Search

Dentale Follikelzellen (DFCs, engl. Dental follicle cells) sind die endogenen Stamm-/Vorläuferzellen des Zahnhalteapparats und können in alveoläre Osteoblasten, Zementoblasten und Fibroblasten des parodontalen Ligaments differenzieren. DFCs besitzen großes Potential für regenerative Therapien von (dentalem) Knochengewebe, wobei zunächst eine genaue Kenntnis der molekularen Mechanismen während der osteogenen Differenzierung, welche sich in vitro durch BMP2 (engl. Bone morphogenetic protein 2) oder Dexamethason induzieren lässt, erforderlich ist. Nachdem Vorarbeiten zeigten, dass klassische Isoformen der Proteinkinase C (PKC) während der Osteogenese von DFCs herunterreguliert werden und diese hemmen, sollten in der vorliegenden Arbeit die zugrundeliegenden Mechanismen evaluiert werden. Hierfür wurde die Regulierung potentieller Zielproteine und Signalwege nach osteogener Induktion und Hemmung klassischer PKCs untersucht sowie deren Einfluss auf osteogene Marker evaluiert. Dabei wurde festgestellt, dass klassische PKCs die Kinase Akt regulieren und stromabwärts durch Phosphorylierung von GSK3β (Glykogensynthase-Kinase 3β) die Aktivität des Proteins β-Catenin beeinflussen, welches eine wichtige Rolle für die Induktion der Osteogenese spielt. Während Akt zwar die Expression von aktivem β-Catenin unterstützte, führte eine Überaktivierung der Kinase jedoch zur Inhibition der Differenzierung und des Signalwegs stromabwärts von BMP2. Darüber hinaus konnte eine Regulierung des NF-κB (engl. Nuclear factor kappa B)-Signalwegs durch klassische PKCs und Akt nachgewiesen werden, wobei NF-κB die Proliferation und osteogene Differenzierung von DFCs unterdrückte. Dahingegen konnte keine direkte Beteiligung von klassischen PKCs oder Akt an der BMP2-induzierten Aktivierung der Proteinkinase A (PKA), welche die Osteogenese unterstützt, gefunden werden. Stattdessen zeigten die Versuche, dass die PKA-Aktivierung von der intrazellulären Expression des Proteins PTHrP (engl. Parathyroid hormone-related protein) abhängt, und dass PKA den Signalweg stromabwärts von BMP2 durch eine negative Rückkopplung hemmt. Des Weiteren konnte eine Induktion des mitochondrialen Energiemetabolismus und des oxidativen Stresses während der osteogenen Differenzierung und nach Inhibition klassischer PKCs festgestellt werden, während eine Hemmung des mitochondrialen Stoffwechsels die Mineralisierung unterdrückte. Eine Evaluierung von Proteinen, welche oxidativen Stress neutralisieren können, zeigte eine Stimulierung der Catalase-Expression und eine Herunterregulierung der Expression von GPX1 (Glutathionperoxidase 1) während der Differenzierung und nach Inhibition klassischer PKCs. Überdies führte eine Hemmung der Catalase zu einer verringerten Mineralisierung. Stromaufwärts von PKC wurde PTHrP für die Aktivität der Kinase benötigt, während das Protein WNT5A (engl. Wnt family member 5A) diese unterdrückte. Die Ergebnisse legten dar, dass klassische Isoformen von PKC die osteogene Differenzierung von DFCs über verschiedene Mechanismen hemmen, wobei insbesondere biologische Prozesse reguliert werden, die in späteren Differenzierungsphasen wichtig sind., Dental follicle cells (DFCs) are the genuine stem/precursor cells of the periodontium and capable of differentiating into alveolar osteoblasts, cementoblasts and periodontal ligament fibroblasts. DFCs possess great potential for regenerative therapies of (dental) bone tissue, but their usage first requires a profound knowledge of the molecular mechanisms during the osteogenic differentiation, which can be induced in vitro by BMP2 (Bone morphogenetic protein 2) or dexamethasone. After previous experiments showed that classical isoforms of PKC (Protein kinase C) are downregulated during osteogenesis of DFCs and inhibit the differentiation, this thesis aimed to evaluate the underlying mechanisms. For this, regulation of potential target proteins and signaling pathways was analyzed after osteogenic induction and inhibition of classical PKCs, and their impact on osteogenic markers was investigated. The results showed that classical PKCs regulate the kinase Akt, which in turn phosphorylates GSK3β (Glycogen synthase kinase 3β) and consequently affects the stability of β-catenin, which plays an important role for the induction of osteogenesis. While Akt supported the expression of active β-catenin, overactivation of the kinase, however, inhibited the differentiation and the signaling pathway downstream of BMP2. Furthermore, classical PKCs and Akt regulated the NF-κB (Nuclear factor kappa B) signaling pathway, and NF-κB was shown to suppress proliferation and osteogenic differentiation of DFCs. By contrast, classical PKCs and Akt were not directly involved in the BMP2-induced activation of protein kinase A (PKA), which is known to support osteogenesis. Instead, the experiments showed that activation of PKA depends on the intracellular expression of the protein PTHrP (Parathyroid hormone-related protein) and that PKA inhibits the signaling pathway downstream of BMP2 via negative feedback. Moreover, mitochondrial energy metabolism and oxidative stress were induced during the osteogenic differentiation as well as after inhibition of classical PKCs, and inhibition of the mitochondrial metabolism suppressed mineralization. Evaluation of proteins which are capable of neutralizing oxidative stress revealed that expression of catalase was upregulated and expression of GPX1 (Glutathione peroxidase 1) was inhibited during differentiation and after inhibition of classical PKCs. Besides, inhibition of catalase attenuated mineralization. Upstream of PKC, PTHrP was required for kinase activity, while WNT5A (Wnt family member 5A) suppressed it. The results showed that classical isoforms of PKC inhibit the osteogenic differentiation of DFCs via different mechanisms, which especially involve biological processes important for later differentiation periods.

My work examines functional aspects of the structural plasticity of parvalbumin-positive interneurons in the mouse dentate gyrus. It has been recently shown in Prof. Wulff lab that this type of interneurons carry a considerable number of dendritic spines. Here I describe how the inhibition of protein kinase C, enzyme of a signaling cascade activated during neural plasticity, affects dendritic spine and synapsis density.

G-Protein gekoppelte einwärtsgleichrichtende Kaliumkanäle (GIRK-Kanäle) sind im Herzen an der Ausbildung des Ruhepotentials beteiligt. Sie werden über M\(_2\)R aktiviert und über G\(_q\)PCRs durch PIP\(_2\)-Depletion und/oder Kanalphosphorylierung durch PKCs inhibiert. Der exakte Mechanismus der Inhibition der GIRK-Kanäle ist bisher nicht bekannt. Deshalb wurde in der folgenden Arbeit die Inhibition der GIRK-Kanäle während der Aktivierung von \(\alpha\)1-AR bzw. ET-R mithilfe verschiedener Methoden (FRET, Patch-Clamp) analysiert. Dabei zeigte sich, dass die Rezeptor-spezifische Aktivierung der Ca\(^{2+}\)-abhängigen PKC-Isoformen \(\alpha\) und \(\beta\) zur Inhibition des GIRK beiträgt. Außerdem regulieren cPKCs Rezeptor-spezifisch Dauer und Stärke des Signals von G\(_q\)PCRs. Die Rezeptor-spezifischen Unterschiede in der Aktivierung der cPKCs stellen somit einen neuen Signalweg dar, bei dem die Aktivität des GIRK-Kanals und die Stärke des Rezeptor-Signals über einen negativen Feedback-Mechanismus reguliert werden.

Im Verlauf der Wirtsreaktion auf eine schwere Infektion kommt es früh zu einer exkretorischen Dysfunktion der Leber. Das Auftreten der septischen Cholestase ist mit einem ungünstigen klinischen Verlauf assoziiert. Die, dem Defekt der hepato- und cholangiozellulären Transportsysteme zu Grunde liegenden, pathophysiologischen Mechanismen sind noch nicht vollständig entschlüsselt und Gegenstand aktueller Forschung. Rückschlüsse über beteiligte Komponenten sind anhand der besser charakterisierten Signalkaskade der physiologischen Gallesekretion möglich und weisen der Proteinkinase-C-Familie eine entscheidende Rolle in der Regulation der Signalverarbeitung zu. Ein Grund für die anhaltend hohe Mortalität und Zunahme der Inzidenz der Sepsis ist das Fehlen von adjunktiven, immunmodulatorischen Sepsistherapeutika zur Behandlung des konsekutiven Organversagens. Die Inhibition der Proteinkinase-C wird aktuell als therapeutische Option zur kausalen Behandlung der septischen Cholestase diskutiert. Die Wiederherstellung der hepatischen Exkretionsleistung könnte das Ausmaß des Organversagens verhindern und dazu beitragen, die anhaltend hohe Mortalität der Sepsis zu senken. Zur Entwicklung neuer therapeutische Ansätze, die in die Signalverarbeitung von Zellen eingreifen, ist ein genaues Verständnis für die, der septischen Cholestase zugrundeliegenden Mechanismen notwendig. Vor diesem Hintergrund stellt sich die Frage, inwiefern die Proteinkinase-C die frühe inflammatorische Signalkaskade mitgestaltet, die zu einer Abnahme der Exkretionsleistung führt. Auch soll unter Kontrolle der Werte für die hepatozelluläre Integrität geklärt werden, ob die gezielte Inhibition einzelner Isoformen der Proteinkinase-C positiven Einfluss auf die Sepsis-assoziierte, exkretorische Dysfunktion ausübt. ...

Die Arteriosklerose und ihre Folgeerkrankungen sind für über 50% aller Todesfälle weltweit verantwortlich. Erkrankungen wie z.B. arterielle Hypertonie, Hyperlipidämie und Diabetes mellitus sind als Risikofaktoren eindeutig belegt und etabliert. Seit Jahrzehnten bestehen kontroverse Meinungen bezüglich der Beteiligung des CRP an der Arteriosklerose. Ist es ein reiner Risikomarker ohne direkten Einfluss oder doch ein kausaler Spieler, d.h. ein Risikofaktor. Mehrere Studien bestätigten einen hohen prädiktiven Wert für zukünftige kardiovaskuläre Ereignisse bei erhöhten hsCRP-Werten im oberen Drittel des Normbereichs. Trotz Indizien konnte eine kausale Beteiligung bisher aber nicht zweifelsfrei nachgewiesen werden. So konnte CRP gemeinsam mit Komplement in den Wänden arteriosklerotischer Läsionen nachgewiesen werden. CRP ist weiterhin in der Lage Komplement zu aktivieren welches wiederum durch Freisetzung von Chemokinen zur Proliferation von SMC führen kann. Ein weiterer Hinweis für eine mögliche kausale Beteiligung des CRP an der Arteriosklerose ist seine Eigenschaft, die Schaumzellbildung aus Monozyten, durch Opsonierung des LDLs zur besseren Aufnahme, zu fördern. In dieser Arbeit wurde versucht, eine hepatische CRP-Synthese-Hemmung über den Knockdown der Proteinkinase C zu erreichen. Aufgrund der vielfältigen und noch nicht vollständig bekannten Wirkungen bzw. Interaktionen des CRPs erschien eine Hemmung der Synthese in der Leber am sinnvollsten und einfachsten durchführbar. Die Beteiligung der Proteinkinase C an der Synthese des C-reaktiven Proteins ist bekannt. Mit Hilfe der Methode der RNA-Interferenz zum Knockdown der PKC-Isoformen δ und ε sollte ihre Beteiligung am Syntheseweg eruiert und ein möglicher medikamentöser Ansatzpunkt untersucht werden. Als Zellreihe dienten HepG2-ABEK14-Zellen. Sie sind eine stabil mit einem 1kbp CRP Promotorkonstrukt und dem Luciferase Gen transfizierte Hepatoma-Zelllinie. Es zeigte sich in den Versuchen eine signifikant verminderte Aktivität der CRP-Promoter-Aktivität in HepG2-ABEK14-Zellen nach Gen-silencing der Proteinkinasen δ und ε. Dieser vielversprechende medikamentöse Ansatz muss weiter untersucht werden. Es ist bekannt, dass Thrombin in der akuten Phase vermehrt gebildet wird und evtl. eine stimulierende Wirkung auf die CRP-Synthese hat. Durch die bereits kommerziell verfügbaren Thrombininhibitoren wäre hier ein interessanter Ansatzpunkt gegeben. Nach Stimulation mit Thrombin wurde in den HepG2-ABEK14-Zellen keine signifikante Steigerung der CRP-Promoteraktivität erreicht. Eine medikamentöse Hemmung von Thrombin zur Senkung der CRP-Spiegel erscheint damit nicht sinnvoll zu sein. Es ist jedoch zu beachten, dass die Versuche an einer mit CRP-Luziferase stabil transifizierte Hepatom-Zelllinie durchgeführt wurden. Diese sind PHH in Struktur, Form, Syntheseapparat und Eigenschaften sehr ähnlich, jedoch nicht identisch. Auch bestehen Unterschiede der HepG2-ABEK14-Zellen und PHH gegenüber den Leberzellen in vivo. Es müssen weitere Studien erfolgen, die diese Unterschiede berücksichtigen.

