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Esta não é a primeira vez que a humanidade é alvo de um coronavírus. O histórico de repetidas introduções de vírus animais em populações humanas, resultando em surtos de doenças, sugere que futuras pandemias semelhantes são inevitáveis. Portanto, entender a possível origem e a evolução molecular do SARS-CoV-2 fornecerá informações importantes para prevenir futuros surtos. Os coronavírus têm uma propensão à recombinação genética envolvendo isolados de diferentes espécies hospedeiras. Consequentemente, o genoma do SARS-CoV-2 contém assinaturas de vários eventos de recombinação, provavelmente abrangendo várias espécies e amplas regiões geográficas. Outras regiões do genoma do SARS-CoV-2 evidenciam o impacto de seleção purificadora e diversificadora. A proteína spike (S) do SARS-CoV-2, que permite que o vírus entre nas células hospedeiras, exibe assinaturas de seleção purificadora e diversificadora, levando a uma proteína S mais eficaz na infecção de células humanas e muitos outros mamíferos e explicando o rápido surgimento de novas variantes. A disseminação global e o crescimento explosivo da população de SARS-CoV-2 em hospedeiros humanos contribuíram para um aumento na variabilidade mutacional, aumentando as oportunidades de recombinação futura. Diferentemente do relatado em outros estudos em que o P.1 surgiu em Manaus, Amazonas, Brasil entre novembro e dezembro de 2020, o presente trabalho detecta sua circulação desde agosto de 2020, em São Paulo. Assim, fica evidente a importância do rastreamento e monitoramento de variantes, mesmo no caso daquelas de baixa prevalência, pois sua detecção precoce e o acompanhamento de sua história evolutiva podem possibilitar a prevenção de condições mais agravantes ou mesmo futuras novas epidemias. Palavras-chave: SARS-CoV-2. Evolução. Variantes. This is not the first time that humankind has been targeted by a coronavirus. The history of repeated introductions of animal viruses into human populations, resulting in disease outbreaks, suggests that future similar pandemics are inevitable. Therefore, understanding the possible molecular origin and ongoing evolution of SARS-CoV-2 will provide critical information for preventing future outbreaks. Coronaviruses have a propensity for genetic recombination across host species boundaries. Consequently, the SARS-CoV-2 genome harbors signatures of multiple recombination events, likely spanning multiple species and wide geographic regions. Other regions of the SARS-CoV- 2 genome show the impact of purifying and diversifying selection. The spike (S) protein of SARS-CoV-2, which allows the virus to enter host cells, exhibits both purifying and diversifying selection signatures, leading to a more effective S protein in infecting human cells and many other mammals and explaining the rapid emergence of new variants. The global spread and explosive growth of the SARS-CoV-2 population within human hosts has contributed to an increase in mutational variability, increasing opportunities for future recombination. Differently from what was reported in other studies in which P.1 emerged in Manaus, Amazonas, Brazil between November and December 2020, the present work detects its circulation since August 2020, in São Paulo. Thus, the importance of tracking and monitoring variants is evident, even in the case of low prospecting strains, as their early detection and monitoring of their evolutionary history can enable the prevention of more aggravating conditions or even future new epidemics. Keywords: SARS-CoV-2. Evolutionary. Variants.

FAPEMIG - Fundação de Amparo a Pesquisa do Estado de Minas Gerais A bothropstoxina-I (BthTX-I) é uma proteína miotóxica de cadeia simples semelhante à fosfolipase A2, isolada da peçonha de Bothrops jararacussu. Alguns estudos destacam uma forte correlação das fosfolipases A2 com danos genotóxicos em sistemas biológicos que induzem instabilidade genética. Este trabalho teve como finalidade contribuir com informações sobre as atividades biológicas da BthTX-I, por meio das avaliações: dos efeitos mutagênicos e recombinogênicos in vivo da BthTX-I em células somáticas de asas de Drosophila melanogaster, utilizando o teste para detecção de mutação e recombinação somática (SMART); citotóxica e genotóxica da BthTX-I in vitro, realizando o ensaio de resazurina e do cometa com células HUVEC e DU-145; do potencial carcinogênico e anticarcinogênico in vivo da BthTX-I, por meio do teste de detecção de tumores epiteliais (ETT) em D. melanogaster; do potencial antioxidante da BthTX-I, por meio dos ensaios antioxidantes FRAP, ORAC e SOD e da interação BthTX-I com DNA por meio de análises in silico. Este trabalho está apresentado em capítulos: Capítulo I - Contém a Fundamentação Teórica, na qual é apresentada uma revisão literária a respeito de todo o trabalho; Capítulo II - Apresenta o manuscrito intitulado “Mutagenic and genotoxic activities of Phospholipase A2 Bothropstoxin-I from Bothrops jararacussu in Drosophila melanogaster and human cell lines” e Capítulo III - Apresenta o manuscrito intitulado “Carcinogenic and anti-carcinogenic activities of Bothropstoxin-I from Bothrops jararacussu in Drosophila melanogaster, biochemical assays and protein-DNA molecular docking”. Bothropstoxin-I (BthTX-I) is a single-chain myotoxic protein similar to phospholipase A2, isolated from Bothrops jararacussu snake venom. Some studies highlight a strong correlation of phospholipases A2 with genotoxic damage in biological systems that induce genetic instability. The aim of this work was to contribute with information about the biological activities of BthTX-I, through the evaluation of: the mutagenic and recombinogenic effects in vivo of BthTX-I in somatic cells of Drosophila melanogaster wings, using the test for mutation detection and somatic recombination (SMART); cytotoxic and genotoxic of BthTX-I in vitro, performing the resazurin and comet assay with HUVEC and DU-145 cells; the in vivo carcinogenic and anticarcinogenic potential of BthTX-I, through the epithelial tumor test (ETT) in D. melanogaster; the antioxidant potential of BthTX-I, through the FRAP, ORAC and SOD antioxidant assays and the interaction of BthTX-I with DNA through in silico analysis. This work is presented in chapters: Chapter I - Contains the Theoretical Foundation, in which a literary review about the entire work is presented; Chapter II - Presents the manuscript entitled “Mutagenic and genotoxic activities of Phospholipase A2 Bothropstoxin-I from Bothrops jararacussu in Drosophila melanogaster and human cell lines” and Chapter III - Presents the manuscript entitled “Carcinogenic and anti-carcinogenic activities of Bothropstoxin-I from Bothrops jararacussu in Drosophila melanogaster, biochemical assays and protein-DNA molecular docking”. Tese (Doutorado)

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Margaret de Castro Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A hiperplasia congênita da adrenal (HCA) é uma das heredopatias mais comuns. Mais de 90% dos casos são devido à deficiência da 21-0H e 5-8% são causados pela deficiência da 11'beta'-OH. Ambas envolvem a incapacidade para sintetizar cortisol, sendo a última uma falha na conversão de 11-desoxicortisol a cortisol. ... Observação: O resumo, na íntegra, poderá ser visualizado no texto completo da tese digital Abstract: Congenital adrenal hyperplasia (CAR) is one of the most common inherited endocrine diseases. More than 90% of cases are due to steroid 21-0H deficiency, where as 5-8% are caused by 11'beta'-hydroxylase (11'beta'-0H) deficiency, the inherited inability to synthesize cortisol (failure to convert 11-deoxycortisolto cortisol). ... Note: The complete abstract is available with the full electronic digital thesis or dissertations Mestrado Genética Médica Mestre em Ciências Médicas

Orientador : William Jose da Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado Genética Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Maria Cecilia Barisson Vilares, Marcelo de Carvalho Ramos Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A isoniazida, a rifampicina e a pirazinarnida, têm sido utilizadas no tratamento da Tuberculose em muitos países, inclusive no Brasil. A resistência das cepas de Mycobacterium tuberculosis aos antibióticos tem resultado em falência do tratamento e aumento do custo para o sistema de saúde. As Mycobacterium tuberculosis resistentes às drogas de primeira linha tem emergido e estas tem sido reportadas mundialmente. Nas mutações no gene rpo? têm se evidenciado o mecanismo de resistência prevalente das cepas de Mycobacterium tuberculosis resistentes à rifampicina. A fim de caracterizar as bases genéticas da resistência às drogas, do Mycobacterium tuberculosis, foram analisadas mutações envolvendo a resistência à rifampicina utilizando os métodos SSCP (Single Strand Conformation Polymorphism) e sequenciamento. As cepas de MTB (Mycobacterium tuberculosis) foram genotipadas e avaliadas quanto à suscetibilidade a rifampicina. Como resultado, foram encontradas 13 cepas sensíveis a rifampicina e 65 resistentes. O DNA genômico foi obtido de cada cepa e um fragmento constando de 157pb do gene rpo? foi amplificado, submetido ao SSCP e ao sequenciamento. As mutações identificadas pertenciam a região do gene rpo? entre o códon 511 e 533. A S531L (44%) foi a mutação de maior prevalência, seguida das mutações H526D (21%), H526Y (3%), L533P (3%), D516V (3%) e a inserção Phe514 e Met515 (3%) Abstract: Isoniazid, rifampin, and pyrazinamide, have been used as the standard treatment for tuberculosis in many countries, including Brazil. Antimicrobial resistance among Mycobacterium tuberculosis strains results in increased morbidity, mortality and costs of health care. Control of tuberculosis is thus threatened by widespread emergence of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis as reported worldwide. Mutations in the rpo? gene seems to be the most prevalent mechanism involved in rifampin resistance among M. tuberculosis strains. To characterize the genetic basis of drug resistance in Mycobacterium tuberculosis in Brazil, mutations involved in rifampin resistance were detected using single strand conformation polymorphism (SSCP) and sequencing studies. A sample consisting of 73 isoniazid resistant and 5 isoniazid sensitive isolates recovered from August, 1999 through September, 2000 was screened for susceptibility to rifampin. As a result, 13 susceptible, and 65 resistant strains were detected. Genomic DNA was obtained from each isolate, and a fragment consisting of 157 bp of the rpo? gene was amplified, and submitted to SSCP and sequencing studies. Mutations involving codon 511 through codon 533 were identified. S531L (44%) was the most prevalent mutation found, followed by H526D (21%), and H526Y, L533P, D516V, Ins Phe514, Met515 (3% each). Our study corroborates previous studies done in Brazil which identified S531L as the most prevalent mutation, and several other mutations on the same gene segment (codon 511 through 533) Mestrado Ciências Biomédicas Mestre em Ciências Médicas

Orientadores: Margaret de Castro, Maricilda Palandi Mello Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: A hiperplasia adrenal congênita (HAC) constitui um grupo de doenças hereditárias decorrentes da deficiência de uma das enzimas necessárias para a esteroidogênese adrenal. A forma mais comum de HAC é decorrente da deficiência da 21-hidroxilase (21-OH), correspondendo a 90-95% de todos os casos, cuja herança é autossômica recessiva. Mutações no gene CYP21 são responsáveis pelas diferentes formas da doença. O gene CYP21 codifica a enzima 21-OH e se alternam em tanden com o pseudogene CYP21P, ambos apresentando 98% de homologia, favorecendo o emparelhamento desigual dos cromossomos durante a meiose, levando ao aparecimento de duplicações, deleções ou conversões destes genes. Estudos de mutagênes e in vitro permitiram quantificar a atividade enzimática de cada mutação e sua correlação com as diferentes formas clínicas da doença. O objetivo deste estudo foi delinear o perfil do complexo gênico 21-OH em famílias com pelo menos um membro portador de HAC por deficiência da 21-OH, determinar as freqüências de haplótipos com mutações de ponto no gene CYP21 e estabelecer uma correlação entre genótipo e fenótipo dos indivíduos afetados. Foram estudadas 50 famílias não correlacionadas, sendo 20 indivíduos portadores da forma clássica perdedora de sal (PS), 17 da forma clássica virilizante simples (VS) e 13 da forma não clássica (NC) de deficiência de 21-OH. Utilizamos DNA genômico para amplificação do gene CYP21 por PCR alelo-específico. Mutações foram identificadas em 93 alelos, sendo mais freqüentemente encontrada a mutação I172N (20,4%), seguida da V281L (18,2%), IVS2, A/C>G,-12 (Sp2) (14,0%) e R356W (6,5%), Q318X (1,1%), P30L (1,1%) e 706_713del8 (D8) (1,1%). Os genótipos foram divididos em grupos A, B e C, em ordem crescente da atividade enzimática, e foram comparados com as formas clínicas de HAC: PS, VS e NC, respectivamente. Em nossa amostragem, houve, ainda, uma forte correlação do genótipo com o fenótipo (100% para o C grupo, 100% para o B e 88,8% para o A). A freqüência de microconversões encontrada neste estudo foi semelhante à observada na população mundial e brasileira Abstract: Congenital adrenal hyperplasia due to 21-hydroxylase deficiency (CAH-21OHD) is one of the most common inborn metabolism errors. It presents a wide spectrum of clinical manifestations, varying from a severe form with prenatal virilization and neonatal dehydration to a mild form in which the signs appear around puberty onset. It presents recessive autosomal inheritance and occurs due to mutations in the CYP21 gene, which codifies the 21-hydroxylase enzyme. Mutations leading to less enzymatic activity are related to the classical form and those with more enzymatic activity with nonclassical form of the disease. We studied the frequency of the 7 most frequent point mutations reported in CYP21 gene in 50 families with CAH-21OHD, 21 with classic salt wasting patients (SW), 17 with classic simple virilizing patients (SV) and 13 with nonclassic form (NC). In addition, we correlated the phenotype with the genotype observed in all patients studied. We used genomic DNA to amplify CYP21 gene by allele-specific PCR. Mutations had been identified in 93 alleles. The more frequent mutation found was I172N (21.5%) followed by V281L (18.2%), IVS2, A/C>G,-12 (Sp2) (14.0%) and R356W (6.5%), Q318X (1.1%) and P30L (1.1%) and 706_713del8 (D8) (1.1%). The genotype was divided in groups A, B and C, in an increasing order of enzymatic activity. These three groups were compared to the SW, SV and NC forms, respectively. There was a strong correlation of phenotype with the genotype (100% for C group, 100% for B group and 88.8% for A group). In conclusion, the frequency of microconversions found in this study was similar to those observed in the worldwide and in a Brazilian sub population Mestrado Ciências Biomédicas Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Carmen Silvia Bertuzzo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado Genética Mestre em Ciências Biológicas

Orientador: Sara Teresinha Olalla Saad Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: O presente estudo teve por objetivo a análise molecular de 28 pacientes não relacionados, atendidos no Hemocentro-UNICAMP, portadores de Esferocitose Hereditária (EsH) diagnosticada a partir de dados clínicos, esfregaço de sangue periférico e curva de fragilidade osmótica. Na maioria destes casos, a quantificação das proteínas de membrana das hemácias através da densitometria de gel de políacrilamida-SDS corado pelo azul de Coomassie, detectou deficiência de espectrina e/ou anquirina. O rastreamento de mutações foi feito através de SSCP e confirmadas por sequenciamento. Duas novas mutações foram encontradas em nossa população, ambas tratando-se de substituição de um nucleotídeo com alteração do aminoácido. A primeira no exon 9 (His -> Arg, CAC->CGC) e a segunda no exon 28 (lle->Thr ATC->ACC), totalizando uma frequência de 7.2% de mutações no gene da anquirina na população com Esferocitose Hereditária estudada. Foram também encontrados dois novos polimorfismos: no exon 6 (codon 197, CCG ->CCA) e no exon 29 (codon 1162, AGT -> AGC), além de outros polimorfismos já descritos, no exon 4 (codon 105, AAT->AAC), no exon 16 (codon 594, TCC -> TC A), e no exon 18 (codon 691, GGT -> GGC). Foi ainda realizada a análise da expressão de RNAm do gene da anquirina através de SSCP. Um paciente apresentou defeito na transcrição de um dos alelos, conforme evidenciado pela análise da repetição de nucleotídeos AC na região 3' não transcrita. Assim nossos dados indicam que, diferente da literatura, mutações no gene da anquirina podem não ser frequente em todas as populações Abstract: In this study, we carried out the molecular analysis of 28 unrelated patients seen at the Hemocentro-UNICAMP with Hereditary Spherocytosis diagnosed by clinical data, peripheral blood smear and osmotic fragility test. Spectrin and/or ankyrin deficiency was detected in these patients, by densitometry of SDS-PAGE stained by Coomassie blue. By SSCP and DNA sequencing, two novel mutations were identified: In exon 9 (His ->Arg, CAC->CGC) and in exon 28 (lle-*Thr ATC->ACC) totalizing a frequency of 7,2% of ankyrin mutations in the Hereditary Spherocytosis population studied. Two novel polymorphisms were also observed: in exon 6 (codon 197,CCG ->CCA) and in exon 29 (codon 1162, AGT -" AGC), besides other polymorphisms already described in exon 4 (codon 105, AAT -> AAC), exon 16 (codon 594, TCC -> TCA), and exon 18 (codon 691, GGT -> GGC). Expression of ankyrin mRNA by SSCP-PCR of the AC repeat at the 3'ut region showed, in one patient, a defect in the transcription of one allele. Then, our data indicated that ankyrin defects might be not frequent in all populations Mestrado Mestre em Ciências Médicas

Orientadores: Edi Lucia Sartorato, Andrea T. Maciel Guerra Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Mestrado

