmustert, deren Anzahl ich durch verschiedene Filterschritte reduzieren ließ. Mit verschiedenen Dockingprogrammen wurden über 160.000 Kandidatenmoleküle in die Bindetasche des H+-ATPase/14-3-3-Komplexes eingepasst. Die zahlreichen generierten Dockingposen wurden anhand geeigneter Pharmakophorfilter selektiert. Dazu ließen sich Methoden entwickeln, die effizient mit großen Datenmengen umgehen können. Diejenigen Moleküle mit pharmakophorerfüllenden Eigenschaften und Geometrien wurden anschließend mit verschiedenen Bewertungsfunktionen evaluiert. Für einen intuitiven Einblick in die Beiträge einzelner Atome des Liganden zu dessen Gesamtbewertung, wurde eine etablierte Bewertungsfunktion in ihrer Funktionalität erweitert. Des Weiteren konnte an einem Datensatz mit 198 Protein-Protein Komplexen gezeigt, dass nahezu alle der untersuchten Komplexe taschenförmige Vertiefungen im Randbereich ihrer Kontaktfläche aufweisen. Eine nähere Betrachtung der Taschen zeigt, dass einige eine ähnliche Gestalt zu Bindetaschen in globulären Proteinen aufweisen, die bekanntermaßen kleine Moleküle binden. Diese Erkenntnis lässt vermuten, dass auch Bindetaschen im Randbereich von Protein-Protein Komplexen ein vielversprechendes Target für die Bindung kleiner Moleküle darstellen. Eine Modulierung von Protein-Protein Interaktionen im Sinne einer Stabilisierung durch niedermolekulare Verbindungen erscheint somit als interessante Alternative zur Inhibierung solcher Interaktionen. Ein weiterer Teil dieser Arbeit entstand im Verlaufe eines Projektes zur Entwicklung einer verbesserten Bewertungsfunktion in silico generierter Dockingposen, wie sie bei der Auswahl möglicher Liganden zum Binden in die Fusicoccin Bindetasche des H+-ATPase/14-3-3-Komplexes eingesetzt wurden. Für die Entwicklung empirischer Bewertungsfunktionen, bei denen vorhergesagte gegenüber gemessenen Affinitäten regressionsbasiert korreliert werden, sind große und diverse Datensätze von Protein-Ligand Kristallkomplexen und deren ermittelter Affinität essentiell. In diesem Zusammenhang konnte die webbasierte Datenbank AffinDB entwickelt werden. AffinDB ist im Internet unter http://www.agklebe.de/affinity frei verfügbar., (1) Analyzing protein-protein interactions at the atomic level is critical for our understanding of the principles governing the interactions involved in protein-protein recognition. For this purpose descriptors explaining the nature of different protein-protein complexes are desirable. In this work, we introduce Epic Protein Interface Classification (EPIC) as a framework handling the preparation, processing, and analysis of protein-protein complexes for classification with machine learning algorithms. We applied four different machine learning algorithms: Support Vector Machines (SVM), C4.5 Decision Trees, K Nearest Neighbors (KNN), and Naïve Bayes (NB) algorithm in combination with three feature selection methods, Filter (Relief F), Wrapper, and Genetic Algorithms (GA) to extract discriminating features from the protein-protein complexes. To compare protein-protein complexes to each other, we represented the physicochemical characteristics of their interfaces in four different ways, using two different atomic contact vectors (ACVs), DrugScore pair potential vectors (DPV) and SFCscore descriptor vectors (SDV). We classified two different datasets: (A) 172 protein-protein complexes comprising 96 monomers, forming contacts enforced by the crystallographic packing environment (crystal contacts), and 76 biologically functional homodimer complexes; (B) 345 protein-protein complexes containing 147 permanent complexes and 198 transient complexes. We were able to classify up to 94.8% of the packing enforced/functional and up to 93.6% of the permanent/transient complexes correctly. Furthermore, we were able to extract relevant features from the different protein-protein complexes and introduce an approach for scoring the importance of the extracted features. (2) Since protein-protein interactions play pivotal role in the communication on the molecular level in virtually every biological system and process, the search and design for modulators of such interactions is of utmost interest. In recent years many inhibitors for specific protein-protein interactions have been developed, however, in only a few cases, small and druglike molecules are able to interfere the complex formation of proteins. On the other hand, there a several small molecules known to modulate protein-protein interactions by means of stabilizing an already assembled complex. To achieve this goal, a ligand is binding to a pocket, which is located rim-exposed at the interface of the interacting proteins, e.g. as the phytotoxin Fusicoccin, which stabilizes the interaction of plant H+-ATPase and 14-3-3 protein by nearly a factor of 100. To suggest alternative leads, we performed a virtual screening campaign to discover new molecules putatively stabilizing this complex. Furthermore, we screen a dataset of 198 transient recognition protein-protein complexes for cavities, which are located rim-exposed at their interfaces. We provide evidence for high similarity between such rim-exposed cavities and usual ligand accommodating active sites of enzymes. This analysis suggests that rim-exposed cavities at protein-protein interfaces are druggable targets. Therefore, the principle of stabilizing protein-protein interactions seems to be a promising alternative to the approach of the competitive inhibition of such interactions by small molecules. (3) AffinDB is a database of affinity data for structurally resolved protein-ligand complexes from the PDB. It is freely accessible at http://www.agklebe.de/affinity. Affinity data are collected from the scientific literature, both from primary sources describing the original experimental work of affinity determination and from secondary references which report affinity values determined by others. AffinDB currently contains over 730 affinity entries covering more than 450 different protein-ligand complexes. Besides the affinity value, PDB summary information and additional data are provided, including the experimental conditions of the affinity measurement (if available in the corresponding reference); 2D drawing, SMILES code, and molecular weight of the ligand; links to other databases, and bibliographic information. AffinDB can be queried by PDB code or by any combination of affinity range, temperature and pH-value of the measurement, ligand molecular weight, and publication data (author, journal, year). Search results can be saved as tabular reports in text files. The database is supposed to be a valuable resource for researchers interested in biomolecular recognition and the development of tools for correlating structural data with affinities, as needed, for example, in structure-based drug design.