The sodium dependent reduced folate carrier (Rfc1; Slc19a1) provides the major route for cellular uptake of reduced folates and antifolate drugs such as methotrexate (MTX) into various tissues. Despite its essential role in folate homeostasis and cancer treatment, little is known about Rfc1 regulation. A barbiturate recognition box, which as yet has only been found in the promoter region of xenobiotic metabolizing enzymes, particularly those of the CYP450 enzyme family, was predicted in the 5′ untranslated region of rat rfc1 cDNA. We have therefore investigated the regulation of Rfc1 by phenobarbital (PB)-type CYP450 inducers on the functional, transcriptional and translational level in a suitable in vitro model for rat liver. A decrease of >75% in substrate uptake was observed following treatment (48 h) with 1–10 times therapeutic plasma concentrations of PB-type CYP450 inducers like PB, carbamazepine, chlorpromazine, clotrimazole and with 0.1–1 ng/ml of the constitutive androstane receptor agonist TCPOBOP. This was not associated with reduced mRNA and protein levels. Further mechanistic investigations revealed that short-term treatment (2 h) of cells with protein phosphatase 1/2A inhibitor okadaic acid (80.5 ng/ml) and proteinkinase C inducer phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA; 0.62 μg/ml) almost abolished Rfc1 mediated MTX uptake. Finally, the reduction in Rfc1 activity caused by PB, TCPOBOP and PMA was reversed by simultaneous incubation with the specific PKC inhibitor bisindolylmaleimide (BIM; 21 ng/ml). These results demonstrate that clinically relevant concentrations of PB-type CYP450 inducers cause a significant PKC-dependent reduction in Rfc1 uptake activity at the posttranscriptional level. © 2007 Elsevier B.V. All rights reserved.

Pannexinkanäle sind an interzellulärer Kommunikation und zellspezifischen Eigenschaften beteiligt. Die Membraninsertion artverwandter Kanäle wie der Connexine wird durch Phosphorylierung vermittelt. In der vorliegenden Arbeit wurden die für den Membraneinbau von Panx1 erforderlichen Mechanismen untersucht. Dafür wurden prospektive Stellen für Phosphorylierung und MAPK-Bindung mutiert. Mittels Patch-Clamp-Technik wurden an Wildtypzellen, N2a-Kontrollzellen und verschiedenen Transfektanen Transmembranstromdichten gemessen, um Rückschlüsse auf die Aktivität der Pannexinkanäle ziehen zu können. Die Mutationen führten zur fehlenden Expression einzelner Glykosylierungsformen sowie zu Veränderungen spannungssensitiver Domänen des Panx1-Proteins. Durch Zugabe PKA-modulierender Pharmaka waren zudem Modulationen der Membranstromdichten möglich. Für eine intakte Kanalfunktion sind vermutlich alle drei Glykosylierungsformen unverzichtbar, die Funktion scheint nicht vollkommen PKA-abhängig zu sein.

Cultivation with 4-8 μmol/l hypericin (specific proteinkinase C inhibitor) activated by light induced high inhibition of the rate of HL-60 cell growth. When hypericin treated cells were not exposed to light growth inhibition was insignificant. Cultivation with light activated hypericin in concentration 16 μmol/l slightly inhibited growth rate of AtT20/D16v-F2 cells. AtT20/D16v-F2 cells did not proliferate in presence of light activated 32 μmol/l hypericin. Evidence of apoptosis was found in HL-60 cells treated with 1-8 μmol/l light activated hypericin, with maximum of apoptotic cells detected after 8 μmol/l light activated hypericin. Light activated hypericin induces both apoptosis and necrosis in dose and time dependent manners in HL-60 cells, but causes only necrosis in AtT20/D16v-F2 cells.

Calcium (Ca2+) steuert in Zellen eine Vielzahl von lebenswichtigen Prozessen wie z.B. Befruchtung, Wachstum oder auch die menschliche Immunabwehr. Bei der Immunabwehr spielt die erfolgreiche Aktivierung von T-Lymphozyten (T-Zellen), die ein lang andauerndes und hohes Ca2+-Signal erfordert, eine wichtige Rolle. Da im Normalfall hohe Ca2+-Konzentrationen schädlich für Zellen sind, existieren mehrere Mechanismen um den zytosolischen Ca2+-Pegel wieder herunter zu regeln. Deshalb wird in der vorliegenden Arbeit der Frage nachgegangen, wie es T-Zellen schaffen, all diese Mechanismen zu umgehen. In der vorliegenden Dissertation werden verschiedene Modelle untersucht, um den Einfluss der Polarisierung - eine starke morphologische Änderung der Zelle - auf die Entstehung der Ca2+-Signale zu erklären. Die Ergebnisse bestätigen, dass die experimentell beobachtete Mitochondrienbewegung hin zur Immunologischen Synapse (IS) die Ca2+-Signale kontrolliert und sagen voraus, dass die Anhäufung von Ca2+-Pumpen an der IS essentiell für die Existenz hoher Ca2+-Signale ist. Darüber hinaus wird in dieser Dissertation ein Modell präsentiert, mit dessen Hilfe die experimentell beobachteten Membransignale des Enzyms Protein Kinase C (PKC) durch Postulation einer kooperativen Bindung zwischen den PKC erklärt werden können. Calcium (Ca2+) controls a multitude of vital processes in cells as diverse as fertilisation, proliferation or the human immune defence. The activation of T-lymphocytes (T-cells) is very important for the human immune defence. The successful T-cell activation needs a high, long lasting and robust Ca2+signal. This raises the intriguing question of how T-cells overcome all those mechanisms nature provides to remove an increased Ca2+level as fast as possible from the cytosol since under normal circumstances high cytosolic Ca2+concentrations are lethal for the cell. In this thesis different models were used to study the influence of T-cell polarization - a strong morphological change of the cell - on the Ca2+signals and thus on T-cell activation. The results confirm that the experimentally observed mitochondria movement towards the immunological synapse (IS) controls Ca2+signals. Furthermore the models predict that an accumulation of special Ca2+pumps around the IS is essential for the occurrence of high Ca2+signals. In addition to this a model is presented that helps to explain the experimentally observed membrane signals of the enzyme protein kinase C (PKC) by postulating a cooperative binding of PKC’s.

RKIP reguliert Proteinkinasen der Signaltransduktionskaskaden von G Protein-gekoppelten Rezeptoren, der Raf/MEK/ERK-MAPK, des Transkriptionsfaktors NFκB und von GSK3β. Unklar war bisher, wie die spezifische Interaktion von RKIP mit seinen mannigfaltigen Interaktionspartnern ermöglicht und reguliert wird. Raf1 und GRK2 sind die einzigen bekannten direkten Interaktionspartner von RKIP und wurden deshalb gewählt, um die zugrundeliegenden molekularen Mechanismen dieser Interaktion genauer zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass RKIP nach PKC-vermittelter Phosphorylierung von Serin153 dimerisiert und dass diese Dimerisierung für die RKIP/Raf1-Dissoziation und die RKIP/GRK2-Interaktion essentiell ist. Co-Immunpräzipitationsexperimente mit einer phosphorylierungsdefizienten Mutante zeigten, dass für diese Dimerisierung die Phosphorylierung von beiden RKIP-Molekülen notwendig ist. Als Dimerinteraktionsfläche wurden die Aminosäuren 127-146 von RKIP identifiziert, da das Peptid RKIP127-146 die Dimerisierung von RKIP spezifisch und effizient hemmte. Um die Bedeutung dieser phosphorylierungsinduzierten Dimerisierung von RKIP für seine Interaktion mit Raf1 und GRK2 zu untersuchen, wurden eine phosphomimetische Mutante (RKIPSK153/7EE) und eine Mutante von RKIP generiert, welche bereits unphosphoryliert dimerisiert (RKIP∆143-6). Folgende Ergebnisse legen nahe, dass die Dimerisierung von RKIP für die spezifische Interaktion mit Raf1 bzw. GRK2 entscheidend ist: (i) Die Dimerisierung von phosphoryliertem RKIP ging mit der Dissoziation von RKIP und Raf1 und der Assoziation von RKIP und GRK2 einher; (ii) die Mutanten RKIPSK153/7EE und RKIP∆143-6, die bereits in unstimulierten Zellen eine starke Dimerisierung zeigten, hatten eine höhere Affinität zu GRK2 als zu Raf1; (iii) die Hemmung der RKIP-Dimerisierung interferierte nur mit der RKIP/GKR2- aber nicht mit der RKIP/Raf1-Interaktion; (iv) in vitro und in Mausherzen konnte ein RKIP- und GRK2-immunreaktiver Komplex nachgewiesen werden; (v) Untersuchungen zur RKIP-vermittelten Hemmung der Kinaseaktivität von GRK2 und Raf implizierten, dass dimerisiertes RKIP nur die Aktivität von GRK2, nicht aber von Raf hemmt. Diese Arbeit zeigt, dass die phosphorylierungsinduzierte Dimerisierung von RKIP die spezifische Interaktion von RKIP mit Raf1 und GRK2 koordiniert. Die Aufklärung dieses Mechanismus erweitert unser Verständnis der spezifischen Interaktion von Kinasen mit ihren Regulatorproteinen., RKIP is a regulator of several distinct kinases and modulates diverse signal transduction cascades such as the signaling of G protein coupled receptors, of the Raf/MEK/ERK-cascade, of the transcription factor NFκB, and of GSK3β. Until now, it was not well understood how the specific interaction of RKIP with its diverse targets is achieved and regulated. Raf1 and GRK2 are the only known direct interaction partners of RKIP and were thus chosen to untangle the molecular mechanisms regulating the specific interaction of RKIP with these kinases. In this dissertation it is shown that RKIP dimerizes upon PKC-mediated phosphorylation of serine153 and that this dimerization is essential for RKIP/Raf1-dissociation and RKIP/GRK2-association. Co-immunoprecipitation experiments with a phosphorylation-deficient mutant revealed that the dimerization of RKIP requires the phosphorylation of two RKIP molecules. The amino acids 127-146 of RKIP were identified as dimer-interface, since RKIP-dimerization was efficiently and specifically inhibited by the peptide RKIP127-146. To elucidate the implication of this phosphorylation-induced dimerization on the target specificity of RKIP, a phosphomimetic RKIP mutant (RKIPSK153/7EE) and a dimeric RKIP mutant (RKIP∆143-6) were generated. The following results indicated that dimerization of RKIP controls its specific interaction with Raf1 or GRK2, respectively: (i) dimerization of phosphorylated RKIP occurred concomitantly with the release of RKIP from Raf1 and its association with GRK2; (ii) the RKIP mutants RKIPSK153/7EE and RKIP∆143-6, which had a higher propensity for RKIP-dimerization already under basal conditions, had a higher affinity to GRK2 than to Raf1; (iii) inhibition of RKIP-dimerization prevented only RKIP/GRK2-binding but did not interfere with RKIP/Raf1-binding; (iv) an RKIP- and GRK2-immunoreactive complex was detected in vitro as well as in mouse hearts; (v) analyses of RKIP-mediated inhibition of GRK2 and Raf showed that a higher propensity for RKIP-dimerization translates into efficient GRK2-inhibition but not into Raf-inhibition. The results of this thesis show that phosphorylation-induced dimerization of RKIP regulates its specific interaction with Raf1 and GRK2. The elucidation of this mechanism improves our understanding how specificity in the interaction of kinases and their regulatory proteins can be achieved.