Orientadores: Jose Paulo Cabral de Vasconcellos, Vital Paulino Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A Síndrome de Axenfeld-Rieger é uma entidade clínica rara, de transmissão autossômica dominante e grande variabilidade clínica, podendo chegar à penetrância incompleta. Manifesta-se clinicamente por malformações do segmento anterior do olho acompanhada ou não de malformações extra-oculares, das quais as mais comuns são alterações dos ossos craniofaciais e dos dentes e falência de involução da pele peri-umbilical. O principal fator de morbidade da síndrome é a associação com glaucoma de desenvolvimento, presente em aproximadamente 50% dos indivíduos afetados. Dois genes, PITX2, localizado no cromossomo 4q25, e FOXCl, no cromossomo 6 p25, estão associados à Síndrome de Axenfeld-Rieger. Recentemente, identificou-se o gene GJAl associado à Síndrome de Displasia Oculodentodigital, a qual compartilha aspectos clínicos com a Síndrome de Axenfeld-Rieger tais como malformações do segmento anterior ocular, glaucoma e alterações ósseas e dentárias, tornando-se, assim também, mais um gene candidato para a Síndrome de Axenfeld-Rieger. O objetivo deste estudo foi avaliar a ffeqüência e os tipos de mutações nos genes PITX2, FOXCl e GJAl em pacientes portadores da Síndrome de Axenfeld-Rieger associada a glaucoma, além de correlacionar possíveis alterações moleculares com aspectos clínicos dos pacientes. Para tanto, foram examinados oito indivíduos (casos-índice) acometidos pela síndrome associada a glaucoma, assim como seus familiares. Após avaliação oftalmológica e sistêmica, foram coletados 5ml de sangue periférico para extração de DNA genômico, o qual foi amplificado por reação em cadeia de polimerase utilizando-se pares de iniciadores específicos para as regiões codificadoras e limites íntronJexon dos genes PITX2, FOXCl e GJAl, procedendo-se com o seqüenciamento automático para o rastreamento de mutações. Não foram encontradas mutações no - gene PITX2. No gene FOXCl foram encontradas uma inserção (1359-1360insGGC), uma deleção (718-719deICT) e uma mutação de ponto do tipo sem sentido (TrpI52STOP) entre as famílias estudadas. O paciente portador da deleção no gene FOXCl era um caso isolado e apresentava apenas alterações oculares da síndrome. As outras duas mutações ocorreram em pacientes com manifestações oculares e sistêmicas da doença, estando a inserção presente em um caso isolado e a mutação sem sentido em seis indivíduos da mesma família com padrão de transmissão autossômico dominante. O rastreamento de mutações no gene GJAl evidenciou uma mutação de ponto do tipo sentido trocado (Ala253Val) em três indivíduos da mesma família, sendo que um deles era clinicamente normal e dois sintomáticos que apresentavam concomitantemente a mutação Trp152STOP no gene FOXCl. Esta é a primeira descrição de uma mutação no gene GJAl em pacientes inequivocamente portadores da Síndrome de Axenfeld-Rieger. As ITeqüências de mutações observadas nos genes PITX2, FOXCl e GJAl em oito famílias brasileiras com Síndrome de Axenfeld-Rieger e glaucoma de desenvolvimento associado foram de 0%, 37,5% e 12,5%, respectivamente, sendo esta última em combinação com a mutação Trp152STOP no gene FOXCl. Apesar da amostragem reduzida, observou-se uma tendência a maior agressividade do glaucoma em pacientes portadores de mutação somente no gene FOXCl do que nos indivíduos portadores de mutação concomitante no gene FOXCl e no gene GJAl, sugerindo um possível efeito protetor da mutação Ala253Val no gene GJAl nesta família. Outros estudos são necessários, contudo, para definir a função do gene GJAl na etiopatogênese da Síndrome de Axenfeld-Rieger Abstract: Axenfeld-Rieger Syndrome (ARS) is arare disorder, usually transmitted in an autosomal dominant pattem characterized by anterior segment dysgenesis and often associated with developmental glaucoma. In addition to the ocular changes observed in ARS, syndromic features can also occur, such as facial bone defects, teeth anomalies and peri-umbilical skin involution. Two transcription factor genes, PITX2 on chromosome 4q25 and FOXCl on chromosome 6p25, have been associated with the ARS phenotype through mutational events. Recently, the GJAl gene (connexin 43), associated with oculodentodigital dysplasia (ODDD) syndrome, which presents some similarities with ARS, was identified. The ODDD syndrome is characterized by malformations that involve the face, eyes, teeth and bones. The ocular abnormalities include microphthalmos and anterior segment dysgenesis that may lead to glaucoma as well. The main purpose of this study was to evaluate FOXCl, PITX2 and GJAl genes mutations in Brazilian patients with ARS. Eight unrelated patients atfected by ARS (all of them with glaucoma and 5 without systemic malformations) and their families were ophthalmologically evaluated and had their blood collected for DNA extraction purposes. The coding regions and íntron/exon boundaries of these genes were completely evaluated through direct sequencing. Among the 8 patients, 3 (37,5%) presented with ditferent structural alterations in the FOXCl gene. A deletion in heterozygosis oftwo bases downstream the forkhead domaÍn was observed in a patient with no systemic malformations (718-719deICT). An insertion ofthree bases, also downstream the forkhead domain, was identified in a patient with systemic malformation (1359-1360insGGC). A new nonsense mutation (Trp152STOP) was identified in the forkhead domain of the FOXCl gene in another patient with ARS and systemic alterations as well. One patient harbored the mutation Ala253Val in the GJAl gene (12,5%). No mutations were identified in the PITX2 gene among these individuaIs. Patients who carried the GJAl (Ala253Val) and FOXCl (TrpI52STOP) mutations (:&om the same family) developed less severe glaucoma compared with family members presenting FOXCl (TrpI52STOP) mutation alone. Three new structural alterations of the FOXCl gene and one new mutation in the GJAl gene were described in Brazilian patients with ARS and the :&equencyof mutations in the PITX2, FOXCl and GJAl genes in this study were 0%, 37,5% and 12,5%, respectively. Despite the small number of patients, we found a slight trend to more severe glaucoma in patients with FOXCl mutations compared to those without them, except in the two patients with FOXCl and GJAl associated mutations, suggesting an attenuation effect of GJAl gene mutation (Ala253Vai). However, other studies are necessary to define the exact role ofGJAl in ARS Mestrado Oftalmologia Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Fernando F. Costa Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A hemofilia B é uma doença hemorrágica hereditária caracterizada pela deficiência ou anormalidade da atividade coagulante do fator IX (FIX:C). O gene que controla a produção do fator IX está localizado no cromossomo X, na posição Xq27.1. É constituído por oito exons e sete íntrons abrangendo uma região de aproximadamente 33,5 kb que origina um mRNA de 2,2 kb. A análise do gene do fator IX de hemofílicos indica que cerca de 95% das alterações moleculares são identificadas nas seqüências correspondentes à região promotora, regiões codificadoras e sítios de excisão de íntrons. A maioria das mutações apresenta origem independente. As mutações de ponto são as alterações moleculares descritas em aproximadamente 85% dos casos de hemofilia 8, sendo o restante devido a perdas ou inserções gênicas. A análise do polimorfismo de conformação de hélices simples de DNA (SSCP) possibilita o rastreamento rápido e eficaz de mutações. A identificação das mutações pelo seqüenciamento direto do DNA permite a determinação precisa da portadora, diagnóstico pré-natal e viabiliza o aconselhamento genético. A comparação das mutações e quadros clínicos dos pacientes estudados neste trabalho com aqueles descritos em publicações anteriores também permitem a avaliação do efeito destas alterações na atividade do fator IX. Neste estudo foi realizada a análise das alterações moleculares no gene do fator IX de 29 pacientes portadores de hemofilia 8. A metodologia consistiu na amplificação das regiões codificadoras e promotora do gene do fator IX pela reação em cadeia da polimerase (PCR) e posterior análise do SSCP radioativo e não-radioativo, este último em um sistema automático de eletroforese (Phastsystem® Pharmacia), corado com nitrato de prata. A identificação das mutações foi realizada pelo seqüenciamento direto do fragmento do DNA com padrão anormal no SSCP. Com o emprego destas técnicas foi possível o reconhecimento de alterações moleculares em todos os pacientes analisados. Cinco mutações de ponto foram detectadas apenas na análise de SSCP radioativo. O seqüenciamento dos fragmentos com padrão de migração anormal permitiu a detecção de 31 mutações de ponto no gene do fator IX. Destas alterações, 22 representavam mutações diferentes, das quais 6 ainda não descritas na literatura. Em um paciente foram encontradas três alterações nucleotídicas, uma delas uma mutação silenciosa na posição 31.093. A análise dos haplótipos indica que 24 mutações identificadas neste estudo apresentam origem independente. Quatro pacientes originários do Estado do Pará apresentam mesma mutação e haplótipo idêntico evidenciando a ocorrência de um possível efeito do fundador. O estudo das mutações no gene do fator IX apresenta-se como um modelo para a determinação do padrão das alterações moleculares em linhagens de células germinativas. O padrão de mutações identificado no gene do fator IX é semelhante entre Caucasóides, Asiáticos, e pequenos grupos de Hispânicos e Negróides. A população brasileira apresenta origem étnica bastante heterogênea e é representada por imigrantes provenientes da Europa, África, Ásia e pelas populações indígenas residentes mostrando-se, desta forma, distinta das demais populações previamente analisadas. O padrão de mutação verificado neste estudo é semelhante àquele observado em outras populações o que sugere a predominância dos processos endógenos na determinação das mutações espontâneas em células germinativas Abstract: Hemophilia B is a common hereditary bleeding disorder resulting from a deficiency of functional factor IX. The gene of factor IX spans about 33,5 kilobases and is situated on the distal portion of the long arm of X-chromosome at band Xq27.1. The gene is composed of eight exons and seven introns. Around 95% of mutations leading to hemophilia B occur in the 2,2 kilobases of the factor IX gene that included the promotor region, coding sequences, and splice junctions. Most are independent mutations. Point mutations account for about 85% of independent mutations. Deletions, insertions, and more complex gene rearrangements account for the remainder of the molecular mechanisms responsible for hemophilia B. The Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) analysis is a rapid and sensitive technique that can be used to detect single base substituions. Direct Sequencing of amplified genomic DNA defines the location and nature of any mutation and is a necessary final step of any detection method. The SSCP analysis followed by DNA sequencing allows accurated carrier detection and prenatal diagnosis, eliminating the need for informative segregetion of markers. Hemophilia B is a good model for deducing the underlying pattern of spontaneous germ-line mutation in humans. In addition, the study of naturally occurring mutations, combined with the study of genetically engineered mutant recombinant proteins, has yielded a wealth of information regarding structure-function relationships of factor IX. The pattern of mutation is similar among .Caucasians, Asians, and small groups of Blacks and Hispanics. The ethnic origin of Brazilian population is highly. heterogeneous (imigrants from Europe, Africa, Asia and, also, Indigenous) and different from previous populations studied. In order to elucidate the genetic basis of a distinct population and to perform a precise carrier detection, we carried out a study of 29 patients with hemophilia B of Brazilian origino The screening protocol consisted of amplification of coding and promoter regions of factor IX gene by PCR, followed by a radioactive and non-radiactive analysis of single-strand conformation polymorphisms (SSCP) on the PhastSystem Df Pharmacia®. The confirmation of the molecular defect was done by sequencing of the exon with abnormal electrophoretic mobility on SSCP. The results of SSCP revealed abnormal mobility in ali 29 patients and 31 point mutations were determined by direct sequencing of DNA. Twenty-two diferent single base pairs were identified: fifteen in exon 8, three in exon 6, and two in exon 4. Six non previously described point mutation were identified. Three point mutations were found in patient HB31, one of them silent. Haplotype analysis determined that at least twenty-four point mutations could be considered of indenpendent origino Our results shown that this methodology has the potential of detecting ali genetic defects in patients of Brazilian origin with hemophilia B. A large number of recurrent mutations described here is in accordance with data from distinct patients from around world and suggest that the mutation in the factor IX gene is likely the result of endogenous process rather than enviromental mutagens Mestrado Genética Mestre em Ciências Biológicas

Orientadores: Denise Yvonne Janovitz Norato, Carmem Silvia Bertuzzo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas Resumo: A Acidúria Glutárica tipo I (GA I) é um erro inato do metabolismo com herança autossômica recessiva, causado por mutações no gene glutaril-CoA desidrogenase (GCDH), que determina a deficiência da enzima glutaril-CoA desidrogenase, levando a comprometimento neurológico caracterizado por distonia, com início e evolução extremamente variável. Embora sua incidência estimada seja de 1/30.000 nascidos vivos, muitos pacientes permanecem sem diagnóstico pela dificuldade de suspeição e confirmação laboratorial dessa doença. Este estudo tem como objetivo a caracterização clínica e molecular de 14 casos de acidúria glutárica tipo I, seguidos em instituições brasileiras. Foram incluídos pacientes que apresentavam quadro clínico sugestivo de AGI e positividade do exame de espectrometria de massa de ácidos orgânicos urinários e/ou exame de neuroimagem compatível com esse diagnóstico. Para cada paciente foi preenchido o protocolo padronizado de avaliação clínica e obtido o consentimento informado dos responsáveis e em 13, realizado a coleta de sangue para análise molecular. Foram utilizadas as técnicas de SSCP para triagem de mutações nos 11 éxons e o posterior seqüenciamento automático do DNA para caracterização da mutação. As 13 amostras apresentaram diferentes padrões de migração no gel de eletroforese através da técnica de SSCP, sendo confirmado, através do seqüenciamento automático dos éxons alterados, a presença de nove diferentes mutações, duas delas não reportadas previamente, caracterizando a heterogeneidade molecular em nossa amostra Abstract: Glutaric Aciduria I (GA I), is an autossomic recessive inborn error of metabolism due to mutations in the glutaryl-CoA dehydrogenase(GCDH) gene. The glutaryl-CoA desidrogenase deficiency causes neurological impairment with dystonic postures, with extremely varied beginning and evolution. Although the estimated incidence is 1/30.000 newborns, many patients are not diagnosed due to the difficulties in suspecting and confirming this disease. This study aims the clinical and molecular characterization of 14 suspected cases of AGI followed in Brazilian institutions. Patients presenting suggestive clinical picture were included if organic acids mass spectrometry was positive or a brain scan showed compatible images. Blood samples were obtained after applying a standardized clinical evaluation protocol and the informed consent was signed by parents of 13 patients. Mutation screening with SSCP for 11 exons and automatic DNA sequencer were used to detect and characterize mutations. The 13 samples showed different migration patterns in SSCP electrophoresis gel and nine different mutations were confirmed by automatic sequencing, two of them previously unreported, characterizing the molecular heterogeneity of our sample grou Mestrado Genética Médica Mestre em Ciências Médicas

Orientadores : Maria de Fatima Sonati, Monica Barbosa de Melo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas Resumo: Mutações de ponto e pequenas inserções ou deleções nos genes da globina a humana podem produzir variantes estruturais de cadeia a e a-talassemia. As mutações podem ser identificadas tanto pelo sequenciamento total dos genes, como por métodos de triagem, os quais selecionam o exon mutado para, então, ser seqüenciado. Embora sejam pequenos (cerca de 1Kb, com 3 exons e 2 introns), os genes da globina a são duplicados (a2 and a1) e extremamente ricos em ligações G-C, o que torna difícil a desnaturação e reduz a eficiência do sequenciamento, causando freqüentes artefatos e necessidade de repetições. Como o sequenciamento é ainda um método demorado e de custo elevado para muitos laboratórios, nós modificamos algumas condições do Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) com o intuito de otimizar a triagem de mutações nos genes da globina a humana Abstract: Point mutations and small insertions or deletions in the human a-globin genes may produce a-chain structural variants and a-thalassemia. Mutations can be detected either by direct sequencing of the whole gene or by screening methods, which select the mutated exon for sequencing. Although small (around 1 Kb, 3 exons and 2 introns), the a-globin genes are duplicate (a2 and a1) and extremely G-C rich, what makes them difficult to denature and reduces sequencing efficiency, causing frequent artifacts and the need of repetitions. As DNA sequencing is still a time-consuming and expensive method for many laboratories, we modified some conditions of the Single Strand Conformation Polymorphism (SSCP) in order to optimize mutation detection in the a-globin genes Mestrado Ciências Biomédicas Mestre em Ciências Médicas

Orientador: Edi Lucia Sartorato Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A deficiência auditiva é dos defeitos sensoriais o mais comum, afetando cerca de um em cada quinhentos recém-nascidos. Mais de 60% dos casos de perda auditiva congênita são causadas por fatores genéticos. Apesar da grande heterogeneidade da perda auditiva genética, mais de 50% estão associadas a mutações no locus DFNB1 no cromossomo 13q12. Este locus contém os genes GJB2 e GJB6 que codificam as proteínas conexina 26 e 30 respectivamente. A alta prevalência de indivíduos com perda auditiva apresentando mutações recessivas no locus DFNB1 em apenas um alelo tem dificultado o diagnóstico molecular e consequentemente o aconselhamento genético. Portanto, o principal objetivo deste trabalho foi elucidar a causa genética da perda auditiva em quarenta e oito indivíduos monoalélicos para mutações recessivas no gene GJB2 (46) ou no gene GJB6 (2). Prováveis novas deleções no locus DFNB1 foram encontradas em quatro indivíduos heterozigotos para mutações no gene GJB2. Além disso, entre os quarenta e oito indivíduos estudados foram detectadas duas mutações no gene SLC26A4 (p.V609G, p.C282Y) em três deles e ainda, duas mutações no gene CDH23, p.R1746Q e p.R301Q, em dois indivíduos. As mutações, p.V609G, p.C282Y e p.R1746Q, foram encontradas em heterozigose e, portanto, não é possível afirmar que, de fato, essas alterações sejam a causa da surdez. Contudo, a mutação p.R301Q, encontrada em homozigose em um dos pacientes estudados, trata-se de uma mutação missense e poderia explicar o fenótipo. Entre os quarenta e oito indivíduos estudados foram ainda detectadas oito alterações mitocondriais em dezoito casos. Quatro delas podem estar envolvidas com a perda auditiva justificando assim a surdez. Quanto a análise do cluster miR-183, nenhuma mutação patogênica foi encontrada em nenhum dos quinhentos e vinte e um indivíduos analisados, o que corrobora com dados da literatura onde mutações nos microRNAs, miR-96-183-182 não são uma causa comum de surdez. Concluiu-se que, a pesquisa de mutações em outros genes diminui o número de casos com diagnóstico inconclusivo. Entretanto, devido à grande heterogeneidade genética e clínica da perda auditiva muitos permanecem ainda com diagnóstico indefinido Abstract: Hearing impairment is the most common sensory impairment, affecting approximately one in five hundred newborns. More than 60% of the congenital hearing loss cases are caused by genetics factors. Despite the enormous heterogeneity of genetic hearing loss, up to 50% of the cases are associated with mutations in the DFNB1 locus on chromosome 13q12. This locus contains the GJB2 and GJB6 genes, which code for the gap junction (GJ) proteins connexin 26 (Cx26) and connexin 30 (Cx30) respectively. A large number of affected individuals carry only a single identified recessive mutation in locus DFNB1, making the molecular diagnostic and genetic counseling difficult. The aim of this study was to elucidate the genetic cause of hearing loss in forty eight individuals monoallelic for recessive mutations in the GJB2 gene (46) or in GJB6 gene (2). Probable new DFNB1 locus deletions were found in four individuals heterozygous for mutations in GJB2 however. Moreover, among the forty eight heterozygous individuals studied, two mutations were detected in the SLC26A4 gene (p.V609G, p.C282Y) in three of them and two mutations in CDH23 gene (p.R1746Q p.R301Q) were identified in two individuals. Mutations, p.V609G, and p.C282Y p.R1746Q were found in heterozygous and therefore could not be considered the cause of deafness in the patients studied. However, the mutation p.R301Q was present as homozygous in one individual. This alteration is a missense mutation, and may explain the deafness in this patient. Among the forty eight subjects studied, we detected eight mitochondrial alterations in eighteen cases. Four of them may be involved with hearing loss, thus justifying deafness. As the analysis of the miR-183 cluster, no pathogenic mutation was found in any of the five hundred twenty-one individuals analyzed, which agrees with literature data where mutations in microRNAs, miR-96-183-182 are not a common cause of deafness. We conclude that the detection of mutations in other genes reduces the number of cases with inconclusive diagnostic. However, due to high clinical and genetic heterogeneity of hearing loss with many still remains undefined diagnosis Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Hyun Mo Yang, Norberto Anibal Maidana Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Matemática, Estatística e Computação Científica Resumo: Esta tese tem como objetivo abordar, matematicamente, a mutação do vírus da imunodeficiência humana (HIV) por meio de um processo de difusão e advecção. é dividida em três partes: estudo e compreensão do fenômeno biológico; formulação e análise de um primeiro sistema de equações diferenciais ordinárias para estudar o tema e, finalmente, construção e análise de um modelo de equações diferenciais parciais envolvendo a mutação. Os modelos são formulados com base em características biológicas, e procurando, sempre que possível, estabelecer um paralelo entre Biologia e Matemática. Com o modelo de equações diferenciais ordinárias mostrou-se que um sistema imunológico que perde sua capacidade de resposta permite a persistência do vírus HIV no organismo infectado. Também, do modelo com equações diferenciais parciais, concluímos que usar as próprias mutações para combater o vírus pode ser uma alternativa, assim como na idéia de mutagênese letal Abstract: The aim of this thesis is to study mathematically the mutation of the human immunodeficiency virus (HIV) taking into account the process of diffusion and advection. The thesis is divided in three parts: the current understand of the HIV biology; formulation and analysis of a system of ordinary differential equations to understanding the persistent HIV infection; and, finally, construction and analysis of a model of partial differential equations considering the mutation. The models are formulated based on biological characteristics and whenever it is possible, a parallel between biology and mathematics was established. From system of ordinary differential equations, the persistent HIV infection can be explained by exhausting immune system response. From partial differential equations, the main conclusion is that mutations themselves can be used to fight the virus based on the idea of lethal mutagenesis Doutorado Matemática Aplicada Doutor em Matemática Aplicada