The G protein-coupled receptors constitute still the most densely populated proteinfamily encompassing numerous disease-relevant drug targets. Consequently, medicinal chemistry is expected to pursue targets from that protein family in that hits need to be generated and subsequently optimized towards viable clinical candidates for a variety of therapeutic areas. For the purpose of rationalizing structure-activity relationships within such optimization programs, structural information derived from the ligand's as well as the macromolecule's perspective is essential. While it is relatively straightforward to define pharmacophore hypotheses based on comparative modelling of structurally and biologically characterized low-molecular weight ligands, a deeper understanding of the molecular recognition event underlying, remains challenging, since the principally available amount of experimentally derived structural data on GPCRs is extremely scarse when compared to, e.g., soluble enzymes. In this context, the protein modelling methodologies introduced, developed, optimized, and applied in this thesis provide structural models that are capable of assisting in the development of structural hypotheses on ligand-receptor complexes. As such they provide a valuable structural framework not only for a more detailed insight into ligand-GPCR interaction, but also for guiding the design process towards next-generation compounds which should display enhanced affinity. The model building procedure developed in this thesis systematically follows a hierarchical approach, sequentially generating a 1D topology, followed by a 2D topology that is finally converted into a 3D topology. The determination of a 1D topology is based on a compartmentalization of the linear amino acid sequence of a GPCR of interest into the extracellular, intracellular, and transmembrane sequence stretches. The entire chapter 3 of this study elaborates on the strengths and weaknesses of applying automated prediction tools for the purpose of identifying the transmembrane sequence domains. Based on an once derived 1D topology, a type of in-plane projection structure for the seven transmembrane helices can be derived with the aide of calculated vectorial property moments, yielding the 2D topology. Thorough bioinformatics studies revealed that only a consensus approach based on a conceptual combination of different methods employing a carefully made selection of parameter sets gave reliable results, emphasizing the danger to fully automate a GPCR modelling procedure. Chapter 4 describes a procedure to further expand the 2D topological findings into 3D space, exemplified on the human CCK-B receptor protein. This particular GPCR was chosen as the receptor of interest, since an enormous experimentally derived and structurally relevant data-set was available. Within the computational refinement procedure of constructed GPCR models, major emphasis was laid on the explicit treatment of a non-isotropic solvent environment during molecular mechanics (i.e. energy minimization and molecular dynamics simulations) calculations. The majority of simulations was therefore carried out in a tri-phasic solvent box accounting for a central lipid environment, flanked by two aqueous compartments, mimicking the extracellular and cytoplasmic space. Chapter 5 introduces the reference compound set, comprising low-molecular weight compounds modulating CCK receptors, that was used for validation purposes of the generated models of the receptor protein. Chapter 6 describes how the generated model of the CCK-B receptor was subjected to intensive docking studies employing compound series introduced in chapter 5. It turned out that by applying the DRAGHOME methodology viable structural hypotheses on putative receptor-ligand complexes could be generated. Based on the methodology pursued in this thesis a detailed model of the receptor binding site could be devised that accounts for known structure-activity relationships as well as for results obtained by site-directed mutagenesis studies in a qualitative manner. The overall study presented in this thesis is primarily aimed to deliver a feasibility study on generating model structures of GPCRs by a conceptual combination of tailor-made bioinformatics techniques with the toolbox of protein modelling, exemplified on the human CCK-B receptor. The generated structures should be envisioned as models only, not necessarily providing a detailed image of reality. However, consistent models, when verified and refined against experimental data, deliver an extremely useful structural contextual platform on which different scientific disciplines such as medicinal chemistry, molecular biology, and biophysics can effectively communicate., Die Familie der G Protein-gekoppelten Rezeptoren repräsentiert eine der