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Tesis Univ. Granada. Departamento de Química Física. Leída el 15 de julio de 2005

Los capítulos II, III, IV, V y Vi de esta tesis están sujetos a confidencialidad por el autor. 102 p.

161 p., The sarcomere-based structure of muscles is conserved among vertebrates; however, vertebrate muscle physiology is extremely diverse. A molecular explanation for this muscle diversity and its evolution has not been proposed. In this Thesis, We use phylogenetic analysis and single-molecule force spectroscopy (smFS) to investigate the mechanochemical evolution of titin, a giant protein responsible for the elasticity of muscle filaments. We bring back to life eight-domain fragments of titin corresponding to ancestors to mammals, sauropsids, and tetrapods, that lived 105-356 Myr, and compare them with some of their modern descendants. We demonstrate that resurrected titin molecules are rich in disulfide bonds and display high mechanical stability. These mechanochemical elements have changed over time creating a paleomechanical trend that correlates with animal body size, allowing us to estimate the size of extinct species. We hypothesize that mechanical adjustments in titin contributed to physiological changes that allowed the muscular development and diversity of modern tetrapods., CICNanoGUNE

224 p. En esta tesis doctoral el objetivo ha sido estudiar la nanomecánica de proteínas de superficie celular involucradas en la adhesión de patógenos a células humanas. Concretamente se han estudiado lasproteínas que utiliza Escherichia coli uropatogénica para unirse al tracto urinario, y el receptor CD4 de los linfocitos T que es empleado por el Virus de la Inmunodeficiencia Humana (VIH) para unirse e infectar a estas células del sistema inmune. Ambos procesos infecciosos han sido estudiados en profundidad desde diversos campos del conocimiento como la Medicina, la Biología, la Química y la Física, empleando diversas técnicas que han aportado información útil para el desarrollo de tratamientos médicos. Sin embargo, y pese a todos los avances logrados, estas enfermedades aún hoy suponen un desafío para la comunidad científica y médica. Las infecciones del tracto urinario son muy comunes y recurrentes entre la población. Aunque en muchos casos se resuelvan de manera favorable, el problema de la resistencia a antibióticos es cada vez mayor y ya hoy supone un problema grave de salud pública. Las cepas patogénicas están adquiriendo resistencia a cada vez más antibióticos, y tratamientos que antes funcionaban han dejado de hacerlo. Complicaciones derivadas de una infección del tracto urinario pueden desembocar en graves problemas de salud que en última instancia pueden provocar la muerte. En el caso del VIH los avances científicos han permitido transformar una enfermedad mortal en una enfermedad crónica, mejorando sensiblemente la calidad de vida de las personas que viven con la infección. No obstante a día de hoy no existe una cura para esta enfermedad de distribución mundial, de la que cada año alrededor de un millón de personas se contagia. La enorme capacidad del virus para eludir al sistema inmune y para, de hecho, utilizar y destruir a las mismas células que deberían combatirlo lo convierten en un desafío para la Medicina. Si bien estos dos patógenos son diferentes existen paralelismos entre ambos que además son exportables a otros casos. Independientemente de la etiología de cada caso, todo proceso infeccioso comienza por el reconocimiento y la adhesión del patógeno a la superficie de la célula que infecta. Para esto las bacterias y los virus utilizan moléculas expuestas tanto en sus propias superficies como en las de las células a las que se unen, siendo mayoritariamente proteínas las moléculas que median el anclaje específico entre los actores involucrados. Una vez superado este primer escollo del proceso infectivo el patógeno puede proceder con su ciclo de vida y expandirse, infectando nuevas células usando mecanismos similares y, en consecuencia, deteriorando la salud del huésped. Tanto en el caso de E. coli uropatogénica como en el del VIH, el patógeno debe unirse a sus células diana de manera específica y superar obstáculos que se oponen a su adhesión física, tales como