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The development of hybrids has been an effective approach to generate novel yeast strains with optimal technological profile for use in beer production. This study describes the generation of a new yeast strain for lager beer production by direct mating between two Saccharomyces cerevisiae strains isolated from cachaça distilleries: one that was strongly flocculent, and the other with higher production of acetate esters. The first step in this procedure was to analyze the sporulation ability and reproductive cycle of strains belonging to a specific collection of yeasts isolated from cachaça fermentation vats. Most strains showed high rates of sporulation, spore viability, and homothallic behavior. In order to obtain new yeast strains with desirable properties useful for lager beer production, we compare haploid-to-haploid and diploid-to-diploid mating procedures. Moreover, an assessment of parental phenotype traits showed that the segregant diploid C2-1d generated from a diploid-to-diploid mating experiment showed good fermentation performance at low temperature, high flocculation capacity, and desirable production of acetate esters that was significantly better than that of one type lager strain. Therefore, strain C2-1d might be an important candidate for the production of lager beer, with distinct fruit traces and originating using a non-genetically modified organism (GMO) approach. IMPORTANCE Recent work has suggested the utilization of hybridization techniques for the generation of novel non-genetically modified brewing yeast strains with combined properties not commonly found in a unique yeast strain. We have observed remarkable traits, especially low temperature tolerance, maltotriose utilization, flocculation ability, and production of volatile aroma compounds, among a collection of Saccharomyces cerevisiae strains isolated from cachaça distilleries, which allow their utilization in the production of beer. The significance of our research is in the use of breeding/hybridization techniques to generate yeast strains that would be appropriate for producing new lager beers by exploring the capacity of cachaça yeast strains to flocculate and to ferment maltose at low temperature, with the concomitant production of flavoring compounds.

Previous results from our laboratory and from the literature have implicated the expression of ecto-nucleotidases in the establishment of Leishmania infection. In the present study we evaluated the correlation between ecto-nucleotidasic activity and the infectivity of L. amazonensis promastigotes that were kept in culture for short or extended numbers of passages, a condition that is known to decrease parasite infectivity. We also analyzed the immune response associated with the infection by these parasites. As expected, we found that long-term cultured parasites induce the development of smaller lesions than the short-term cultured counterparts. Interestingly, long-term cultured parasites presented reduced ecto-nucleotidasic activity. In addition, cells recovered from animals infected with long-term cultured parasites produced higher amounts of IFN-gamma and have smaller parasite load, after 8weeks of infection. Furthermore, after 1week of infection, there is increased expression of the chemokine CCL2 mRNA in animals infected with short-term cultured parasites. Finally, infection of peritoneal macrophages by these parasites also shows marked differences. Thus, while short-term cultured parasites are able to infect a greater proportion of macrophages, cells infected by long-term cultured parasites express higher amounts of CXCL10 mRNA, which may activate these cells to kill the parasites. We suggest that the enzymes involved in metabolism of extracellular nucleotides may have an important role in infection by L. amazonensis, by acting directly in its adhesion to target cells and by modulating host cell chemokine production.