höchst-populierten Proteinfamilien, die zahllose Krankheitsrelevante Zielproteine enthält. Folglich wird die Medizinische Chemie Repräsentanten dieser Rezeptorfamilie bearbeiten, d.h. Hit-Strukturen generieren und diese zu vielversprechenden Kandidaten für die klinische Entwicklung weiter optimieren, wobei sich ein breites Spektrum therapeutischer Indikationen adressieren lässt. Zum tiefergehenden Verständnis von Struktur-Wirkungsbeziehungen im Kontext solcher Optimierungsprogramme liefern Strukturinformation über Liganden und über die Rezeptorproteine wertvolle Beiträge. Während Pharmakophorhypothesen relativ einfach aus vergleichenden Studien von strukturell wie biologisch charakterisierten niedermolekularen Substanzen aufzustellen sind, stellt die Generierung eines detaillierten Verständnisses über das zugrundeliegende molekularen Erkennungsgeschehen von z.B. Antagonist-GPCR Wechselwirkung nach wie vor eine grosse Herausforderung dar. Dies liegt u.a. daran, dass die prinzipiell zur Verfügung stehende, experimentell abgeleitete Strukturinformation im Vergleich zu z.B. löslichen Enzymen extrem limitiert ist. Vor diesem Hintergrund erlauben die in dieser Arbeit eingeführten, entwickelten und optimierten Methoden der Proteinmodellierung die Erstellung von Strukturmodellen, die wertvolle Hilfestellung zum Aufstellen von Strukturhypothesen zu Ligand-Rezeptorkomplexen liefern. Dadurch wird es nicht nur möglich, Ligand-Rezeptor Interaktion auf einem detaillierteren Niveau zu verstehen, auch wird der Designprozess zu Verbindungen der nächsten Generation beeinflusst, der letztlich zu Substanzen mit verbesserter Affinität führen soll. Das hier entwickelte Verfahren folgt systematisch einem hierarchischen Vorgehen, das sequentiell eine 1D Topologie, eine 2D Topologie und eine 3D Topologie erzeugt. Die Erstellung der 1D Topologie beruht auf einer Kompartmentierung der linearen Primärstruktur, sprich der Aminosäuresequenz des GPCRs in extrazelluläre, intrazelluläre und transmembrane Sequenzabschnitte. Kapitel 3 setzt sich mit den Vor- und Nachteilen der Anwendung automatisierter Vorhersage Programme auseinander, anhand derer die potentiell transmembranen Sequenzbereiche identifizierbar sein sollten. Ausgehend von einer erstellten 1D Topologie wird eine Projektionsstruktur für die 7 Helices erstellt, wobei die Projektionsebene parallel zur Membranoberfläche liegt. Diese Projektionsstruktur(2D) wird mit Hilfe der vektoriellen Eigenschaftsmomente der einzelnen Helices erhalten. Intensive Studien führten zu dem Resultat, dass nur ein Konsensus-Vorgehen (Kombination unterschiedlicher Methoden), basierend auf sorgfältig ausgewählten Parametersätzen valide 2D Topologien lieferte, was auf die Gefahr hinweist, die sich in der Anwendung voll-automatisierter GPCR Modellingverfahren zur Modellgenerierung verbirgt. Kapitel 4 beschreibt ein Procedere zur Transformation der 2D Topologie in ein 3D Strukturmodell, was exemplarisch am humanen CCK-B Rezeptorprotein demonstriert wird. Dieser Rezeptor wurde ausgewählt, da eine Grosszahl experimentell abgeleiteter strukturrelevanter Daten vorhanden sind. Zur Computer-gestützten energetischen Verfeinerung konstruierter GPCR-Modelle wurde die Hauptaufmerksamkeit auf die explizite Berücksichtigung der anisotropen Umgebung im Rahmen von molekulardynamischen-Simulationen gelegt. Alle Simulationen wurden demzufolge in einem speziell entwickelten 3-Phasen-System durchgeführt, das aus einer zentralen Lipidphase besteht, die von 2 wässrigen Phasen flankiert wird, welche das extrazelluläre und das cytoplasmatische Kompartiment imitieren sollen. Im Kapitel 5 wird der Ligandsatz vorgestellt, der als Referenz zur Validierung der Rezeptormodelle im Zuge der in Kapitel 6 beschriebenen Docking-Studien darstellt. Im Kontext dieser Docking-Studien stellte sich heraus, dass durch Verwendung der DRAGHOME Methodik validierbare Strukturmodelle zur Rezeptor-Ligand Interaktion erhalten werden konnten. Mithilfe des in dieser Studie verwendeten und entwickelten Methodenarsenals gelang es, ein detailliertes Modell der Rezeptor-Bindungstasche zu formulieren, das sowohl bekannte Struktur-Wirkungsbeziehungen, als auch Ergebnisse aus Mutagenese-Studien zufriedenstellend zu erklären vermag. Ein Dieser Arbeit war auch eine Art Machbarkeitsstudie zur Modellierung von GPCRs mit einem Kombination von maßgeschneiderte Bioinformatik-Techniken und Methoden der Proteinmodellierung, was am Beispiel des humanen CCK-B Rezeptors demonstriert worden ist. Zusammenfassend: die erzeugten Strukturmodelle sind als Modelle einzustufen, die nicht notwendigerweise mit den realen Gegebenheiten am Rezeptor übereinstimmen. Trotzdem stellt ein in sich konsistentes Modell eine extrem hilfreiche Plattform dar, auf der unterschiedlichste wissenschaftliche Disziplinen miteinander effektiv kommunizieren können.