Das HIV-1-Protein p6 ist im C-terminalen Bereich von Gag lokalisiert und besitzt trotz seiner geringen Größe von nur 52 Aminosäuren eine komplexe strukturelle und funktionelle Organisation. Es bindet mindestens zwei zelluläre Buddingfaktoren (Tsg101 und ALIX) sowie zwei virale Proteine (Vpr und Env) und übt eine Vielzahl biologischer Funktionen aus. Außerdem besitzt p6 sowohl C- als auch N-terminal jeweils eine L-Domäne, welche unter anderem den letzten Schritt in der Abschnürung des naszierenden Virions von der Zellmembran, in einem bis heute noch nicht vollständig geklärten Mechanismus, regulieren. Neben den Modifikationen der Ubiquitinylierung und Sumoylierung fungiert p6 außerdem als Substrat für verschiedene Kinasen: Im Jahr 2002 wurde p6 als Hauptphosphoprotein in HIV-1-Partikeln identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass p6 durch die MAP-Kinase ERK-2 an der Position Thr-23 phosphoryliert wird. Weiter gibt es Hinweise, dass die genannte Kinase durch die Phosphorylierung an Thr-23 von p6 den Viruszusammenbau sowie die Virusfreisetzung reguliert. Zur Identifikation weiterer potentieller Kinasen wurde zu Beginn dieser Arbeit eine in silico Analyse durchgeführt und schließlich mittels in vitro Experimenten mit synthetischem und viralem p6-Peptid die Proteinkinase C, welche spezifisch Ser-Reste an Position 14, 25 und 40 in p6 phosphoryliert, identifiziert. Vergleicht man die Konsensussequenzen verschiedener HIV-1-Isolate der M-Hauptgruppe, so ist eine absolute Konservierung von Ser-40 festzustellen, was auf eine mögliche biologische Funktion dieser Stelle hindeutet. Zur Untersuchung der biologischen Funktion der Phosphorylierungsstellen in p6 wurden Konstrukte kloniert, die an den identifizierten Ser-Resten mutiert wurden. Die Substitution aller Ser-Reste einzeln zeigte in Infektionsstudien, dass nur die Mutation von Ser-40 zu einer verminderten Replikationskapazität in T-Zellen sowie in primären humanen Zellen führte. Die Mutation von Ser-14 und Ser-25 zeigte keinen Effekt auf die Replikation von HIV-1. Die Mutation aller drei PKC-Stellen zusammen führte hingegen zu einem kompletten Verlust der Replikationsfähigkeit. Obwohl die Mutation der Phosphoakzeptorstellen die Freisetzung der Viruspartikel nicht beeinflusste, sind die produzierten Virionen der Ser-40-Mutante weniger infektiös und die Dreifachmutation führte sogar zu einem kompletten Verlust der Infektiösität. Als molekularer Mechanismus hinter diesem Phänomen konnte in Pulse-Chase Experimenten beobachtet werden, dass die CA-Prozessierung von p25 zu p24 im Fall der Ser-40-Mutante gestört ist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass der Defekt in der CA-Prozessierung zu einer irregulären Core-Morphologie und zur Bildung einer elektronendichten Struktur außerhalb des Cores führt. Die erhaltenen Ergebnisse belegen eine neue, bis heute unbekannte Funktion von p6, die nicht die Virusfreisetzung, sondern die Gag-Prozessierung betrifft. Das konservierte Ser-40 reguliert auf noch unbekannte Weise, womöglich durch PKC-Phosphorylierung, die CA-Reifung und somit die Infektiösität von HIV-1. Neben den verschiedenen Bindungsstellen für virale und zelluläre Proteine sowie den Modifikationsstellen besitzt p6 die inhärente Fähigkeit zur Ausbildung oligomerer Formen. Diese wurden durch die Behandlung von sp6 und vp6 mit chemischen Crosslinkern und anschließender Western Blot Analyse untersucht. Es zeigte sich, dass das C-terminale Fragment von p6 oligomere Strukturen ausbildet. Somit konnte der in silico Befund, dass p6 eine im C-terminalen Bereich lokalisierte Oligomerisierungsdomäne besitzt, bestätigt werden. Ob diese Oligomerisierungsdomäne in p6 zur Gag-Gag-Multimerisierung, welcher eine wichtige Rolle in der Gag-Assemblierung und der Produktion von Viruspartikeln zukommt, beiträgt, sie eine ganz andere funktionelle Relevanz hat oder gar funktionslos ist, ist bislang nicht bekannt. The HIV-1 protein is located at the C-terminus of Gag and despite its small size of 52 amino acids it comprises a quite complex structural and functional organization: it binds at least two cellular budding factors (Tsg101 and ALIX) as well as two viral proteins (Vpr and Env) and it exerts a variety of biological functions. Among others, it regulates the final abscission step of the nascent virion from the cell membrane by the action of two different l domains, one located at the C- and one located at the N-terminus of the peptide, in a yet not completely elucidated mechanism. Besides the ubiquitinylation and sumoylation p6 acts as a substrate for distinct kinases: 2002 p6 was identified as the major phosphoprotein found in HIV-1 particles and it could be shown that phosphorylation of p6 by MAP-kinase ERK-2 at position Thr-23 regulates the assembly and release of progeny virions. To identify further potential kinases an in silico analysis was performed and finally in vitro experiments with synthetic and viral p6 identified PKC to specifically phosphorylate Ser residues in position 14, 25 and 40 in p6. When the consensus sequences derived from various HIV-1 group M isolates were compared, one can see that Ser-40 is absolutely conserved. Therefore, the biological function of this site has to be identified. To analyze the biological function of the identified phosphorylation sites, different constructs carrying mutations of the identified Ser residues were generated. Individual substitutions of the Ser residues revealed that only mutation of Ser-40 reduced virus replication in T-cell lines and in primary human cells, while mutation of Ser-14 and Ser-25 had no effect on the replication. In contrast, mutation of all three PKC-sites completely abrogated replication. Although mutation of PKC sites had no influence on virus release, the infectivity was reduced for the Ser-40 mutant and completely lost for the triple mutant. As molecular mechanism behind this phenomenon pulse-chase experiments illustrated that the efficiency in final processing of CA from p25 to p24 was dependent on the integrity of Ser-40. Electron micrographs showed that the defect in CA processing led to an irregular morphology of the virus core and the formation of an electron dense extra core structure. Thus, the obtained results support a novel, till this day unknown function of p6, that does not affect virus release but concerns Gag processing. The conserved Ser-40 regulates in a yet unknown manner CA maturation and thereby infectivity of HIV-1 in a process that might involve PKC phosphorylation. In addition to the different binding sites for viral and cellular proteins and the modification sites p6 displays the inherent ability to undergo oligomerization. This observation was analyzed by incubating sp6 and vp6 with chemical crosslinkers and western blotting. It turned out that the C-terminal fragment of p6 has the propensity to form oligomeric structures. This is consistent with in silico analysis, which predicts an oligomerization domain in the C-terminus of p6. Whether this oligomerization domain in p6 contributes to the Gag-Gag multimerization, which has an important role in Gag assembly and virus particle production, or whether it has a complete different functional relevance or it is totally out of any function is previously not known.

Die Regulation der Insulinfreisetzung in vivo ist ein komplexer Prozeß. Über unterschiedliche Mechanismen kommt es sowohl durch Aktivierung des PLC/IP3-als auch des c-AMP-Signaltransduktionsweges zu einem Anstieg der [Ca2+]i. Dieser gilt als zentrales intrazelluläres Signal für die Insulinfreisetzung. Ziel der vorliegenden Arbeit war die molekulare Analyse der an der Regulation des Calciumstoffwechsels beteiligten PKC-Isoenzymformen. Die Dissektion der Signaltransduktionswege erfolgte nach Aktivierung der PKC-Isoformen durch Acetylcholin am Modell der isolierten \(\beta\)-Zelle der Maus. In den Versuchen konnte durch Aktivierung und Inhibierung der PKC-Isoformen gezeigt werden, daß insbesondere die konventionellen, calciumabhängigen PKC-Isoformen eine zentrale Rolle für das Acetylcholin-induzierte Ca2+-Signal in primären \(\beta\)-Zellen spielen.

Hintergrund: Die interstitielle Fibrose spielt bei der Verschlechterung der Nierenfunktion mit dem Endstadium der Urämie eine große Rolle. In diesem Geschehen kommt der Interaktion der im Krankheitsfall vermehrt filtrierten Proteine mit der proximalen Tubuluszelle, dem Ort der Proteinrückresorption, eine entscheidende Bedeutung zu. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, anhand eines Zellkulturmodells den Einfluss eines vermehrten Albuminangebots auf die Kollagenhomöostase kultivierter proximaler Tubuluszellen zu untersuchen, dabei involvierte Signaltransduktionswege aufzuzeigen und die zentrale Rolle der Albuminendozytose im Rahmen des Geschehens zu beurteilen. Methoden: Für unsere Untersuchungen verwendeten wir überwiegend die kultivierten proximalen Tubuluszellen des Opossums, welche – wie auch die LLC-PK1 Zellen - die für die Proteinendozytose notwendigen Komponenten - nämlich die Rezeptoren Megalin und Cubilin sowie den Natrium-Protonen-Austauscher 3 – besitzen und somit eine hohe Endozytoserate aufweisen. Diese wurden mit Albuminkonzentrationen - wie man sie bei erhöhter Proteinfiltration unter pathophysiologischen Bedingungen findet - inkubiert. Für Vergleichsstudien zogen wir Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) heran. Die Kollagenhomöostase wurde mittels Kollagenase-sensitiven Prolininkorporationsassay, Kollagen-ELISA und Kollagen-Western Blot, die Aktivität der Matrixmetalloproteinasen mittels Zymographie und Gelatinaseassay erfasst. Die Aktivierung von Signaltransduktionswegen wurde mittels eines SEAP-Reporter Gen Assays untersucht. Ergebnisse: Albuminexposition führte bei den Zelllinien mit hoher endozytotischer Aktivität (OK- und LLC-PK1- Zellen) zu einer vermehrten Sekretion von Kollagen Typ I, III und IV. Bei den Zelllinien mit niedriger endozytotischer Aktivität (MDCK-, IHKE-1-, NHE3-defiziente-OK-Zellen) kam es nach Albuminexposition zu einem Rückgang der Kollagensekretion. Im Kollagen-Western Blot zeigte sich nach Inkubation mit Albumin eine Zunahme des zellulären Kollagens. Mittels Zymographie und Gelatinaseassay konnte eine Albumin-induzierte Abnahme der MMP-Aktivität nachgewiesen werden. Inkubation der OK-Zellen mit Albumin führte im SEAP-Reporter-Gen-Assay zu einer Aktivierung des NF-kappaB-, AP-1- und CRE-Singalweges. Hemmung der NF-kappaB-, PKC- und PKA- Aktivierung hatte eine teilweise Reduktion der Albumin-inudzierten Kollagensekretion zur Folge. Eine Hemmung der Rezeptor-vermittelten Endozytose mittels des NHE3-Inhibitors EIPA verminderte sowohl die Kollagensekretion als auch die Aktivierung der untersuchten Signaltransduktionswege. Diskussion: Unsere Daten zeigen, dass ein Mehrangebot an Albumin die Kollagenhomöostase der proximalen Tubuluszellen aufgrund einer vermehrten Kollagensynthese und eines verminderten Kollagenabbaus stört. Dabei scheinen vor allem Kollagen Typ I und III zur tubulointerstitiellen Fibrose beizutragen. Albuminexposition aktiviert PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 und CRE. Für PKC, PKA und NF-kappaB konnte eine direkte Beteiligung an der Albumin-induzierten Kollagensekretion nachgewiesen werden. Albumin muss mittels Rezeptor-vermittelter Endozytose in die proximale Tubuluszelle aufgenommen werden, um die beobachteten Effekte zu vermitteln. Die alleinige Anwesenheit von Protein im proximalen Tubulus reicht dafür nicht aus. Es ist anzunehmen, dass die gestörte Matrixhomöostase zu einer Progression der interstitiellen Fibrose und somit zum Fortschreiten der Niereninsuffizienz führt. Albuminurie ist also nicht nur ein Marker, sondern ein Motor der Nierenfibrose., Background: Interstitial fibrosis is of major importance for the deterioration of renal function, leading to uremia. Interaction of filtered proteins with proximal tubular cells is crucial for the onset and development of tubulointerstitial damage. In the present study we investigated the effects of albuminuria on collagen homeostasis and signaling pathways of the proximal tubular cells. Methods: Therefore we exposed cultured cells derived from the proximal tubule (OK-, LLC-PK1-cells) with high endocytic activity by expressing the endocytic machinery typical for the proximal tubule (megalin, cubilin, NHE3) to albumin concentrations in a range expected during enhanced protein filtration. For comparative studies we used renal epithelial cells (MDCK-, IHKE1-, NHE3-deficient-OK-cells) with low endocytic activity. Collagen homeostasis was assessed by collagenase-sensitive proline incorporation assay, collagen ELISA and collagen Western blot; matrix metalloproteinase activity was assessed by zymography and gelatinase assay. Signaling pathways were monitored by SEAP reporter gene asssay. Results: Albumin exposure led to an increase of secreted collagen type I, III and IV in cells with high endocytic activity. In cells with low endocytic activity albumin exposure inhibited collagen secretion. Collagen Western blot analysis showed an albumin-induced increase of cellular collagen. MMP activity was significantly decreased by albumin exposure shown by zymography and gelatinase assay. Furthermore, albumin exposure led to activation of the NF-kappaB-, AP1- and CRE-pathways detected by SEAP reporter gene assay. Inhibition of NF-kappaB, PKC and PKA partially reversed the effects of albumin-induced collagen secretion. Inhibition of receptor-mediated albumin endocytosis by NHE3-inhibitor EIPA reduced collagen secretion and activation of the above investigated pathways. Discussion: The data show that protein exposure, in a concentration range expected during enhanced protein filtration, disturbs collagen homeostasis of proximal tubular cells due to increased collagen synthesis and decreased collagen degradation. Especially collagen type I and III may contribute to tubulointerstitial fibrosis. The signaling pathways activated by albumin exposure include PKC, PKA, NF-kappaB, AP1 and CRE; stimulation of PKC, PKA and NF-kappaB directly contribute to collagen secretion. There has to be efficient receptor-mediated protein endocytosis in order to stimulate collagen secretion and signaling pathways; the mere presence of protein in the proximale tubule is not sufficient. The disturbed matrix homeostasis probably supports the progression of interstitial fibrosis, which is of importance for the development of renal insufficiency. Therefore albuminuria is not only a marker, but also a motor or renal fibrosis.