Diferentes espécies de parasitos do gênero Leishmania causam infecções expressivamente distintas em uma mesma espécie de hospedeiro. Enquanto alguns hospedeiros são resistentes à infecção por diversas espécies do parasito, quase todas as linhagens de camundongos são susceptíveis à infecção por L. amazonensis, desenvolvendo lesões crônicas e progressivas em resposta à infecção. Esta pronunciada virulência dos parasitos pode estar relacionada à expressão de moléculas superficiais que favoreçam sua interação com os hospedeiros. As ecto-enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos são um possível fator de virulência para parasitos do gênero Leishmania. Para caracterizar a resposta imune desenvolvida por animais infectados com parasitos que apresentam distintos perfis de atividade ectonucleotidásica, foram avaliadas infecções por L. amazonensis mantida em cultura por poucas ou muitas passagens. Esses parasitos, quando mantidos em cultura axênica por muitas passagens, apresentam menor virulência, bem como menor atividade ectonucleotidásica. A atividade das suas enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos extracelulares pode ser modulada pela cultura em presença de determinadas moléculas. Assim, os parasitos cultivados em meio suplementado com adenosina, produto final da via catabólica, apresentam redução na sua capacidade hidrolítica e levam a lesões menores em camundongos C57BL/6. Já os parasitos submetidos a muitas passagens em cultura, quando cultivados em meio suplementado com suramina, um inibidor de ecto-ATPases, apresentam aumento na capacidade de hidrólise de ATP e causam lesões maiores em camundongos C57BL/6. De modo interessante, os animais infectados com os parasitos que apresentam maior atividade ATPásica produziram menores quantidades de IFN- , após oito semanas de infecção. A infecção de macrófagos pelos parasitos mantidos em cultura axênica por poucas ou muitas passagens também apresenta diferenças marcantes, tanto para macrófagos peritoneais, quanto para macrófagos derivados de medula óssea. Os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens são capazes de infectar maior proporção de macrófagos; entretanto, não são observadas grandes diferenças no parasitismo celular. Não há alterações na produção de citocinas, quimiocinas e NO pelas células infectadas pelos diferentes parasitos. Dados obtidos in vivo permitem inferir que células T reguladoras naturais parecem ser importantes para o retardo do desenvolvimento da lesão. Porém, sua participação parece ser idêntica em animais infectados com parasitos mantidos em cultura axênica por poucas ou muitas passagens. Após uma semana de infecção, há maior produção da quimiocina CCL2 em animais infectados com parasitos mantidos em cultura por poucas passagens. Como esta quimiocina participa do recrutamento de monócitos, pode-se cogitar que os parasitos mantidos em cultura por poucas passagens promovem um maior recrutamento dessas células para o sítio da infecção. Uma vez diferenciadas em macrófagos, são eficazmente infectadas por estes parasitos. Em conjunto, esses resultados demonstram que as enzimas envolvidas no metabolismo de nucleotídeos extracelulares desempenham um papel importante na infecção por L. amazonensis, podendo ter função direta na aderência do parasito às células-alvo e na modulação da resposta imune subseqüente. Infection by different species of parasites from the genus Leishmania have distinct outcome in the same species of host. While some mouse strains are resistant to infection by various species of the parasite, almost all strains of mice are susceptible to infection by L. amazonensis, developing chronic and progressive lesions in response to infection. This pronounced virulence of parasites may be related to the expression of surface molecules that promote their interaction with hosts. The ecto-enzymes involved in metabolism of nucleotides are a potential factor of virulence for parasites of the genus Leishmania. To characterize the immune response developed in animals infected with parasites that have distinct profiles of ecto-nucleotidase activity, we evaluated the infection by L. amazonensis kept in axenic culture for few or many passages. These parasites, when maintained in axenic culture for many passages, have lower virulence in vivo and reduced ecto-nucleosidasic activity. The activity of the enzymes involved in metabolism of extracellular nucleotides can be modulated by culturing the parasites in the presence of certain molecules. Thus, when the culture medium is supplemented with adenosine, the final product of the catabolic pathway, the parasites have reduced ectonucleosidasic activity capacity and induce smaller lesions in C57BL/6. Parasites that have been kept in culture for a long time, when grown in medium supplemented with suramin, an inhibitor of ecto-ATPases, have increased ability to hydrolyze ATP and cause bigger lesions in C57BL/6. Interestingly, cells recovered from animals infected with the parasites that have a higher ATPase activity produced smaller amounts of IFN- , after eight weeks of infection. Infection of macrophages by these parasites also shows marked differences, for both peritoneal macrophages and for macrophages derived from bone marrow. The parasites maintained in culture for few passages are able to infect a greater proportion of macrophages; however, differences in cellular parasitism are not observed. There are no changes in the production of cytokines, chemokines and NO by cells infected by different parasites. Data obtained in vivo showed that natural regulatory T cells appear to be important for delaying the lesion development. However, their participation seems to be similar in animals infected with both parasites. After a week of infection, there is increased production of the chemokine CCL2 in animals infected with parasites maintained in culture for few passages. As this chemokine participates in the recruitment of monocytes, it is possible to imagine that the parasites maintained in culture for few passages leads to greater recruitment of these cells to the site of infection. Once differentiated into macrophages, these cells are effectively infected by these parasites. Together, these results show that the enzymes involved in metabolism of extracellular nucleotides play an important role in infection by L. amazonensis, and could have direct role in adhesion of the parasite to target cells and subsequent modulation of immune response.

Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas. Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas, Pró-Reitoria de Pesquisa de Pós Graduação, Universidade Federal de Ouro Preto. A leishmaniose pode ser descrita como um conjunto de manifestações clínicas causadas pela infecção de protozoários do gênero Leishmania. Essas manifestações clínicas podem ser agrupadas em quatro quadros bem definidos: leishmaniose cutânea localizada, leishmaniose muco-cutânea, leishmaniose visceral e leishmaniose cutânea difusa. As diferentes condições dependerão de fatores inerentes ao hospedeiro humano e por características do parasito. Por exemplo, L. amazonensis é o único causador da leishmaniose cutânea difusa. Para essa condição clínica o balanço das citocinas produzidas pelas células T CD4 positivas é de grande importância. A infecção por L. amazonensis resulta no desenvolvimento de uma fraca resposta celular T CD4 Th1 em pacientes que são negativos para a reação de hipersensibilidade a antígenos de Leishmania. A deficiência na resposta celular pode ser consequência de mecanismos de evasão específicos de L. amazonensis que podem induzir imunossupressão no hospedeiro. A presença de ectonucleotidases e produção de adenosina extracelular pode representar um desses mecanismos. Atuando nesses receptores, a adenosina pode induzir respostas antiinflamatórias, o que favorece a multiplicação do parasito. Sendo a cafeína por sua vez, uma metilxantina capaz de antagonizar os efeitos da adenosina nos receptores P1, nosso objetivo foi investigar os efeitos da administração diária de cafeína sobre a infecção por L. amazonensis no modelo murino. Camundongos C57BL/6J foram tratados com diferentes concentrações de cafeína em água de beber e posteriormente infectados com metacíclicas de L. amazonensis. Os animais tratados com cafeína apresentaram menor tamanho de lesão quando comparados com os animais não tratados e não observamos diferença no número de parasitos na lesão. A produção de IFN-ɣ por células do linfonodo foi significativamente maior nos animais tratados com cafeína. Concluímos, portanto, que o tratamento com cafeína possuiu a capacidade de interferir no curso da infecção por L. amazonensis. Essa interferência pode ser explicada pela alteração na produção de citocinas como o IFN-ɣ. Dessa maneira o tratamento com cafeína pode oferecer mais um meio de expandir os conhecimentos a respeito dos mecanismos de evasão da resposta imune utilizados pelo parasito, através da sinalização purinérgica, e melhorando o entendimento do papel desta via no curso da infecção por L. amazonensis. Leishmaniasis can be described as a set of clinical manifestations caused by the infection of protozoa of the genus Leishmania. These clinical manifestations can be grouped into four well-defined pictures: localized cutaneous leishmaniasis, mucocutaneous leishmaniasis, visceral leishmaniasis and diffuse cutaneous leishmaniasis. The different conditions will depend on factors inherent to the human host and on the characteristics of the parasite. For example, L. amazonensis is the sole cause of diffuse cutaneous leishmaniasis. For this clinical condition, the balance of cytokines produced by CD4 positive T cells is of great importance. L. amazonensis infection results in the development of a weak CD4 Th1 T cell response in patients who are negative for the hypersensitivity reaction to Leishmania antigens. Deficiency in the cellular response may be a consequence of specific escape mechanisms of L. amazonensis that may induce immunosuppression in the host. The presence of ectonucleotidases and the production of extracellular adenosine may represent one of these mechanisms. Acting on these receptors, adenosine can induce anti-inflammatory responses, which favors the multiplication of the parasite. As caffeine is a methylxanthine capable of antagonizing the effects of adenosine on P1 receptors, our objective was to investigate the effects of daily caffeine administration on L. amazonensis infection in the murine model. C57BL / 6J mice were treated with different concentrations of caffeine in drinking water and subsequently infected with methacyclics of L. amazonensis. The animals treated with caffeine presented smaller lesion size when compared to the untreated animals and did not observe a difference in the number of parasites in the lesion. IFN-ɣ production by lymph node cells was significantly higher in caffeine-treated animals. We conclude, therefore, that caffeine treatment has the potential to interfere with the course of L. amazonensis infection. This interference can be explained by the change in the production of cytokines such as IFN-ɣ. Thus, caffeine treatment may offer another means of expanding the knowledge about the mechanisms of immune response evasion used by the parasite through purinergic signaling and improving the understanding of the role of this pathway in the course of L. amazonensis infection

Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas. CIPHARMA, Escola de Farmácia, Universidade Federal de Ouro Preto. As leishmanioses, que tem protozoários parasitos do gênero Leishmania como agentes etiológicos, são doenças de grande importância em saúde pública no Brasil. Há uma gama muito restrita de fármacos para o tratamento da leishmaniose e, além disso, estes apresentam alta toxicidade, comprometendo a eficácia da terapia. Assim, a busca por outras alternativas terapêuticas se faz necessária. Neste contexto, a própolis representa uma potencial alternativa para auxiliar no tratamento da leishmaniose, uma vez que a sua atividade leishmanicida vem sendo avaliada e relatada na literatura. Este estudo tem como finalidade avaliar a atividade leishmanicida do extrato hidroalcoólico da própolis verde sobre Leishmania amazonensis, tanto in vitro, quanto in vivo. Para tanto, a atividade leishmanicida do extrato hidroalcoólico da própolis verde foi avaliada em cultura de formas promastigotas, de formas amastigotas axênicas e de macrófagos peritoneais murinos infectados, e em camundongos C57BL/6 infectados por L. amazonensis. Nos testes in vitro, observou-se que o extrato hidroalcoólico da própolis verde não foi tóxico para macrófagos peritoneais murinos nas concentrações testadas e foi capaz de inibir a proliferação de L. amazonensis a partir da concentração 62,5 μg/mL para formas promastigotas, 31,25 μg/mL para formas amastigotas axênicas e 250 μg/mL para formas amastigotas intracelulares. Para os ensaios in vivo, foram utilizados camundongos C57BL/6 divididos em quatro grupos: grupos tratados com o extrato hidroalcoólico da própolis verde na dose de 250 mg/kg/dia, por 2 e 8 semanas e os respectivos grupos controle. No tempo de 2 semanas, houve uma redução da carga parasitária no linfonodo poplíteo drenante, mas não houve redução da carga na pata infectada. No tempo de 8 semanas, houve aumento da carga parasitária no linfonodo poplíteo drenante, mas não houve alteração na pata infectada. Para ambos os tempos de tratamento, não houve influência significativa no tamanho da lesão na pata infectada. Conclui-se que o extrato hidroalcoólico da própolis verde possui efeitos inibitórios sobre L. amazonensis in vitro, de maneira concentração-dependente e, na infecção in vivo, este extrato possui efeito leishmanicida apenas nos estágios iniciais da infecção. Leishmaniasis has protozoan parasites of the genus Leishmania as etiological agentes and are diseases of great importance in public health in Brazil. There is a very narrow range of drugs for the treatment of leishmaniasis and, in addition, they present high toxicity, compromising the efficacy of the therapy. Thus, the search for other therapeutic alternatives becomes necessary. In this context, propolis represents a potential alternative to assist in the treatment of leishmaniasis, since its leishmanicidal activity has been evaluated and reported in the literature. This study aims to evaluate the leishmanicidal activity of the hydroalcoholic extract of the green propolis on Leishmania amazonensis, both in vitro and in vivo. For this, the leishmanicidal activity of the green propolis hydroalcoholic extract was evaluated in culture of promastigotes, axenic amastigotes and murine peritoneal macrophages, and in C57BL/6 mice infected with L. amazonensis. In the in vitro tests, it was observed that the hydroalcoholic extract of the green propolis was not toxic to murine peritoneal macrophages in the tested concentrations and was able to inhibit the proliferation of L. amazonensis from 62,50 μg/mL for promastigotes, 31,25 μg/mL for axenic amastigote forms and 250 μg/mL for intracellular amastigote forms. For the in vivo assays, C57BL/6 mice were divided into four groups: groups treated with the hydroalcoholic extract of green propolis at a dose of 250 mg/kg/day for 2 and 8 weeks and the respective control groups. At 2 weeks, there was a reduction of the parasitic load on the draining popliteal lymph node, but there was no reduction of the load on the infected paw. At 8 weeks, there was an increase in the parasitic load on the draining popliteal lymph node, but there was no change in the infected paw. For both treatment times, there was no significant influence on the lesion size in the infected paw. It is concluded that the hydroalcoholic extract of green propolis has inhibitory effects on L. amazonensis in vitro in a dose-dependent manner and, in in vivo infection, this extract has leishmanicidal effect only in the initial stages of infection.