In this study the similarity analysis of protein binding pockets is used to annotate protein structures, detect structurally related proteins, rationalize and predict cross-reactivities of known drugs to different proteins, and to classify protein families according to the similarities in their active sites. Cavbase is a method to describe and compare protein binding pockets according to the physicochemical properties of their active sites. Binding pockets are automatically extracted in terms of clefts on the protein surface. A cavity is represented by pseudocenters mapping physicochemical properties of the flanking amino acids together with their surface exposure. Such classified cavities are stored in Cavbase, which is integrated into the protein ligand database Relibase. The property description in Cavbase was validated and adapted by comparing the cavity surface attributed with the physicochemical properties of the pseudocenters with Superstar and Drugscore hotspots of comparable atom probes. This allows for a better representation of the physicochemical properties of the active sites. For the comparison of different binding sites, a clique algorithm is applied to detect common substructures. A significant speed-up of the clique algorithm was achieved using heuristic filters and optimizations. It is now possible to compare very large datasets of protein cavities. Additionally, a fast similarity measure comparable to bitstring patterns used in the pharmacophore matching of small molecules was developed. Using the fast bitstring matches as filter to reduce the number of cases that have to be considered in the more elaborate clique detection algorithm, the time consumption is significantly reduced. By optimising binding to a selected target protein, modern drug research strives to develop safe and efficacious agents for the treatment of disease. The unexpected nanomolar affinity of the COX-2 specific inhibitors Celecoxib and Valdecoxib for isoenzymes of the totally unrelated carbonic anhydrase family is rationalized using Cavbase. The similarity analysis detects similar areas in the active sites of both proteins and helps in the explanation of this cross-binding. The functional classification of protein families is presented using two pharmaceutically relevant protein families: the alpha-carbonic anhydrases and the protein kinases. The family of the alpha-carbonic anhydrases contains presently 14 members, all involved in the interconversion of carbon dioxide and bicarbonate. For six carbonic anhydrase isozymes the crystal structure are known. A dataset of 24 cavities is used to classify the different isozymes. Cavbase successfully distinguishes between the different members of the carbonic anhydrase subfamilies using only information about the active sites. Furthermore, structural differences in a carbonic anhydrase II important for the catalytic mechanism are detected. The second protein family contains information for all structural known kinases (263 kinase binding pockets). Kinases are a ubiquitous group of enzymes involved in a large variety of cellular signalling pathways thus providing an interesting panel of pharmaceutically relevant targets. The elucidation of selectivity discriminating features exhibited by the binding site of protein kinases is of fundamental importance to classify kinases and provides the basis for the design of selective inhibitors. We present the results for the classification and clustering of a set of protein kinase structures with respect to their binding sites as stored in Cavbase. We are able to generate a reasonable clustering of different subtypes of the kinase family. Cavbase also distinguishes between cavities of different activation states from one subfamily. Furthermore, a number of unexpected similarities of protein kinases not related in sequence space are found., Die Analyse der Ähnlichkeitsbeziehungen von Proteinbindetaschen ist das zentrale Thema, das in verschiedenen Variationen in dieser Arbeit bearbeitet wurde.Die grundlegende