Orientador: Liana Maria Cardoso Verinaud Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico que cresce na forma miceliar a temperatura ambiente e na forma de levedura a 35-37ºC. Recentemente, no laboratório de Imunopatologia do Departamento de Microbiologia e Imunologia do Instituto de Biologia da Unicamp, foi observado que uma amostra da cepa virulenta Pb18 crescia de forma diferente das outras. A análise preliminar desta cultura mostrou que o fungo se apresentava, exclusivamente, em formas intermediárias entre levedura e micélio. Assim, este trabalho teve como objetivo a caracterização parcial deste isolado atípico através da comparação com a cepa selvagem. Para tanto, foram analisados: a morfologia do isolado a 25 e 37ºC; a composição de proteínas de parede celular; o desenvolvimento da doença e a resposta imunológica adaptativa em camundongos BALB/c. Os resultados mostraram que este isolado não alterou a sua forma de crescimento, independente da temperatura de cultivo ou da passagem por animal. Através da análise das proteínas de parede celular observou-se ausência de expressão de algumas proteínas e baixa concentração da glicoproteína 43 (gp43) no fungo atípico quando comparado com o selvagem. A infecção causada por este isolado atípico foi mais branda do que aquela observada com a cepa virulenta Pb18, com completa resolução das lesões de disseminação. Entretanto, não foi possível determinar diferenças na avaliação da resposta imune adaptativa dos animais infectados com os diferentes isolados. Apesar da necessidade de mais estudos, estes resultados indicam que o isolado atípico pode vir a ser uma importante ferramenta para o estudo da biologia do fungo e sua relação com o hospedeiro Abstract: P. brasiliensis is a dimorphic fungus that grows in mycelial phase at room temperature and in yeast form at 35-37°C. Recently, in the Immunopathology Laboratory of the Department of Microbiology and Immunology (Biology Institute/Unicamp), it was observed that a sample of the virulent strain Pb18 grew in a different way from other ones. Preliminary analysis of this culture showed that the isolated exhibited, exclusively, an intermediate form of pseudohyphae. That way, the objective of this work was the partial characterization of the atypical isolated (Pb18PH) through the comparison with the wild strain Pb18. For this, there were analyzed: the morphology of the isolated to 25 and 37ºC; the composition of cell wall proteins; the disease development and the adaptative immune response in BALB/c mice. The results showed that Pb18PH didn't alter their growth form, independently of the cultivation temperature or the passage through animal. By the analysis of the cell wall proteins, it was observed that Pb18PH didn't express some proteins and presented low concentration of the glicoprotein 43 (gp43) when compared with the wild one. The infection caused by this atypical isolated was softer than that observed with the virulent strain Pb18. Besides, it was noted the complete resolution of disseminated lesions. However, it was not possible to determine differences in the adaptative immune response evaluation of the animais infected with the different isolated. To despite the need of more studies about this atypical isolated, our results indicate that Pb18PH would come to be an important tool for the study of the fungus biology and their relationship with the host Doutorado Imunologia Doutor em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Marcos Antônio Machado, Alessandra Alves de Souza O último capítulo está em inglês Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Xylella fastidiosa é o agente causal da clorose variegada dos citros (CVC), da doença de Pierce em videiras e doenças em muitas outras culturas. Com o seqüenciamento completo do genoma de várias linhagens deste organismo, a função de cada gene , principalmente os ligados à virulência ainda estão pouco caracterizados. A fixação da X. fastidiosa nos vasos do xilema e no canal alimentar dos insetos vetores, cigarrinhas, é necessária para a virulência, formação de biofilme e transmissão desta bactéria. Uma vez que o gene pilC esta envolvido na formação do pili tipo IV e este por sua vez é importante na motilidade e formação do biofilme, neste presente trabalho é mostrado dados fenotípicos obtidos com a interrupção de pilC na linhagem J1a12 de X. fastidiosa. A interrupção do gene pilC na linhagem J1a12 foi obtida por recombinação homóloga utilizando o plasmídeo pUCBM21oriC. Reação de polimerase em cadeia (PCR) e análises por Southern blot dos mutantes indicaram que o gene cromossômico foi substituido pelo gene truncado e com isso a produção da proteína correspondente, PilC, não foi indicada pelo Westen blot. Microscopia eletrônica de varredura transmissão revelou que o tamanho e o número das fímbrias foi reduzido para os mutantes de pilC de X. fastidiosa. Esses mutantes não mostraram capacidade de colonização das regiões acima do ponto de inoculação dos vasos do xilema da planta de laranja Pêra e, além disso, não apresentaram formação de biofilme. No estudo da formação do biofilme, a caracterização da expressão de proteínas foi realizada através do uso da eletroforese de primeira e segunda dimensão e a espectrometria de massa encontramos um total de 456 proteínas expressas na condição de biofilme maduro e 387 proteínas no crescimento planctônico, sendo que, o biofilme apresentou 37% (ou 144 proteínas) diferencialmente expressas em relação ao crescimento planctônico. As alterações encontradas no estado fisiológico das células em biofilme podem ser explicadas pela diferença no padrão de proteínas encontrado. Essas proteínas são produtos correspondentes à 31 genes presentes no biofilme maduro da linhagem isolada de citros 9a5c, esses foram envolvidos na adaptação, no metabolismo e na adesão dessa bactéria. Foi observado superexpressão de genes relacionados ao quorum sensing, comprovando a existência da comunicação entre células e com isso, o desenvolvimento da estruturação do biofilme (biofilme maduro) levando à obstrução dos vasos e desenvolvimento da doença Abstract: Xylella fastidiosa is the causal agent of citrus variegated chlorosis (CVC), Pierce's disease in grapevines and other diseases in many crops. With the full genome sequencing of several strains of this organism, the function of each gene, particularly those related to virulence are still poorly characterized. The setting of X. fastidiosa in xylem vessels and the alimentary canal of insects, leafhoppers, is required for virulence, biofilm formation and transmission of this bacterium. Once the gene is involved in the formation pilC of type IV pili and this in turn is important in motility and biofilm formation, this work is shown in this phenotypic data obtained with the interruption in the strain of pilC J1a12 X. fastidiosa. The interruption of the gene pilC in the strain J1a12 was obtained by homologous recombination using the plasmid pUCBM21oriC. Polymerase chain reaction (PCR) and Southern blot analysis of mutants indicated that the chromosomal gene was replaced by the truncated gene and thereby producing the corresponding protein, PilC was not indicated by Western blot. Scanning transmission electron microscopy revealed that the size and number of fimbriae was reduced for the mutants of pilC X. fastidiosa. These mutants showed no ability to colonize the region above the inoculation of the plant xylem vessels of Pera and, moreover, did not show biofilm formation. In the study of biofilm formation, the characterization of protein expression was performed by using electrophoresis of first and second dimension and mass spectrometry we found a total of 456 proteins expressed in condition of mature biofilm and 387 proteins in planktonic growth, and , the biofilm showed 37% (or 144 proteins) differentially expressed in relation to planktonic cells. The changes found in the physiological state of cells in biofilm can be explained by the difference in the pattern of proteins found. These proteins are products corresponding to 31 genes present in the mature biofilm of strain isolated from citrus 9a5c, they were involved in the adaptation, metabolism and adhesion of bacteria. We observed overexpression of genes related to quorum sensing, proving the existence of communication between cells and thus, the development of the biofilm structure (mature biofilm) leading to obstruction of vessels and development of disease Doutorado Bioquímica Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Orientador: Edi Lucia Sartorato Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: Mutações no gene GJB2 (Cx26) são as causas mais comuns de perda auditiva não-sindrômica autossômica recessiva. Contudo, 10 a 40% dos casos com mutações no gene da Cx26 são detectadas em apenas um dos alelos, causando um problema no diagnóstico molecular. Estes achados podem ser atribuídos à existência de mutações em regiões não codificantes do gene ou mutações em outros genes cujos produtos protéicos estão envolvidos em interações com a Cx26. O principal objetivo deste trabalho foi esclarecer a causa genética da perda auditiva de 45 pacientes com surdez sensorioneural não-sindrômica monoalélicos para mutações patogênicas na região codificante do gene GJB2. Mutações incluindo deleções e duplicações nos genes GJB2, GJB3 e GJB6 foram investigadas nesses pacientes. A mutação IVS1+ lG>A no sítio de splice na região não codificante do gene GJB2, que pode contribuir para o fenótipo de surdez, foi também investigada em todos os 45 pacientes. A fim de avaliar a freqüência da mutação IVS1+1G>A em pacientes brasileiros foram analisados 142 pacientes com perda auditiva sensorioneural não-sindrômica que não apresentavam nenhuma mutação patogência na região codificante do gene GJB2. Além disso, o método de MLP A (Multiplex Ligationdependent Probe Amplification) foi utilizado neste estudo para avaliar sua eficiência em detectar deleções e duplicações em genes envolvidos na perda auditiva. Analisando todos os pacientes, dez diferentes mutações no gene GJB2 e uma deleção no gene GJB6 foram encontradas.. Esses achados explicaram a perda auditiva de aproximadamente 27% dos pacientes monoalélicos para mutações no gene GJB2. A mutação IVSl+IG>A foi encontrada em dois pacientes monoalélicos. Essa alteração não foi encontrada nos pacientes sem mutações na região codificante do gene GJB2. Essa mutação parece ser rara entre pacientes surdos brasileiros. Na região promotora do gene, em um paciente, uma deleção foi encontrada e no outro uma duplicação foi observada por meio do método de MLP A. Essas possíveis alterações na região não codificante do gene ainda não foram descritas. Outras análises moleculares e estudos funcionais são necessários para confirmar uma possível associação desses achados com a perda auditiva. A técnica de MLP A se mostrou eficiente para detectar deleções e duplicações no genoma. Portanto, demonstramos no presente estudo que essa técnica pode contribuir para explicar a surdez em pacientes monoalélicos. Abstract: Mutations in the GJB2 gene (Cx26) are the most common cause of autosomal recessive nonsyndromic hearing loss. However, in 10 to 40% of these cases, mutations in Cx26 gene are detected in on1y one allele which causes a problem in molecular diagnostico These findings could be attributed to the existence of mutations in non-coding regions of the gene or mutations in other genes of which protein products are involved in interaction with Cx26. The aim of this study was to clarifying the genetic cause of the hearing loss of 45 patients with non-syndromic sensorioneural deafness, monoallelics for pathogenic mutations in the coding region of the GJB2 gene. Mutations including deletions and duplications in the GJB2, GJB3 and GJB6 genes were investigated in these patients. 'The IVSl+ 1G>A splice site mutation in the non-coding region of the GJB2 gene which can contribute to the deafuess phenotype was also investigated in all 45 patients. In order to evaluate the frequency of the IVSl+ 1G>A mutation were tested 142 Brazilian patients with non-syndromic sensorineural hearing loss without any pathogenic mutation ín the GJB2 coding region. Furthermore, the MLP A method (Multiplex Ligation-dependent Probe Amplification) was used to evaluate its usefulness in detecting deletions/duplications in genes involved in hearing loss. Ten different mutations in the GJB2 gene and one deletion in the GJB6 gene were found. These findings eXplained the hearing loss about 27% ofGJB2 monoallelic patients. The IVSl+ 1G>A mutation was found in two monoallelics patients. This alteration was not found in patients without mutations in the GJB2 coding region. This mutation seems to be rare in deaf Brazilian patients. One patient a deletion was found in the promoter region of GJB2 gene and in another patients a duplication was observed by the MLP A method. These possible alterations were not described in noncoding region of GJB2 gene yet. Additional molecular and functional studies are needed to assess a possible association of these findings with hearing loss. MLP A proved to be a highly accurate method to detected deletions and duplications in the genome. Therefore, we have shown in the present study that this technique can explain the deafness in monoallelics patients. Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Mônica Barbosa de Melo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O glaucoma é a principal causa de cegueira irreversível, afetando mais de 60 milhões de pessoas e com perspectiva de atingir 76 milhões em 2020. O glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA) é a forma mais comum da doença, com padrão de herança complexo e que se caracteriza como uma neuropatia ótica crescente causando a perda de células ganglionares da retina. O principal fator de risco é a pressão intraocular elevada, além do histórico familiar positivo, idade avançada e etnia negra. Vários loci já foram associados ao GPAA, e o mais reprodutível e representativo é o locus GLC1A no gene MYOC. A mutação Cys433Arg no gene MYOC foi observada apenas na população brasileira e os poucos estudos sobre essa mutação revelam uma alta penetrância em portadores de GPAA juvenil (GPAA-J), variando de 28 a 100%, de acordo com a idade do paciente. Estudos do tipo caso/controle apontam que aproximadamente 40% dos pacientes com GPAA-J portadores de alterações no gene MYOC apresentam a mutação Cys433Arg. O objetivo desse estudo foi estimar a idade da mutação Cys433Arg comparando indivíduos afetados pelo GPAA-J e não afetados pela doença através do sequenciamento de Sanger para SNPs e eletroforese automatizada para microssatélites, determinar os haplótipos e estimar a idade pelo software DMLE+, o qual por meio de desequilíbrio de ligação consegue calcular a idade da mutação em gerações. De acordo com este estudo pode-se sugerir que essa mutação tenha chegado ao Brasil através dos colonizadores europeus e aumentaram de frequência nos casos de GPAA-J atingindo cerca de 40% dos casos no país Abstract: Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness, affecting more than 60 million people and projected to reach 76 million by 2020. Primary open-angle glaucoma (POAG) is the most common form of the disease, with a complex inheritance pattern, which is characterized as a growing optic neuropathy causing the loss of retinal ganglion cells. The main risk factor is elevated intraocular pressure (IOP), in addition to positive family history, advanced age and black ethnicity. Several loci have already been associated with POAG, and the most reproducible and representative is the GLC1A locus in the MYOC gene. The Cys433Arg mutation in the MYOC gene was observed only in the Brazilian population, and the few studies on this mutation reveal a high penetrance in patients with juvenile POAG, ranging from 28 to 100% depending on the age of the patient. Case-control studies report that approximately 40% of the patients that harbor mutations in the MYOC gene have the Cys433Arg mutation. The aim of this study was to estimate the age of the Cys433Arg mutation in individuals affected by the J-POAG and unaffected by the disease through Sanger sequencing for SNPs and automatic electrophoresis for microsatellites, to determine the haplotypes and to estimate the age by the DMLE+ software, which through linkage disequilibrium can calculate the age of the mutation in generations. According to this study it can be suggested that this mutation has reached Brazil through the European colonizers and increased frequency in the cases of J-POAG reaching about 40% of the cases in the country Mestrado Genética Animal e Evolução Mestra em Genética e Biologia Molecular CAPES

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Monica Barbosa de Melo, Fernanda Caroline Soardi Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O gene PAX6 é o principal gene para o controle da organização do sistema ocular durante a embriogênese. Este gene pertence a uma família de reguladores de transcrição denominada PAX, sendo que seus membros compartilham um domínio funcional de 128 aminoácidos chamado de paired domain. O PAX6 é o mais bem estudado dessa família. O gene PAX6 está localizado na banda 13 do braço curto do cormossomo11 em humanos, e apresenta 14 exons sendo que os três primeiros e parte do quarto exon não são traduzidos. A proteína do PAX6 possui dois domínios funcionais: o paired domain e o homeo domain, que são separados por um segmento de ligação denominado LNK e seguidos por uma região com importante função na ativação transcricional denominada PST. A proteína do gene PAX6 é um fator de regulação transcricional altamente conservado com funções importantes para o desenvolvimento normal dos olhos e do sistema nervoso. Alterações no gene PAX6 em humanos foram associadas ao fenótipo de aniridia, da síndrome de Morning Glory (MGS) e também de doenças associadas ao desenvolvimento ocular. A aniridia é um defeito congênito raro, a qual provoca uma formação incompleta ou a ausência da íris. Embora seus efeitos variem entre os indivíduos, pode causar perda de visão. A doença pode ser de herança autossômica dominante ou de manifestação esporádica. MGS é uma anomalia congênita do nervo óptico, comumente unilateral, podendo encontrar-se associada estrabismo, ambliopia e nistagmo. Freqüentemente essa síndrome pode encontrar-se associada a anomalias endócrinas, renais e do sistema nervoso central. Sendo assim, o projeto teve por objetivos a análise molecular do gene PAX6 através de seqüenciamento e da técnica de MLPA em pacientes com aniridia e pacientes portadores da síndrome de MGS, a fim de se detectar mutações e/ou polimorfismos que pudessem estar ligados ao quadro clínico dos indivíduos. A casuística do projeto foi de três famílias com segregação aniridia, um indivíduo esporádico com aniridia e quatro indivíduos portadores da síndrome de Morning Glory. O grupo controle consistiu de 50 indivíduos triados como não tendo alterações oftalmológicas. Foi encontrada uma mutação p.R240X no gene PAX6, que causa uma troca de uma arginina por um stop codon, segregando nos indivíduos afetados da Família 1 e assim explicando o fenótipo dos indivíduos. Essa mutação é a mais freqüente associada à aniridia, porém é a primeira vez que ela foi descrita na população brasileira. Também foram encontradas diversas alterações descritas e não descritas que necessitam de mais estudos para que possam ser associadas à manifestação do fenótipo dos indivíduos afetados. Além disso, foi observada pela técnica de MLPA, uma possível micro-deleção ou alteração nucleotídica no exon 1 do gene RCN1 encontrada nos filhos das Famílias 1 e 3 podendo estar envolvida na regulação 5' do gene PAX6. Outra possível micro-deleção ou alteração nucleotídica foi também observada no exon 9 do gene ELP4, que pode estar associada a regulação 3' do gene PAX6. Esse estudo demonstrou que para a etiologia de aniridia e síndrome Morning Glory devem existir outros genes cuja expressão possa estar alterada durante o desenvolvimento. Abstract: PAX6 gene is the major gene in the control of eye organization during development. It belongs to a family of transcription regulators called PAX, formed by several members which share a 128 aminoacid functional domain called paired domain. PAX6 is best studied within this family. In humans, it is located on chromosome 11p13 and is formed by 14 exons; the first three and part of the fourth are not translated. PAX6 protein comprises two functional domains: the paired domain and the homeo domain which are separated by a linker called LNK and followed by an important region with trancriptional activity called PST. The PAX6 protein is a highly conserved transcriptional regulator factor that is important for normal ocular and neural development. Mutations on human PAX6 gene were associated to aniridia, Morning Glory Syndrome and other ocular diseases. Aniridia is rare birth defect which leads to an incomplete formation or the absence of the iris. Although their effects vary between individual, aniridia can cause loss of vision. The disease may be autosomal dominant or sporadic event. The Morning Glory Syndrome (MGS) is a congenital optic disk dysplasia, generally unilateral, which can be associated with strabismus, amblyopia and nystagmus. This syndrome may be often associated with endocrine, renal and central nervous system abnormalities. Thus the aim of this investigation was to evaluate the molecular composition of PAX6 gene using direct sequencing and MLPA technique in patients with Aniridia and Morning Glory Syndrome, to detect mutations and/or polymorphisms associated with the patient's phenotypes. Were included in the study 1 family with segregation of aniridia, 1 family with Axenfeld-Rieger Syndrome, 1 sporadic individual with aniridia and 4 individuals carrying MGS. The control group comprised 50 individuals considered ophthalmologically normal. The nonsense mutation p.R240X was found in the PAX6 gene, segregating with the affected members in family 1, what explains their phenotypes. This mutation is one of the most frequent nonsense mutations associated with the aniridia, however this is the first report on a PAX6 gene mutation familial case of aniridia in Brazil. Several described and non-described nucleotide variations were found, but additional studies are required to correlate them to the phenotype of affected individuals. Furthermore, the MLPA technique showed possible micro-deletions or mutations in exon 1 of RCN1 gene, located 5' to PAX6. This result was observed in both male children of families 1 and 3. Other possible micro-deletion or mutation was observed in exon 9 of ELP4 gene, which can be associated to 3' regulation of PAX6 gene. This study demonstrated that the involvement of other gene whose expressions may be altered during the development cannot be excluded for the etiology of aniridia and Morning Glory Syndrome. Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientadores: Maricilda Palandi de Mello, Celso Eduardo Benedetti, Fernanda Caroline Soardi Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A expressão do gene SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) é responsável por desencadear a determinação testicular durante o desenvolvimento embrionário, a partir das gônadas ainda indiferenciadas. Mutações nesse gene são encontradas em muitos casos de anomalias do desenvolvimento gonadal. O projeto teve por objetivo principal a análise funcional do efeito de uma mutação na região promotora do gene SRY, sendo que essa mutação consiste em uma deleção de 3 pares de base em um dos sítios consenso de ligação do fator de transcrição Sp1 ao promotor do gene. O portador dessa mutação é um indivíduo com disgenesia gonadal pura 46,XY, sendo que outros membros da família apresentavam ambiguidade genital e o pai, também portador da mutação, possuía grave hipospadia ao nascimento. Para tentar esclarecer os efeitos desta mutação nos mecanismos moleculares de regulação da expressão do gene SRY, este trabalho primeiramente analisou a interação da proteína Sp1 com os sítios localizados na região promotora de SRY e o efeito da mutação nesta interação, através de ensaios de EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Concluiu-se que os sítios Sp1A e Sp1B se ligam a duas moléculas de Sp1 e que a mutação no Sp1A praticamente abole esta ligação. Possivelmente a ausência dessa ligação impediu a formação de um complexo de transcrição, causando uma diminuição na expressão do gene SRY e levando à ausência de formação dos testículos e reversão sexual completa na paciente. Complementando, foi analisado o efeito dessa mutação na expressão através de ensaio de expressão com gene repórter, no qual o promotor normal se mostrou em média duas vezes mais eficiente na ativação da expressão da luciferase que o promotor mutante. Entretanto, mais experimentos de transfecção, inclusive com outras linhagens celulares, devem ser realizados para confirmação desse resultado. Além disso, foi analisado o efeito de uma nova mutação (localizada na região codificante do gene SRY) na ligação da proteína SRY com o DNA, através de ensaios de EMSA. Concluiu-se que a mutação E89K, associada com disgenesia gonadal pura 46,XY, reduziu em alto nível a atividade de ligação in vitro da proteína SRY mutante ao DNA, o que representa um forte indício de que atividade reduzida da proteína mutante não foi suficiente para desencadear o processo de determinação testicular. Paralelamente, foi feito o rastreamento de mutações no gene SRY e sua região promotora em novos casos de disgenesia gonadal, não tendo sido encontradas, porém, alterações nos pacientes analisados Abstract: The SRY (Sex Determining Region in chromosome Y) gene expression is responsible for testicular determination during embrionary development. Mutations in SRY are found in many cases of anomalies of gonadal development. This project analyzed the functional effect of a mutation in SRY promoter region; the mutation is a 3-bp deletion in a consensus binding site for Sp1 transcription factor. The patient presented 46,XY pure gonadal dysgenesis, and a family history of relatives with different levels of genital ambiguity. Her father shares the same mutation in the SRY promoter region. In order to investigate the effects of the mutation upon the molecular mechanisms that regulate SRY gene expression, the interaction of the Sp1 transcription factor with normal and mutant binding sites was analyzed by EMSA (Electrophoretic Mobility Shift Assay). Each of Sp1A and Sp1B normal sites binds to a single Sp1 molecule, whereas the 3-bp deletion in Sp1A abolishs the binding to this site. Probably, the lack of Sp1 binding to the Sp1A site prevented the formation of a stable transcription complex, reducing the level of SRY expression and leading to the absence of testicles and complete sex reversal in the patient. Parallely, the effect of the mutation was analyzed by a reporter gene assay, indicating that the normal promoter is almost two times more efficient than the mutant promoter in the activation of luciferase gene expression using HeLa cells. However, further transfection experiments with other cell lineages must be performed to confirm this result. In addition, the effect of a new mutation (E89K, located in the SRY gene coding region) was analyzed by testing the ability of the SRY mutant protein to bind its DNA consensus sequence. EMSA assays revealed that the E89K mutation, which is associated with 46,XY pure gonadal dysgenesis, strongtly reduced the SRY protein binding activity in vitro. This result is a strong evidence that the reduced activity of SRY mutant protein was not sufficient to trigger the testicular determination in the patient, leading to the pure gonadal dysgenesis phenotype. Screening of mutations in the SRY gene coding and promoter regions was also performed in six diferent patients with 46,XY gonadal dysgenesis. However, other mutations have not been identified Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Mônica Barbosa de Melo Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A catarata congênita é a principal causa de cegueira reversível na infância, com prevalência de um a cinco casos por 10.000 nascidos vivos. A forma hereditária corresponde a cerca de 50% desses casos, sendo a herança autossômica dominante a mais frequente. As alterações gênicas responsáveis pela catarata congênita não-sindrômica levam a mudanças nas proteínas do cristalino, tais como cristalinas, proteínas de transporte de membrana (dentre as quais as conexinas) e do citoesqueleto, além de alterações nos genes relacionados ao desenvolvimento ocular (dentre os quais o HSF4). As cataratas nuclear e lamelar são duas das formas mais comuns das opacidades congênitas, e alterações nos genes CX46 e CX50, que codificam as proteínas conexinas, têm sido relacionadas ao fenótipo nuclear, enquanto alterações no gene HSF4 têm sido associadas ao fenótipo lamelar. O objetivo do presente estudo foi avaliar mutações presentes nos genes CX46, CX50 e HSF4 em famílias brasileiras portadoras de catarata congênita bilateral nuclear ou lamelar, anteriormente investigadas para os genes CRYAA, CRYGC e GRYGD. O exame oftalmológico e a análise molecular foram realizados em 78 indivíduos pertencentes a onze famílias atendidas no ambulatório de catarata congênita do Hospital de Clinicas da Universidade Estadual de Campinas (UNICAMP). As regiões codificadores e fronteiras intron/exon foram avaliadas por meio da Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) e sequenciamento direto. Foram identificadas 19 alterações nos três genes estudados, cinco das quais inéditas. As mutações P59L no gene CX46 e W45L, D47H e P280R no gene CX50 mostraram-se potencialmente deletérias para a função da proteína, além de segregarem com a doença nas famílias 1 (D47H), 3 (P59L), 8 (P280R), 9 (W45L) e 11 (D47H). Dessa forma, das onze famílias estudadas, foi possível identificar quatro mutações provavelmente responsáveis pela etiologia da catarata congênita em cinco famílias, todas nos genes das conexinas, demonstrando a importância dessas proteínas na manutenção da transparência do cristalino. As mutações identificadas nas conexinas 46 e 50 podem explicar 45,45% da catarata congênita hereditária dos fenótipos nuclear e lamelar nesta amostra da população do sudeste brasileiro Abstract: Congenital cataract is the leading cause of reversible blindness in childhood, with a prevalence of one to five cases per 10.000 live births. The hereditary form corresponds to about 50% of these cases, and the autosomal dominant inheritance is the most frequent. The genetic alterations responsible for non-syndromic congenital cataracts lead to changes in lens proteins, such as crystallins, membrane transport proteins, like connexins, and cytoskeletal proteins, besides alterations in genes related to ocular development (for example, HSF4). Nuclear and lamellar cataracts are two of the most common forms of congenital opacities, and alterations in the CX46 and CX50 genes, that encode connexin proteins, have been related to the nuclear phenotype, while alterations in the HSF4 gene have been associated with the lamellar phenotype. The present study aimed to determine mutations in the CX46, CX50 and HSF4 genes in Brazilian families with nuclear and lamellar bilateral congenital cataracts, previously investigated for the CRYAA, CRYGC and CRYGD genes. The ophthalmological examination and the molecular analysis were performed in 78 individuals belonging to eleven families followed in the congenital cataract ambulatory of the Clinical Hospital, University of Campinas (UNICAMP). The coding regions and the intron/exon boundaries were evaluated through Polymerase Chain Reaction (PCR) and direct sequencing. Nineteen alterations were identified in the three evaluated genes, five of those being novel. The P59L mutation in the CX46 gene and the W45L, D47H and P280R mutations in the CX50 gene were predicted to be probably damaging to the protein function, and segregated with the disease in families 1 (D47H), 3 (P59L), 8 (P280R), 9 (W45L) and 11 (D47H). Thus, it was possible to identify four probably causal mutations in five of the eleven families studied, all of them in the connexin genes, demonstrating the importance of these proteins in maintaining the transparency of the lens. The mutations identified in the connexin 46 and 50 can explain 45,45% of the hereditary nuclear and lamellar congenital cataract in this sample of the population from the southeastern Brazil Mestrado Genética Animal e Evolução Mestra em Genética e Biologia Molecular FAPESP 2013/05316-6

Agradecimentos: This work was partly funded by the Brazilian agencies CNPq, Grants No. 301082/2019-7 (M.A.M.A.) and No. 132438/2017-8 (G.D.F.); FAPESP, Grants No. 2016/01343-7, No. 2019/20271-5 (M.A.M.A.), and No. 2020/13957-5 (G.D.F.); and Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior–Brasil (CAPES)–Finance Code 001 Abstract: Mutation and drift play opposite roles in genetics. While mutation creates diversity, drift can cause gene variants to disappear, especially when they are rare. In the absence of natural selection and migration, the balance between the drift and mutation in a well-mixed population defines its diversity. The Moran model captures the effects of these two evolutionary forces and has a counterpart in social dynamics, known as the voter model with external opinion influencers. Two extreme outcomes of the voter model dynamics are consensus and coexistence of opinions, which correspond to low and high diversity in the Moran model. Here we use a Shannon's information-theoretic approach to characterize the smooth transition between the states of consensus and coexistence of opinions in the voter model. Mapping the Moran into the voter model, we extend the results to the mutation-drift balance and characterize the transition between low and high diversity in finite populations. Describing the population as a network of connected individuals, we show that the transition between the two regimes depends on the network topology of the population and on the possible asymmetries in the mutation rates CONSELHO NACIONAL DE DESENVOLVIMENTO CIENTÍFICO E TECNOLÓGICO - CNPQ FUNDAÇÃO DE AMPARO À PESQUISA DO ESTADO DE SÃO PAULO - FAPESP COORDENAÇÃO DE APERFEIÇOAMENTO DE PESSOAL DE NÍVEL SUPERIOR - CAPES Fechado