condiciones químicas adversas o la respuesta del sistema inmune. Entre estas dificultades se encuentran las fuerzas mecánicas, un ámbito muy inexplorado pero a la vez crucial tanto para el éxito como para el fracaso de una infección. El diseño y el uso de medicamentos que alteren mecánicamente a las proteínas empleadas durante la adhesión patogénica podría suponer un avance ante los desafíos que tiene que afrontar la Medicina moderna. A la luz de esta nueva aproximación orientada a alterar mecánicamente proteínas involucradas en enfermedades humanas nace el campo de la Mecanomedicina o Mecanofarmacología, una nueva forma de estudiar y de tratar patologías donde un componente mecánico juega un papel importante. Debido a que las fuerzas mecánicas intervienen en este proceso, creemos que la adhesión patogénica constituye un ámbito de acción apropiado para el desarrollo de este nuevo campo. El estudio desde este nuevo punto de vista cobra sentido cuando se atiende a las peculiaridades de la infección del tracto urinario. En su ruta de ascenso desde la uretra, E. coli debe avanzar por el tracto urinario y permanecer unida al epitelio en contra del flujo de orina. En ausencia de mecanismos de adhesión sería expulsada durante la micción y por ello, de entre un arsenal de factores, dispone de estructuras filamentosas denominadas pili o fimbrias que le sirven para unirse de manera específica a las células del epitelio urinario. Existen distintos tipos de fimbrias pero las empleadas por este organismo en el tracto urinario inferior son las denominadas de tipo I. Estos filamentos poseen diversas propiedades biomecánicas que le otorgan a la bacteria una adaptación extraordinaria para poder prosperar y resistir en este nicho tan adverso de la anatomía humana. Una cualidad muy interesante de estas estructuras, que pueden llegar a medir varias micras de longitud, es el modo en el que están organizadas y ensambladas. Estos filamentos están compuestos de cientos de proteínas dispuestas linealmente, en el que cada unidad de proteína está conectada a la siguiente mediante interacciones débiles de tipo hidrofóbico y puentes de hidrógeno. De manera que estas largas cadenas de proteínas conectadas, empleadas como anclajes que deben resistir estrés mecánico, mantienen su integridad mediante interacciones en apariencia débiles pero que se han demostrado como unas de las más resistentes de la naturaleza. Ante el creciente problema de resistencia a antibióticos, atacar los pili podría suponer una alternativa válida para impedir la adhesión bacteriana en primer lugar. En este sentido comprender las propiedades nanomecánicas de las proteínas que componen el pilus así como el proceso de biogénesis de este puede ser el comienzo para diseñar nuevos tratamientos que alteren la estabilidad mecánica de estos filamentos, o bien el proceso de ensamblaje y secreción del pilus en la superficie de la bacteria. En el caso del VIH la adhesión se produce preferencialmente a los linfocitos T del sistema inmune, y para esto utiliza un receptor propio de la membrana del linfocito denominado CD4. La partícula vírica expone en su superficie un complejo proteico formado de dos glicoproteínas que median tanto la adhesión como la posterior fusión del virus con la célula. Una de estas proteínas se une de manera específica pero no covalente a CD4, estableciendo el anclaje en la superficie de la célula. Posteriormente esta misma glicoproteína reconoce a un segundo receptor de membrana en la célula y tras su unión se desencadena el proceso que conduce a la fusión del virus con la célula. Los esfuerzos realizados para encontrar una vacuna efectiva contra el VIH han sido frustrados debido a la naturaleza del virus. El VIH dispone de una serie de ventajas que le permiten eludir al sistema inmune, tales como la glicosilación de las dos únicas proteínas que expone en su superficie así como de su alta tasa de mutación, lo que se traduce en la rápida generación de variantes de estas proteínas. Esto convierte a la lucha del sistema inmune contra este patógeno en una carrera de fondo en la que el virus es siempre más rápido. Además la habilidad para integrarse en el genoma de las células y permanecer escondido en estas lo hace indetectable hasta que vuelve a reaparecer para