Annahme hinter dem vorgestellten Ansatz ist, daß die Funktion eines Proteins in starkem Maße von der Gestalt und den physikochemischen Eigenschaften der Bindetasche bestimmt wird. Ähnlichkeiten von Proteinbindetaschen lassen sich demnach dazu nutzen, Rückschlüsse über die Funktion von Proteinen zu erhalten. Außerdem helfen sie in der Identifizierung von Liganden oder Ligandfragmenten, die in verwandte Bindetaschen binden und können so Ideen für das Design von neuen Inhibitoren liefern. Des Weiteren können Ähnlichkeiten in den Bindetaschen nicht Sequenz-verwandter Proteine dazu genutzt werden, mögliche Kreuzreaktivitäten zwischen diesen vorherzusagen. Schließlich bilden sie die Grundlage für eine funktionelle Klassifizierung von Proteinbindetaschen. Die vorgestellte Arbeit baut auf der Methode Cavbase auf, die die geometrische Form und die physikochemischen Eigenschaften von Bindetaschen beschreibt und ähnliche Bereiche in zwei Bindetaschen bestimmt. Die physikochemischen Eigenschaften der Aminosäuren wird durch 3D-Deskriptoren (Pseudozentren) ausgedrückt. Für einige Interaktionseigenschaften der Aminosäuren wurden neue Pseudozentren eingeführt. Ein Vergleich der Bindetaschenrepräsentation mit wissensbasierten Ansätzen wie Superstar und Drugscore hat gezeigt, daß die Eigenschaften der Bindetaschen von Cavbase sehr gut abgebildet werden. Durch die Implementierung der Beschreibung von Bindetaschen durch Bitstrings, konnte die Geschwindigkeit von Bindetaschenvergleichen wesentlich erhöht werden. An verschiedenen Beispielen ist der erfolgreiche Einsatz von Cavbase in der Ähnlichkeitsanalyse und dem Entdecken von verwandten Proteinbindetaschen gezeigt worden. Weiterhin konnten an 26 ausgewählten Proteinen, deren Funktion zum Zeitpunkt der Kristallstrukturbestimmung noch nicht bekannt war (sogenannten hypothetical proteins), die Möglichkeiten und Grenzen des Cavbase Ansatzes gezeigt werden. Cavbase ist in der Lage, funktionelle Ähnlichkeiten mit anderen Proteinen zu entdecken und Ideen für die Funktionsannotierung vorzuschlagen. Ähnlichkeiten in den Bindetaschen von zwei Proteinen können sich in einer unerwünschten Nebenwirkung manifestieren. Eine mögliche Kreuzreaktivität ist bei Sequenz-verwandten Strukturen relativ einfach abzuschätzen. Schwieriger ist die Vorhersage von Kreuzreaktivitäten, wenn die betrachteten Proteine keine Sequenz- und Faltungsmusterhomologie aufweisen. In dieser Arbeit konnte eine im Experiment beobachtete Kreuzreaktivität strukturell verstanden und mit Cavbase nachvollzogen werden . Als zweiten Fall einer möglichen Kreuzreaktivität wurden ähnliche Bereiche in den Bindetaschen von Carboanhydrase und Malatdehydrogenase aufgefunden, die eine im Experiment beobachtbare Kreuzreaktivität strukturell plausibel machen. Traditionelle Methoden, die die Ähnlichkeit zwischen Proteinen oder Proteinbindetaschen bestimmen, vergleichen eine Bindetasche gegen einen großen Datensatz eben solcher und beschränken sich dabei nur auf die Analyse ausgewählter Bindetaschen. In dieser Arbeit wurde der Fokus stattdessen auf eine Clusteranalyse von großen Datensätzen gelegt. Dabei steht jetzt nicht die Ähnlichkeitsbeziehungen einzelner Bindetaschen zueinander im Vordergrund, sondern die gleichzeitige Analyse von Ähnlichkeitsbeziehungen von mehreren Bindetaschen. In dieser Arbeit wurden deshalb Methoden entwickelt, um große Datensätzen von Bindetaschen miteinander vergleichen und Ähnlichkeits- und Clusteranalysen durchführen zu können. Durch den Einsatz heuristischer Filter konnten Bindetaschenvergleichen wesentlich beschleunigt werden. Besonders interessant ist die Analyse von Proteinfamilien. Am Beispiel von zwei pharmazeutisch relevanten Proteinfamilien den alpha-Carboanhydrasen und den Proteinkinasen konnte gezeigt werden, wie sich Ähnlichkeiten und Unterschiede in den Bindetaschen dazu nutzen lassen, um eine funktionelle Klassifizierung dieser Familien aufzubauen. Cavbase ist in der Lage, die betrachteten Bindetaschen auf der Ebene der Proteinsubfamilie zu unterscheiden.