Epilepsy is a disease characterized by abnormal brain activity and a predisposition to generate epileptic seizures, leading to neurobiological, cognitive, psychological, social, and economic impacts for the patient. There are several known causes for epilepsy; one of them is the malfunction of ion channels, resulting from mutations. Voltage-gated sodium channels (NaV) play an essential role in the generation and propagation of action potential, and malfunction caused by mutations can induce irregular neuronal activity. That said, several genetic variations in NaV channels have been described and associated with epilepsy. These mutations can affect channel kinetics, modifying channel activation, inactivation, recovery from inactivation, and/or the current window. Among the NaV subtypes related to epilepsy, NaV1.1 is doubtless the most relevant, with more than 1500 mutations described. Truncation and missense mutations are the most observed alterations. In addition, several studies have already related mutated NaV channels with the electrophysiological functioning of the channel, aiming to correlate with the epilepsy phenotype. The present review provides an overview of studies on epilepsy-associated mutated human NaV1.1, NaV1.2, NaV1.3, NaV1.6, and NaV1.7.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico O gênero Begomovirus é constituído por vírus com DNA de fita simples circular, transmitidos por moscas-brancas para plantas dicotiledôneas. A maioria dos begomovírus do Novo Mundo (NM) possuem dois componentes de DNA e compartilham uma região comum (RC) que contém a origem de replicação reconhecida pela proteína viral Rep para iniciar a replicação. Infecções mistas naturais com dois ou mais begomovírus são comuns em tomateiro. Estudos anteriores demonstraram que a interação entre os begomovírus Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) e Tomato severe rugose virus (ToSRV) é complexa, com o ToRMV interferindo negativamente na infectividade e no acúmulo de ToSRV. Interessantemente, o ToRMV é de ocorrência esporádica no campo, ao contrário de ToSRV, que predomina no tomateiro no sudeste do Brasil. Além do efeito que um begomovírus pode exercer sobre o outro em um mesmo hospedeiro, begomovírus do NM podem ser encontrados também em plantas não- cultivadas em associação com alfassatélites, os quais dependem do begomovírus auxiliar para causar infecção sistêmica. O impacto de uma possível interação entre alfassatélites e begomovírus em plantas cultivadas como o tomateiro é desconhecido. A tese teve como objetivos: i) verificar a eficiência de transmissão de ToSRV e ToRMV por B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (BtMEAM1) e Mediterranean (BtMED) em infecções simples e mistas; ii) investigar se sítios divergentes na RC e na Rep desses begomovírus estão envolvidos na interferência negativa que o ToRMV exerce sobre a replicação do ToSRV; iii) verificar se o alfassatélite Euphorbia yellow mosaic alphasatellite (EuYMA) é capaz de interagir com dois begomovírus que infectam tomateiro, Tomato yellow spot virus (ToYSV) e ToSRV. Para o primeiro objetivo, ao qual corresponde o primeiro capítulo, plantas inoculadas por biobalística com cada vírus em infecções simples e mista foram utilizadas como fonte de inóculo. O ToSRV foi transmitido com a mesma eficiência em relação ao ToRMV por BtMEAM1 e em maiores taxas por BtMED em infecção simples. Entretanto, o ToRMV foi transmitido mais eficientemente do que o ToSRV em infecções mistas, sugerindo que a transmissão preferencial de ToRMV em relação a ToSRV pode estar relacionada à replicação. Para o segundo objetivo, correspondente ao segundo capítulo, mutantes do DNA-A do ToSRV contendo os mesmos nucleotídeos nas posições divergentes da RC e da IRD (domínio relacionado ao reconhecimento de iterons) da Rep que ocorrem no ToRMV foram construídos. Em inoculações mistas com o ToRMV, foi observado um acúmulo elevado do DNA-A de ToSRV contendo as mutações na RC (em relação ao ToSRV selvagem), sugerindo que nucleotídeos específicos da RC servem como sítios de reconhecimento para ligação da Rep, aumentando a taxa de replicação e o acúmulo de DNA viral. Para o terceiro objetivo, correspondente ao terceiro capítulo, plantas de tomateiro e Nicotiana benthamiana foram inoculadas por biobalística com ToYSV e ToSRV na presença ou ausência do alfassatélite. A interação dos dois begomovírus com o EuYMA foi demonstrada, e apresentou a maior severidade de sintomas. A associação de EuYMA com o ToYSV foi menos eficiente em tomateiro do que em N. benthamiana, no entanto, entre ToSRV e EuYMA foi similar em ambos os hospedeiros, indicando diferenças na interação entre alfassatélites e diferentes espécies de begomovírus. Os resultados deste estudo fornecem novas informações que aumentam o entendimento das interações entre vírus, DNAs satélites, vetor e hospedeiro que contribuem para a adaptação e predominância dos begomovírus no campo. The genus Begomovirus includes viruses with circular single-stranded DNA, transmitted by whiteflies to dicotyledonous plants. Most New World (NW) begomoviruses have two genomic components that share a common region (CR), which contains the origin of replication recognized by the viral protein Rep to initiate replication. Natural mixed infections with two or more begomoviruses in tomato are common in the field. Previous work demonstrated that the interaction between two begomoviruses, Tomato rugose mosaic virus (ToRMV) and Tomato severe rugose virus (ToSRV), is complex, with ToRMV negatively interfering in the infectivity and accumulation of ToSRV. Interestingly, ToRMV is not widely disseminated in the field, unlike ToSRV, which predominates in tomato fields in southeastern Brazil. In addition to the effect that one begomovirus can exert on the other in the same host, NW begomoviruses have also been found in non-cultivated plants in association with alphasatellites, which depend on the helper begomovirus to cause systemic infection. The impact of a possible interaction between alphasatellites with begomoviruses in cultivated hosts such as tomato is unknown. The objectives of this thesis included: i) to verify the transmission efficiency of ToSRV and ToRMV by B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (BtMEAM1) and Mediterranean (BtMED) in single and mixed infections; ii) to investigate if divergent sites in the CR and Rep of these begomoviruses are involved in the negative interference that ToRMV exerts on the replication of ToSRV; iii) to verify if the alphasatellite Euphorbia yellow mosaic alphasatellite (EuYMA) is capable of interacting with two tomato-infecting begomoviruses, Tomato yellow spot virus (ToYSV) and ToSRV. For the first objective, corresponding to the first chapter, plants that were biolistically inoculated with each virus in single and mixed infections were used as inoculum sources. ToSRV was transmitted with the same efficiency in relation to ToRMV by BtMEAM1 and at higher rates by BtMED in single infections. However, ToRMV was transmitted more efficiently than ToSRV in mixed infections, suggesting that this preferential transmission of ToRMV over ToSRV may be related to replication. For the second objective, corresponding to the second chapter, ToSRV DNA-A mutants containing the same nucleotides of ToRMV DNA-A at the divergent positions in the CR and within the IRD (iteron-related domain) of the Rep gene were constructed. In mixed inoculation with ToRMV, high accumulation of ToSRV DNA-A containing mutations in the CR was observed (as compared to wild-type ToSRV), suggesting that the mutated CR sites serve as specific recognition sites for Rep binding, increasing viral replication and viral DNA accumulation. For the third objective, corresponding to the third chapter, tomato and Nicotiana benthamiana plants were biolistically inoculated with ToYSV and ToSRV in the presence or absence of the alphasatellite. Interaction of the two begomoviruses with EuYMA was demonstrated, and shown to be associated the increased symptom severity. The association of EuYMA with ToYSV was less efficient in tomato than in N. benthamiana, while that between ToSRV and EuYMA was similar in both hosts, indicating differences in the interaction between the alphasatellite and different tomato- infecting begomoviruses., The results of this study provide new information that increases the understanding of virus, DNA satellite, vector and host interactions that contribute to the adaptation and predominance of begomoviruses in the field.

Introdução: No mundo foram diagnosticados em 2014, 256.000 novos casos de tumores do Sistema Nervoso Central (SNC) e no Brasil, estima-se 11.320 novos casos em 2018. Os gliomas correspondem a 20% dos casos e a 80% dos tumores malignos. Mutações no gene da Isocitrato Desidrogenase 1(IDH1) estão presentes em mais de 80% dos oligodendrogliomas e oligoastrocitomas graus II, III e glioblastomas secundários e conferem maior sobrevida global aos pacientes. A radioterapia desempenha um papel fundamental no tratamento dos gliomas e as evidências sugerem que os pacientes mutados têm um aumento na sensibilidade a radioterapia. Metodologia: O estudo avaliou 20 pacientes com diagnóstico de glioma difuso submetidos a radioterapia no Hospital de Clínicas da Universidade Federal de Uberlândia entre os anos de 2005 a 2016. Blocos de histologia com tecido tumoral dos pacientes foram submetidos a técnica de TMA, seguida de coloração HE para confirmação histologica e exame de imuno-histoquimica para observação do status da mutação IDH1. Estatisticamente, foi utilizado um nível de significância de 5% (p

Submitted by Boris Flegr (boris@uerj.br) on 2021-01-05T19:42:58Z No. of bitstreams: 1 Carolina de Andrade Leite Dissertacao completa.pdf: 7604736 bytes, checksum: ac99efcafda7993a253399441f310848 (MD5) Made available in DSpace on 2021-01-05T19:42:58Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Carolina de Andrade Leite Dissertacao completa.pdf: 7604736 bytes, checksum: ac99efcafda7993a253399441f310848 (MD5) Previous issue date: 2018-07-18 RESUMO Myelodysplastic syndrome (MDS) is a heterogeneous group of clonal disorders characterized by ineffective hematopoiesis, apoptosis and increased risk of progression to acute myeloid leukemia (AML). Over the years, little has evolved regarding the handling of this entity. With the development of prognostic indicators such as IPSS (International Prognostic Scoring System) in 1997, WPSS (World Health Organization Prognostic Scoring System) in 2005 and, more recently, the IPSS-R (Revised International Prognostic Scoring System) in 2012, there was an improvement in the stratification and estimation of prognosis. IPSS is still considered the best option for MDS classification, but we often observe patients with different clinical behaviors coexisting in the same stratification group. It suggests that the currently available scores are imperfect and that there´s an urgent need for a more refined categorization. With the improvement in MDS studies, many researches have highlighted the importance of somatic mutations profiling as accountable factors for poor prognosis and disease progression. We studied 50 patients with MDS followed at the Pedro Ernesto University Hospital Hematology Service (HUPE) from 2012 to 2014. We analyzed mutations in ASXL1, NRAS/KRAS and TP53 genes, by extracting genomic DNA sequencing. Of the 50 patients studied, 42 (84%) had at least one kind of mutation. Mutation in gene ASXL1 was the most frequent in 41 patients (82%), followed by TP53 in 10 patients (20%) and NRAS in only one patient (2%). In LMA-t group, 11% had mutations in TP53 and 78% in ASXL1, and no mutation was found in NRAS or KRAS genes. This study showed no differences between the mutated and non-mutated groups with respect to overall survival, bone marrow fibrosis, need for transfusion or cytopenias. We expect to have more significant variations in this group in a long-term monitoring becomes available. A síndrome mielodisplásica (SMD) é um grupo bastante heterogêneo de doenças clonais, caracterizado por hematopoese ineficaz, apoptose e risco aumentado de evolução para leucemia mielóide aguda (LMA). Ao longo dos anos, pouco se evoluiu em relação ao manejo desta entidade. Com o desenvolvimento de índices prognósticos como o IPSS (International Prognostic Scoring System) em 1997, o WPSS (World Health Organization-Prognostic Scoring System) em 2005 e, mais recentemente, o IPSS-R (Revised International Prognostic Scoring System) em 2012, houve melhora na estratificação e na estimativa do prognóstico. O IPSS ainda é considerado padrão para a classificação prognóstica das SMD, entretanto, não raro, observamos pacientes com comportamentos clínicos distintos coexistindo no mesmo grupo de estratificação. Isso sugere que os escores disponíveis atualmente ainda são falhos e que existe necessidade de uma classificação mais refinada. Com o avanço no conhecimento da SMD, em muito estudos tem sido destacada a importância da investigação das mutações somáticas como fatores responsáveis pelo pior prognóstico e evolução da doença. Neste estudo, foram incluídos 50 pacientes com diagnóstico de SMD acompanhados no Hospital Universitário Pedro Ernesto (HUPE) entre 2012 e 2014. Foram analisadas mutações nos genes ASXL1, NRAS/KRAS e TP53 por meio de extração e sequenciamento de DNA genômico. Dos 50 pacientes analisados, 42 deles (84%) apresentaram algum tipo de mutação. A mutação no gene ASXL1 foi a mais frequente, estando presente em 41 pacientes (82%), seguida do gene TP53, presente em 10 pacientes (20%) e NRAS encontrada em apenas 1 paciente (2%). No grupo LMA secundária a SMD (LMA t), 11% apresentaram mutação no TP53 e 78% no ASXL1, nenhuma mutação foi encontrada nos genes NRAS e KRAS. Neste estudo não foram observadas diferenças entre os grupos mutado e não mutado em relação à sobrevida global, fibrose da medula óssea, necessidade transfusional ou em relação ao grau de citopenias. Esperamos que o acompanhamento desse grupo a longo prazo permita o esclarecimento dessas associações de maneira mais significativa.

Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Microbiana, 2018. Fundação Universidade de Brasília (FUB); Fundação de Apoio a Pesquisa do Distrito Federal (FAP-DF) e Secretaria de Educação do Distrito Federal (SEDF). Cryptococcus neoformans é um basidiomiceto caracterizado pela presença de cápsula polissacarídica. Esse fungo é o agente patogênico da criptococose, uma doença oportunista que leva a mais de 180.000 mortes anuais. Até o presente, não foram identificadas, nesse patógeno, proteínas de reparo ao dano de DNA O6-alcilguanina (O6-alcilG), gerado pela alcilação da posição O6 de guaninas. O6-alcilG leva a erro de pareamento de bases nitrogenadas, causando mutação. Análises de bioinformática (FungiDB, UniProt, BLAST e Clustal Omega) da sequência de DNA CNAG_02105 de C. neoformans sugeriram que essa sequência poderia codificar Atl1 (Alkyltransferase-like protein), proteína de reparo a O6-alcilG. Uma vez que o hospedeiro humano não possui Atl1, uma Atl1 de C. neoformans poderia representar um alvo para fármacos de ação seletiva sobre esse fungo. Neste trabalho, buscou-se obter uma linhagem de C. neoformans mutante para o gene putativo ATL1 (CNAG_02105), com o objetivo de caracterizar seus principais atributos de virulência e fenótipos. As linhagens atl1Δ não apresentaram diferenças na termotolerância, expansão da cápsula polissacarídica, melanização da parede celular, produção de urease, desenvolvimento do ciclo sexual e virulência em Galleria mellonella quando comparadas às linhagens controle. Não foram detectadas alterações de fenótipo de crescimento de atl1Δ em condições de estresse osmótico, estresse de parede celular e estresse oxidativo. Também não foi identificada sensibilidade aumentada do mutante ao agente genotóxico hidroxiureia, à exposição à radiação UV, a fluconazol e a diferentes pHs. Por outro lado, as linhagens atl1Δ apresentaram hipersensibilidade ao agente alcilante EMS (etil metanossulfonato), mas não a MMS (metil metanossulfonato) ou ENU (etil nitrosoureia). O EMS gera O6-etilguanina, dano de DNA que é reparado pela proteína Atl1. Coletivamente, a bioinformática e as análises experimentais sugerem que CNAG_02105 codifica uma putativa Atl1 em C. neoformans. Cryptococcus neoformans is a basidiomycete characterized by the presence of a polysaccharide capsule. This fungus is the pathogenic agent of cryptococcosis, an opportunistic disease that leads to more than 180,000 annual deaths. To date, no repair proteins to the DNA damage of O6-alkylguanine (O6-alkylG), generated by alkylation of the position O6 of guanines. O6-alkylG leads to mismatch of nitrogenous bases, causing mutation. Bioinformatics analyzes (FungiDB, UniProt, BLAST and Clustal Omega) of the C. neoformans DNA sequence CNAG_02105 suggested that this sequence could encode Atl1 (Alkyltransferase-like protein), an O6-alkylG repair protein. Since the human host does not have Atl1, an Atl1 of C. neoformans could represent a target for selective action drugs on this fungus. In this work, we aimed to obtain a C. neoformans mutant srain for the putative ATL1 gene (CNAG_02105), in order to characterize its main virulence attributes and phenotype. The strains atl1Δ did not present differences in thermotolerance, polysaccharide capsule expansion, cell wall melanization, urease production, sexual cycle development and virulence in Galleria mellonella when compared to control strains. No changes in atl1Δ growth phenotype were detected under conditions of osmotic stress, cell wall stress and oxidative stress. No increased sensitivity of the mutant to the genotoxic hydroxyurea agent, exposure to UV radiation, fluconazole and different pHs was also identified. On the other hand, the atl1Δ strains showed hypersensitivity to EMS (ethyl methanesulfonate), but not to MMS (methyl methanesulphonate) or ENU (ethyl nitrosourea). EMS generates O6-ethylguanine, DNA damage that is repaired by the Atl1 protein. Collectively, bioinformatics and experimental analyzes suggest that CNAG_02105 encodes a putative Atl1 in C. neoformans.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas, Florianópolis, 2018. Objetivos: Caracterização clínica, funcional, radiológica e genotípica dos pacientes portadores de mutações do gene da alfa-1 antitripsina (A1AT) em um centro de referência no Brasil. Métodos: Estudo transversal de pacientes com mutação no gene da A1AT compatível com deficiência, com diagnóstico confirmado até 28/02/2015. Foram avaliadas características genotípicas, demográficas, clínicas, tomográficas, de função pulmonar, e dosagem de A1AT, com realização de análise estatística exploratória. Resultados: 27 pacientes com deficiência da A1AT (DA1AT) confirmada por genotipagem, com mediana da dosagem de A1AT de 45 mg/dl, e quatro pacientes (15%) apresentavam dosagens normais. A idade mediana foi 54 anos, 63% do sexo masculino e idade do início dos sintomas aos 40 anos. A mediana do VEF1 foi 1,37L (43% do predito). Enfisema tomográfico foi encontrado em 77,8% dos indivíduos, sendo panlobular em 76% e de predomínio em lobos inferiores em 48%. A frequência de bronquiectasias foi de 52% e espessamento brônquico 81,5%. O genótipo mais encontrado foi o Pi*ZZ em 40,7% dos participantes. Os demais genótipos foram: Pi*SZ (18,5%), Pi*M1Z (14,8%), Pi*M1S (7,4%), Pi*M2Z (3,7%), Pi*M1I (3,7%), Pi*ZMnichinan (3,7%), Pi*M3Plowell (3,7%), Pi*SF (3,7%). Não encontramos diferença significativa para idade, carga tabágica, VEF1 e presença de bronquiectasias entre os grupos com dosagem de A1AT normal versus alterada, e nem entre 1 alelo versus 2 alelos com mutação para DA1AT. A prevalência de DA1AT em nosso centro de referência em DPOC foi de 5,1%. Conclusão: O genótipo mais frequente foi o Pi*ZZ, embora genótipos heterozigotos e níveis normais de A1AT também semanifestaram com doença pulmonar significativa. Foram encontrados baixos valores medianos de A1AT e VEF1, alta frequência de enfisema, bronquiectasias e espessamento brônquico, e início precoce dos sintomas respiratórios. Abstract : Objectives: Clinical, functional, radiological and genotypic description of patients with alpha-1 antitrypsin (A1AT) gene mutation in a reference center in Brazil. Methods: Transversal study of patients with A1AT gene mutation compatible with deficiency, with confirmed diagnosis until 28/02/2015. We evaluated the A1AT dosage and genotypic, demographic, clinical, tomographic, and functional characteristics of these patients; and an exploratory statistical analysis was done. Results: 27 A1AT deficiency (A1ATD) patients confirmed by genotyping, A1AT median dosage was 45mg/dl, and normal dosage occurred in 4 patients (15%). Median age was 54, 63% male, and the respiratory symptoms started at the age of 40. The median FEV1 was 1.37L (43% predicted). Tomographic emphysema was found in 77,8% of individuals, being panlobular in 76% and lower lobes predominance in 48%. The frequency of bronchiectasis was 52% and bronchial thickening 81,5%. The most common genotype was Pi*ZZ in 40,7% of participants. The other genotypes found were: Pi*SZ (18,5%), PiM1Z (14,8%), Pi*M1S (7,4%), Pi*M2Z (3,7%), Pi*M1I (3,7%), Pi*ZMnichinan (3,7%), Pi*M3Plowell (3,7%), Pi*SF (3,7%). We didn´t find any significant difference in age, smoking load, FEV1, and presence of bronchiectasis between groups with normal or reduced A1AT dosage, neither for 1 nor 2 allele mutation for A1ATD. The A1ATD prevalence in our reference center was 5,1%. Conclusion: The most frequent genotype was Pi*ZZ, though heterozygous genotypes and normal levels of A1AT also manifested significant lung disease. We found lower median values for A1AT and FEV1, high frequency ofemphysema, bronchiectasis and bronchial thickening, and early beginning of respiratory symptoms.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:10:15Z No. of bitstreams: 1 Emylli Dias Virginio Tese completa.pdf: 4678931 bytes, checksum: 18aa802050ed38e5b235747180a3f85b (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:10:15Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Emylli Dias Virginio Tese completa.pdf: 4678931 bytes, checksum: 18aa802050ed38e5b235747180a3f85b (MD5) Previous issue date: 2017-09-05 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior The cell surface of Aspergillus fumigatus is the first structure of the fungus to get in contact with host constituents. Recent studies have shown that glycoconjugates of A. fumigatus cell surface are involved in the host adhesion processes. Among these surface carbohydrates, a galactosaminogalactan (GAG) was characterized for its key role at the adhesion of the fungus. The GAG synthesis process and its transportation to the cell wall is not fully understood. However, it is known that the UGE3 and GT4C genes encodes, respectively, an UDP-glucose-4-epimerase and a glycosyl transferase that are essentials for the production of A. fumigatus GAG. In this context, this work aimed to elucidate the role of GAG molecule at endothelial activation end to uncover which endothelial biological processes were regulated because of this activation. To achieve this objective, we used the primary culture of human umbilical vein endothelial cells model (HUVECs) challenged with wild type and mutant strains of A. fumigatus. The mutant strains used were: (i) two strains deficient at GAG synthesis (∆uge3 e ∆gt4c) and; (ii) one mutant strain wich super express GAG at cell surface (∆ugm1). After HUVECs interaction with each A. fumigatus strains, we evaluated the adhesion profile to endothelial cells, the HUVECs viability and the secretion of cytokines in the conditioned media. Besides, a comparative and quantitative proteomic study was performed, to elucidate the biological processes modulated by GAG. The results of this study indicated that the mutant strains ∆uge3 and ∆gt4c had a hypo-adherent profile to HUVECS when compared to the AF293 e Ku80 wild type strains, also, a significant decrease at TNF-α secretion was observed. In contrast, the ∆ugm1 strain showed a hyper-adherent profile to HUVECs, when compared to the wild type strains. Corroborating previous data of our group, the ∆ugm1 strain induced a significant increase of TNF-α secretion. The HUVECs infected with the ∆uge3 e ∆gt4c mutants showed a reduction of the pro-inflammatory IL-6 and the TNF-α secretion profile when compared to the wild type strains. The proteomic data indicated that GAG is related with the modulation of HUVECs proteins involved in biological processes that are important in the physiopathology of invasive aspergillosis, such as: adhesion and cellular movement, regulation of angiogenesis and coagulation, oxidative stress, cellular homeostasis, platelet activation and apoptosis. A parede celular do Aspergillus fumigatus é a primeira estrutura do fungo a entrar em contato com constituintes do hospedeiro. Estudos recentes sugerem que os glicoconjugados da superfície celular de A. fumigatus estejam envolvidos nos processos de adesão deste fungo a células do hospedeiro. Dentre estes carboidratos de superfície, uma galactosaminogalactana (GAG) foi caracterizada como tendo papel chave na adesão do fungo. O processo de síntese de GAG e seu transporte para a parede celular não é completamente conhecido. Entretanto, sabe-se que os genes UGE3 e GT4C codificam, respectivamente, uma UDP-glicose-4-epimerase e uma glicosil transferase, que são essenciais para a síntese de GAG em A. fumigatus. Nesse contexto, o objetivo dessa tese foi elucidar o papel da molécula de GAG na ativação endotelial e desvendar quais processos biológicos endoteliais são reguladas a partir desta ativação. Para atingir este objetivo, foi utilizado o modelo de cultura primária de células endoteliais da veia umbilical humana (HUVECs) desafiadas com cepas selvagens e mutantes de A. fumigatus. As cepas mutantes utilizadas foram: (i) duas cepas deficientes na síntese de GAG (∆uge3 e ∆gt4c) e; (ii) uma cepa mutante que superexpressa GAG na parede (∆ugm1). Após interação das HUVECs com cada uma das cepas de A. fumigatus foi verificado o perfil de adesão às células endoteliais, a viabilidade das HUVECs e a secreção de citocinas no meio condicionado. Além disto, foi realizado um estudo proteômico comparativo e quantitativo, para elucidar processos biológicos endoteliais modulados pela GAG. Os resultados desse estudo indicaram que as cepas mutantes ∆uge3 e ∆gt4c possuem perfil hipo-aderente às HUVECs quando comparadas com as cepas selvagens AF293 e Ku80, além de uma significativa diminuição da secreção de TNF-α. Em contraste, a cepa ∆ugm1 apresentou perfil hiper-aderente às HUVECs, quando comparada as cepas selvagens. Corroborando dados anteriores de nosso grupo, a mutante ∆ugm1 induziu um aumento significativo da secreção de TNF-α. As HUVECs infectadas com as mutantes ∆uge3 e ∆gt4c, apresentaram um perfil de redução de secreção das citocinas pró-inflamatórias IL-6 e TNF-α em relação ao perfil observado com as cepas selvagens. Os dados proteômicos revelaram que a GAG está relacionada com a modulação de proteínas de HUVECs envolvidas em processos biológicos importantes na fisiopatologia da aspergilose invasiva, tais como: adesão e movimentação celular, regulação da angiogênese e da coagulação, estresse oxidativo, homeostase celular, ativação de plaquetas e apoptose.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:16:30Z No. of bitstreams: 1 Camilla Pereira da Silva Dissertacao completa.pdf: 5289542 bytes, checksum: 96d9a09e6fa1328f2183a52cd649b142 (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:16:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camilla Pereira da Silva Dissertacao completa.pdf: 5289542 bytes, checksum: 96d9a09e6fa1328f2183a52cd649b142 (MD5) Previous issue date: 2017-07-05 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Parkinson s disease (PD) is a neurodegenerative disorder characterized by remarkable phenotypic variability. Accumulated evidence points that the manifestation of PD clinical signs might be differentially modified by genetic factors, as mutations in LRRK2 and GBA genes. In this sense, the clarification of the genotype-phenotype correlations in PD has important implications in predicting prognosis and can contribute to the development of specific therapeutic approaches. The objective of this study was to conduct a comparative analysis of motor and non-motor features in LRRK2 and GBA mutations carriers and non-carriers in a cohort of Brazilian PD patients. Molecular analyzes to identify the variants were performed through the sequencing of polymerase chain reaction products. For compilation of clinical and demographic data of 131 patients with PD, a form was elaborated, contemplating the presence or absence of motor and non-motor symptoms, as well as the response to treatment with levodopa, age at onset and family history of the disease. Comparison of data from 22 probands with GBA mutations, 17 individuals with LRRK2 G2019S and 96 idiopathic PD patients showed significant differences among the three groups regarding the age at onset (p = 0.004), family history of the disease (p = 0.003) and the presence of rest tremor (p = 0.03); motor complications, as gait freezing (p = 0.0498), and non-motor complications, as depressive symptoms (p = 0.04) and dysautonomia (p