infectar nuevas células. La interacción con el receptor CD4 es clave y es la primera que conduce a una infección exitosa. El posterior proceso de unión a un segundo receptor en la membrana del linfocito supone el acercamiento del virus a la membrana mientras está unido a CD4, lo que implicaría que CD4 debería ser una molécula flexible que permitiera esta aproximación. Diversos cambios estructurales y químicos ocurren en las moléculas involucradas en la infección, y las fuerzas mecánicas de nuevo no están exentas en este proceso. Una partícula vírica unida al receptor CD4 está sometida a movimiento Browniano, de manera que el virus podría ejercer fuerzas en CD4 que le permitirían estirar a esta molécula para así acercarse al segundo receptor de membrana. Obviamente el rango de fuerzas en las que esto se podría producir tiene que ser muy bajo, de lo contrario el virus podría separarse de CD4 y alejarse de la superficie celular. En este sentido un delicado equilibrio de fuerzas podría inducir la extensión y la contracción mecánicamente inducida de CD4, pero sin comprometer la unión del virus. Aunque las fuerzas aquí tengan un papel menos conspicuo que en el caso de la infección del tracto urinario, también pueden ser decisivas y por lo tanto soluciones a la infección por el VIH pueden ser encontradas desde un abordaje mecanofarmacológico. Comprender la nanomecánica de CD4 así como el efecto de ciertos factores que se conoce que afectan a esta molécula, podría ser el primer paso para diseñar terapias orientadas a combatir al VIH desde el primer paso de la infección. Bloquear el proceso de infección en este punto supondría evitar la infección por completo. Aunque no supusiera una cura definitiva para aquellas personas que padecen la infección, limitaría su propagación en estos pacientes y además podría ser utilizado como medida profiláctica para prevenir nuevas infecciones. Conociendo este contexto nuestro planteamiento ha sido abordar estos dos procesos de adhesión desde un punto de vista mecánico, explorando cómo las fuerzas y ciertas modificaciones químicas afectan mecánicamente a las proteínas involucradas. Para ello en esta tesis se ha empleado la espectroscopia de fuerza atómica para aplicar fuerzas a moléculas únicas y así poder determinar su comportamiento mecánico bajo diferentes condiciones. En primer lugar nuestro objetivo fue determinar la estabilidad mecánica de las proteínas que componen el pilus tipo I de E. coli uropatogénica. Se diseñaron proteínas quiméricas en las que se preservó la interacción nativa que mantiene a cada proteína del pilus unida a su predecesora mediante la creación de permutantes circulares. La espectroscopia de fuerza en este caso nos permite aplicar fuerzas y explorar la resistencia mecánica de estas proteínas y de sus interacciones recreando la misma geometría que tendría lugar en el proceso in vivo cuando una bacteria es empujada por el flujo de orina y el pilus anclado al epitelio es estirado longitudinalmente. Nuestros experimentos de fuerza han demostrado la altísima resistencia mecánica de estas proteínas, cuyos valores van desde los 500 pN para la proteína que está más representada en el pilus tipo I, hasta los 100 pN en la última proteína del pilus que media la adhesión al epitelio urinario. De manera muy significativa observamos que la estabilidad mecánica de estas proteínas es jerárquica y está relacionada con la arquitectura del pilus, siendo las proteínas más débiles a medida que se aproxima el final del pilus. Además detectamos el efecto mecánico que tiene un puente disulfuro muy conservado en estas proteínas, cuya presencia incrementa sustancialmente la estabilidad de estas proteínas. Esta parte de la investigación verificó la enorme estabilidad mecánica de estas proteínas, de lo resistente que es la interacción no covalente entre proteínas del pilus y de lo importante que es la presencia del puente disulfuro en cada una de ellas para garantizar la integridad mecánica de cada una de las proteínas. En la segunda parte de esta investigación decidimos estudiar el proceso de biogénesis del pilus tipo I. Estudiamos el plegamiento y maduración de una de las proteínas del pilus tipo I a nivel de molécula única y en presencia de los factores que la ayudan en este proceso. La