Multidrug resistance is a major public health issue, which requires urgent development of new antibiotics and thus identification of original bacterial targets. NADK is the only known enzyme producing NADP(H) by 2'-phosphorylation of NAD(H) using ATP as phosphate donor. NADP(H) is a major cofactor in virtually all living organisms. It is used by oxidoreductases in key metabolic pathways, such as the tricarboxylic cycle, the pentose phosphate pathway, and fatty acid or amino acid biosynthesis. NADK activity has been shown to be essential for growth of clinically relevant pathogenic bacteria such as Mycobacterium tuberculosis, Salmonella enterica and Pseudomonas aeruginosa. Importantly, bacterial and human NADK share less than 25% sequence identity. Thus, bacterial NADK could be a promising target for antibiotic discovery. A collaborative initiative involving our laboratory led to synthesis of the first bacterial NADK inhibitor, NKI1, using fragment-based drug design and screening by X-ray crystallography. NKI1 is a diadenosine derivative that inhibits growth of Staphylococcus aureus both in vitro and in a murine model of acute hematogenous pyelonephritis. Target validation is a decisive step in the drug development process. Accordingly, we investigated NADK targeting by NKI1 using a combination of genetic and biochemical approaches. First, we showed that decreasing expression of the NADK gene ppnK by CRISPR interference led to increased susceptibility of S. aureus to NKI1. Second, treatment of S. aureus with NKI1 led to reduced NADP(H)/NAD(H) ratios. Together, these results suggest that NKI1 targets NADK in bacteria. In order to identify improved compounds, we next screened a series of small synthetic diadenosine derivatives for their capacity to inhibit S. aureus growth in vitro. We identified NKI2, a derivative of NKI1 characterized by increased solubility and antibacterial efficiency. Super-resolution microscopy provided the nanoscale localization of a fluorescent derivative of NKI2 within bacteria. We further showed by electron microscopy that genetic and chemical inhibition of NADK by CRISPR interference and NKI2, respectively, resulted in loss of bacterial envelope integrity and leakage of cytoplasmic content. While the enzymatic activity of the NADK protein has been extensively studied, little is known about its role in bacterial physiology and its contribution to the infection process triggered by pathogenic bacteria remains to be determined. In order to get a better understanding of the role of NADK and thereby of the anti-infectious activity of NADK inhibitors, we measured growth of S. aureus whose NADK gene expression was decreased in conditions mimicking those encountered during infection. Strikingly, reducing NADK expression impaired bacterial survival under oxidative, osmotic, membrane and antibiotic-mediated stresses. These growth defects were even more dramatic upon calcium chelation by EGTA, suggesting a role for calcium in NADK activity. CRISPR interference-mediated knock-down of NADK expression also reduced S. aureus survival in murine macrophages in vitro and in a zebrafish infection model. Overall, our study reveals that NADK is a key metabolic enzyme that affects virulence and resistance to antibiotics, and provides original lead compounds inhibiting NADK, active against S. aureus.; La résistance aux antibiotiques est en enjeu de santé publique majeur, requérant le développement de nouveaux antibiotiques et l'identification de nouvelles cibles bactériennes originales. NADK est l'unique enzyme connue produisant du NADP(H) par la phosphorylation en 2' du NAD(H), utilisant l'ATP comme donneur de phosphate. NADP(H) est un cofacteur majeur, présent chez la quasi-totalité des êtres vivants. Il est utilisé par les oxydoréductases dans des voies métaboliques clés, comme le cycle de Krebs, la voie des pentoses phosphates et la biosynthèse des acides gras et acides aminés. L'activité de la NADK est essentielle pour la croissance de pathogènes comme Mycobacterium tuberculosis, Salmonella enterica et Pseudomonas aeruginosa. De plus, les NADK bactériennes et humaines partagent moins de 25% d'identité de séquence. Ainsi, la NADK bactérienne semble être une cible prometteuse pour la découverte d'antibiotiques. Une initiative collaboratrice impliquant notre laboratoire a permis la synthèse du premier inhibiteur d'une NADK bactérienne, NKI1, par un design par fragments et une sélection par cristallographie à rayons X. NKI1 est un dérivé diadénosine qui inhibe la croissance de Staphylococcus aureus à la fois in vivo et dans un modèle murin de pyélonéphrite hématogène aiguë. La validation de la cible est une étape importante lors du développement d'un médicament. Ainsi, nous avons vérifié que NKI1 cible la NADK par une utilisation d'outils génétiques et biochimiques. Premièrement, nous avons montré qu'une diminution de l'expression de ppnK, gène codant pour la NADK, par une interférence médiée par CRISPR, augmente la susceptibilité de S. aureus au NKI1. Deuxièmement, le traitement de S. aureus par NKI1 diminue les ratios NADP(H)/NAD(H). Ensembles, ces résultats suggèrent que NKI1 cible la NADK bactérienne. Afin d'identifier de meilleurs composés, nous avons testé la capacité d'une série de dérivés diadénosine à inhiber la croissance de S. aureus in vitro. Nous avons identifié NKI2, un dérivé de NKI1, ayant une meilleure solubilité et une plus grande efficacité antibactérienne. La microscopie super-résolutive a permis une localisation nanoscopique d'un dérivé fluorescent du NKI1 au sein de la bactérie. Nous avons également montré par microscopie électronique que l'inhibition génétique ou chimique de la NADK, par interférence par CRISPR ou NKI2 respectivement, résulte en une perte de l'intégrité de l'enveloppe bactérienne, entraînant une fuite du contenu cytoplasmique. Alors que l'activité enzymatique de la NADK a été largement étudiée, peu de choses sont connues sur son rôle dans la physiologie bactérienne et sa contribution chez les bactéries pathogènes lors du processus d'infection reste à être déterminée. Afin de mieux comprendre le rôle de la NADK et ainsi l'activité anti-infectieuse d'inhibiteurs de la NADK, nous avons mesuré la croissance de S. aureus dont l'expression de la NADK a été inhibée, dans des conditions mimant celles rencontrées lors d'une infection. Remarquablement, une réduction de l'expression de la NADK impacte la survie bactérienne lors d'un stress oxydatif, osmotique, membranaire ou induit par des antibiotiques. Ces déficits de croissance sont d'avantage dramatiques lors d'une chélation du calcium par EGTA, suggérant un rôle du calcium dans l'activité de la NADK. La diminution de l'expression de la NADK par CRISPR interférence réduit également la survie de S. aureus dans des macrophages murins in vitro ainsi que dans un modèle d'infection de zebrafish. Ainsi, notre étude montre que la NADK est une enzyme clé du métabolisme qui affecter la virulence et la résistance aux antibiotiques, mais a aussi permis l'obtention d'un nouveau composé inhibant la NADK, actif contre S. aureus.