CNPQ Mutações no gene DNMT3A foram previamente associadas com pior desfecho clínico na Leucemia Mielóide Aguda (LMA). Várias mutações foram descritas, a maioria delas na posição da arginina 882, localizada no éxon 23. Grande parte das evidências associando mutações no DNMT3A ao prognóstico na LMA vem de ensaios clínicos, que refletem o perfil de coortes selecionadas e por isso, nem sempre são confiáveis para a tomada de decisão terapêutica. Pouco se sabe sobre a importância clínica e a frequência de mutações no DNMT3A em pacientes com LMA no contexto de vida real. Neste estudo, investigamos a presença de mutações no DNMT3A e seu perfil de expressão gênica em 201 pacientes com LMA, associando estes achados com características clínicas e laboratoriais, sobrevida global (SG) e sobrevida livre de doença (SLD). Foram identificadas mutações no DNMT3A em 27 pacientes (13%). Estas mutações foram associadas com leucocitose (P=0,034), no entanto, não afetaram o desfecho clínico dos pacientes (SG: 261 dias (IC95%: 1-670 dias; P=0,13); SLD: 182 dias (IC95%: 161–377 dias; P=0,157)). Além disso, mutações no DNMT3A não estão associadas com níveis diferenciais de expressão gênica (P=1,000). Em contrapartida, a baixa expressão do DNMT3A foi associada com uma menor SG (P= 0,044). Em resumo, nossos dados sugerem que a baixa expressão do gene DNMT3A esteja associada ao pior desfecho clínico em pacientes com LMA. DNMT3A gene mutations were previously associated with poor clinical outcome in acute myeloid leukemia (AML). Several mutations have been described, most of them on arginine in position 882, located in exon 23. Interestingly, most of evidence associating DNMT3A mutations and clinical outcome in AML are from clinical trials, that reflect the profile of selected cohorts and therefore, which are not always trustworthy clues for decision-making therapy. To date, little is known about the clinical importance and the frequency of DNMT3A mutations in AML in a real life setteing. Here, we performed DNMT3A screening mutation in exon 23 and its gene expression profile in 201 patients with AML, and associated these findings with clinical and laboratory characteristics, hematologic recovery, relapse, and survival. We identified DNMT3A mutations in 27 patients (13%). DNMT3A mutations were associated with higher white blood cell counts (P=0.034), but had no impact on clinical outcome (overall survival, OS: 261 days (IC95%: 1-670 days); P=0.13; disease-free survival, DFS: 182 days (IC95%: 161–377 days); P=0.157). DNMT3A mutations did not interfere in the gene expression levels (P= 1.000), although the lower DNMT3A gene expression had a negative impact on overall survival (P= 0.044). Taken together, our data suggest that lower expression of the DNMT3A gene is associated prognostic impact in AML.

CNEN - Comissão Nacional de Energia Nuclear CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico As radiações ionizantes (RI) estão presentes na maioria dos diagnósticos precoces de uma infinidade de doenças, muitos tipos de câncer estão inclusos, e têm a característica de um diagnóstico rápido e preciso e, muitas das vezes, mais barato. A utilização deste tipo de energia no entanto, requer de cuidados de proteção específicos, uma vez que as RI tem a característica de alterar o material genético, através de mutações. Os operadores da área da radiologia em hospitais são a classe de trabalhadores que está exposta de forma mais direta e, portanto, são alvos de investigações que podem auxiliar no entendimento da interação das RI com o material biológico, além de auxiliar a estes profissionais no requisito de proteção radiológica. Foram coletadas 75 amostras de indivíduos que trabalham em vários departamentos da radiologia em 5 hospitais de 4 Estados diferentes no Brasil (São Paulo, Minas Gerais, Rio Grande do Sul e Pará). Os critérios de seleção para a participação foram: ter ao menos 18 anos de idade e 2 anos de profissão, não ser etilista ou tabagista, não estar tomando medicamentos. Para análise citogenética, foram realizados os testes do cometa e Micronúcleo, assim como estudo de aberrações cromossômicas. Este estudo foi avaliado e aprovado por comitê de ética. Todos as amostras foram comparadas com indivíduos do mesmo gênero e idade que não tenham passado por qualquer tipo de exame radiológico nos últimos 6 meses.Quando comparados com o controle, os testes de MN e AC demonstraram uma totalidade de danos, usando o teste T, o banco de dados SPSS e bioestat. O teste do cometa mostrou um nível de danos maior se comparado aos controles (0,84 0,47). Foi estabelecida a média de idade e feita relação entre gênero e idade dos participantes, sendo os níveis de danos maiores para o gênero feminino em relação ao masculino. Individuos com idades acima dos 45 anos também demonstraram um nível de dano maior quando comparados com idades inferiores. Um fator a ser levado em consideração é de que a população de Porto alegre apresentar um nível de dano menor se comparado aos outros grupos, sendo muito provável este evento por conta da utilização de equipamentos DR de conversão direta. Os equipamentos de Belo Horizonte e Ribeirão Preto utilizam CR e os de Belém, convencionais. Ionizing radiation (IR) are present in most of the early diagnosis of a multitude of diseases, many cancers are included, and have the characteristic of a quick and accurate diagnosis, and often cheaper. The use of this type of energy but requires specific care protection, since the IR has a characteristic of altering the genetic material through mutations. The radiology area operators in hospitals are the class of workers who are exposed more directly and thus are targets of investigations that may assist in understanding the interaction of IR with the biological material, in addition to assisting these professionals in requirement radiological protection. We collected 73 samples of individuals working in various radiology departments in five hospitals in four different states in Brazil (São Paulo, Minas Gerais, Rio Grande do Sul and Pará). The selection criteria for participation were: at least 18 years old and 2 years in the profession, not alcoholic or smoker, not taking drugs. For cytogenetic analysis were performed the comet test and micronucleus, and chromosome aberration study. This study was approved by ethics committee. All the samples were compared to individuals of the same age and gender who have not gone through any kind of radiological examination in the last 6 meses.Quando compared with the control, MN tests and AC showed a total damage, using the t test, the database and SPSS BioEstat. The comet assay showed a higher level of damage compared to controls (0.84 0,47). The average age was established and made relationship between gender and age of the participants, the more damage levels in females compared to males. Individuals aged over 45 years also showed a higher level of damage when compared with the age. A factor to be taken into consideration is that the population of Porto Alegre present a lower level of damage compared to other groups, and most likely this event due to the use of DR equipment Direct conversion. The Belo Horizonte and Ribeirão Preto equipment using CR and Belém, conventional.

Made available in DSpace on 2015-12-10T14:24:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-07-20. Added 1 bitstream(s) on 2015-12-10T14:30:27Z : No. of bitstreams: 1 000854092.pdf: 4152129 bytes, checksum: 2349bde07b4af6efb99d75bc7ad08203 (MD5) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) Programa de Apoio ao Desenvolvimento Científico (PADC) da Faculdade de Ciências Farmacêuticas - UNESP O fator da tradução 5A (eIF5A) é altamente conservado em arqueas e eucariotos e essencial para a viabilidade celular. eIF5A é a única proteína conhecida que contém o aminoácido essencial hipusina, gerado através de uma modificação pós-traducional conhecida como hipusinação e que ocorre em duas etapas enzimáticas catalisadas pelas enzimas desoxi-hipusina sintase (Dys1) e desoxi-hipusina hidroxilase (Lia1). Apesar de eIF5A ter sido relacionada recentemente com a etapa da elongação da tradução, a função específica de eIF5A nesse processo, bem como o papel do resíduo de hipusina ainda não estão descritos. Com esse intuito, este trabalho aprofundou inicialmente a caracterização do mutante dys1-1, mutante condicional da enzima desoxi-hipusina sintase. Os resultados revelaram que o mutante dys1-1 apresenta defeito no perfil polissomal característico de fatores que atuam na etapa da elongação da tradução, diminuição da ligação de eIF5A nos polissomos e redução dos níveis de síntese proteica total. Além disso, foram realizadas análises de interação genética envolvendo eIF5A e dirigidas por hipóteses, à partir de dados já publicados ou resultados obtidos previamente pelo laboratório. Nestas análises foi identificada letalidade sintética entre mutantes de ASC1 e o mutante dys1-1, assim como interações genéticas negativas (synthetic sick) entre o mutante tif51A-1 e mutantes de genes relacionados com secreção, mais especificamente com a translocação de proteínas para o retículo endoplasmático pela via co-traducional. Finalmente, foram realizados rastreamentos de interações genéticas em larga escala por Synthetic Genetic Array (SGA), utilizando diferentes mutantes de eIF5A e duas coleções de linhagens mutantes de S. cerevisiae (linhagens nocautes e mutantes sensíveis a temperatura). Os resultados revelaram, respectivamente, 338 e 239 genes das coleções de linhagens nocautes e mutantes... The translation factor 5A (eIF5A) is highly conserved in arqueas and eukaryotes and essential for cell viability. eIF5A is the only protein known to contain the essential amino acid hypusine, generated by a post-translational modification known as hypusination which occurs in two enzymatic steps catalyzed by the enzymes deoxyhypusine synthase (DYS1) and deoxyhypusine hydroxylase (Lia1) enzymes. Although eIF5A has been implicated with the elongation step of translation, its specific function and the role of the hypusine residue is still unknown. For this purpose, this work further characterized the dys1-1 mutant, a conditional mutant of the deoxyhypusine synthase. The results revealed that the dys1-1 mutant shows a polysome profile defect characteristic of translation elongation factors, decrease of eIF5A binding to the polysome fractions and reduction of the total protein synthesis rate. Furthemore, genetic interaction analyses of eIF5A driven by hypotheses, from published and previous data obtained in our laboratory, were performed and revealed synthetic lethality between ASC1 mutants and the dys1-1 mutant and negative genetic interactions (synthetic sick) between the tif51A-1 mutant and mutants of genes related with secretion, specifically those involved with the co-translational translocation of proteins into the endoplasmic reticulum. Finally, high throuput genetic interaction analyses by Synthetic Genetic Array (SGA) were carried out using different eIF5A mutants and two S. cerevisiae mutant strain collections (deletion strains and temperature-sensitive mutants). The results showed, respectively, 338 and 239 genes of the deletion mutant and the temperature-sensitive mutant collections interacting with eIF5A mutants. A total of 577 positive and negative genetic interactions were observed. Moreover, the gene ontology analysis revealed genes involved with cell cycle (53%), DNA repair (18%), translation (16%) and vesicular trafficking/... FAPESP: 11/50801-4

Made available in DSpace on 2016-08-29T15:34:42Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_8279_Tese_Clara Fernanda Barbirato.pdf: 794712 bytes, checksum: 13290894bcf3053215336989ea116592 (MD5) Previous issue date: 2015-02-13 A Osteogênese Imperfeita (OI) é uma doença clínica e geneticamente heterogênea caracterizada, predominantemente, por fragilidade e deformidade ósseas e por fraturas recorrentes. A maioria dos casos de OI resulta de mutações autossômicas dominantes nos genes COL1A1 e COL1A2, que codificam as cadeias formadoras do colágeno tipo I, principal proteína dos ossos. Nos últimos anos, um número crescente de casos decorrentes de mutações recessivas vem sendo relatado em genes associados à biossíntese do colágeno tipo I ou à formação e a mineralização óssea, como os genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1. Mutações nesses genes, em geral, levam ao desenvolvimento de fenótipos graves e letais de OI. Neste trabalho, foram analisados os genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1 de 25 pacientes com OI utilizando-se as técnicas de SSCP e sequenciamento. Ao todo, 29 variações genéticas foram detectadas, entre mutações e polimorfismos. Das onze variações encontradas no gene LEPRE1, estão a já bem descrita c.1080+1G>T e as mutações potencialmente deletérias c.2024G>A / p.Lys363Glu e c.1501C>T / p.Arg501Trp. No gene FKBP10, foi encontrada a também descrita duplicação c.831dupC, além da c.1546G>A / p.Leu516Phe, predita como causadora da doença. Observou-se que os genes FKBP10 e LEPRE1 contêm as principais mutações encontradas neste trabalho e sugere-se que os mesmos sejam preferencialmente analisados em estudos de triagem e identificação de mutações em OI. Até o momento, não existem relatos de mutações nos genes LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 e SERPINF1 em pacientes brasileiros e este trabalho fornece novas informações sobre os aspectos genéticos da OI recessiva Osteogenesis Imperfecta (OI) is a clinically and genetically heterogeneous disease predominantly characterized by bone fragility and deformity and recurrent fractures. Most cases of OI result of autosomal dominant mutations in COL1A1 and COL1A2 genes that encode the chains forming type I collagen, the main protein in bones. In the past few years, an increasing number of cases due to recessive mutations has been reported in genes associated with the biosynthesis of type I collagen or to the formation and bone mineralization, such as LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1. Mutations in these genes, in general, lead to the development of severe and lethal OI phenotypes. In this work, LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1 of 25 OI patients were analyzed using SSCP and automated sequencing. Altogether, 29 genetic variations were detected, mutations and polymorphisms. Among the eleven variants found in LEPRE1 gene, there are the already well described c.1080 + 1G> T and the potentially deleterious mutations c.2024G> A / p.Lys363Glu and c.1501C> T / p.Arg501Trp . In FKBP10 gene, the previously described duplication c.831dupC, and c.1546G>A / p.Leu516Phe, predicted to be disease causing, were detected. It was observed that FKBP10 and LEPRE1 contain the most important mutations found in the patients studied in this work and it is suggested that LEPRE1 and FKBP10 should be preferably analyzed in studies of screening and identification of mutations in patients with OI. To date, there are no reports of mutations in LEPRE1, CRTAP, PPIB, FKBP10, SERPINH1 and SERPINF1 genes in Brazilian patients and this study provides new information on the genetic aspects of recessive OI.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Farmácia, Florianópolis, 2015. As leucemias agudas (LA) compreendem um grupo heterogêneo de doenças caracterizadas pela rápida e incontrolada expansão clonal de células progenitoras do sistema hematopoiético. Segundo a OMS, características imunofenotípicas, citogenéticas e moleculares, além de outras associações, estão relacionadas ao prognóstico e contribuem para a estratificação das LAs, que é baseada na citogenética e na incidência de mutações gênicas, como as mutações no gene NPM1 e FLT3. Assim, o objetivo deste estudo foi avaliar a associação das mutações nos genes NPM1 e FLT3 (DIT e D835) com outros parâmetros laboratoriais e clínicos em casos de LA, atendidos pelo Serviço de Hematologia (HUUFSC), no período de janeiro de 2012 a setembro de 2014. Entre as 57 amostras encaminhadas ao LOEH, 42 estavam de acordo aos critérios de inclusão. A análise das amostras em relação a essas alterações foi realizada pela técnica de reação em cadeia da polimerase (PCR). Para avaliar a presença de mutações no gene NPM1, foi realizado o sequenciamento da região de interesse. Entre os pacientes diagnosticados com leucemia mieloide aguda (LMA), 30,7% apresentaram a mutação no gene FLT3 (FLT3-DIT: 19,2% e FLT3- D835: 11,5%). Nos pacientes diagnosticados com o subtipo leucemia linfoide aguda (LLA) apenas um caso (7,1%) apresentou a mutação FLT3-D835. Não foi observado associação entre a presença dessas mutações com o subtipo de LA. Porém, observou-se que a presença da mutação foi mais incidente em pacientes com LMA. Os resultados mostram que nos casos onde foi detectada a mutação FLT3-DIT, os pacientes apresentaram tanto pior progressão clínica da doença (P=0,006) quanto menor taxa de sobrevida global (P=0,002). Ainda mais, foi possível observar valores para leucometria, atividade da enzima LDH e porcentagem de blastos maiores em relação àqueles sem a presença da mutação. Esses resultados sugerem que a presença de mutações FLT3-DIT são preditivos de mau prognóstico e atuam de forma independente, pois não foi possível observar associação com os demais fatores prognósticos. Em relação mutação FLT3-D835, não foi possível encontrar associação entre esta variável e os demais parâmetros analisados. Na análise da mutação NPM1 entre os pacientes incluídos no estudo, nenhum apresentou mutações compatíveis às descritas na literatura. No entanto, foi possível detectar uma nova mutação no gene NPM1 em amostras de três pacientes. Apesar do número pequeno de casos, pode-se observar que os pacientes apresentaram fatores prognósticos desfavoráveis como o percentual do número de blastos, leucocitose em dois dos três casos, e foram a óbito antes da primeira remissão. Esses dados sugerem que essa mutação pode ser considerada de mau prognóstico, como as mutações no gene NPM1 do tipo não-A. Entretanto, a avaliação prognóstica requer maior número de casos avaliados para sua elucidação. Esses resultados mostram, que diferentes mutações no gene NPM1 podem não ser raras, e requerem a análise da sequência alvo completa. Assim, outros tipos de alteração podem ser detectadas. No geral, o presente estudo destaca a importância de incluir a investigação de marcadores moleculares na avalição prognóstica dos pacientes portadores de LA no momento do diagnóstico, a fim de que a escolha do protocolo terapêutico seja o mais apropriado. Abstract : Acute leukemias (ALs) are a heterogeneous group of diseases characterized by a fast and uncontrolled clonal proliferation of hematologic progenitor cells. According to the current classification proposed by WHO, the prognosis is defined by immunophenotypic, cytogenetic and molecular characteristics, which contribute to the stratification of ALs, which is based on cytogenetic and on the incidence of gene mutations, as mutations in NPM1 and FLT3. Thus, the aim of this study was to evaluate the prognostic impact of the association between mutations in NPM1 and FLT3 (DIT and D835) genes with other laboratory and clinical parameters in patients with AL before the first therapy. Patients attended the Hematology Department (UFSC-HU) from January 2012 to September 2014. Among the 57 samples sent to (LOEH), 42 were according to the inclusion criteria. The analysis of the mutations in the samples was performed by polymerase chain reaction (PCR). To assess the presence of mutations in NPM1 gene, it was further carried out the sequencing of the region of interest. Among the patients diagnosed with acute myeloid leukemia (AML) included in this study, 30.7% had mutations in the FLT3 gene (FLT3-DIT: 19.2% and FLT3-D835: 11.5%). Among the patients diagnosed with acute lymphocytic leukemia (ALL), only one patient (7.1%) had a mutation FLT3-D835. There was no association between the presence of these mutations and the LA subtype. However, it was observed that the presence of the mutation was more prevalent in patients with AML. The results show that when the mutation FLT3-DIT was observed, patients had a worse clinical progression (P=0.006) and a reduced overall survival rate (P=0.002). Moreover, patients with this mutation had higher values of white blood cell count, LDH enzyme activity and blasts percentage in relation to those without the mutation. The results suggest that the presence of FLT3-DIT mutations are predictive of a worse prognosis, but they act independently, since it was not observed an association with the other prognostic factors. Regarding NPM1 mutation, none of the patients included in this study showed mutations according to the described in the literature. However, by sequencing analysis, it was possible to detect a new mutation in NPM1 gene in three patient samples. Despite the small number of patients, it may be noted that all three cases had unfavorable prognostic factors such as the percentage of blasts, high white blood cell count in two of the three cases, and all of them died before the first remission. These data suggest that this mutation can be considered as poor prognosis, such as mutations in NPM1 gene non-A type. However, the prognostic evaluation of this new mutation requires a larger number of cases to be fully elucidated. These results show that different mutations in NPM1 gene may not be rare, and require analysis by sequencing of the complete target sequence.Thus, other typesof changes can be detected. Overall, the present study highlights the importance of including the investigation of molecular markers in prognostic evaluation of patients with AL at the diagnosis, so the most appropriate treatment protocol can be chosen.