Die Regulation der Insulinfreisetzung in vivo ist ein komplexer Prozeß. Über unterschiedliche Mechanismen kommt es sowohl durch Aktivierung des PLC/IP3-als auch des c-AMP- Signaltransduktionsweges zu einem Anstieg der [Ca2+]i. Dieser gilt als zentrales intrazelluläres Signal für die Insulinfreisetzung. Ziel der vorliegenden Arbeit war die molekulare Analyse der an der Regulation des Calciumstoffwechsels beteiligten PKC- Isoenzymformen. Die Dissektion der Signaltransduktionswege erfolgte nach Aktivierung der PKC-Isoformen durch Acetylcholin am Modell der isolierten β-Zelle der Maus. In den Versuchen konnte durch Aktivierung und Inhibierung der PKC-Isoformen gezeigt werden, daß insbesondere die konventionellen, calciumabhängigen PKC-Isoformen eine zentrale Rolle für das Acetylcholin-induzierte Ca2+-Signal in primären β-Zellen spielen.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit der funktionellen und biochemischen Charakterisierung des im Jahre 2001 entdeckten 11. Influenza-A-Virus-(IAV)-Proteins PB1-F2. Vor kurzem wurde im Mausmodell gezeigt, dass PB1-F2 die Virulenz hochpathogener IAV-Isolate verstärkt. Weiterhin besitzt PB1-F2 funktionelle Ähnlichkeit zum pro-apoptotischen Vpr-Protein von HIV-1, weshalb zunächst untersucht wurde, ob extrazelluläres PB1-F2, ähnlich dem transduzierenden Vpr-Protein in der Lage ist, apoptotische Prozesse einzuleiten. Grundlage für diese Arbeitshypothese war die bekannte Tatsache, dass PB1-F2 in den Mitochondrien lokalisiert und pro-apoptotische Funktionen in einem noch nicht verstandenen Mechanismus vermittelt. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass weder extrazelluläres synthetisches (s)PB1-F2 noch intrazelluläres, durch Plasmid exprimiertes PB1-F2 ausreichend ist, um in verschiedenen Zelllinien Apoptose zu induzieren. Des Weiteren konnte hier gezeigt werden, dass nach der Infektion von primären humanen Monozyten ein apoptoseverstärkender Effekt in Gegenwart von PB1-F2 gemessen werden kann. Wurden dieselben Zellen mit einem PB1-F2-defizienten Virus infiziert, war die Apoptoseinduktion deutlich reduziert. Diese Befunde legen nahe, dass PB1-F2 nur im Kontext einer Virusinfektion pro-apoptotisch wirkt und dieser Effekt zellspezifisch ist, was in späteren Publikationen anderer Labore bestätigt wurde. Ein weiterer Schwerpunkt war die Untersuchung einer möglichen posttranslationalen Modifikation von PB1-F2. Es konnte hier erstmals gezeigt werden, dass PB1-F2 ein Phosphoprotein ist und direkt mit der Proteinkinase C (PKC) interagiert. Das virale Protein wurde von einem Extrakt aus verschiedenen konventionellen PKC-Isoformen sowie den Zellextrakten verschiedener Zelllinien effizient in vitro phosphoryliert. Die radioaktive 32P-Markierung von transfizierten 293-T-Zellen und infizierten MDCK-Zellen ergab, dass PB1-F2 in vivo phopshoryliert wird. Die in vitro und in vivo Phosphorylierung konnte in Gegenwart PKC-spezifischer Inhibitioren dosisabhängig inhibiert und durch den Aktivator PMA verstärkt werden. Es wurde mehrfach berichtet, dass die PKC nach einer IAV-Infektion aktiviert vorliegt, jedoch ist nur wenig über die Funktion dieser Aktivierung im Kontext der Virusreplikation bekannt. Als PB1-F2-relevante Phosphorylierungsstellen wurden in dieser Arbeit die Aminosäuren Threonin in Poistion 27 und Serin in Position 35 ermittelt, wobei die letztere in verschiedenen Isolaten konserviert ist, was eine Grundvoraussetzung für eine mögliche funktionelle Bedeutung der PB1-F2-Phosphorylierung wäre. Ein rekombinantes Virus, das für die Phosphorylierungsstellen in PB1-F2 mutiert wurde, zeigte nach der Infektion von primären Monozyten einen vergleichbaren Phänotyp wie eine Mutante, die durch gezielte Austauschmutationen nicht mehr in der Lage ist, PB1-F2 zu exprimieren. Beide Virusmutanten waren im Vergleich zum Wildtyp-Virus in ihrer Fähigkeit eingeschränkt, effektiv Apoptose zu induzierten. Ob die Phosphorylierung von PB1-F2 auch für die kürzlich beschriebenen immunmodulatorischen Effekte des Proteins im Tiermodell von Bedeutung ist und in welchem Zusammenhang sie zur IAV-aktivierten, zellulären Signaltransduktion steht, bleibt noch Gegenstand zukünftiger Untersuchungen. PB1-F2 besitzt die inhärente Fähigkeit zu oligomerisieren. Dieses Phänomen wurde durch die Behandlung von sPB1-F2 mit chemischen Crosslinkern und anschließenden Westernblot-Analysen untersucht. Es zeigte sich, dass sowohl ein N-terminales als auch C-terminales Fragment von PB1-F2 Oligomere ausbildet, was mit dem in silico Befund übereinstimmt, dass das Protein je eine Oligomerisierungsdomäne im N- und C-terminalen Bereich besitzt, wobei die C-terminale Domäne ein deutlich größeres Potential zur Multimerisierung aufweist. Unter chemisch reduzierenden Bedingungen konnte gezeigt werden, dass das Cystein in Position 42 maßgeblich an der Ausbildung der dimeren Spezies von PB1-F2 durch Disulfidbindung beteiligt ist, wohingegen die PB1-F2-Multimerisierung ausschließlich auf die Integrität der Oligomerisierungsdomänen zurückgeführt werden kann. Über die funktionelle Relevanz der Oligomerisierung von PB1-F2 wurde bisher viel spekuliert. Die prominenteste Hypothese ist, dass PB1-F2 Membranporen ausbildet und möglicherweise zur Destabilisierung des mitochondrialen Membranpotentials beiträgt und damit funktionell der Gruppe der Viroporine zugeordnet werden kann. This study is focused on the functional and biochemical characterization of the novel 11th influenza A virus (IAV) protein PB1-F2. Recently, it was shown that PB1-F2 contributes to the increased virulence of highly pathogenic IAV strains and enhances the effects of secondary bacterial coinfection in mice. This results in severe pneumonia which is the major cause of influenza related mortality. PB1-F2 shares functional similarities to the pro-apoptotic Vpr protein of HIV-1. Initial experiments in this work are based on the hypothesis that extracellular synthetic (s)PB1-F2 might be able to induce apoptosis in cell culture, similar to the membrane transducing Vpr protein. PB1-F2 is predominantely located in the mitochondria of transfected or infected cells and mediates pro-apoptotic functions by a so far unknown mechanism. No cytotoxic effects were detected after incubation of different cell lines with extracellular PB1-F2. Also the plasmid mediated expression of PB1-F2 after transfection of 293T cells showed no influence on apoptosis induction. Additional experiments revealed that PB1-F2 is an enhancer of virus induced apoptosis after infection of primary human monocytes, measured by caspase 3 acitivity. Therefore it was concluded that the pro-apoptotic effects of PB1-F2 are predominantly mediated after virus infection and in a cell-type-specific manner. Further studies shown in this work describe the discovery of PB1-F2 phopshorylation, which is a totally new finding in the field. PB1-F2 is phopshorylated in vitro by an extract containing the conventional isoforms of the protein kinase C (PKC) and by cellular S10 extract of different cell lines. 32P radiolabelling of transfected 293T cells and infected MDCK cells revealed that PB1-F2 is phosphorylated after expression in cell culture. The in vitro and in vivo phosphorylation of PB1-F2 is sensitive to inhibitors of PKC and could be increased by the PKC activator PMA. Several studies have shown that activation of the PKC occurs subsequent to influenza virus infection. However, the function of the PKC activation in the context of virus replication is unknown. The threonine in position 27 and the serine in position 35 have been identified as the relevant PKC phopshorylation sites of PB1-F2 with the latter being conserved in different influenza isolates which is a prerequisite for a general function of the phosphorylation phenomenon. A recombinant virus which is mutated for the PB1-F2 phopshorylation sites was impaired in its ability to induce apoptosis, similar to a mutant virus which is knocked out for PB1-F2 expression. If PB1-F2 phopshorylation is also important for the recently described immunomodulatory effects and pathogenicity remains to be investigated. PB1-F2 displays the inherent ability to undergo oligomerization. This phenomenon was characterized by the use of sPB1-F2 with chemical crosslinkers and western blot analysis. In silico analysis revealed that the protein displays two oligomerization domains in the C-terminus and a much weaker domain in the N-terminus, which is consistent with the finding that both, a N-terminal and a C-terminal fragment of PB1-F2 are able to form multimers, while the C-terminal fragment has a much higher propensity for oligomerization. Under chemically reducing conditions it was shown that the cystein in position 42 mediates the dimerization of PB1-F2 by disulfid-bridges whereas the protein multimerization depends mainly on the integrity of the oligomerization sites. There has been much speculation about the functional relevance of the oligomerization phenomenon. The most prominent hypothesis suggests that PB1-F2 oligomerization results in the formation of membrane-pores and therefore contributes to the destabilization of the mitochondrial membrane potential, suggesting that PB1-F2 mediates a viroporin-like function.

After stimulation of three thyroid cancer cell lines with several growth factors VEGF-secretion was analyzed by enzyme immunoassay.TSH was not the most powerfull stimulator of VEGF secretion. TGF-beta and EGF were more potent. In absence of a functional TSHr additional growth factors increase capacity for VEGF sectretion. TSHr signaling was evaluated by analyzing the effect of stimulators and inhibitors on VEGF protein levels under basal and TSH stimulated conditions. The effects of TSH were mediated by PKC rather than PKA., Nach Stimulation von drei Schilddrüsenkarzinomzelllinien mit verschiedenen Wachstumsfaktoren wurde die VEGF-Sekretion mittels ELISA ermittelt. TSH war hier nicht der stärkste Stimulator. TGF-beta und EGF waren potenter. In Abwesenheit eines TSHr zeigten weitere Wachstumsfaktoren einen stimulativen Effekt auf die VEGF-Sekretion. Die TSHr Signaltransduktion wurde durch den Einfluss von Stimulatoren und Inhibitoren der Signaltransduktion unter basalen und TSH stimulierten Bedingungen analysiert. Hiebei wurde das Signal für die VEGF-Sekretion hauptsächlich über die PKC vermittelt.