espectroscopia de fuerza en este caso es útil para recrear las condiciones de desplegamiento y estiramiento que tiene la proteína cuando está siendo exportada al periplasma bacteriano, compartimento desde donde estas proteínas son incorporadas y secretadas durante el ensamblaje del pilus. Nuestros primeros hallazgos en presencia de la chaperona que ayuda a estas proteínas a plegarse y a ser incorporadas en el pilus, demostraron que ésta solo actuaba sobre aquellas proteínas que presentaran su puente disulfuro ya formado, discriminando a aquellas que carecen de este enlace. Teniendo en cuenta la diferencia en la estabilidad mecánica de estas proteínas dependiendo de si poseen o no el puente disulfuro formado, este mecanismo de selección por parte de la chaperona garantizaría la incorporación al pilus de únicamente proteínas que presentaran el puente disulfuro y que por lo tanto tuvieran una alta resistencia mecánica. El siguiente descubrimiento que hicimos fue que, en presencia de la enzima oxidorreductasa que induce precisamente la formación del puente disulfuro, el plegamiento de esta proteína fue incluso mayor que con la chaperona. Este dato arroja una nueva perspectiva al proceso de biogénesis del pilus pues hasta ahora se creía que la chaperona era la única encargada de plegar a las proteínas del pilus y que la oxidorreductasa solo inducía la formación del puente disulfuro. De nuestra investigación concluimos que la oxidorreductasa se encarga de ambas cosas y que entrega a la chaperona proteínas prácticamente plegadas y listas para su incorporación en un pilus de nueva generación. En este escenario la chaperona se encargaría de estabilizar el plegamiento de las proteínas que la oxidorreductasa le proporciona, evitaría procesos de agregamiento o polimerización temprana en el periplasma y escoltaría a las proteínas del pilus hasta la plataforma de ensamblaje del pilus tipo I en la membrana externa bacteriana. Desde una perspectiva farmacológica, atacar la integridad estructural del pilus o atacar a los factores encargados de la maduración de sus proteínas podrían ser el camino para combatir las infecciones del tracto urinario ocasionadas por E. coli. En la segunda parte de esta tesis decidimos explorar la nanomecánica de los dos primeros dominios del receptor CD4, CD4D1D2. Obtener información sobre las fuerzas a las que despliegan estos dos dominios supone un primer avance para comprender si es factible que el VIH pueda inducir su extensión mecánica. Es por esto que caracterizamos el desplegamiento de estos dos dominios aplicando rangos de fuerzas y velocidades de estiramiento que fueran representativos del contexto fisiológico en el que se produce la infección. Una partícula vírica unida a CD4 puede ejercer fuerza sobre este pero en ningún caso puede alcanzar los niveles de estrés mecánico a los que se tienen que enfrentar por ejemplo las proteínas del pilus bacteriano. Cuando sometimos a CD4D1D2 a los diferentes protocolos de aplicación de fuerza observamos siempre una jerarquía en el orden de desplegamiento de estos dos dominios, desplegando siempre primero el domino D2 seguido a continuación del dominio D1. Sorprendentemente las fuerzas de desplegamiento de D2 son mayores que las de D1, y sin embargo despliega primero al contrario de lo esperable. Esta característica se reprodujo en cualquiera de las condiciones testadas y la justificamos en base a la estructura de estos dos dominios, que comparten una hebra ß. Esto supone que cuando se les somete a fuerza el dominio D2 despliega y deja desprotegido al dominio D1, cuya estabilidad mecánica se ve comprometida una vez la fuerza es transmitida a través de este elemento estructural compartido. El desarrollo de un modelo matemático que relaciona física de polímeros con grado de infectividad por VIH nos permitió extrapolar, en base a unos experimentos previos que utilizaron variantes de distinta longitud de CD4, que la posibilidad de que algunos dominios de CD4 se desplieguen durante la unión del virus es factible. A mayor longitud de CD4 mayor es la infectividad por VIH, lo que se relaciona con la flexibilidad de CD4 y con la capacidad del virus de explorar áreas más grandes de la superficie celular en busca del coreceptor que necesita para perpetrar la infección