Röntgenkristallographische Studien von Nukleotidkofaktor- bindenden und tRNA-modifizierenden Enzymen Die Ergebnisse meiner Doktorarbeit wurden unter der Leitung von Prof. Dr. G. Klebe und PD Dr. K. Reuter am Institut für Pharmazeutische Chemie der Universität Marburg erarbeitet. Die Untersuchungen konzentrierten sich auf die Aufklärung von Struktur-Wirkungsbeziehungen von potenziellen Arzneistofftargets sowie die Bestimmung von Enzymen mit neuartigen Strukturmotiven durch molekularbiologische und röntgenkristallographische Methoden. Die Arbeit umfasst vier verschiedene Themengebiete, die im Folgenden näher vorgestellt werden. Nukleotidkofaktor-bindende Enzyme Die Kristallstruktur der Carbonylreduktase Sniffer aus Drosophila melanogaster Das Sniffer-Protein aus Drosophila melanogaster ist ein Nukleotidkofaktor-bindendes Enzym. In dieser Arbeit wurde das Protein produziert, über Affinitätschromatographie gereinigt und anschließend kristallisiert. Die Selenomethionylderivat-Kristallstruktur des Sniffer-Proteins im Komplex mit NADP+ wurde durch die Methode der multiplen Wellenlängen unter Nutzung anomaler Differenzen (MAD) am Synchrotron BESSY, PSF-Beamline II in Berlin mit einer Auflösung von 1,7 Å bestimmt. Das Sniffer-Protein gehört zur Familie der Kurzkettigen Dehydrogenasen/Reduktasen. Das Enzym besteht aus einem siebensträngigen ß-Faltblatt, das auf beiden Seiten von jeweils drei Helices flankiert wird. Im aktiven Zentrum des dimeren Enzyms befindet sich die katalytische Triade. Mit Hilfe eines genetischen Docking-Algorithmus des Programms AutoDock wurden die artifiziellen Substrate des Sniffer-Proteins in die Bindetasche eingepasst, um eine Vorstellung über ihren denkbaren Bindungsmodus im aktiven Zentrum zu erhalten. In der Nähe des aktiven Zentrums befindet sich die Substratbindeschleife, die bei den meisten SDR-Enzymen aus mehr als 20 Aminosäuren besteht und erst im ternären Komplex mit Kofaktor und Substrat eine geordnete Konformation einnimmt. Im Sniffer-Protein hingegen ist die Substratbindeschleife sehr kurz und bereits im binären Komplex mit NADP+ vollständig geordnet. Das Sniffer-Protein weist, besonders im Bereich der Substratbindeschleife, eine hohe strukturelle Homologie zur Schweinecarbonylreduktase (PTCR) auf. Aus der Kristallstruktur ergibt sich eine interessante Schlussfolgerung auf eine mögliche Funktion der humanen Orthologen des Sniffer-Proteins im Hinblick auf neurodegenerative Erkrankungen. In vivo-Studien haben eindrucksvoll gezeigt, dass bei einer reduzierten Expressionsrate des sniffer-Gens der altersabhängige neurodegenerative Prozess in den Fruchtfliegen beschleunigt wird [Botella et al., 2004]. tRNA-modifizierende Enzyme Neben diesem eukaryontischen Enzym wurden tRNA-modifizierende Enzyme aus der Domäne Archaea und Eubakterien untersucht. Diese Enzyme erkennen spezifisch bestimmte Bereiche in der L-förmigen Tertiärstruktur der Transfer-RNA (tRNA). In der katalytischen Reaktion werden die Nukleotide der tRNA posttranslational modifiziert. Die Rolle des Asp280 in der katalytischen Reaktion der tRNA-Guanin Transglykosylase Die eubakterielle tRNA-Guanin Transglykosylase (TGT) spielt für die Expression beinahe aller wichtigen Virulenzfaktoren des Bakterienruhrerregers Shigella eine bedeutende Rolle. Das tRNA-modifizierende Enzym katalysiert den Austausch der Base Guanin gegen preQ1 an Position 34 der Antikodonschleife bestimmter tRNAs über einen assoziativen Mechanismus [Romier et al., 1996]. Dabei bildet die tRNA ein kovalentes Intermediat mit dem Asp280 im aktiven Zentrum [Xie et al., 2003]. In Kollaboration mit der Arbeitsgruppe von Dr. G. Garcia in der Abteilung Medizinische Chemie der Universität Michigan, USA wurde die Funktion des Asp280 untersucht [Kittendorf et al., 2003]. In biochemischen Studien mit der E. coli TGT wurde das Asp264 (entspricht Asp280 in Z. mobilis) gegen verschiedene Aminosäurereste ausgetauscht. Die E. coli TGT(D264E) ist das einzige Enzym, das eine signifikante spezifische Aktivität aufweist und in der Lage ist, einen kovalenten Komplex mit dem RNA-Substrat zu bilden. Die Anwesenheit einer Carboxylatgruppe an Position 264 ist für den Ablauf der katalytischen Reaktion essentiell. In dieser