Zusammenfassung Krebs ist nach Herz-Kreislauferkrankungen die häufigste Todesursache in Deutschland. Die Fünf-Jahres-Überlebensrate liegt im Durchschnitt bei 35% bis 45% und resultiert unter anderem aus der Behandlung mit ionisierender Strahlung. Die Strahlentherapie ist neben chirurgischen Eingriffen und chemotherapeutischen Methoden eine der wichtigsten Behandlungsarten onkologischer Erkrankungen. Trotz technischer Präzisierung und modernster Behandlungsplanung wirkt die bislang unvermeidliche Schädigung des tumorumgebenden Normalgewebes Dosis limitierend und kann zu akuten und späten Normalgewebsreaktionen und damit assoziierten Nebenwirkungen führen. Zum Schutz des gesunden Gewebes im Strahlenfeld können Radioprotektoren eingesetzt werden, die spezifisch Normalgewebe, nicht aber Tumorgewebe vor strahleninduzierten Effekten schützen sollen. Die damit verbundene Dosiseskalation bei verbesserter Strahlentoleranz des umliegenden Normalgewebes hat eine Senkung der Nebenwirkungsrate und eine erhöhte Tumorkontrolle zur Folge. In der vorliegenden Arbeit wurde der molekulare Wirkmechanismus des Radioprotektors O-Phospho L-Tyrosin (pTyr) untersucht und die damit assoziierte Modulation der strahleninduzierten Effekte auf verschiedene Signalkaskaden beobachtet. Es konnte gezeigt werden, dass eine Vorinkubation normaler Hautfibroblasten mit pTyr zu einer signifikanten Erhöhung der klonogenen Überlebensrate nach Bestrahlung führt und somit radioprotektiv wirkt. Diese pTyr-vermittelte Radioprotektion erwies sich als abhängig von der Verfügbarkeit des Tumorsupressors TP53. Nur Zellen mit wildtyp-TP53-Status zeigten nach einer pTyr Behandlung den radioprotektierten Effekt. Da ein Großteil humaner Tumoren ein funktionell mutiertes TP53 aufweist, kommen über 50% der Tumoren für eine Kombinationsbehandlung mit pTyr und Bestrahlung in Frage. Erste Vorarbeiten zum pTyr-induzierten molekularen Wirkmechanismus zeigten eine Interaktion zwischen pTyr und der EGFR-assoziierten Signalkaskade, welche einen positiven Einfluss auf die strahleninduzierte DNS-Reparatur hat (Dittmann et al., JBC 2005). Basierend auf diesen Daten wurde in der vorliegenden Arbeit der Einfluss einer pTyr Behandlung auf molekularer Ebene untersucht und folgende Resultate erzielt: 1.Eine pTyr-Behandlung stimuliert die Akkumulation des EGFR im Zellkern, welche mit einer Stimulierung der DNA-PK-abhängigen DNS-Reparatur (NHEJ) gekoppelt ist. 2.Eine pTyr-vermittelte Stimulierung der DSB-DNS-Reapraturprozesse geschieht in Anhängigkeit von funktionell verfügbarem Tumorsupressor TP53. 3.Der Phosphorylierungszustand des EGFR im Zellkern wird durch eine Behandlung mit pTyr und ebenso durch ionisierende Strahlung am Threoninrest 654 moduliert. Diese Phosphorylierung spielt eine wesentliche Rolle bei der nukleären Akkumulation des EGFR. 4.Die für die pTyr- und strahlenvermittelte Phosphorylierung am T654 des EGFR verantwortliche Proteinkinase C ist die Isoform ε im Zellkern. 5.Die Aktivierung der nukleären PKCε ist essentiell für die EGFR-assoziierte Stimulierung der DNA-PK-abhängigen DNS-Reparatur. 6.Die für die pTyr- und strahleninduzierte Aktivierung der PKCε in Frage kommende Signalkomponente ist Diacylglycerol, welches durch die Diacylglycerolkinase θ limitierend reguliert wird. 7.Die Erzeugung von Diacylglycerol durch Hydrolyse von Phosphoinositol Bisphosphat kann durch pTyr-Behandlung und Strahlung stimuliert werden. 8.pTyr stimuliert die Bindung des kernständigen EGFR und der phosphorylierten DNA-PK an die DNS nach Bestrahlung . Ziel dieser Arbeit war die Identifikation der molekularen Eckpunkte einer pTyr-Behandlung, um den Gedanken eines klinischen Einsatzes von Phosphotyrosin im Rahmen einer radioonkologischen Behandlung voranzutreiben. Aus den vorliegenden Daten lässt sich schließen, dass eine pTyr-Behandlung in Kombination mit Bestrahlung bei der Behandlung TP53-mutierter Tumoren einen signifikanten Vorteil aufweist und die positive Beeinflussung von DNS-Reparaturprozessen zu einem verbesserten Überleben des tumorumliegenden Normalgewebes beiträgt. Des weiteren trägt diese Arbeit ihren Teil dazu bei sowohl strahlenvermittelte als auch radioprotektive Signalwege genauer zu verstehen und somit ein besseres Verständnis für die Vorgänge in einer Zelle nach Bestrahlung und der damit gekoppelten Überlebenssignale zu erlangen. Summary Cancer is, after cardiovascular diseases, the main cause of death in Germany. The five-year-survival-rate averages at 35% to 45% and is supported by tumour treatment with ionizing irradiation. Radiotherapy is among surgical interventions and chemotherapeutical methods one of the most important treatment procedure for oncological diseases. In spite of technical improvements and modern therapy designs the ineluctable damage of the tumour surrounding normal tissue acts dose limiting and may lead to acute and late normal tissue reactions and associated side effects. Radioprotectors are applied to protect healthy tissue in the radiation field, but should not protect tumour tissue against radiation effects. The potential dose escalation due to enhanced radiation-tolerance would be associated with increased tumour control. The intention of this work was to shed light on the molecular mode of action of the radioprotector O-Phospho L-Tyrosine (pTyr) and the associated modulation of radiation-induced effects on signalling cascades. The data presented provide evidence that preincubation of human fibroblasts with pTyr leads to a significant increase of cell survival after irradiation. The pTyr-mediated radioprotection was found to be dependent on the availability of the tumour suppressor TP53. Only cells characterized by a wildtype TP53, but not cells with mutated TP53 cells were protected by a pTyr-treatment. Given that a large proportion of human tumours express a mutated TP53, more than 50% of tumours are considered to be treated with pTyr and irradiation in combination. Preliminary work on the field of pTyr-induced molecular mechanism showed an interaction between pTyr and the EGFR-associated signalling pathway, which positively influences radiation-induced DNA-repair (Dittmann et al., JBC 2005). Based on these data we investigate the influence of pTyr treatment on a molecular level. The following results were obtained: 1.pTyr treatment stimulates accumulation of the EGFR in the nucleus, which is involved in regulation of DNA-PK-dependent DNA-repair (NHEJ). 2.pTyr-mediated stimulation of DSB-DNA-repair processes is dependent on functional tumour suppressor TP53. 3.Ionizing radiation and pTyr are able to modulate the phosphorylation status of nuclear EGFR at the position No. 654. This phosphorylation site plays an important role in accumulation of EGFR in the nucleus. 4.The isoform ε of the protein kinase C family is responsible for the pTyr- and radiation-induced T654 phosphorylation of the EGFR in the nucleus. 5.The kinase activity of the nuclear PKCε is essential for nuclear EGFR accumulation and EGFR-associated stimulation of the DNA-PK-dependent DNA-repair. 6.The considered second messenger in the pTyr- and radiation-induced activation of PKCε is diacylglycerol, which is limited by its regulatory kinase DGK θ. 7. Diacylglycerol is generated by hydrolyzation of phosphoinositol biphosphate, which can be stimulated by pTyr treatment and ionizing irradiation. 8.pTyr enhances complex formation between nuclear EGFR, phosphorylated form of DNA-PK and DNA after irradiation. Aim of this work was to elucidate molecular vertices of a pTyr treatment in order to promote the clinical application of pTyr in the context of radiooncological therapy. From present data we suggest that combined treatment of TP53-mutated tumours with pTyr and irradiation improves survival of tumour surrounding normal tissue by influencing DNA-repair processes positively and therefore takes advantage in radiotherapy-treatment. Furthermore this work gives a better insight into radiation-mediated and radioprotective signalling pathways and helps to achieve a deeper understanding in molecular mechanisms after irradiation and radiation-associated survival signals.

In dieser Arbeit wurde der Proteinkinase C-Signalweg als wichtiges Instrument zur Weitergabe des Entzündungsstimulus und Vermittler zwischen Entzündungsreaktion und CRP-Synthese bestätigt. Initial wurden zunächst die potenziell in den CRP-Syntheseweg involvierten PKC-Isoformen in primären Hepatozyten isoliert. Als relevante biochemische Isoform konnte mittels Gen-silencing über siRNAs (small interfering RNA), die PKC-beta-I (Proteinkinase C, Isoform Beta-2) im CRP-Luciferase-HepG2-Zellkonstrukt (ABEK-14, eine modifizierte Hepatomzelllinie) detektiert werden. Eine Übertragbarkeit der Ergebnisse auf primäre Hepatozyten liegt auf Grund genomischer Ähnlichkeiten sowie Parallelen im Aufbau des Biosyntheseapparates dieser Zellen nahe. Es ist also davon auszugehen, dass der gentechnologische "knock-down" der PKC-Isoform PKC-beta-I mittels siRNAs die Blockade eines wichtigen Elementes im CRP-Syntheseweg ermöglicht und über diesen Mechanismus in vitro eine Senkung der CRP-Syntheserate erzielt werden kann.

Für das Hepatitis B Virus wurden neben der Proteinkinase C noch vier andere potentielle Proteinkinasen (GAPD, CAK, SRPK-1, SRPK-2) beschrieben, die das Capsidprotein phosphorylieren können. Der Zeitpunkt der Phosphorylierungen – vor oder nach der Capsidbildung – ist jedoch unbekannt. Um die Natur und Funktion der Proteinkinasen zu untersuchen, wurden Versuche mit Isotyp-spezifischen Proteinkinase C Inhibitoren in assemblierten Capsiden durchgeführt. Um eine allgemeine Übertragbarkeit der Ergebnisse zu untersuchen, wurden verschiedene Genotypen des HBV, sowohl aus Patientenplasmen als auch aus Zellkultur, für die Experimente verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass unabhängig vom HBV-Genotyp und dem Ursprung der Capside eine Proteinkinase C des Isotyp alpha oder beta verpackt worden war. Inhibitionen dieser PKC Isoformen in der stabil das HBV exprimierenden Zelllinie HepG2.2.15 belegten, dass die PKC-Phosphorylierung essentiell für die Verpackung der Capside in die Hüllproteine ist. Die Analyse der Proteinkinase in Virus-extrahierten Capsiden, die trotz PKC-Inhibition sekretiert worden waren belegte, dass auch diese PKC beinhalteten, also kein Ersetzen von PKC durch eine andere zelluläre Proteinkinase erfolgt. Korrespondierend zur herabgesetzten Virussekretion zeigte sich eine intrazelluläre Akkumulation von Capsiden, die allerdings auch durch eine erhöhte Stabilität der Capside bedingt gewesen sein könnte. Zusammengefasst zeigen die Befunde, dass das HBV Capsidprotein nach dem Capsidassembly spezifisch durch Proteinkinase C wahrscheinlich des Isotyps beta phosphoryliert wird und diese Phosphorylierung essentiel für den hepadnaviralen Lebenszyklus ist. Dessen ungeachtet erscheint es jedoch wahrscheinlich, dass der Capsidprotein-Phosphorylierung durch eine weitere Proteinkinase vor dem Assembly eine wesentliche Bedeutung zukommt, z.B. im Rahmen der Prägenom-Verpackung. Beside protein kinase C four other potential protein kinases (GAPD, CAK, SRPK-1, SRPK-2) were described for phosphorylation of the hepatitis B virus capsid protein. Whether phosphorylation takes place prior or after the capsid assembly is unknown. For characterization and function of the protein kinase within assembled capsids experiments with isotyp specific protein kinase C inhibitors were performed. Capsids from different HBV genotyps derived from patient plasma or from cell culture were used in order to allow general conclusion. It could be demonstrated that an isotyp alpha or beta protein kinase C was present inside of the capsids. This finding was independent upon genotyp or origin of the capsids. Inhibition of these two isoforms in the stably HBV expressing cell line HepG2.2.15 showed that phosphorylation with protein kinase C was essentiell for capsid envelopment into the surface proteins. Analysis of the protein kinase in capsids of viruses, which were secreted despite the presence of the PKC inhibitor, demonstrated that these capsids still contained PKC. Hence, protein kinase C could not be replaced by another cellular protein kinase. Coherently to lower virus secretion an intracellular capsid accumulation was observed although increased capsid stability could not be excluded. In summary these results show that the HBV capsid protein after assembly becomes phosphorylated from a protein kinase C likely of the isotyp beta. This phosphorylation is essential for the hepadnaviral life cycle. Despite of these findings a phosphorylation of the capsid protein before the assembly is likely. Presumably this modification is performed by another protein kinase and is essential e.g. in pregenome packaging.

Schon aus früheren Studien ist bekannt, dass die Proteinkinase C in menschlichen Erythrozyten exprimiert wird und neben der Phosphorylierung von zytoskelettalen Proteinen auch Einfluss auf die zelluläre Integrität und die Funktion der Erythrozyten hat. Mit unseren Experimenten wollten wir herausfinden, welche Rolle und Funktion dieses Enzym bei der Regulation des programmierten Erythrozytentods spielt. Wie unsere Arbeit deutlich zeigt, kann der PKC im Apoptoseprogramm von Erythrozyten eine Schlüsselrolle zugeschrieben werden. So führen Stressoren, wie die Energiedepletion oder die Behandlung mit Phorbolestern, zu einer Aktivierung dieser Proteinkinase, welche dann in ihrem aktivierten Zustand den Kationenkanal auf direktem Weg phosphoryliert. Der durch die Phosphorylierung aktivierte Kanal öffnet sich und bedingt dadurch einen massiven Einstrom von Ca2+ in die Zelle, was daraufhin in der Aktivierung der Ca2+-sensitiven Scramblase mündet. Diese wiederum bewirkt die Exposition von Phosphatidylserin auf der Membranaußenseite. Weiterhin aktiviert Ca2+ den Ca2+-abhängigen K+-Kanal, was zum K+-Ausstrom und zur Schrumpfung der Zellen führt. Schrumpfung und Phosphatidylserinexposition werden dann als Signale erkannt, um die geschädigten Erythrozyten auszusortieren. Die Beobachtungen jedoch, dass Staurosporin den stimulierenden Effekt der Glukosedepletion auf die Erythrozytenapoptose nur teilweise hemmt und in Kontrast dazu den Anteil an Annexin-positiven Zellen nach Behandlung mit Okadaic acid vollständig unterbindet, wie auch die Versuche mit Okadaic acid unter Wegnahme von extrazellulärem Ca2+, führten uns zu dem Schluss, dass eine durch Energiedepletion hervorgerufene Annexin-Bindung nicht ausschließlich durch die Aktivierung der PKC hervorgerufen wird, sondern dass noch ein zweiter, davon unabhängiger Mechanismus existieren muss. As has been established earlier, human erythrocytes contain protein kinase C (PKC). Besides its role in the phosphorylation of cytoskeletal proteins, this kinase also influences cytoskeletal integrity and erythrocyte functions. In the present study, we aimed to find out which role this enzym plays in the regulation of programmed cell death of erythrocytes (eryptosis). Our study clearly shows that PKC takes a key role in the eryptosis program. Different stressors, e. g. glucose depletion or treatment with phorbolesters, lead to stimulation of PKC alpha which in turn activates the non-specific cation channels in the erythrocyte membrane, presumably by direct phosphorylation of the channel proteins. The phosphorylated channel opens its cation pore, and the subsequent entry of Ca2+ leads to activation of a Ca2+-sensitive erythrocytic scramblase. This in turn effects the phosphatidylserine exposure on the erythrocyte surface. Beyond this, Ca2+ activates Ca2+-sensitive K+ channels leading to cell shrinkage through release of K+, Cl- and osmotically obliged water. Both hallmarks of eryptosis, i. e. shrinkage and phosphatidylserine exposure, are signals for clearing affected erythrocytes from circulating blood. Whereas okadaic acid-induced eryptosis was completely blocked by the PKC inhibitor staurosporine, eryptosis inhibition of glucose-depleted cells was only partial. This incomplete inhibitory effect of staurosporine on annexin binding of glucose-depleted cells points to additional mechanisms leading to erythrocyte programmed cell death after energy removal.