de la célula. Nuestro siguiente paso fue estudiar el efecto que un anticuerpo denominado Ibalizumab, conocido por su potente efecto inhibidor de la infección por VIH, sobre la nanomecánica de CD4D1D2. La mayor parte de los contactos intermoleculares que se establecen entre este anticuerpo y CD4 se localizan en el dominio D2, y se ha demostrado que las interacciones proteína-proteína pueden tener un efecto positivo en la estabilidad mecánica de las moléculas involucradas. Dado que el origen del efecto inhibitorio de Ibalizumab no ha sido hallado nosotros hemos planteado la posibilidad de que este anticuerpo pueda volver rígido a CD4 tras su unión, reduciendo su flexibilidad y quizás impidiendo que CD4 pueda ser extendido mecánicamente por la partícula vírica. Descubrimos que efectivamente Ibalizumab altera la nanomecánica de CD4 y que las fuerzas requeridas para su desplegamiento son mayores, sugiriendo que este efecto estabilizador puede ser el responsable de la inhibición de la infección y apoyando nuestra hipótesis de que el desplegamiento de CD4 facilita los siguientes eventos previos a la fusión del virus a la célula. Finalmente quisimos estudiar el efecto que la oxidorreductasa tioredoxina puede tener en la regulación de los puentes disulfuros de CD4. Esta y otras enzimas encargadas de la regulación tiol-disulfuro son secretadas por la célula y afectan al estado de oxidación de los puentes disulfuro de CD4 y otras proteínas. De hecho las reducciones de puentes disulfuro del dominio D2 de CD4 y de las proteínas superficiales del VIH han sido señaladas como prerrequisitos necesarios para la consecución de la infección. Estos enlaces covalentes limitan la extensión mecánica de los dominios de CD4, y sólo la reducción química de estos por enzimas podría permitir mayores extensiones de CD4. Nuestros experimentos de fuerza sobre CD4D1D2 en presencia de tioredoxina demostraron que los puentes disulfuros de estos dos dominios solo son reducidos después de haber sido estirados mecánicamente. En ambos dominios estos enlaces están ocultos en el interior hidrofóbico de sus estructuras, de manera que solo después del desplegamiento de cada dominio se hacen accesibles para la tioredoxina. Dado que la reducción del puente disulfuro de al menos del dominio D2 parece necesaria para que se produzca la infección, nosotros planteamos que la partícula del VIH puede inducir el desplegamiento mecánico de algunos dominios de CD4 y este hecho puede hacer que la tioredoxina pueda acceder a los puentes disulfuros de estos dominios, reduciéndolos, y permitiendo que el virus pueda extender incluso más a CD4, mejorando sus oportunidades de encontrar al coreceptor de membrana. Con este conjunto de factores vemos el comportamiento del receptor CD4 como el de un amortiguador, que se expande y se contrae debido a los movimientos del virus que tiene unido en su extremo. El VIH tendría la ventaja de, permaneciendo unido, ejercer fuerzas bajas que desplieguen y plieguen a los dominios de CD4 mientras se produce el encuentro con el coreceptor de membrana que finalmente conduce a la fusión del virus. Junto con los cambios químicos que tienen lugar en CD4, esto puede facilitar su flexibilidad e incrementar las probabilidades de encontrar a su coreceptor. A la luz de los datos de estas investigaciones proponemos a la investigación mecanofarmacológica como una estrategia de futuro para tratar enfermedades cuyo origen yace en el malfuncionamiento de un componente mecánico. En esta tesis se ha estudiado el proceso de adhesión de patógenos y creemos que esta parte de la infección donde las fuerzas mecánicas juegan un papel relevante puede ser atacada mecánicamente. En el caso de la infección del tracto urinario debilitar sus estructuras de adhesión o deteriorando las propiedades biomecánicas de estas puede ser el camino para combatir esta enfermedad. En el caso de la adhesión del VIH, hacer más estable al receptor CD4 e impedir su extensión mecanoquímica puede ser el punto de partida para estudiar si esta opción tiene relevancia a nivel fisiológico y puede convertirse en un nuevo tratamiento efectivo para prevenir la infección, tanto de nuevas células como de nuevos individuos.

Tesis Doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 24-07-2015