Orientador: Edi Lúcia Sartorato Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: A perda da audição é uma doença sensorial comum, que pode ser causada por fatores genéticos ou ambientais. Os recentes avanços na biologia molecular têm permitido a determinação das causas genéticas da perda auditiva, e mais de 100 genes já foram relacionados com este fenótipo. Devido à elevada heterogeneidade genética envolvida, um grande número de pacientes permanece sem diagnóstico molecular, pois apenas um pequeno conjunto de genes é geralmente analisado. Isso indica a necessidade de novas estratégias metodológicas para o rastreamento simultâneo de mutações em múltiplos genes. Neste trabalho, um painel para genotipagem utilizando o sistema de espectrometria de massa iPLEX MassARRAY® (Sequenom Inc.), contendo 86 alterações em 17 genes, foi otimizado e testado, visando sua aplicação no diagnóstico molecular de indivíduos com perda auditiva. Inicialmente, um teste com indivíduos controles mostrou falha em 20% das alterações. Na tentativa de se obter uma maior taxa de genotipagem, os primers das alterações que falharam foram redesenhados e ressintetizados. Novos testes com 25 indivíduos controles mostraram um significativo aumento na taxa de genotipagem, e a especificidade e sensibilidade da técnica foram estimadas em mais de 95%. Após a otimização dos ensaios, um grupo de 180 indivíduos, com perda auditiva não-sindrômica com causa presumidamente genética, foi rastreado utilizando o painel desenvolvido, e a validação das mutações identificadas foi realizada por sequenciamento de DNA ou PCR seguido de análise de restrição enzimática. Alterações genéticas foram confirmadas em 31% dos indivíduos, sendo que em 20,6% dos casos analisados foi possível esclarecer a etiologia da perda auditiva. Alterações no gene GJB2 foram as mais prevalentes, porém outras mutações também foram identificadas nos genes SLC26A4, CDH23, MT-RNR1, MT-TS1, MYO15A e OTOF. A genotipagem de mutações usando o sistema iPLEX MassARRAY® mostrou melhor custo-benefício em comparação com as técnicas convencionais, e permitiu rastrear um conjunto mais abrangente de genes do que aqueles atualmente analisados. Portanto, o painel desenvolvido é viável para o rastreamento inicial de mutações envolvidas com a perda auditiva não-sindrômica e poderá auxiliar no diagnóstico dos pacientes afetados Abstract: Hearing loss (HL) is a common sensorial disorder, which can be caused by genetic or environmental factors. Recent advances in molecular biology have allowed the determination of the genetic causes of HL, and more than 100 genes have been linked to the phenotype. Due to the extraordinary genetic heterogeneity involved in HL a large percentage of patients remain without any molecular diagnosis. This indicates the need for new methodological strategies for simultaneously screening for mutations in multiple genes. In this work, we optimized and tested a panel of 86 mutations in 17 different genes, screened using the mass spectrometry system, iPLEX MassARRAY® (Sequenom Inc.), in order to determine the molecular etiology of hearing loss. An initial genotyping of control subjects, showed failures in 20% of the selected alterations. In an attempt to achieve greater genotyping rates, the tests that failed were redesigned and new primers were synthesized. Further tests with 25 control subjects were then performed and showed significant increase in genotyping rate. The sensitivity and specificity of the technique showed average values above 95%. Additionally, a group of 180 individuals, with nonsyndromic hearing loss with presumably genetic causes, was tested using the developed panel, and the validation of the identified mutations was performed by DNA sequencing or PCR followed by restriction enzyme analysis. Genetic alterations were confirmed in 31% of patients, and in 20.6% of the individuals was possible to elucidate the etiology of HL. Mutations in the GJB2 gene were the most prevalent, but other mutations in the SLC26A4, CDH23, MT-RNR1, MYO15A, and OTOF genes were also identified. Genotyping of mutations using iPLEX MassARRAY® Spectrometry System proved to be faster and more cost-effective, compared to conventional techniques, and enabled the screening of a broader set of genes and mutations than those currently analyzed to establish the molecular etiology of hearing loss. Hence, the developed panel is feasible for the initial screening mutations involved in non-syndromic hearing loss and may aid in the diagnosis of affected patients Doutorado Genética Animal e Evolução Doutora em Genética e Biologia Molecular CAPES

Universidade Federal de Minas Gerais Literature reports that genetic polymorphisms may determine important modulations on athletes phenotypes, such as height, cardiovascular adaptations, use of energy substrates as well as electrolyte and hormonal balance. It is possible that individuals who express the alpha actinin 3 gene (ACTN3; ancestral homozygous RR or heterozygous RX) may offer advantages in movements that require strength and fast twitch compared with individuals with XX genotype. ACTN3 is a sarcomeric Z line component, which is important for the actin filaments anchorage and myofibrillar arrangement maintenance. Regarding AMP deaminase (AMPD1) polymorphism, it has been reported that athletes with the mutant allele (allele T) may present disadvantages in intense and repetitive physical activities, since the enzyme encoded by this gene is responsible for the ATP resynthesis after intense muscle contractions. Polymorphisms in the angiotensin converting enzyme gene (ACE; deletion allele D) and angiotensinogen (AGT; mutated allele T) may favor athletes in activities requiring strength, due to the fact of higher Angiotensin (Ang) II circulating levels. The present study investigated whether polymorphisms in ACTN3, AMPD1, ACE and AGT genes, alone or in combination, may influence the hemodynamic and cardiac parameters as well as soccer players performance during physical tests such as jump, speed and endurance. Saliva from 220 young professional soccer players (14-20 years) from São Paulo Futebol Clube (Brazil) was collected. Then, total DNA was extracted from saliva and polymerase chain reaction (PCR) was used for genotyping of athletes. To provide more reliability to the study, athletes were also separated according to their age. Before this separation, the athletes with the mutation in the ACTN3 gene jumped lower heights in Squat Jump test (SJ) (RR/RX = 33.64 ± 5.31 vs XX = 30.81 ± 4.51 cm, p = 0.007), as well as in the Under (U)-15 (RR/RX = 34.88 ± 5.39 vs XX = 30.59 ± 4.07 cm, p = 0.04) and U- 17 (RR/RX = 35.82 ± 4.35 vs XX = 30.24 ± 5.16 cm, p = 0.01) categories. In the Counter Movement Jump test (CMJ), RR/RX jumped 37.26 ± 5.72 cm and XX 34.12 ± 4.84 cm (p = 0.005). In the U-17 category, RR/RX jumped 38.56 ± 5.69 cm and XX 32.90 ± 6.06 cm (p = 0.02). In the Counter Movement Jump with arms (CMJb) test, with all athletes, RR/RX jumped 43.85 ± 6.38 cm and XX 40.61 ± 5.06 cm (p = 0.009). The speed test (30 m) showed in the U-17 category that RR/RX were faster than the XX athletes (RR/RX = 4.13 ± 0.13 vs XX = 4.27 ± 0 17 s, p = 0.04). Regarding AMPD1 gene, no significant difference was found in the jumps and endurance tests, but in the speed test (10 m), CC athletes were faster than those with CT/TT genotypes (CC = 1.53 ± 0.19 vs CT/TT = 1.62 ± 0.16 s, p = 0.04). Athletes with DD genotype (ACE) jumped significantly higher in CMJb test compared with ID/II (DD = 44.37 ± 6.22 vs ID/II = 42.35 ± 6.23 cm, p = 0.02). In the U-17 category, DD athletes jumped higher in SJ (DD = 38.04 ± 5.00 vs ID/II = 33.16 ± 4.11 cm, p = 0.01), CMJ (DD = 41.03 ± 5.64 vs ID/II = 35.76 ± 4.26 cm, p = 0.01) and CMJb (DD = 48.62 ± 5.98 vs ID/II = 42.42 ± 4.81 cm, p = 0.007). In the endurance test, athletes from U-16 category with genotypes ID/II, traveled greater distances compared with DD (ID/II = 1.467 ± 63.70 vs DD =1.244 ± 64.25 m, p = 0.04). The DD genotype also favored athletes in speed test (30 m), either for players from U-14 category (DD = 4.29 ± 0.19 vs ID/II = 4.40 ± 0.16 s, p = 0.02) or for the U- 17 category (DD = 4.07 ± 0.15 vs ID/II = 4.20 ± 0.13 s, p = 0.04). AGT gene polymorphism did not influence the performance in the tests, but athletes with the mutant genotype (TT) showed greater left ventricle (LV) hypertrophy (114.6 ± 105.2 g/m2 for TT, 92.16 ± 18.88 g/m2 for MT and 94.78 ± 21.08 g/m2 for MM, p = 0.04) without any change in cardiac and other hemodynamic parameters. Greater LV hypertrophy (DD = 96.95 ± 19.96, ID = 90.14 ± 21.58 and II = 91.67 ± 21.09 g/m2, p = 0.04) and higher ejection fraction (DD = 71.73 ± 7.71, ID = 69.48 ± 6.51 and II = 68.59 ± 5.72 %, p = 0.02) were also found in the athletes with the DD genotype. The analysis of genes combination on athletic performance, when characteristics of strength and muscle fast twitch in the ranking by score were taken into account, showed that athletes with the highest scores (5-8) jumped higher than those with lower scores (1-4) in SJ test (score 5 to 8 = 33.80 ± 5.16 vs score 1 to 4 = 31.60 ± 5.22 cm, p = 0.01) and CMJ test (score 5 to 8 = 43.90 ± 6.85 vs score 1 to 4 = 41.87 ± 5.98 cm, p = 0.04). The present results suggest that RR/RX (ACTN3), DD (ACE) and CC (AMPD1) genotypes may benefit soccer players in activities requiring strength and fast twitch. In addition, ID/II genotypes seem to provide more resistance to athletes in endurance activity. In the future, the organization, standardization and ethical responsibility will be required in the management of these genetic markers for use in athletes training process. Há relatos na literatura de que os polimorfismos genéticos podem determinar importantes modulações nos fenótipos dos atletas, como por exemplo, estatura, adaptações cardiovasculares, utilização dos substratos energéticos bem como balanço eletrolítico e hormonal. É possível que indivíduos que expressem o gene alfa actinina 3 (ACTN3; genótipos RR para homozigotos ancestrais ou RX para heterozigotos) possam apresentar vantagens em movimentos que exijam força e rápida contração muscular quando comparados aos indivíduos com genótipo XX. Isto pelo fato de a ACTN3 ser um componente da linha Z sarcomérica, o qual é importante para o ancoramento dos miofilamentos de actina e manutenção do arranjo miofibrilar. Com relação ao polimorfismo no gene AMP deaminase (AMPD1), tem sido relatado que os atletas que apresentam o alelo mutado (alelo T) possam apresentar desvantagens em atividades físicas intensas e repetitivas, uma vez que a enzima codificada por este gene é responsável pela ressíntese de ATP muscular após intensas contrações. Os polimorfismos nos genes da enzima conversora de angiotensina (ECA; alelo de deleção D) e angiotensinogênio (AGT; alelo T mutado) podem favorecer os atletas em atividades que requeiram força, isto por conta dos maiores níveis circulantes de Angiotensina (Ang) II. Este estudo investigou se os polimorfismos nos genes ACTN3, AMPD1, ECA e AGT, combinados ou não, podem influenciar nos parâmetros hemodinâmicos, cardíacos e no desempenho de jogadores de futebol em testes físico-motores tais como saltos, velocidade e endurance. Foi coletada a saliva de 220 jogadores jovens (14 a 20 anos) das categorias de base profissional do São Paulo Futebol Clube, Brasil. Em seguida, o DNA total foi extraído a partir da saliva e ensaios de reação em cadeia da polimerase (PCR) foram utilizados para a genotipagem dos atletas. Para conferir mais fidedignidade ao estudo, os atletas foram também separados de acordo com a idade. Antes desta separação, os atletas com a mutação no gene ACTN3 saltaram menos no teste Squat Jump (SJ) (RR/RX = 33,64 ± 5,31 vs XX = 30,81 ± 4,51 cm, p = 0,007), assim como nas categorias Sub-15 (RR/RX = 34,88 ± 5,39 vs XX = 30,59 ± 4,07 cm, p = 0,04) e Sub-17 (RR/RX = 35,82 ± 4,35 vs XX = 30,24 ± 5,16 cm, p = 0,01). No teste Counter Movement Jump (CMJ) os RR/RX saltaram 37,26 ± 5,72 cm e os XX 34,12 ± 4,84 cm (p = 0,005). Na categoria Sub-17, detectou-se que os RR/RX saltaram 38,56 ± 5,69 cm e os XX 32,90 ± 6,06 cm (p = 0,02). No teste Counter Movement Jump com os braços (CMJb), com todos os atletas, os RR/RX saltaram 43,85 ± 6,38 cm e os XX 40,61 ± 5,06 cm (p = 0,009). O teste de velocidade de deslocamento (30 m) revelou, na categoria Sub-17, que os RR/RX foram mais velozes que os atletas XX (RR/RX = 4,13 ± 0,13 vs XX = 4,27 ± 0,17 s, p = 0,04). Com relação ao gene AMPD1, nenhuma diferença significativa foi encontrada nos testes de saltos e endurance, porém no teste de velocidade de deslocamento (10 m), os atletas CC foram mais velozes comparados àqueles com genótipos CT/TT (CC = 1,53 ± 0,19 vs CT/TT = 1,62 ± 0,16 s, p = 0,04). Atletas com o genótipo DD (ECA) saltaram significativamente mais alto no teste CMJb comparados aos ID/II (DD = 44,37 ± 6,22 vs ID/II 42,35 ± 6,23 cm, p = 0,02). Na categoria Sub-17, os atletas DD saltaram mais nos testes SJ (DD = 38,04 ± 5,00 vs ID/II = 33,16 ± 4,11 cm, p = 0,01), CMJ (DD = 41,03 ± 5,64 vs ID/II = 35,76 ± 4,26 cm, p = 0,01) e CMJb (DD = 48,62 ± 5,98 vs ID/II = 42,42 ± 4,81 cm, p = 0,007). No teste de endurance, atletas da categoria Sub-16 com os genótipos ID/II, percorreram maiores distâncias comparados aos DD (ID/II = 1.467 ± 63,70 vs DD = 1.244 ± 64,25 m, p = 0,04). O genótipo DD do gene da ECA também favoreceu os atletas no teste de velocidade (30 m), pois jogadores da categoria Sub-14 com o referido genótipo foram mais velozes comparados aos ID/II (DD = 4,29 ± 0,19 vs ID/II = 4,40 ± 0,16 s, p = 0,02). O mesmo pôde ser visto para a categoria Sub-17 (DD = 4,07 ± 0,15 vs ID/II = 4,20 ± 0,13 s, p = 0,04). O polimorfismo no gene AGT parece não influenciar o desempenho nos testes propostos, porém atletas com o genótipo mutado (TT) apresentaram maior hipertrofia do ventrículo esquerdo (VE; 114,6 ± 105,2 g/m2 para TT; 92,16 ± 18,88 g/m2 para MT e 94,78 ± 21,08 g/m2 para MM, p = 0,04), sem qualquer outra alteração nos outros parâmetros cardíacos e hemodinâmicos. Maior hipertrofia do VE (DD = 96,95 ± 19,96; ID = 90,14 ± 21,58 e II = 91,67 ± 21,09 g/m2, p = 0,04) e maior fração de ejeção (DD = 71,73 ± 7,71; ID = 69,48 ± 6,51 e II = 68,59 ± 5,72 %, p = 0,02) também foram encontradas nos atletas com o genótipo DD. A análise da combinação dos genes no desempenho dos atletas, quando se privilegiaram as características de força e explosão muscular no ranqueamento por escore, revelou que os atletas com os escores mais altos (5 a 8) saltaram mais comparados àqueles com escores mais baixos (1 a 4) no teste SJ (Escore 5 a 8 = 33,80 ± 5,16 vs Escore 1 a 4 = 31,60 ± 5,22 cm, p = 0,01) e no teste CMJ (Escore 5 a 8 = 43,90 ± 6,85 vs Escore 1 a 4 = 41,87 ± 5,98 cm, p = 0,04). Os resultados do presente estudo sugerem que os genótipos RR/RX (ACTN3), DD (ECA) e CC (AMPD1) podem beneficiar os jogadores de futebol em atividades que requeiram força e rápida contração muscular. Além disso, os genótipos ID/II parecem proporcionar mais resistência aos atletas em atividade de endurance. Para o futuro, serão necessárias organização, padronização e responsabilidade ética no manejo desses dados genéticos para a utilização no processo de formação de atletas.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior In an attempt to solve the drought problem which causes the loss of agricultural productivity in the Brazilian semiarid zone, leading to starvation, unemployment and rural exodus, the Federal Government has deployed several public irrigated perimeters. In the State of Sergipe, we highlight the Irrigated California Area, which was intended to be the model of rational exploitation of soil and water in the northeast semi-arid. The main crops grown in this perimeter are acerola, banana, guava, mango, soursop, pumpkin, cassava, peanut, cowpea, maize, okra and tomato, with an average annual production of 12,682, 34 tons. Aiming to fulfill this agricultural demand, the use of pesticides and fertilizers is given in excess and without any technical support. This Perimeter is located in the surroundings of the Monumento Natural Grota do Angico a conservation unit. The excessive use of pesticides in this region can contaminate the environment, cause serious harm to human health, putting endangered the local wild species and those that inhabit the conservation area, can cause the loss of biodiversity and as a last destination can reach the water bodies near the plantations. Based on these data, we aimed in the present study to investigate the presence of pesticides with mutagenic effects in temporary water bodies in the Irrigated California Area by 2 tests: the SMART in the wings of D. melanogaster, in which the larvae were treated with water samples from 6 different points and the Micronucleus test, applied in erythrocytes of Hypsiboas creptans tadpoles collected in 3 water bodies between 2013 and 2014. The micronucleus test showed significantly higher frequency of micronuclei in tadpoles collected in one of the temporary water bodies in the Irrigated California Area (CD2) than the ones in the reference area (MNGA). In SMART Test we observed an increase in the frequency of mutant spot cells in the wings of D. melanogaster only in one of the water bodies (CD5), the one with no pesticides detected. The data presented here are pioneers in the evaluation of pesticides mutagenic effect in the semiarid irrigation areas of Sergipe and allow us to conclude that there are different sources of genotoxins presented in the Irrigated California Area, impacting the water and the resident biota, bringing huge risk for farmers and their families who live in that environment. Na tentativa de resolver o problema das secas, que causam a perda da produtividade agrícola na zona semiárida brasileira, gerando fome, desemprego e êxodo rural, o Governo Federal tem implantado diversos perímetros irrigados públicos. No Estado de Sergipe, destaca-se o Perímetro Irrigado Califórnia, que foi planejado para ser o modelo de exploração racional de solo e água no semiárido nordestino. As principais culturas exploradas neste Perímetro, são acerola, banana, goiaba, manga, graviola, abóbora, aipim, amendoim, feijão de corda, milho, quiabo e tomate, com uma média de produção anual de 12.682, 34 toneladas. Visando atender essa demanda agrícola, agrotóxicos e fertilizantes são usados em excesso e sem qualquer acompanhamento técnico. Este Perímetro localiza-se no município de Canindé de São Francisco, no entorno da unidade de Conservação Monumento Natural Grota do Angico. O uso excessivo de agrotóxicos nesta região pode contaminar o meio ambiente, causar sérios danos à saúde humana, colocar em risco de extinção as espécies selvagens do local e aquelas que habitam a unidade de conservação, podendo causar a perda da biodiversidade e, como último destino, podem alcançar os corpos de água próximos às plantações. Baseando-se nestes dados, o objetivo geral do presente estudo foi investigar a presença de agrotóxicos com efeitos mutagênicos em corpos de água temporários do Perímetro Irrigado Califórnia por meio de 2 testes: Teste SMART de asa em D. melanogaster, onde larvas foram tratadas com amostras de água de 6 diferentes pontos e o Teste do Micronúcleo, aplicado em eritrócitos de girinos da espécie Hypsiboas creptans, coletados em 3 corpos de água, entre 2013 e 2014. O Teste do micronúcleo mostrou frequência significativamente maior de micronúcleos nos girinos coletados em um dos corpos de água temporários do Perímetro Irrigado Califórnia (CD2) que da área de referência (Monumento Natural Grota do Angico). No Teste SMART observou-se aumento na frequência de manchas mutantes em células da asa de D melanogaster somente para um dos corpos de água (CD5). Os dados aqui apresentados são pioneiros na avaliação de efeito mutagênico de agrotóxicos em áreas de irrigação do semiárido sergipano e nos permitem concluir que há genotoxinas de diferentes fontes presentes no ambiente do Perímetro Irrigado Califórnia, com impacto sobre a água e a biota residente, trazendo enorme risco para os agricultores e suas famílias que convivem nesse ambiente.