Für das Hepatitis B Virus wurden neben der Proteinkinase C noch vier andere potentielle Proteinkinasen (GAPD, CAK, SRPK-1, SRPK-2) beschrieben, die das Capsidprotein phosphorylieren können. Der Zeitpunkt der Phosphorylierungen vor oder nach der Capsidbildung ist jedoch unbekannt. Um die Natur und Funktion der Proteinkinasen zu untersuchen, wurden Versuche mit Isotyp-spezifischen Proteinkinase C Inhibitoren in assemblierten Capsiden durchgeführt. Um eine allgemeine Übertragbarkeit der Ergebnisse zu untersuchen, wurden verschiedene Genotypen des HBV, sowohl aus Patientenplasmen als auch aus Zellkultur, für die Experimente verwendet. Es konnte gezeigt werden, dass unabhängig vom HBV-Genotyp und dem Ursprung der Capside eine Proteinkinase C des Isotyp alpha oder beta verpackt worden war. Inhibitionen dieser PKC Isoformen in der stabil das HBV exprimierenden Zelllinie HepG2.2.15 belegten, dass die PKC-Phosphorylierung essentiell für die Verpackung der Capside in die Hüllproteine ist. Die Analyse der Proteinkinase in Virus-extrahierten Capsiden, die trotz PKC-Inhibition sekretiert worden waren belegte, dass auch diese PKC beinhalteten, also kein Ersetzen von PKC durch eine andere zelluläre Proteinkinase erfolgt. Korrespondierend zur herabgesetzten Virussekretion zeigte sich eine intrazelluläre Akkumulation von Capsiden, die allerdings auch durch eine erhöhte Stabilität der Capside bedingt gewesen sein könnte. Zusammengefasst zeigen die Befunde, dass das HBV Capsidprotein nach dem Capsidassembly spezifisch durch Proteinkinase C wahrscheinlich des Isotyps beta phosphoryliert wird und diese Phosphorylierung essentiel für den hepadnaviralen Lebenszyklus ist. Dessen ungeachtet erscheint es jedoch wahrscheinlich, dass der Capsidprotein-Phosphorylierung durch eine weitere Proteinkinase vor dem Assembly eine wesentliche Bedeutung zukommt, z.B. im Rahmen der Prägenom-Verpackung., Beside protein kinase C four other potential protein kinases (GAPD, CAK, SRPK-1, SRPK-2) were described for phosphorylation of the hepatitis B virus capsid protein. Whether phosphorylation takes place prior or after the capsid assembly is unknown. For characterization and function of the protein kinase within assembled capsids experiments with isotyp specific protein kinase C inhibitors were performed. Capsids from different HBV genotyps derived from patient plasma or from cell culture were used in order to allow general conclusion. It could be demonstrated that an isotyp alpha or beta protein kinase C was present inside of the capsids. This finding was independent upon genotyp or origin of the capsids. Inhibition of these two isoforms in the stably HBV expressing cell line HepG2.2.15 showed that phosphorylation with protein kinase C was essentiell for capsid envelopment into the surface proteins. Analysis of the protein kinase in capsids of viruses, which were secreted despite the presence of the PKC inhibitor, demonstrated that these capsids still contained PKC. Hence, protein kinase C could not be replaced by another cellular protein kinase. Coherently to lower virus secretion an intracellular capsid accumulation was observed although increased capsid stability could not be excluded. In summary these results show that the HBV capsid protein after assembly becomes phosphorylated from a protein kinase C likely of the isotyp beta. This phosphorylation is essential for the hepadnaviral life cycle. Despite of these findings a phosphorylation of the capsid protein before the assembly is likely. Presumably this modification is performed by another protein kinase and is essential e.g. in pregenome packaging.

Bei Verletzung einer Gefäßwand kommen Blutplättchen in Kontakt mit den Substanzen des Subendothels; Die Plättchen werden dadurch aktiviert, sie aggregieren und verschließen die Wunde, wodurch ein hoher Blutverlust verhindert wird. Unter pathologischen Bedingungen, bei Aufbrechen eines artherosklerotischen Plaques an der Gefäßwand, können sich jedoch große Plättchenaggregate, die Thromben, formen, die das Gefäß verschließen, den Blutfluss stoppen und somit zu Schlaganfall und Herzinfarkt führen können. Die kontrollierte Regulation und Signaltransduktion von bzw. durch Plättchenoberflächenrezeptoren ist wesentlich für das Funktionieren der Zellen und die intakte Balance zwischen physiologischer Plättchen-Aktivierung und der pathologischen Bildung eines Thrombus. In der vorliegenden Arbeit wird über wichtige Aspekte dieser Signalwege, die in drei Unterprojekten untersucht worden sind, berichtet. In dem ersten Unterprojekt wurde die Regulation von Plättchenoberflächenrezeptoren, den Glykoproteinen (GP) V und VI, bei Mäusen analysiert. Hier wird beschrieben, dass GPV und GPVI von der Plättchenoberfläche durch Metalloproteinasen geschnitten werden. Während physiologischer Stress, wie das Entkoppeln der oxidativen Phosphorylierung in den Mitochondrien, das Schneiden von GPVI durch eine unbekannte Proteinase auslöst, verursacht die Aktivierung von Plättchen mit bestimmten Agonisten das Schneiden von GPV. Die dafür verantwortliche Metalloproteinase wurde als ADAM17 identifiziert. In dem zweiten Unterprojekt wurde die Rolle der Protein Kinase C (PKC) in der Plättchenaktivierung einerseits und in der Plättchen pro-koagulanten Aktivität andereseits untersucht. Die Konformationsänderung/Aktivierung von alphaIIbeta3-Integrinen und Sekretion von Granula sind charakteristisch für die Plättchenaktivierung. Calcium-(Ca2+)-abhängige Phosphatidylserin (PS)- Expression auf der Plättchenoberfläche hingegen ist kennzeichnend für die pro-koagulante Aktivität. Der Beitrag von PKC zu den beschriebenen Plättchenzuständen war bisher unklar. In diesem Projekt wurde zum ersten Mal gezeigt, dass PKC eine doppelte Funktion in den Plättchen besitzt: einerseits fördert PKC die Plättchen-Aktivierung und –Aggregation, andererseits unterdrückt PKC die pro-koagulant Aktivität. In dem dritten Unterprojekt wurde die Rolle der kleinen GTPase Rac1 in der Plättchen- Aktivierung und -Aggregation in vitro und in vivo an konditionalen Rac1 Mäusen analysiert. Es wird berichtet, dass Rac1 für die GPVI abhängige Aktivierung von alphaIIbbeta3-Integrinen und dem Freisetzen von Ca2+ in der Zelle, notwendig ist, sowie für GPVI abhängige Plättchen-Aggregation und Thrombus Bildung. Hiermit wird die GTPase Rac1 zum ersten Mal in den Signalweg unterhalb von GPVI eingeordnet und ihr zudem dort eine essentielle Rolle zugeteilt., Platelets are crucial to inhibit extensive blood loss at sites of vascular injury. However, under pathological conditions such as rupture of an atherosclerotic plaque, activated platelets form aggregates that may occlude the vessel. This can lead to heart attack and stroke. Various and complex signaling pathways in the cell are involved in the steps of platelet adhesion, activation and aggregation. Single aspects of these processes were studied in three different subprojects in this work. The Glycoprotein (GP) Ib-V-IX complex is responsible for the first contact of platelets with the vessel wall. Subsequently, GPVI can bind to collagen of the subendothelium, which initiates a signaling cascade leading to platelet activation, aggregation, characterized by integrin activation and granule secretion and platelet procoagulant activity. The latter is characterized by exposed phosphatidylserine (PS) on the platelet surface, which enhances thrombin generation and thereby the coagulation cascade. A controlled regulation of GP receptors on the platelet surface is vital for an intact response of the cell to platelet agonists. In the first subproject described here the regulation of GPV and GPVI on mouse platelets was investigated and it was found that both receptors are shed from the platelet surface in a metalloproteinase dependent manner. However, GPVI is shed upon mitochondrial injury, while GPV cleavage could be observed upon platelet stimulation. The metalloproteinase responsible for GPVI shedding remains unknown whereas the metallproteinase that sheds GPV was identified in this work as being ADAM17. This shows that the expression of both receptors underlies a controlled mechanism regulated through distinct metalloproteinases. In the second subproject the role of protein kinase C (PKC) in platelet activation and procoagulant response was investigated using PKC specific inhibitors. It was found that PKC blockage reduced platelet activation but enhanced platelet procoagulant activity. This is the first time that a dual role in platelet activation and procoagulant activity is defined for PKC. In the third project the role of the small GTPase Rac1 in platelet signaling was studied using conditional Rac1 knock out mice. It is reported here that Rac1 lies downstream of GPVI and is involved in integrin activation and cytsolic Ca2+ changes in vitro and platelet adhesion and thrombus formation in vivo. This is the first time that Rac1 is demonstrated to have a pivotal role in GPVI signaling and furthermore points to a novel, unknown pathway downstream of GPVI.

Nach einer Organtransplantation ist der Einsatz von Immunsuppressiva wie z.B. Rapamycin notwendig. Fallberichten zufolge kommt es unter Einsatz von Rapamycin immer wieder zu thrombotischen Komplikationen, die zum Organverlust führen können. In dieser Arbeit wurde nachgewiesen, dass humane Monozyten in-vitro unter dem Einfluss von Rapamycin konzentrationsabhängig Tissue factor (TF) exprimieren, was zu einer Zunahme der prokoagulatorischen Aktivität dieser Zellen führt. Eine Therapie mit Rapamycin kann einen Risikofaktor für thrombotische Komplikationen darstellen. Die durch Rapamycin induzierte Zunahme der TF-Expression in Monozyten hat vermutlich primär in entzündlicher Umgebung klinische Bedeutung. Es konnte gezeigt werden, dass das antiinflammatorische Interleukin IL-4 zu einer Suppression von TF in Monozyten führt. In die intrazelluläre Signalkaskade ist die Proteinkinase C (PKC) involviert.

HINTERGRUND: Im Zustand der Herzinsuffizienz sind die Plasmaspiegel des atrialen natriuretischen Peptids (ANP) erhöht. ANP wird durch Herzmuskelzellen bei atrialer (und dadurch kardiomyozytärer) Dehnung freigesetzt. Eine Reihe von Plasmafaktoren, welche bei der Herzinsuffizienz aktiviert sind, bewirken ebenfalls eine ANP-Freisetzung durch die Interaktion mit G(alpha-q)-gekoppelten Rezeptoren und der daraus resultierenden Aktivierung der Proteinkinase C (PKC). Ziel der vorliegenden Studie war es, im Vergleich von normalen und insuffizienten Rattenherzen die dehnungsinduzierte ANP-Sekretion sowie die Rolle der PKC bei der basalen ANP-Freisetzung zu analysieren. METHODIK: Durch Anlegen eines infrarenalen aortokavalen Shunts (4 Wochen) wurde eine volumeninduzierte Herzinsuffizienz in Wistar Ratten erzeugt. Die ANP-Freisetzung wurde am isoliert, retrograd perfundierten Herzmodell analysiert. Durch Umstellen auf anterograde Perfusion (Perfusionsdruck: 10mmHg) wurde eine atriale De! hnung induziert. Die Aktivierung der PKC fand durch Zugabe von PMA (Phorbol-12-Myristat-13-Azetat) zum Perfusat im Vergleich zu Vehikel statt. Alle Versuchsreihen wurden mit Herzen von shunt- sowie scheinoperierten Tieren durchgeführt. ERGEBNISSE UND DISKUSSION: Nach Shuntoperation war die ANP-Basalfreisetzung deutlich gesteigert und könnte die erhöhten ANP-Plasmaspiegel bei Patienten mit Herzinsuffizienz erklären. Dagegen wurde durch atriale Dehnung (als adäquaten Freisetzungsreiz am gesunden Herzen) keine weitere Steigerung der ANP-Freisetzung in der Shuntgruppe bewirkt. Die ANP-Freisetzung am insuffizienten Herzen ist im Vergleich zur normalen Herzfunktion somit verändert. Unter PKC-Stimulation sank die Freisetzung von ANP in der Shuntgruppe erheblich ab, wogegen es in der Kontrollgruppe zu keiner signifikanten Änderung der ANP-Sekretion kam. Damit wurde der Verdacht erhärtet, dass die Proteinkinase C in die abweichende Regulation der ANP-Freisetzung bei Herzinsuffizie! nz involviert ist., BJECTIVE: Plasma levels of atrial natriuretic peptide (ANP) are markedly increased in congestive heart failure. ANP has been shown to be released by cardiomyocytes during atrial (and thereby cardiomyocytical) stretch. Several factors that are activated in heart failure as well enhance ANP release through the interaction with G(alpha-q)-coupled receptors and the consequent activation of proteinkinase C (PKC). The goal of this study was to analyse stretch induced ANP secretion and to investigate the involvement of PKC in the regulation of ANP release in heart failure compared to normal hearts. METHODS: Volume overload induced heart failure was produced by an infrarenal aortocaval shunt (4 weeks) in Wistar rats. ANP release was analysed in an isolated retrogradly perfused heart preparation. Atrial stretch was induced by switching to anterograd perfusion (perfusion pressure: 10mmHg). For PKC activation PMA (phorbol 12 myristate 13 acetate) was added to the perfusate and compar! ed to vehicle treatment. All experiments were performed with shunt and sham operated rats. RESULTS AND CONCLUSIONS: After shunt operation ANP baseline release was considerably augmented and could thus explain elevated ANP plasma levels in heart failure patients. In contrast, atrial stretch as an adequate secretion stimulus in control hearts did not further enhance ANP release in hearts of shunt operated animals. The ANP secretion in heart failure therefore seems to differ from the ANP secretion in the healthy state. Stimulation of PKC markedly decreased ANP release in the shunt group, whereas it did not have any significant effect on ANP release in the control group. In conclusion, the role of the proteinkinase C in ANP release differs between normal and failing hearts and seems to be involved in the deviating regulation of ANP release in states of heart failure.