Arbeit wurde die Kristallstuktur der Z. mobilis TGT(D280E) im Komplex mit preQ1 mit einer Auflösung von 1,7 Å bestimmt und in Konsens mit den biochemischen Daten interpretiert. Im aktiven Zentrum der TGT(D280E) befindet sich das Glutamat nahezu an identischer Position wie das Aspartat in der Wildtyp-TGT. Die Glu280-Seitenkette besitzt jedoch eine sehr ausgeprägte Flexibilität. Das Wasserbrückennetzwerk zwischen dem katalytischen Nukleophil, dem Asp102 und dem Substrat ist im Gegensatz zur Wildtyp-Struktur nicht hinreichend definiert. Die Kristallstruktur der TGT(D280E) liefert eine Erklärung für die signifikante, jedoch reduzierte katalytische Aktivität der E. coli TGT(D264E). Während der katalytischen Reaktion ist nicht nur die Komplexbildung zwischen der TGT und dem RNA-Substrat, sondern auch der nukleophile Angriff des preQ1 am kovalenten Intermediat erschwert. Die archaebakterielle tRNA-Guanin Transglykosylase Im Gegensatz zur eubakteriellen tRNA-Guanin Transglykosylase katalysiert das archaebakterielle Enzym den Austausch der Base Guanin gegen die modifizierte Base preQ0 an Position 15 in die D-Schleife der meisten tRNAs. Das preQ0 wird anschließend zur hypermodifizierten Base Archaeosin umgewandelt [Watanabe et al., 1997]. Im Vergleich zu den eubakteriellen TGTasen besitzen diese Enzyme eine zusätzliche, archaespezifische C-terminale Domäne, die ein neuartiges Faltungsmuster aufweist und für die tRNA-Bindung verantwortlich ist [Romier et al., 1997]. Auch innerhalb der Domäne Archaea unterscheiden sich die Enzyme signifikant in der Länge dieser C-terminalen Domäne. Um einen Einblick in das neuartige Faltungsmuster der C-terminalen Domäne der TGT zu erhalten, wurden die tgt-Gene aus den hyperthermophilen Spezies Archaeglobus fulgidus, Aeropyrum pernix und Pyrococcus horikoshii amplifiziert und kloniert. Nach der rekombinanten Expression der tgt-Gene waren die resultierenden TGT-Enzyme im Rohextrakt sehr gut löslich. Für die Archaeglobus fulgidus TGT wurde ein Reinigungs-protokoll etabliert und anschließend Kristallisationsversuche durchgeführt. In Kristallisations-ansätzen wurden Kristalle der A. fulgidus TGT erhalten, die jedoch nicht reproduzierbar waren. Wie sich zeigte, handelte es sich bei diesen Kristallen um ein 42 kDa großes Abbauprodukt der A. fulgidus TGT, das der N-terminalen Domäne zugewiesen wurde. Um dies zu bestätigen, wurde die kodierende Sequenz der N-terminalen Domäne kloniert und überexprimiert. Das resultierende Protein wurde erfolgreich in hoher Ausbeute gereinigt und Kristallisationsversuche durchgeführt. Parallel wurden auch die C-terminalen Domänen der A. fulgidus und A. pernix TGT aus den kompletten tgt-Genen amplifiziert und gereinigt. Die Kristallstrukturen der A. fulgidus und A. pernix TGT bzw. ihrer N- und C-terminalen Domänen konnten in dieser Arbeit nicht bestimmt werden, da keine reproduzierbaren, diffraktions-fähigen Kristalle erhalten werden konnten. Die Domänen der S-Adenosylmethionin: tRNA-Ribosyltransferase/Isomerase Auch die S-Adenosylmethionin: tRNA-Ribosyltransferase/Isomerase (QueA) zählt zu den tRNA-modifizierenden Enzymen. Das QueA-Enzym überträgt in einer außergewöhnlichen Reaktion den Riboserest des Kofaktors S-Adenosylmethionin auf die Base preQ1 in der modifizierten tRNA. Durch Röntgenstrukturanalyse wurde ein erstes Strukturmodell der B. subtilis QueA mit einer Auflösung von 3,0 Å bestimmt. Das Modell zeigt, dass das Enzym aus zwei Domänen besteht. Die größere Domäne weist ein neuartiges Faltungsmuster auf. Das Strukturmodell ist jedoch mit extrem hohen B-Faktoren behaftet und wird gegenwärtig den Anforderungen an eine vollständige und zuverlässige Kristallstruktur nicht gerecht [Grimm, 2000]. Um die Qualität des Strukturmodells zu verbessern, wurden die Domänen durch Mutageneseverfahren erfolgreich voneinander getrennt, die Proteinfragmente in löslicher Form produziert und gereinigt. Aus einem breit angelegten Screening konnten gut reproduzierbare Proteinkristalle von der kleineren Domäne der B. subtilis QueA erhalten werden. Es wurde bereits versucht, die Kristallisationsbedingungen zu optimieren. Für Röntgenbeugungsexperimente sind die Kristalle jedoch noch nicht von ausreichender Qualität.