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:31Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-28Bitstream added on 2015-03-03T12:06:34Z : No. of bitstreams: 1 000807446_20150227.pdf: 464768 bytes, checksum: 7654a1cf69fa8f20c440d8af16290f2d (MD5) A infecção pelo vírus da hepatite B (VHB) constitui um grave problema de saúde pública mundial, sendo responsável por doenças hepáticas agudas, crônicas, cirrose e hepatocarcinoma. Com o intuito de diminuir a replicação viral e a progressão da infecção pelo VHB, foram aprovadas sete drogas para o tratamento da hepatite B crônica nos últimos 20 anos, sendo que no Brasil, o protocolo de tratamento baseia-se no uso dos fármacos: Interferon-alfa, Inteferon-alfa peguilado, Lamivudina, Tenofovir, Entecavir e Adefovir. No entanto, um obstáculo à utilização das drogas que atuam inibindo enzimas virais é a emergência de variantes resistentes. Desta maneira, sabendo-se que o estudo da variabilidade genética das regiões genômicas do VHB é importante não somente para analisar o perfil de resistência do vírus aos antivirais, mas também para avaliar as variantes virais circulantes no Brasil, a finalidade deste trabalho foi determinar o perfil de mutações de resistência e polimorfismos genéticos em variantes do Vírus da Hepatite B circulantes na região de Botucatu. A região genômica pol do VHB foi amplificada e sequenciada a partir de metodologia in-house, para avaliar o perfil de mutações de resistência e de polimorfismos genéticos. Dados clínicos e laboratoriais foram coletados do prontuário médico dos pacientes. Os resultados obtidos demonstraram a presença das mutações de resistência rtM204V, rtM204I e rtL180M, que conferem resistência cruzada à Lamivudina e Telbivudina e, podem ocasionar resistência cruzada ao Entecavir quando na presença de mutação adicional. Em relação aos polimorfismos, 37 substituições foram encontradas, das quais várias já foram associadas à resistência primária ou secundária ao tratamento antiviral pelo VHB, sendo que 4 ainda não foram relatadas pela literatura, sendo elas Q262E, Q139H, W79C e W257H, o que demonstra que estas subststituições ... Hepatitis B virus (HBV) infection is a serious global public health problem, being responsible for acute and chronic liver diseases, cirrhosis and hepatocellular carcinoma. In order to reduce viral replication and progression of HBV infection, seven drugs for the treatment of chronic hepatitis B have been approved in the past 20 years, and in Brazil, the treatment protocol is based on the use of the drugs: Interferon-alpha, pegylated Interferon-alfa, Lamivudine, Tenofovir, Entecavir and Adefovir. However, an obstacle to the use of drugs that act by inhibiting viral enzymes is the emergence of resistant variants. Therefore, the study of the variability of HBV genome is important not only to assess the resistance profile of the virus to antivirals, but also to evaluate the circulating viral variants in Brazil. Thus, the purpose of this study was to evaluate the profile of resistance mutations and genetic polymorphisms in Hepatitis B virus variants circulating in Botucatu. HBV pol genomic region was amplified and sequenced by in-house methodology, to evaluate the profile of resistance mutations and genetic polymorphisms. Additional clinical and laboratory parameters were collected from the medical records of patients. The results showed the presence of rtM204V, rtM204I and rtL180M resistance mutations, which confer cross-resistance to Lamivudine and Telbivudine and, may cause cross-resistance to Entecavir in the presence of additional mutation. Regarding polymorphisms, 37 substitutions were found, including those associated to primary and secondary resistance to HBV treatment, and of these four substitutions have not been reported in the literature, which were Q262E, Q139H, W79C and W257H, demonstrating that these substitutions may be characteristic of HBV viral variants found in our region

Made available in DSpace on 2014-08-13T14:50:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-24Bitstream added on 2014-08-13T17:59:57Z : No. of bitstreams: 1 000768576_20150224.pdf: 717853 bytes, checksum: 7408062cb04624121242b566d21504b8 (MD5) Bitstreams deleted on 2015-02-27T13:20:27Z: 000768576_20150224.pdf,Bitstream added on 2015-02-27T13:21:08Z : No. of bitstreams: 1 000768576.pdf: 1163804 bytes, checksum: c3cfaf6eb851846fa541ad311558450c (MD5) A coinfecção HIV/VHC tornou-se um importante problema de saúde pública devido à possibilidade desses vírus agirem sinergicamente, acelerando a progressão da doença hepática relacionada ao VHC e podendo favorecer a proliferação do HIV. Apesar de estabelecido que a alta variabilidade genética do HIV gera mutações, conferindo ao vírus a capacidade de responder rapidamente as alterações da pressão seletiva exercida pelo sistema imunológico ou pela terapia antirretroviral (TARV), não é conhecido se a presença do VHC pode favorecer a emergência de variantes do HIV resistentes. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar o perfil de mutações de resistência a inibidores de transcriptase reversa: Inibidores de Transcriptase Reversa análogo nucleosídeo ou nucleotídeo (ITRNs), Inibidores de Transcriptase Reversa não análogo nucleosídeo (ITRNNs); e inibidores de protease (IPs) em variantes de HIV circulantes em indivíduos coinfectados pelo VHC. Foram incluídos 19 pacientes coinfectados pelos vírus HIV/VHC, maiores de 18 anos, com carga viral plasmática do HIV de pelo menos 1.000 cópias de RNA/mL, atendidos no Ambulatório de Gastroenterologia da Faculdade de Medicina de Botucatu e, no Hospital dia “Domingos Alves Meira”. A genotipagem e o sequenciamento foram realizados no Laboratório de Biologia Molecular do Hemocentro de Botucatu, Faculdade de Medicina, UNESP, utilizando o Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens HealthcareDiagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA). Foram observados dois subtipos do HIV-1, B e F, sendo o subtipo B o mais freqüente, 94,74%. Para o VHC foram observados os genótipos 1 (94,74%) e 3 (5,26%). Todos os pacientes apresentaram mutações de resistência as classes avaliadas, tendo maior freqüência mutações associadas aos ITRNs como M184V em 57,89%. As mutações associadas aos ITRNNs mais freqüentes foram a K103N e G190A, presentes em 21,05% das amostras. As mutações principais ... HIV/HCV coinfection has become an important public health problem due to the possibility of these viruses act synergistically, which can accelerate the progression of liver disease related to HCV and may favor the spread of HIV. It is established that the high genetic variability of HIV generates mutations, giving the virus the ability to respond quickly to changes in selective pressure exerted by the immune system or by antiretroviral therapy (ART). It is not known whether the presence of HCV can promote the emergence of resistant variants of HIV. Thus, this study aimed to evaluate the profile of resistance mutations to classes of reverse transcriptase inhibitors: nucleoside and nucleotide analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NRTIs), non-nucleoside analogue Reverse Transcriptase Inhibitors (NNRTIs) and protease inhibitors (PIs), in circulating HIV variants in HCV coinfected individuals. In this study were included 19 HIV/HCV coinfected patients, over 18, with plasma HIV viral load of at least 1,000 RNA copies/mL. These patients were treated at the Ambulatory of Gastroenterology of the Faculty of Medicine of Botucatu and at the Day-Hospital “Domingos Alves Meira”. Genotyping and sequencing were performed at the Laboratory of Molecular Biology of the Blood Center of Botucatu, Faculty of Medicine, UNESP, using the Trugene HIV-1 Genotyping Kit (Siemens HealthcareDiagnóstics, Inc. Tarrytown, NY, USA). Two subtypes of HIV-1, B and F, were observed, but the subtype B was observed more often, 94.74%. It was observed HCV genotypes 1 (94.74%) and 3 (5.26%). All patients presented resistance mutations to the evaluated classes, and the mutations associated to NRTIs as M184V were observed more often (57.89%). The most common mutations associated to NNRTIs were K103N and G190A, present in 21.05% of the samples. The main mutations associated to IPs more frequent were M46I, I54V and V82A, with 15.78% ...

Made available in DSpace on 2014-12-02T11:16:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-02-17Bitstream added on 2014-12-02T11:21:06Z : No. of bitstreams: 1 000773377_20160227.pdf: 491041 bytes, checksum: f98e8637abbf3b0b2af46cc71882d907 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-02-29T12:16:24Z: 000773377_20160227.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-02-29T12:17:23Z : No. of bitstreams: 1 000773377.pdf: 4008553 bytes, checksum: 946bb9dcb59b5183dfd4e4b97e56739d (MD5) Com o advento dos bens de consumo industrializados, tornou-se maior a demanda por compostos minerais, sendo o cobre um dos metais mais utilizados para a produção de componentes tecnológicos, o que confronta a atual capacidade das mineradoras, uma vez que as jazidas vem se esgotando progressivamente e portanto apresentam teores cada vez menores. Neste contexto, a Biohidrometalurgia, processo que utiliza micro-organismos que promovem a dissolução de minérios sulfetados para otimização da extração do metal de interesse, apresenta-se como alternativa promissora e mais ambientalmente adequada para a recuperação de metais a partir de minérios de baixo teor. A maior parte do cobre presente na natureza encontra-se na forma de calcopirita, mas esse sulfeto mineral é altamente refratário ao ataque químico e biológico. Atualmente não há processo biohidrometalúrgico comercial em operação para a extração do cobre da calcopirita. A maior limitação para isso não está nos aspectos operacionais do processo, mas nos micro-organismos envolvidos nele. Desta maneira, o objetivo deste trabalho foi obter novas linhagens mutantes utilizando técnicas da genética clássica (radiação ultravioleta) a partir de uma das principais bactérias envolvida neste processo a Acidithiobacillus ferrooxidans e disponível em nosso banco de linhagens e avalia-las quanto à alguns dos parâmetros envolvidos no processo. Por meio da aplicação de radiação ultravioleta em diferentes tempos (0, 10, 15, 30, 60, 120, 300, 600, 1800 e 7200 segundos) na linhagem selvagem de A. ferrooxidans foram obtidos dezoito linhagens mutantes para cada fonte energética. Estes mutantes foram avaliados quanto à capacidade de produção de ácido na presença de enxofre elementar e quanto às velocidades iniciais (v0) na cinética de oxidação dos íons ferrosos. As linhagens mutantes que se destacaram nestes aspectos foram utilizadas em ensaios de frascos agitados... Recent industrialization has demanded great amounts of mineral compounds copper is one of the most utilized in technological components manufacturing. The large increase in mining activities has resulted in lower grade mineral deposits. As a consequence, the demand for technical and economical solutions became critical. In this context, biohydrometalurgy, a process that uses microorganisms to perform mineral sulphide dissolution for improving metal extraction, has been pointed as a promising and environmentally safer solution for metal recovery from low grade mineral deposits. In its natural conditions most of copper is found as chalcopyrite, but this mineral sulphide is recalcitrant to chemical and biological dissolution. Nowadays, there is no commercial biohydrometalurgic processes for extracting copper from chalcopyrite. The biggest issue for this is not in the operational aspects of the process, but the microrganisms involved in it. The aims of this study were to obtain new mutant strains of Acidithiobacillus ferrooxidans, the main bacterium involved in this process, (available in our strains collection) using classical genetics tools (ultraviolet radiation) and study some parameters involved. By means of ultraviolet radiation directed to the wild strain of Acidithiobacillus ferrooxidans in different exposure periods (0, 10, 15, 30, 60, 120, 300, 600, 1800 and 7200 seconds), eighteen mutant strains were obtained for each energy source. These strains were evaluated regarding their capacity of acid production in the presence of elemental sulphur and initial velocities in the kinetics of ferrous ions oxidation. The cell suspensions with higher performances were submitted to shake flasks experiments in the presence of chalcopyrite. The selective pressure of UV radiation over the wild strain resulted in mutant bacteria that presented different behaviors towards kinetics consumption of its energetic sources. Nine strains from ferrous ions...

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014 Os vírus de genoma RNA apresentam uma ampla variabilidade genética, devido à alta taxa de mutação intrínseca associada à polimerase viral. Essas mutações ocorrerem de forma randômica, mas a variabilidade é desigual ao longo do genoma, pois mutações que resultam em efeitos deletérios sobre a aptidão são restritas. Dessa forma, o genoma é marcado por regiões permissivas para múltiplas mutações e locais críticos para estrutura e função viral. Dentre essas regiões críticas, vários trabalhos demonstraram que mutações na proteína do envelope (E) dos Dengue virus (DENV) têm impacto na aptidão e infectividade viral. Além de ser a proteína mais abundante da superfície do virion e seu principal determinante antigênico, a proteína E participa dos processos de adsorção e fusão do virion nas células hospedeiras, sendo essencial para a replicação do vírus. Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar a conservação e o papel do peptídeo E250-270 na infectividade dos DENV, através da síntese de vírus recombinantes mutantes. Inicialmente uma análise foi feita de modo a desenhar mutações que impactassem a sua estrutura secundária, ou interferissem com possíveis interações entre proteínas. Os fragmentos de DNA contendo essas mutações foram sintetizados e inseridos em um clone infeccioso do DENV-1, sorotipo BR/90, e então testados em ensaios de transfecção. Surpreendentemente, o vírus recombinate vBACMutJ, demonstrou um de nível replicação e espalhamento reduzido, em células de humanos e insetos, quando comparado ao selvagem, sugerindo que as mutações na sequência de E250-270 reduzem a infectividade viral. RNA viruses exhibit wide genetic variability due to the high intrinsic rate of mutation associated with viral polymerase. These mutations occur randomly, but the variability is uneven along the genome, since mutations that result in deleterious effects on fitness are limited. Thus, the genome is marked by regions permissive for multiple mutations, and critical sites for viral structure and function. Among these critical regions, several studies have shown that mutations in Dengue virus (DENV) envelope protein (E) impair viral fitness and infectivity. Besides it is the most abundant protein on the surface of the virion and its main antigenic determinant, the E protein participate in the process of adsorption and fusion into the host cell, and is essential for virus replication. In this context, the aim of this study was to evaluate the conservation and the role of the peptide E250-270 on DENV infectivity, through the synthesis of mutant recombinant viruses. Initially, an in depth analysis was performed in order to design mutations that would either disrupt its secondary structure or interfere with possible protein/protein interactions. DNA fragments containing these mutations were synthesized and inserted into an infectious clone of DENV-1, serotype BR/90, and then tested in transfection assays. Surprisingly, the recombinant virus vBACMutJ demonstrated a very low level of replication and spread, in human and insect cells, when compared to the wild type, suggesting that mutations in the sequence of E250-270 reduced the viral infectivity.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2014 O milho MON810 tem inserido em seu genoma o gene truncado cry1Ab oriundo da bactéria B. thuringiensis (Bt). O gene cry1Ab produz a proteína inseticida Cry1Ab que confere à planta resistência aos insetos da ordem Lepidoptera. Mas a inserção do gene cry1Ab no milho MON810 foi incompleta, dado que parte da região 3' da construção original não foi integrada no genoma do milho, incluindo o terminador NOS. Neste contexto, o principal objetivo foi detectar as possíveis interações da proteína Cry1Ab com as proteínas endógenas de milho. Neste estudo foram utilizadas folhas de milho MON810 no estádio V2 para a caracterização da proteína Cry1Ab e a detecção de possíveis proteínas ligadas à Cry1Ab. Na caracterização da Cry1Ab, foi quantificada a proteína Cry1Ab no limbo e na bainha das folhas por DAS-ELISA, mostrando que o conteúdo da proteína Cry1Ab no limbo (55,56 ± 6,54µg Cry1Ab/g massa fresca) foi seis vezes maior do que na bainha (10,29 ± 2,42µg /g massa fresca). Para a extração da proteína Cry1Ab os protocolos de Mekawi e Gruber resultaram em maior rendimento de extração da proteína Cry1Ab. Os extratos protéicos de milho MON810 foram analisados por Western Blot. O ensaio evidenciou quatro bandas imunorreativas de 70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa correspondentes à proteína Cry1Ab, embora em alguns dos extratos foram detectadas bandas imunorreativas maiores do que 120 kDa em vez da proteína Cry1Ab ativa (70 kDa e 65 kDa). No ensaio de imunoprecipitação foram identificadas 49 proteínas de milho coimunoprecipitadas com a proteína Cry1Ab. De forma similar, o ensaio de Ligand blot mostrou que a proteina Cry1Ab poderia estar ligada com proteinas do milho, especialmente uma de 18 kDa, presente tanto nas plantas transgênicas ou na isolinha. Em conclusão, este estudo encontrou (i) evidencia da interação entre a proteína Cry1Ab e proteínas do milho; (ii) variação na quantidade de proteína Cry1Ab em distintas partes da folha e (iii) quarto formas moleculares distintas (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa) da proteína Cry1Ab, ao invés de uma como indicado pela empresa proponente da tecnologia. Abstract: The MON810 maize has a truncated version of the cry1Ab gene from Bacillus thuringiensis inserted into its genome. The cry1Ab gene produces the insecticidal protein Cry1Ab that confers on the maize resistance to insects of the order Lepidoptera. The construct used in the genetic transformation of MON810 maize contained the CaMV 35S promoter, the hsp70 intron, the cry1Ab gene and the NOS terminator. However, a truncation at the 3 end of the cry1Ab gene led to the complete loss of the NOS terminator, and insertion of cry1Ab gene was incomplete. In this context, the aim of this work was to detect possible interactions of Cry1Ab protein with endogenous protein maize. This study used MON810 leaves (stage V2) to characterize the Cry1Ab protein and to detect possible interaction of Cry1Ab with endogenous maize proteins. To characterize the Cry protein, it was quantified in lamella and sheath by DAS-ELISA. Cry1Ab protein concentration in lamella (55.56 ± 6,54µg Cry1Ab / g fresh weight) was six times greater than the sheath (10.29 ± 2,42µg / g fresh weight). For the extraction of the Cry1Ab protein, five extraction protocols were compared. The protocols of Mekawi and Gruber gave the highest extraction yields of the Cry1Ab protein. The protein extracts of transgenic maize were analyzed by Western blot. The analysis revealed four immunoreactive bands immunoreactive (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa and 34 kDa) corresponding to the Cry1Ab protein, although in some extracts, immunoreactive bands greater than 120 kDa were detected instead of the active Cry1Ab protein (70 kDa and 65 kDa). In addition, in the immunoprecipitation assay there were 49 co-imunoprecipitated proteins from maize with the Cry1Ab protein. Similarly, Ligand blot assay showed that the Cry1Ab protein could be binding with maize proteins, especially an 18 kDa protein which was present in both transgenic and isogenic maize. In conclusion, it was found (i) evidence of interaction between Cry1Ab protein and corn proteins; (ii) variation in the amount of Cry1Ab in distinct part of the leaves, and (iii) four distinct molecular form (70 kDa, 65 kDa, 39 kDa e 34 kDa), instead one indicated by the proponent of the technology.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:11:34Z No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Flavia_Alvim_Dutra_de_freitas.pdf: 6194971 bytes, checksum: 89bcf99dd96a562f0930e66cdb88299a (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:11:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TESE_FINAL_PUBLICADA_Flavia_Alvim_Dutra_de_freitas.pdf: 6194971 bytes, checksum: 89bcf99dd96a562f0930e66cdb88299a (MD5) Previous issue date: 2013-11-27 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro Multidrug resistant (MR) tuberculosis is a major threat to public health due to the greater complexity, cost and side effects of treatment. Few studies have described the molecular epidemiology of MR Mycobacterium tuberculosis isolates in Brazil. In this study, we investigated the genetic diversity and mutations associated with drug resistance of 99 MR and 7 non-MR isolates collected in a 8-year period from 12 Brazilian states. This investigation was performed by restriction fragment length polymorphism analysis of the IS6110 insertion element (IS6110-RFLP), spoligotyping and sequencing of the rpoB and katG genes that, when mutated, confer resistance to isoniazid and rifampin, respectively. Mutations in rpoB and katG were found in 90.9% and 93% of the MR isolates analyzed, respectively. For the rpoB gene, 91.9% of the mutations were found in the 81-bp RRDR region Fifty-one (51.5%), 23 (23.3%) and 11 (11.1%) MR isolates had mutations in codons 531, 526 and 516, respectively. In the katG gene, mutations were found in 93% of the MR isolates analyzed. Seven isolates had mutations only in the first region analyzed (katG1). Codon 315 of the second katG gene region analyzed (katG2) had mutations in 82.8% of the MR isolates, mostly being a Ser315Thr substitution. Mutations were found in 30.3% of the MR isolates in the katG1 region and the majority was a codon 4 deletion. Spoligotyping detected 5 different M. tuberculosis families (with their subfamilies) in the MR isolates in this study. The most common were: LAM (46%), T (17%) and H (12%). We observed that one of the families, the EAI5, carries mutations in codon 463 of the katG gene, which does not occur for the other isolates. In addition, among our isolates we identified an isolate belonging to the Beijing family (highly virulent), but this fact is not alarming since this was only one case. We described new alleles for the rpoB and katG genes. With the exception of the X2 family, we identified an initial region of the katG gene with high frequency of mutations in the MR isolates. IS6110-RFLP analysis demonstrated that 25 isolates formed 11 genotypic groups while 74 showed a unique pattern of bands. This high rate of polymorphism indicates independent acquisition of resistance among our isolates. Concerning the H family, an inversion in the frequency of mutations occurred in the rpoB gene with codon 516 being the most mutated one followed by codons 526 and 531. The results of this study provide useful data for better understanding the spectrum of mutations of the MR isolates from patients in Brazil. Our results are also useful for the development of diagnostic tests for MR tuberculosis and to aid in tracking global transmission of this disease. A tuberculose multirresistente (MR) a drogas é uma séria ameaça à saúde pública devido à maiores complexidade, custo e efeitos colaterais do tratamento. Poucos estudos descreveram a epidemiologia molecular de isolados de Mycobacterium tuberculosis MR no Brasil. Neste trabalho foi investigada a diversidade genética e mutações associadas à resistência a drogas de 99 isolados MR e 7 não MR coletados em um período de 8 anos e provenientes de 12 estados brasileiros. Esta investigação foi feita através da análise do polimorfismo de fragmentos de restrição do elemento de inserção IS6110 (IS6110-RFLP), spoligotyping e sequenciamento de regiões dos genes rpoB e katG que conferem resistência aos antibióticos rifampicina e isoniazida, respectivamente. Mutações nos genes katG e rpoB foram encontradas em 90,9% e 93% dos isolados MR analisados, respectivamente. Para o gene rpoB, 91,9% das mutações estavam contidas na região RRDR de 81-pb. Um total de 51 (51.5%), 23 (23.3%) e 11 (11.1%) isolados MR apresentaram mutações nos códons 531, 526 e 516, respectivamente. Com relação ao gene katG, foram encontradas mutações em 93% dos isolados MR analisados, sendo que 7 apresentaram mutações apenas na primeira região analisada (katG1). O codon 315 da segunda região analisada do gene katG (katG2) apresentou mutações em 82.8% dos isolados MR, sendo a maioria Ser315Thr. A região katG1 apresentou mutações em 30.3% dos isolados MR sendo a maioria deleção do códon 4. Pelo spoligotyping foi possível determinar que os isolados MR deste estudo pertencem a 5 diferentes famílias (com suas subfamílias) de M. tuberculosis circulantes no Brasil, onde as mais frequentemente encontradas foram: LAM (46%), T (17%) e H (12%). Nós observamos que uma das famílias, a EAI5, carrega mutações no códon 463 do gene katG, o que não ocorre para as demais. Além disso, entre nossos isolados foi identificada um isolado pertencente à cepa Beijing (extremamente virulenta), mas este fato não é alarmante já que se tratou de apenas um caso. Através de nossos dados foram descritos novos alelos mutados para os genes rpoB e katG. Com exceção da família X2, foi identificada uma região inicial do gene katG com alta frequência de mutações nos isolados MR. A análise por IS6110-RFLP revelou que 25 isolados formaram 11 grupos genotípicos enquanto 74 mostraram um padrão único de bandas. Esta alta taxa de polimorfismo indica aquisição independente de resistência entre nossos isolados. Para a família H, foi identificada uma inversão na freqüência de ocorrência de mutações no gene rpoB, sendo o códon 516 o mais mutado, seguido pelo 526 e 531. Os resultados deste estudo fornecem informações úteis para um melhor entendimento do espectro de mutações dos isolados MR de pacientes no Brasil. Nossos resultados também se tornam úteis no desenvolvimento de testes diagnósticos de tuberculose MR e para auxiliar no rastreamento da transmissão global desta doença.