Apolipoprotein E (ApoE) ist eine verbreitet vorkommende Komponente der Plasmalipoproteine und spielt eine Schlüsselrolle bei Lipidtransport und Cholesterin-Homöostase über den Low Density Lipoprotein Rezeptor. Im ZNS wird ApoE hauptsächlich von Astrozyten synthetisiert und sekretiert. ApoE-Isoformen haben unterschiedliche Wirkung auf eine Zahl von pathologischen Prozessen, die der Alzheimerschen Krankheit zugrunde liegen. Um die Rolle des ApoE für die Alzheimersche Krankheit zu erhellen, ist es wichtig Kenntnisse über seine Regulation zu erlangen. Ein Ziel dieser Arbeit war zu untersuchen, ob die „Second-Messenger“-Signalpfade „Adenylatcyclase/Proteinkinase A (PKA)“ und/oder „Phospholipase C/Proteinkinase C (PLC/PKC)“ in die Regulation der astrozytären ApoE Sekretion eingreifen. Hierfür wurden primäre hippocampale Astrozytenkulturen von Ratten mit verschiedenen Analoga, Rezeptoragonisten und Neurotransmittern, die diese Signalpfade beeinflussen, inkubiert. Dibutyryl-cAMP (cAMP-Analogon) erhöhte die ApoE Sekretion. Auch Rezeptoragonisten des Adenylatcyclase/PKA-Signalwegs beeinflussten die ApoE Sekretion. Isoproterenol (beta-Adrenorezeptoragonist) erhöhte die ApoE Sekretion, während Clonidine (alpha-2 Adrenorezeptoragonist) sie senkte. Der PKC-Aktivator Phorbol 12-Myristat 13-Acetat senkte die ApoE Sekretion und kehrte die dibutyryl-cAMP-vermittelte Erhöhung der ApoE Sekretion um. Arterenol (alpha-1 Adrenorezeptoragonist) und Serotonin (Neurotransmitter) erhöhten die ApoE Sekretion, wohingegen Carbachol (Acetylcholiner muskarinischer Rezeptoragonist) die ApoE Sekretion senkte. Es wird gezeigt, dass die verwendeten Substanzen einen von der ApoE Sekretion verschiedenen Einfluss auf die Sekretion des Nervenwachstumsfaktors (NGF) haben. Dies legt die Vermutung nahe, dass die beobachteten Ergebnisse nicht auf einen generellen Effekt der Proteinsynthese zurückzuführen sind. Es kann gefolgert werden, dass die astrozytäre ApoE Sekretion von Faktoren beeinflusst werden kann, die die intrazelluläre Konzentration von cAMP verändern oder die PKC aktivieren. Das zweite Ziel der Arbeit war zu untersuchen ob Amyloid Fragmente einen Einfluss auf die astrozytäre ApoE Sekretion haben. Senile Amyloid-Plaques in Alzheimer-Gehirnen zeigen eine ApoE-Immunreaktivität, Astrozyten die diese Plaques umgeben dagegen nicht. Es wird gezeigt, dass gealtertes fibrilläres Amyloid (1-40) die ApoE Sekretion erhöht. Das sekretierte ApoE wird durch die, die Zellen umgebenden Amyloid-Konglomerate, gebunden. Die verwendeten Amyloid Fragmente beeinflussten nicht die Menge des sekretierten basischen Fibroblastenwachstumsfaktors. Dies legt nahe, dass die beobachteten Ergebnisse nicht auf einen generellen Effekt der Proteinsynthese zurückzuführen sind., Apolipoprotein E (apoE) is an abundant component of plasma lipoproteins that plays a key role in lipid transport and cholesterol homeostasis via the low density lipoprotein receptor. In the CNS, apoE is synthesised and secreted especially by astrocytes. ApoE isoforms have different effects on a number of pathological processes underlying Alzheimer’s disease. Therefore, understanding the regulated synthesis of apoE is important for determining its role in Alzheimer’s disease. One aim of this work was to examine whether the second-messenger-pathways „adenylyl cyclase/proteinkinase A (PKA)“ and/or „phospholipase C/proteinkinase C (PLC/PKC) are involved in the regulation of apoE secretion in astrocytes. Therefore rat primary hippocampal astrocyte cultures were incubated with various analogues, receptor agonists and neurotransmitters which influence these pathways. Dibutyryl-cAMP (cAMP analogue) increased the apoE secretion. ApoE secretion was also modulated by receptor agonists of the adenylyl cyclase/PKA pathway. Isoproterenol (beta-adrenoceptor agonist) enhanced, while Clonidine (alpha 2-adrenoceptor agonist) decreased, the secreted apoE. In contrast, the PKC activator phorbol 12-myrisate 13-acetate decreased the apoE secretion. It also reversed the effects of dibutyryl-cAMP. Arterenol (alpha 1-adrenoceptor) and serotonin (neurotransmitter) enhanced, whereas carbachol (acetylcholine muscarinic receptor agonist) deceased secreted apoE. It is shown, that the used substances have different effects on the secretion of the nerve growth factor (NGF) as compared to apoE secretion, suggesting that the results obtained were unlikely to be due to a general effect on protein synthesis. It can be concluded that actrocytic apoE production can be regulated by factors that affect cAMP intracellular concentration or activate PKC. The second aim of this work was to examine whether amyloid fragments have an effect on the apoE secretion of astrocytes. Senile amyloid plaques in Alzheimer’s disease brains show apoE immunoreactivity, astrocytes which surround them do not. It is shown, that aged, fibrillic amyloid (1-40) increases apoE secretion. The secreted apoE is bound to the surrounding amyloid conglomerates. The used amyloid fragments did not increase or decrease basic fibroblast growth factor secretion, suggesting that the results obtained were unlikely to be due to a general effect on protein synthesis.

Die Glukose-induzierte Aktivierung der PKC-\(\beta\) bei der Entstehung der diabetischen Folgekomplikationen ist in vielen Untersuchungen im Tiermodell und zunehmend auch in menschlichen Zellen gesichert. Die transkriptionelle Regulierung der PKC-\(\beta\) durch Glukose wurde hier untersucht. Promotorkonstrukte der humanen PKC-\(\beta\) wurden transient in die humane, embryonale Nierenzellinie HEK-293 transfiziert. Nach 72h Inkubation in 16,5 mmol/l Glukose zeigte sich eine hochsignifikante Aktivierung des PKC-\(\beta\)-Promotorkonstruktes C2. Der Effekt wurde durch den PKC-\(\beta\)-Agonisten TPA verstärkt, GF109203X, ein unselektiver Antagonist, hemmte diesen Promotorabschnitt. LY379196, ein PKC-\(\beta\)-selektiver Antagonist, zeigte keinen Einfluß auf den PKC-\(\beta\)-Promotor. Hohe Glukose bewirkt eine transkriptionelle Aktivierung des humanen PKC-\(\beta\)-Promotors. Der Transkriptionsfaktor AP-2 ist ein Aktivator dieser Sequenz und damit ein möglicher Vermittler dieser Glukosewirkung.

Die Glukose-induzierte Aktivierung der PKC-β bei der Entstehung der diabetischen Folgekomplikationen ist in vielen Untersuchungen im Tiermodell und zunehmend auch in menschlichen Zellen gesichert. Die transkriptionelle Regulierung der PKC-β durch Glukose wurde hier untersucht. Promotorkonstrukte der humanen PKC-β wurden transient in die humane, embryonale Nierenzellinie HEK-293 transfiziert. Nach 72h Inkubation in 16,5 mmol/l Glukose zeigte sich eine hochsignifikante Aktivierung des PKC-β-Promotorkonstruktes C2. Der Effekt wurde durch den PKC-β-Agonisten TPA verstärkt, GF109203X, ein unselektiver Antagonist, hemmte diesen Promotorabschnitt. LY379196, ein PKC-β-selektiver Antagonist, zeigte keinen Einfluß auf den PKC-β-Promotor. Hohe Glukose bewirkt eine transkriptionelle Aktivierung des humanen PKC-β-Promotors. Der Transkriptionsfaktor AP-2 ist ein Aktivator dieser Sequenz und damit ein möglicher Vermittler dieser Glukosewirkung.

Der Makrophagen-Migrations-Inhibitions-Faktor wurde erstmals 1966 als ein pro-inflammatorisches Zytokin beschrieben, welches von aktivierten T-Zellen sezerniert wird. In den letzten zehn Jahren wurden zahlreiche neue biologische Eigenschaften von MIF entdeckt, wie z.B. eine Rolle in der Tumorgenese und regulatorische Wirkungen in endokrinen Geweben. Trotz dieser fortschreitenden Erkenntnisse sind die molekularen Wirkmechanismen dieses Zytokins jedoch bis heute nur sehr wenig verstanden. Im Hoden wird MIF von den Leydig-Zellen exprimiert und löst in Peritubulärzellen (PTC) eine Erhöhung der intrazellulären Calciumkonzentration aus. Ziel dieser Arbeit war es, die Signaltransduktionsmechanismen, welche MIF in PTC aktiviert, näher zu charakterisieren. Mittels cDNA-Array konnte nach MIF-Stimulation der PTC eine differentielle Genexpression von mindestens 26 Genen festgestellt werden. So zeigten Gene des MAP-Kinase-Weges eine erhöhte Expression, während Elemente des Proteinkinase A-Signalweges herunterreguliert wurden. Die Signaltransduktion von MIF über den PKA-Signalweg konnte ausgeschlossen werden, da neben der inhibitorischen Wirkung auf Schlüsselenzyme des PKA-Weges auch kein Einfluß von MIF auf die cAMP-Konzentration dokumentiert werden konnte. Zur Überprüfung einer MAP-Kinase-Aktivierung wurden mit Reportergen-Assays die Transkriptionsfaktoren AP1 und Elk-1, beide mögliche Zielproteine der MAP-Kinase, untersucht. Hier konnte eine Aktivierung durch MIF ausgeschlossen werden. Auch Proliferationsstudien ergaben, dass MIF die Wachstumsrate der PTC nicht steigert und somit eine MAP-Kinase-Aktivierung trotz Erhöhung der Genexpression dieser Faktoren unwahrscheinlich ist. Vermutlich werden andere Reaktionen der PTC über die MAP-Kinase reguliert. Eine Aktivierung der Proteinkinase Cb (PKCb) durch MIF konnte in transfizierten PTC gezeigt werden. Nach MIF-Stimulation wurde die für die Aktivierung essentielle Translokation der PKCb mittels eines PKCb-Green-Fluorescent-Protein-Konstruktes aus dem Zytoplasma an die Plasmamembran beobachtet. Zusammenfassend kann davon ausgegangen werden, daß MIF in den Peritubulärzellen die Phospholipase C aktiviert, welche dann über IP3 und DAG eine Aktivierung der PKC bewirkt. Die Untersuchung der Phospholipase C-Aktivierung und die Charakterisierung von Zielproteinen der PKC bleiben Ziel zukünftiger Studien. Die im Rahmen der vorliegenden Arbeit erhobenen Ergebnisse können dazu beitragen, die molekularen Wirkmechanismen von MIF im Hoden besser zu definieren, um Erkenntnisse über mögliche Therapieansätze bei testikulären Erkrankungen, in denen MIF eine Rolle spielt, zu gewinnen. Macrophage migration inhibitory factor (MIF) was first described in 1966 as a pro-inflammatory cytokine secreted by activated T-lymphocytes. Lately, new biological roles have been described for MIF, as for example a role in tumor growth and endocrine systems. Despite these progresses, still little is known about the molecular mechanism of MIF action on target cells. In the testis, MIF is expressed in Leydig cells and increases the intracellular calcium concentration in peritubular cells (PTC). The aim of this study was to further characterize the signal transduction pathway that MIF is eliciting in PTC. Using cDNA-arrays, differential gene expression of at least 26 genes was found after MIF stimulation in PTC. Expression was up-regulated in genes of the MAP-kinase pathway, whereas down-regulation was noticed in those of the proteinkinase A (PKA) pathway. Measurement of the intracellular cAMP concentration did not show any increase after MIF stimulation, therefore activation of the PKA-pathway could be excluded. Studies on the transcription factors AP1 and ELK-1, both potential targets of the MAP-Kinase pathway, did not show any activation of these factors. Also, MIF did not show an effect on cell proliferation in PTC, which makes a MAP-kinase activation unlikely. Possibly, other PTC reactions are regulated by the MAP-kinases. Transfection studies showed activation of the protein kinase Cb (PKCb). MIF stimulation led to the translocation of a PKCb-green-fluorescent-protein from the cytoplasm to the cell membrane. This translocation is an essential step in PKC activation. In conclusion, MIF seems to activate phospholipase C in PTC which leads to activation of the PKCb through IP3 and DAG. In the future, studies on phospholipase C activation and possible target proteins of the PKCb should be done. The results of this study should help to define the molecular effects of MIF in the testis and to find therapies for testicular diseases in which MIF is involved.