Ein Ziel der modernen Wirkstoffforschung ist die Entwicklung von Arzneistoffen, die selektiv mit einem Zielprotein wechselwirken. Dadurch sollen Nebenwirkungen in einem frühen Stadium der Entwicklung minimiert, wenn möglich sogar ausgeschlossen werden. Bei der strukturbasierten Entwicklung von Wirkstoffen wurden im Falle der Carboanhydrase (CA) die physikochemischen Eigenschaften von CA-Inhibitoren mit den biologischen Affinitäten an drei Isoenzymen (CA I, CA II, CA IV) korreliert. Mit den daraus erhaltenen 3D-QSAR-Modellen können diejenigen physikochemischen und strukturellen Eigenschaften der Verbindungen bestimmt werden, die die biologische Aktivität im Hinblick auf ein Isoenzym beeinflussen. Mit zwei verschiedenen Ansätzen wurden selektive 3D-QSAR-Modelle erhalten, mit deren Hilfe anhand von Konturdiagrammen Bereiche ermittelt werden können, die für eine bestimmte physikochemische Eigenschaft (sterische, elektrostatische, hydrophobe, Akzeptor, Donor) die Selektivität hinsichtlich eines Isoenzyms erhöhen oder erniedrigen. Aus dieser reinen Liganden-basierten Analyse konnten dennoch Rückschlüsse auf die Gegebenheiten in der umgebenden Bindetasche gezogen werden. Aber nicht nur die Auswertung von Ligandeninformationen kann wichtige Hinweise für die Entwicklung selektiver CA-Inhibitoren liefern. Die Auswertungen von Kristallstrukturen der CA bestätigten diese aus reiner Ligandeninformation erhaltenen Selektivitätsmodelle und lieferten zusätzliche Informationen für die Entwicklung selektiver Verbindungen. Ferner konnte anhand eines Homologiemodells der C AIX gezeigt werden, dass die Modellierung von Enzymen, deren Kristallstrukturaufklärung sich als schwierig erweist, durchaus nützliche Hinweise für den strukturbasierten Entwurf bzw. die Optimierung von Liganden liefern kann. Um potentielle neue (selektive) Leitstrukturen zu finden, können neben dem experimentellen Hochdurchsatz-Screening virtuell am Computer Datenbanken mit gespeicherten Molekülbibliotheken durchmustert werden. Die korrekte Vorhersage des Bindungsmodus und die korrekte Abschätzung der Bindungsaffinität der platzierten Moleküle ist entscheidend für die erfolgreiche Identifizierung von neuen Leitstrukturen. Es konnte erfolgreich gezeigt werden, dass für CA-Inhibitoren mit einem rigiden Ringgerüst und mit bekannter Kristallstruktur der Bindungsmodus korrekt vorhergesagt werden konnte. In den Fällen, in denen die Bewertungsfunktionen der Dockingprogramme in der Affiniätsvorhersage der Verbindungen fehlschlagen, konnte durch die Kombination mit den zuvor erhaltenen 3D-QSAR-Modellen die Affinität dieser gedockten Verbindungen richtig abgeschätzt werden. Darüber hinaus wurde in Datenbanken und in der Literatur nach potentiellen neuen CA-Inhibitoren gesucht und ihre Bindung ließ sich biochemisch in einem Assay bestätigen. Eine Platzierung in der Bindetasche von CA II ermöglicht die korrekte Abschätzung der Affinität. Bei der Optimierung von Leitstrukturen/Wirkstoffen ist es sehr schwierig Wechselwirkungen mit Proteinen vorherzusagen beziehungsweise abzuschätzen, die sich in ihrer Sequenz und Funktion stark von dem Ausgangsprotein unterscheiden. Es konnte gezeigt werden, dass Cyclooxygenase (COX)-2-selektiven Verbindungen (Valdecoxib, Celecoxib) ebenfalls CA hemmen. Obwohl beide Enzyme ? COX und CA - unterschiedliche biologische Funktionen besitzen, weisen beide Enzyme lokale Bereiche im aktiven Zentrum mit ähnlichen physikochemischen Eigenschaften auf, so dass die Bindung von Celecoxib und Valdecoxib an beiden Enzymen ermöglicht wird. Diese Kreuzreaktivität von Celecoxib und Valdecoxib wurden durch kinetische Daten und mit der Kristallstruktur von Celecoxib im Komplex mit CA II belegt., To minimize side effects in the drug design process the development of selective inhibitors is very important. Here selective 3D QSAR were generated that allow the extraction of physicochemical properties that are selective for carbonic anhydrase (CA) isozymes. On the other hand CA isozymes were successfully docked into CA II, compared with the poses in X-ray strcutures and the affinities of these compounds were predicted with the 3D QSAR models. The cross-reactivity of cyclooxygenase (COX)-2 inhibitors (valdecoxib, celecoxib) with CA was confirmed with affinity data and the X-ray structure of celecoxib in complex with CA II.