Tese de doutoramento, Bioquímica (Genética Molecular), Universidade de Lisboa, Faculdade de Ciências, 2013 Submitted by amelia Janeiro (ajaneiro@reitoria.ul.pt) on 2013-07-25T14:21:01Z No. of bitstreams: 1 ulsd66177_td_Jaime_Pita.pdf: 14748633 bytes, checksum: c4c6e3d4439fbe1f43f9449ff32c981a (MD5) Made available in DSpace on 2013-07-26T09:25:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulsd66177_td_Jaime_Pita.pdf: 14748633 bytes, checksum: c4c6e3d4439fbe1f43f9449ff32c981a (MD5) Previous issue date: 2013 Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/46096/2008); Fundação Calouste Gulbenkian; Chronic Disease Research Centre; Portuguese Society of Endocrinology, Diabetes and Metabolism.

Submitted by Boris INFORMAT (boris@uerj.br) on 2021-04-26T01:16:03Z No. of bitstreams: 1 Gabriela Westerlund Peixoto Neves Dissertacao completa.pdf: 1610206 bytes, checksum: 393c9b49e5d58a2bffed5ea94e9b341d (MD5) Made available in DSpace on 2021-04-26T01:16:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Gabriela Westerlund Peixoto Neves Dissertacao completa.pdf: 1610206 bytes, checksum: 393c9b49e5d58a2bffed5ea94e9b341d (MD5) Previous issue date: 2012-02-10 Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico Besides the emergency of more active and less toxic antifungal agents and the conventional use of antifungal prophylaxis, invasive mold infections have still high mortality rates, especially, invasive aspergillosis (IA). This life-threatening disease is a predominant fungal opportunistic infection for patients with long-term neutropenia, mostly HSCT recipients. Aspergillus fumigatus is the most important species causing IA and is already known as an angioinvasive fungal pathogen. Upon filamentation this fungus can damage and activate human vein endothelial cells (HUVEC) which in turn switch to a pro-thrombotic phenotype. HUVEC activation is known to be mediated by TNF-α once cell-cell contact occurs. The aim of this study was to investigate the endothelial activation ability of several mutants of A. fumigatus. Briefly, HUVECs were infected with germ tubes and conidia of A. fumigatus wild type (WT) Af293 and Ku80 and mutant (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) strains and a differential quantitative fluorescence assay performed to determine adhesion and internalization rates. Thus, a kinetic study of secreted pro-inflammatory cytokines and chemokines in HUVEC conditioned medium was achieved by a multiplex immuneassay. The cytokine production was assayed at three time points (4, 8 and 16 hours) using dead germ tubes, and at one time point (16 hours) using dead conidia, for an E:T ratio of 2:1. Additionally, to investigate endothelial activated phenotype, the expression of tissue factor was performed by a real time RT-PCR assay. The ugm1 mutant, which lacks the ugm1 gene encoding UDP-galactopyranose mutase, an enzyme responsible for the conversion of galactopyranose in galactofuranose, showed a hiperadherent phenotype and an increased capability to cause endothelial cell stimulation and activation. This mutant stimulated at least a 10-fold and 2.5-fold increase of TNF-alfa and IL-6 secretion, respectively and 2-fold increase of tissue factor expression by host cells, as compared to WT strains. Galactofuranose is an uncommon 5-membered ring form of galactose and a very important component of glycostructures of the A. fumigatus cell wall. The lack of this monosaccharide in the fungal cell wall leads to a compensatory mechanism characterized by an increment in the galactosaminogalactan expression. In contrast, the calA and crzA mutants, with upstream and downstream dysfunction in the calcium/calcineurin pathway, with alteration in the cell wall β-1,3-glucan content, showed a decrease capacity to adhere to HUVECs and did not induce both the secretion of pró-inflammatory cytokine and activation on endothelial cells. Furthermore, the mutant ΔprtT, witch lacks the transcriptional factor (prtT) that regulates the secretion of multiple proteases, showed the same adhesion and endothelial cell activation phenotype as observed for WT strains. As indicated in previous investigations, our data showed that conidia of A. fumigatus weren t able to cause the same endothelial cell cytokine stimulation observed for germ tubes, and that endothelial cell activation is independent on fungal cell viability. Finally, it s possible to conclude that the polymers of galactose in the cell wall of A. fumigatus, especially the galactosaminogalactan molecule, seem to be responsible for the endothelial cell interaction mechanisms and activation. Apesar do desenvolvimento de novas drogas antifúngicas e da sua utilização como terapia profilática visando à prevenção de infecções fúngicas invasivas, estas ainda constituem-se num problema emergente, com elevadas taxas de mortalidade. Neste contexto, destaca-se a aspergilose invasiva, uma infecção fúngica oportunista que acomete pacientes com neutropenia profunda e prolongada, principalmente os pacientes com leucemia aguda ou submetidos a transplante de medula óssea. Aspergillus fumigatus, um fungo filamentoso, é o principal agente etiológico da aspergilose invasiva, sendo um patógeno angioinvasivo. As hifas deste fungo são capazes de causar injúria e ativação endotelial, induzindo o endotélio a um fenótipo pró-trombótico, que por sua vez, é mediado pela secreção de citocinas pró-inflamatórias, em especial, o TNF-α. O presente trabalho teve como objetivo estudar a capacidade de cepas mutantes de A. fumigatus em ativar células endoteliais, avaliando o perfil de secreção de citocinas em meio condicionado e a expressão de fator tecidual. Resumidamente, monocamadas confluentes de células endoteliais isoladas da veia umbilical humana foram incubadas com conídios e tubos germinativos de cepas selvagens (Af293 e Ku80) e mutantes (Δugm1, ΔcalA, ΔcrzA, ΔprtT) de A. fumigatus. A taxa de adesão e endocitose destas cepas às monocamadas de HUVEC foi avaliada a partir de um ensaio quantitativo de imunofluorescência diferencial. O perfil cinético de secreção de citocinas foi determinado em meio condicionado das HUVECs, por ensaio de multiplex para IL-6, IL-8 e TNF-α. A ativação endotelial, por sua vez, foi determinada pela expressão de fator tecidual por RT-PCR em tempo real. Os resultados obtidos demonstraram que a mutante para o gene ugm1, responsável por codificar a enzima UDP-galactopiranose mutase, que converte resíduos de galactopiranose a galactofuranose, apresentou um fenótipo hiperaderente às células endoteliais e um estímulo 10 vezes maior à secreção de TNF-α e 2,5 vezes maior a secreção de IL-6, quando comparada a ativação observada para as cepas selvagens. A galactofuranose é um componente importante de glicoconjugados da parede celular de A. fumigatus. Dessa forma, a ausência desse monossacarídeo na célula fúngica leva a um mecanismo compensatório caracterizado por um aumento na expressão de moléculas de galactosaminogalactana na parede celular. De maneira contrária, mutantes para os genes calA e crzA, apresentaram um fenótipo hipoaderente às HUVECs e uma perda na capacidade de induzir a secreção de citocinas e ativar o endotélio. Essas mutantes apresentam deleções que interferem na via de cálcio/calcineurina, responsável por regular a morfogênese e virulência de A. fumigatus, além de apresentarem alterações no conteúdo de beta-1-3 glucana. Já a cepa ΔprtT, mutante para o fator de transcrição prtT que regula a secreção de múltiplas proteases, apresentou um fenótipo de adesão, estímulo e ativação endotelial semelhante ao observado para as cepas selvagens. A comparação entre a capacidade de conídios e tubos germinativos em ativar células endoteliais, corroborou achados anteriores da literatura que reportam que só hifas são capazes de ativar células endoteliais, independentemente da sua viabilidade. Os dados deste estudo permitiram concluir que dentre os componentes de superfície celular de A. fumigatus, os polímeros de galactose, em especial a galactosaminogalactana, parecem ser responsáveis, pelo menos em parte, pelos mecanismos de interação e ativação endotelial.

Orientador: Mônica Barbosa de Melo Dissertação (mestrado - Universidade Estadual de Campinas, Intituo de Biologia Resumo: O glaucoma compreende um grupo heterogêneo de neuropatias ópticas, caracterizadas pela escavação do disco óptico e perda progressiva do campo visual, representando uma das maiores causas mundiais de perda irreversível da visão. Em 1997, o gene Myocilin (MYOC) foi descoberto, e mutações neste gene foram envolvidas no desenvolvimento do glaucoma primário de ângulo aberto (GPAA) e do GPAA do tipo juvenil (GPAA-J). No Brasil, 35,7% e 3,85% dos pacientes com GPAA-J e GPAA, respectivamente, são portadores de mutações no gene MYOC. O gene citocromo P450, família 1, subfamília B, polipeptídeo 1 (CYP1B1), primeiramente associado ao glaucoma congênito primário, tem sido apontado como modulador do fenótipo do GPAA na presença de alterações no gene MYOC. Recentemente, observaram-se mutações no gene CYP1B1 associadas ao GPAA e GPAA-J, independentemente da presença de alterações estruturais no gene MYOC, em diferentes populações. Este projeto se propôs a avaliar mutações nos genes MYOC e CYP1B1, utilizando técnicas de PCR e sequenciamento direto, em 100 indivíduos pertencentes a famílias com GPAA ou GPAA-J e 43 pacientes não relacionados portadores de GPAA-J, bem como avaliar a possível modulação do gene CYP1B1 no fenótipo da doença. Uma nova mutação no gene MYOC, c.1187_1188insCCCAGA, foi identificada segregando com a doença em três gerações de uma família. De acordo com análises in silico, esta mutação pode alterar os contatos internos da proteína, além de comprometer um sítio de fosforilação de caseína quinase II. Nas demais três famílias foi detectada a mutação C433R, já descrita anteriormente. Como os membros das famílias apresentavam fenótipos bastante variados, foi realizada a análise da possível modulação do fenótipo da doença pelo gene CYP1B1. Contudo, as análises mostraram a não associação de variantes deste gene na modulação do fenótipo do glaucoma nestas famílias. Nos casos não relacionados de GPAA-J, foram observadas as mutações P370L, Q368X e C433R. Nenhuma mutação no gene CYP1B1 foi identificada nestes casos, mas somente polimorfismos: R48G, A119S, V243V, V432L, A443G, D449D e N453S. De acordo com este e outros estudos, é possível concluir que mutações no gene MYOC tem papel importante no desenvolvimento do GPAA e GPAA-J, sendo a mutação C433R a mais frequente na população brasileira. Além disso, o gene CYP1B1 parece ter menor contribuição no desenvolvimento destes tipos de glaucoma em nossa população Abstract: Glaucoma comprises a group of heterogeneous optic neuropathies characterized by excavation of the optic disc and progressive loss of visual field, representing a major global cause of irreversible blindness. In 1997, the Myocilin gene (MYOC) was discovered, and mutations in this gene were involved in the development of primary open-angle glaucoma (POAG) and juvenile-onset of POAG (JOAG). In Brazil, 35.7% and 3.85% of patients with POAG and JOAG, respectively, are carriers of mutations in the MYOC gene. The gene cytochrome P450, family 1, subfamily B, polypeptide 1 (CYP1B1), primarily associated with primary congenital glaucoma, has been related to phenotypic modulation of POAG in the presence of MYOC gene mutations. Recently, mutations in the CYP1B1 gene associated with POAG and JOAG were observed, regardless the presence of structural alterations in the MYOC gene in different populations. This project proposed to evaluate mutations in the MYOC and CYP1B1 genes using PCR and direct sequencing, in 100 individuals belonging to families with JOAG or POAG and 43 unrelated JOAG patients, and assess the possible role of the CYP1B1 gene in modulating the disease phenotype. A novel mutation in the MYOC gene, c.1187_1188insCCCAGA, was detected, segregating with the disease in three generations of one family. According to in silico analysis, this mutation can change the internal contacts of the protein, and has altered a phosphorylation site of casein kinase II. In the other three families the C433R mutation was detected, as described earlier. As family members presented with very different phenotypes, the CYP1B1 gene was evaluated as a possible modulator of the disease. However, the analysis showed no association of variants in CYP1B1 gene in modulating the glaucoma phenotype in these families. In unrelated cases of JOAG, the mutations P370L, Q368X and C433R were detected. No mutation in the CYP1B1 gene was observed in these cases, but only polymorphisms: R48G, A119S, V243V, V432L, A443G, D449D, and N453S. According to the present and other studies, we conclude that mutations in the MYOC gene play an important role in the development of POAG and JOAG, and the C433R mutation is the most frequent MYOC alteration in the Brazilian population. Furthermore, the CYP1B1 gene seems to have less contribution to the development of these types of glaucoma in our population Mestrado Genética Animal e Evolução Mestre em Genética e Biologia Molecular

A peçonha da aranha brasileira Phoneutria nigriventer, conhecida popularmente como armadeira, é composta por diversas toxinas ativas em canais iônicos e outros receptores de mamíferos e insetos. Os envenenamentos envolvendo seres humanos são caracterizados por vários sintomas, incluindo neurotoxicidade, dor intensa, sudorese, agitação, salivação, priapismo, perturbações cardíacas, como taquicardia, arritmia e morte. Priapismo é uma ereção dolorosa e involuntária do pênis, também verificada na presença das toxinas purificadas, PnTx2-5 e PnTx2-6. Estudos eletrofisiológicos mostraram que estas toxinas deslocam a corrente de inativação de canais para sódio para potenciais hiperpolarizantes. Nosso grupo vem estudando o efeito da toxina PnTx2-6 na função erétil de ratos e camUongos. O tratamento com esta toxina potenciou a função erétil de ratos normotensos e reverteu total ou parcialmente, a disfunção erétil de ratos hipertensos DOCA-sal, e de camUongos idosos e diabéticos. O seu efeito mostrou-se ser mediado pelo NO, que aumenta na presença desta molécula. Estes resultados sugerem que a PnTx2-6 pode ser uma importante ferramenta para o desenvolvimento de novos agentes farmacológicos para o tratamento de disfunção erétil. Esta toxina é produzida em baixa quantidade na glândula de peçonha da aranha e isto é um fator limitante para estes estudos. Desta forma, houve um grande interesse na produção da proteína recombinante, de modo a provê-la para uma ampla investigação. Neste estudo, a região codificadora da toxina PnTx2-6 foi clonada e expressa como uma proteína de fusão à tiorredoxina, no citoplasma de E. coli. Após purificações e clivagens, testes in vivo indicam que a toxina recombinante apresenta atividade similar à toxina nativa e análises de Western-Blot revelaram que anticorpos anti-peçonha de Phoneutria nigriventer foram reativos contra esta molécula. O efeito da rPnTx2-6 na função erétil foi avaliado através de mudanças na razão entre a pressão intracavernosal e pressão arterial média (PIC/PAM) sob estimulação elétrica do gânglio pélvico maior de ratos normotensos. Injeções subcutâneas de rPnTx2-6 (12g/kg), como verificado para a toxina nativa, potenciaram a relação PIC/PAM sob estimulação gangliônica. A proteína de fusão recombinante foi efetiva, por sua vez, aumentando a liberação de glutamato em sinaptosomas cérebro-corticais de rato. Obtivemos também mutantes da toxina recombinante, visando-se verificar o papel chave de certos resíduos de aminoácidos para a ação desta toxina, conforme previsto por estudos prévios de modelagem molecular. Os mutantes foram construídos por síntese in vitro usando-se iniciadores específicos que continham em seus flancos as regiões de mutação. O vetor recombinante pET32c (+)-PnTx2-6, anteriormente clonado, foi usado como um molde para as mutações. Os plasmídeos mutantes foram transformados em E. coli, sequenciadas e expressas como proteínas de fusão à tiorredoxina. Estas foram purificadas (por cromatografia de afinidade e gel filtração). Até o momento, 6 mutantes foram idealizados (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35NW37L; Y35AW37A), dois quais 5 foram sequenciados (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35AW37A) purificados e suas massas moleculares foram determinadas. Em comparação com a toxina nativa e a proteína de fusão recombinante, as proteínas de fusão mutantes foram testadas quanto à liberação de glutamato e foram menos ativas. Em conclusão, neste trabalho expressaram-se rPnTx2-6 e alguns de seus mutantes (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35AW37A), evidenciando-se o papel chave de alguns de seus resíduos de aminoácidos implicados na atividade biológica desta toxina. The venom of Brazilian armed spider, Phoneutria nigriventer, contains several toxins; many of them are active on ion channels and other receptors of mammals and insects. Accidents involving humans are characterized by various symptoms including: neurotoxicity, intense pain, sudoresis, agitation, salivation, priapism, cardiac perturbations characterized by tachycardia, arrhythmia and death. Priapism is a painful and involuntary erection of the penis that is also induced by the purified toxins PnTx2-5 and PnTx2-6. In addition, electrophysiological studies have shown that these toxins slow down the inactivation current of sodium channels. Our group has studied the effects of PnTx2-6 in erectile function of rats and mice. It has shown that PnTx2-6 potentiates the erectile function in normotensive rats and fully or partially restored the erectile function of DOCA-salt hypertensive rats, stz-diabetics and old mice. The effects of PnTx2-6 on erectile function are shown to be mediated by NO that increases in the presence of this toxin. These results suggest that PnTx2-6 could be an important tool for the development of new pharmacological agents for the treatment of erectile dysfunction. As the toxin is produced in low quantity in the spiders venom gland, this is a limiting factor for studies. Therefore, the recombinant production of this toxin is of great interest providing it to a range of experimental approaches. In this study, the encoding region of the PnTx2-6 toxin was cloned and expressed as thioredoxin fusion protein in the cytoplasm of E. coli. After purification and cleavage, tests in vivo indicated that the recombinant toxin presents activity similar to that of the native toxin and the Western-Blotting analysis revealed that the anti-venom antibody of Phoneutria nigriventer is reactive against recombinant toxin. The effect of rPnTx2-6 in the erection function was evaluated through changes in intracavernosal pressure/mean arterial pressure ratio (ICP/MAP) during electrical stimulation of the major pelvic ganglion of normotensive rats. Subcutaneous injection of rPnTx2-6 (12g/kg), as the natural peptide, potentiated the ICP/MAP induced by ganglionic stimulation. The rPnTx2-6 fusion protein increased the glutamate release by cortical synaptosomes in the rat brain. We also obtained mutant fusion proteins to check for the key role of certain amino acid residues in the toxin action, as previously suggested by molecular modeling. The mutants were constructed from in vitro synthesis by using specific primers that flanked the regions of mutations. The recombinant vector pET32c(+)-PnTx2-6, previously cloned, was used as a template for mutations. The mutant plamids were transformed in E. coli, sequenced, and expressed as thioredoxin fusion proteins. The mutant fusion proteins were purified (affinity and gel filtration chromatographies). To date, six mutants were idealized (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35NW37L; Y35AW37A). Five (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35AW37A) were sequenced (DNA), purified, and their molecular masses were determined. The mutant fusion proteins, comparative with native toxin and recombinant fusion proteins, were tested for their effect on glutamate release. All the mutants were less effective in releasing glutamate compared to the native toxin PnTx2-6 and recombinant fusion protein rPnTx2-6. In conclusion,we expressed the rPnTx2-6 active and some of its mutants (Y35N; Y35A; W37L; W37A; Y35AW37A) evidencing the key role of some amino acid residues implied in the biological activity of this toxin.

Resumo: A maioria dos recursos biologicos da Terra estao localizados em ambientes costeiros e nos grandes sistemas de bacias fluviais. No entanto, mais de 3 bilhoes de pessoas vivem em estreita proximidade desses locais. Como consequencia dessa situacao, grande parte dos residuos gerados, tanto industriais como domesticos, ocorrem nessas areas. A atrazina e utilizada desde os anos 50, sendo desde entao um dos herbicidas mais utilizados no mundo, com estimativas de aplicacao entre 70.000 e 90.000 toneladas por ano. Esse produto foi banido na Uniao Europeia em 2004, no enquanto continua sendo o segundo herbicida mais utilizado no mundo. O cobre e um micronutriente para a vida, presente em todos os ambientes aquaticos naturais e sedimentos. No entanto, ele pode se tornar prejudicial quando sua concentracao ultrapassa certos limites naturais, sendo considerado um dos metais mais toxicos para peixes. Os sais de cobre sao intencionalmente introduzidos nos corpos d'agua como herbicidas, algicidas e moluscicidas em todo o mundo. Resultados controversos sobre a toxicidade da atrazina foram obtidos por diferentes autores nos ultimos anos, e poucos trabalhos tem sido desenvolvidos utilizando o sal cloreto de cobre (II) para se avaliar os efeitos desse metal sobre organismos aquaticos. Dessa forma, o objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial genotoxico da Atrazina e do Cloreto de Cobre em tres concentracoes, em biensaios estatico (BE) e semi-estatico (BSE), utilizando o teste do micronucleo pisceo (MNP) e o ensaio cometa em branquias (ECB) e eritrocitos (ECE). Nossos resultados mostram efeitos deleterios ao DNA de Rhamdia quelen, expostos a todas as concentracoes de atrazina, atraves do teste do micronucleo pisceo. ECE, em ambos experimentos, mostra um efeito dose-dependente do contaminante sobre o bioindicador, no entanto para branquias apenas foram observados danos nas concentracoes de 2 e 100 ƒÊg.L-1 no BSE. Danos ao DNA de eritrocitos foram observados atraves do MNP em concentracoes de 9 e 18 ƒÊg.L-1. Tanto o ECE quanto o ECB foram capazes de detectar danos ao material genetico das celulas em todas as concentracoes teste. Apenas no BE a concentracao de 2 ƒÊg.L-1 nao causou danos significativos em relacao ao controle pelo ECB. Nossos resultados apontam para um efeito genotoxico dose-dependente de ambos contaminantes, sendo que existem indicos que a ATZ causa danos ao DNA de Rhamdia quelen mesmo na concentracao permitida pela legislacao brasileira (2 ƒÊg.L-1). O mesmo pode ser dito para o cobre, sendo que os resultados obtidos pelo ensaio cometa, para ambos os tecidos, evidenciaram efeitos genotoxicos do metal na concentracao de 9 ƒÊg.L-1, que e o limite estipulado pela legislacao do pais.