RS1, ein Genprodukt von RSC1A1, ist entscheidend an der zelldichteabhängigen transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 in LLC-PK1 Zellen und an der post-transkriptionellen Herunterregulation von SGLT1 im Dünndarm beteiligt. RS1 hemmt die Freigabe von SGLT1 enthaltenden Vesikeln aus dem trans-Golgi Netzwerk und wandert in den Zellkern wo es die Transkription von SGLT1 inhibiert. In der vorliegenden Arbeit identifizierten wir eine neuartige 21 Aminosäuren lange nicht-konventionelle Kernlokalisierungssequenz (RS1 NLS) in RS1 vom Schwein (pRS1), die für die Kernlokalisierung von pRS1 nötig und ausreichend ist. RS1 NLS ist von zwei Konsensussequenzen für Phosphorylierung umrahmt, welche für die konfluenzabhängige Regulierung von RS1 NLS verantwortlich sind: Eine Stelle für Casein Kinase 2 (CK2) in der Position 348 und eine Stelle für Protein Kinase C (PKC) in der Position 370. Es wurde eine konfluenz-abhängige Kernlokalisierung mit den Aminosäuren 342-374 (R-NLS-Reg) beobachtet. Die Mutationsanalyse deutete darauf hin, dass Kernlokalisierung durch die Phosphorylierung von Serin 370 (PKC) geblockt wird, und dass die Phosphorylierung von Serin 348 (CK2) die Phosphorylierung von Serin 370 verhindert. Da während der Konfluenz CK2 herunterreguliert und PKC hochreguliert wird, deuten unsere Daten darauf hin, dass die Kernlokalisierung die zelldichteabhängigen Veränderungen in der transkriptionellen und posttranskriptionellen Hemmung von SGLT1 Expression koordiniert., RS1, a gene product of RSC1A1, is critically involved in cell density-dependent transcriptional down-regulation of SGLT1 in LLC-PK1 cells and in the post-transcriptional down-regulation of SGLT1 in small intestine. RS1 inhibits the release of SGLT1 containing vesicles from the trans-Golgi network and migrates into the nucleus where it inhibits transcription of SGLT1. In the present work we identified a novel 21 amino acids-long nonconventional nuclear localization sequence (RS1 NLS) in porcine RS1 (pRS1) that is necessary and sufficient for nuclear targeting of pRS1. RS1 NLS is framed by two consensus sequences for phosphorylation which are responsible for confluence-dependent regulation of RS1 NLS: a casein kinase 2 (CK2) site in position 348 and a protein kinase C (PKC) site in position 370. Confluence-dependent nuclear targeting was observed with amino acids 342-374 (R-NLS-Reg). Mutation analysis suggested that nuclear targeting is blocked by phosphorylation of serine 370 (PKC) and that phosphorylation of serine 348 (CK2) prevents phosphorylation of serine 370. Because CK2 is down-regulated and PKC is up-regulated during confluence of LLC-PK1 cells, our data suggest that nuclear localization coordinates cell density-dependent changes in transcriptional and post-transcriptional inhibition of SGLT1 expression.

The Epstein-Barr virus (EBV) causes infectious mononucleosis and is associated with tumors like Burkitt's lymphoma or Hodgkin's lymphoma. In this thesis, the overexpression of s-adenosylhomocystein hydrolase (SAH) was analyzed in EBV genome positive B95-8 cells. The focus of the examination has been on the signal transduction pathways which play a part in the activation of latent persistent EBV.The gene of SAH was brought in a fusion vector (pcDNA-AHCY) which was transfected in B95-8 cells by endocytosis. The successful transfection was proved by the evidence of ß lactamase on the vector pcDNA-AHCY.In pcDNA-AHCY transfected B95-8 cells an increased expression of the viral genes EA-D and BZLF1 was shown by immunofluorescence assay and PCR. The transfection with SAH led to an increase of phosphorylated and activated protein kinase C (PKC). The lytic cycle might be activated additionally using a PKC and PLA2 independent way.The rate of DNA synthesis and cell proliferation increased significantly in pcDNA-AHCY transfected B95-8 cells. A modulated expression of surface markers CD11a, CD19, CD23, CD30, CD40, CD44, CD54, and CD58 has not been detected. The clarification of reaction mechanisms to activate the lytic cycle is an important step for the development of substances to therapy EBV associated tumors.

GRK2 wird an Serin29 durch PKC phosphoryliert. Die Phosphorylierung verhindert die Inhibition der GRK2 durch Calmodulin. Die Inhibition der GRK2 durch Calmodulin wird durch den N-Terminus der GRK2 vermittelt und ist auf eine gestörte Aktivierbarkeit der GRK2 durch G-Protein beta/gamma-Untereinheiten zurückzuführen., GRK2 is phosphorylated by PKC at serin29. The phosphorylation prevents GRK2 inhibition by calmodulin. Inhibition of GRK2 by calmodulin is mediated by the N-terminus of the kinase and is due to a disturbed activation of GRK2 by G-protein beta/gamma subunits.

Die Proteinkinase C (PKC) besteht aus einer Familie von 11 Isoenzymen (IE). Zur genaueren Charakterisierung der Wirkung der PKC-IE, wurden 4 Hydroxytamoxifen induzierbare PKC-Fusionsproteine (PKC-FP) hergestellt. Die katalytische Domäne der PKC\(\alpha\), \(\beta\)1 und \(\delta\) wurde mit dem mutierten Östrogenrezeptor fusioniert und in die pcDNA3.1/HisB subkloniert. Die Expression wurde für alle drei FP nachgewiesen. Die Funktionalität des PKC\(\beta\)1-FP ist aufgrund des Nachweises einer Mutation mittels Sequenzanalyse fraglich. Die Enzymaktivität wurde im Phosphorylierungsassay für das PKC\(\alpha\)- und PKC\(\delta\)-FP in vitro nachgewiesen. Im dualen Luciferase-Assay wurde die PKC-abhängige Aktivierung und Hemmung des MAPK-Signaltransduktionsweges über ERK1/ERK2 in vivo gezeigt. Als Schlüsselenzym für die Signaltransduktion spielt die PKC u.a. eine Rolle beim Diabetes mellitus und seinen Folgeerkrankungen. Die hergestellten und etablierten FP können in weiteren Experimenten neue isoenzymspezifische Erkenntnisse ermöglichen.

Die Haupttodesursache in westlichen Gesellschaften stellen Krankheiten des Gefäßsystems und des Herzens dar. Diesen Krankheiten liegt eine Arteriosklerose zugrunde, die mit einer arteriellen Hypertonie vergesellschaftet sein kann. Sie können dann in eine chronische Herzinsuffizienz münden. Bei diesen Erkrankungen scheint das Endothelinsystem eine große Rolle zu spielen, denn es akkumuliert bereits im Anfangsstadium dieser Krankheiten massiv in den Gefäßen. Der Umfang dieser ET-1-Konzentrationserhöhungen korreliert dabei positiv mit dem Schweregrad der Krankheitsausprägung und somit mit der Prognose der einzelnen Patienten. Die Proteinkinase C (PKC) stellt hierbei ein sehr wichtiges Schlüsselenzym dar. Bei der PKC werden multiple Isoformen unterschieden, unter anderem die PKC-alpha, PKC-delta, PKC-epsilon und die PKC-zeta. Bekannt ist, daß die Kurzzeitinkubation von Zellkulturen mit ET-1 zu einer quantitativen Zunahme der PKC-Isoformen führt. Es ist jedoch nicht bekannt, ob bei langfristig erhöhten ET-1-Konzentrationen ebenfalls differenzierte Veränderungen der PKC-Isoformen beobachtbar sind. Eine Untersuchung dieser Frage ist von Relevanz, da erhöhte PKC-Konzentrationen bei chronisch erhöhtem ET-1 kardiale und vaskuläre Krankheiten wesentlich mitverursachen könnten. Im Rahmen dieser Arbeit wurde daher der Einfluß einer permanenten Stimulation von glatten Gefäßmuskelzellen in vitro und Herzmuskelzellen in vivo mit ET-1 am Rattenmodell auf die PKC untersucht. Neue Erkenntnisse konnten durch die Durchführung quantitativer Western-Blots gewonnen werden. Mit der Aktivierung der PKC kommt es zu einem Wechsel der Lokalisation der PKC. Diese wurde mittels Immunfluoreszenz-Versuchen analysiert. Die relativen Proteinkonzentrationen der PKC-alpha und der PKC-epsilon in A-10-glatten-Muskelzellen steigen bei chronischer 96-stündiger Inkubation der Zellen mit ET-1 bis zu einem Maximum von 243 % für die PKC-alpha und 339 % für die PKC-epsilon, wohingegen die Konzentration der PKC-zeta konstant bleibt. Bei der PKC-epsilon läßt sich in der Immunfluoreszenz keine Translokation in den Zellkern und somit wahrscheinlich auch keine Aktivität nach mehrstündiger ET-1-Inkubation feststellen. Eine Translokation und damit wahrscheinlich auch eine Aktivierung läßt sich erst durch Zugabe von AT-II nach 15 Minuten erreichen. Bei Ratten läßt sich nach vierwöchiger Infusion von ET-1 ein Anstieg der Konzentrationen der PKC im Myokardgewebe feststellen, und zwar bei der PKC-alpha auf 167,0 %, bei der PKC-delta auf 123,8 % und bei der PKC-epsilon auf 162,3 % feststellen, wohingegen die Konzentration der PKC-zeta praktisch konstant bleibt (91,4 %). Die vorliegenden Daten schlagen somit eine Brücke zwischen quantitativer Erhöhung der PKC bei chronischer Erhöhung der ET-1-Konzentrationen und der Pathogenese von Hypertonie, Atherosklerose und chronischer Herzinsuffizienz. Unter der Stimulation mit ET-1 steigen die PKC-Isoformen in Zellen an, verbleiben jedoch bei längerfristig erhöhtem ET-1 im Zytoplasma, sind also nicht in den Kern transloziert. Dies macht eine Aktivierung wenig wahrscheinlich. Durch Zugabe von Angiotensin-II jedoch ist die Translokation der gesamten PKC-epsilon, also auch der Fraktion, die unter dem Einfluß von ET-1 gebildet wurde, in den Zellkern beobachtbar, so daß eine Aktivierung der PKC zu vermuten ist. Ähnliche Prozesse könnten auch in vivo stattfinden. Langfristig erhöhte ET-1-Konzentrationen führen zur erhöhten intrazellulären PKC-Konzentrationen, die beispielsweise durch AT-II vollständig transloziert und damit wahrscheinlich auch aktiviert werden und somit die Entwicklung von Hypertonie, Atherosklerose und Herzinsuffizienz fördern. Nach den vorliegenden Daten läßt sich schlußfolgern, daß daß eine Blockade des Endothelinsystems wahrscheinlich sehr frühzeitig erfolgen muß, ET-1 bereits in der Frühphase der Arteriosklerose erhöht ist und hier adaptive Prozesse initiiert. Cardial and vascular diseases are the main reason for death in western societies. Starting point of those diseases is an atherosclerotic change of the vascular structure that can be related with hypertension. This can cause chronic heart failure, too. A major actor in that development seems to be the endothelin system as it is activated even in early states of those diseases. The dimension of accumulation of ET-1 correlates with the severeness of the change and with the prognosis of the actual patient. Protein kinase C (PKC) represents a key enzyme in this process. There are several different isozymes of PKC, e. g. PKC-alpha, PKC-delta, PKC-epsilon and PKC-zeta. It is already known that a short time incubation of cells with ET-1 causes a significant quantitative raise of PKC-isozymes. However, it is not known if a chronically raised concentration of ET-1 also causes changes of the PKC isozymes. An investigation is of importance as chronically raised concentrations of PKC because of high concentrations of ET-1 could possibly contribute to an initiation and progression of cardial and vascular diseases. This paper investigates the impact of a chronical stimulation of smooth muscle cells in vitro and heart muscle cells in vivo on PKC isozymes. New findings could be gained by quantitative western blotting. As an activation of PKC is combined with a change of localisation findings of activity could be gained by immunofluorescene. The relative proteine concentrationof PKC isozymes in smooth muscle cells reach a maximum of 243% (PKC-alpha) respectively 339% (PKC-epsilon) after 96 hours of chronical incubation with ET-1, whereas the concentration of PKC-zeta seems to remain unchanged. PKC-epsilon doesn’t show any translocation into the nucleus in immunofluorescence experiments and thus probably no activation either after a long time incubation with ET-1. However, a translocation and thus probably an activation of PKC is shown after addition of Angiotensine-II after 15 minutes. Rat myocardial cells show significant raise of PKC-alpha (167%), PKC-delta (123%) and PKC-epsilon (162%) after four weeks of ET-1-infusion whereas the concentration of PKC-zeta doesn’t change any significant change (91%). These data build a bridge between the quantitative raise of ET-1-blood-concentrations and raised concentrations of PKC and the pathogenesis of cardial and vascular diseases. Chronically raised blood concentrations of ET-1 cause a raise of PKC-concentrations in vascular smooth muscle cells and cardiac muscle cells. However, these PKC enzymes remain in the cytoplasmatic area, an aspect that shows an activation of PKS to be unlikely. An addition of Angiotensine-II causes a complete translocation of PKC-epsilon into the nucleus, i.e. even of that part of PKC that has been produced because of the long term incubation with ET-1, an aspect that shows an activation of PKC to be likely. Similar proceedings could happen in vivo. Long time raise of ET-1 blood concentrations could cause a raise of intracellular PKC that could be translocated and activated by other hormons such as Angiotensine-II and thus contribute to the initiation and progress of diseases such as hypertension, atherosclerosis and heart failure. Thus, a blockade of the endothelin system obviously has to be made as early as possible to prevent changes in vascular and cardial structure to proceed.

PKC is a family of serine-threonine kinases, which plays an important role in kidney function. It can influence tubular transport, renal hemodynamics, cell growth and differentiation. One of the most abundantly expressed isoenzymes in rat kidney is PKC alpha. In mouse kidney, the classical PKC isoenzyme alpha is expressed in glomeruli, cortical collecting duct (intercalated cells only) and medullary collecting duct. To assess the role of PKC alpha in kidney function, PKC alpha knockout mice (-/-) were studied which had been generated before by Michael Leitges. First, PKC alpha -/- mice and littermate wild type mice (+/+) were housed in metabolic cages for 24-hour urine collection with free access to water and comparable food intake. PKC alpha -/- mice showed a higher urine output (mean±SE: 2.4±0.1 vs 1.6±0.1 ml/day, n=6 mice/group, P