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Die Translokation von Proteinen durch die prokaryotische Zytoplasmamembran und die Membran des eukaryotischen Endoplasmatischen Retikulums (ER) ist ein wichtiger Schritt in der Biosynthese sekretorischer Proteine sowie Membranproteinen und erfolgt über den hoch konservierten Sec-Translokationskanal (Sec61 in Eu-, SecY in Prokaryoten). Die Analyse der Translokation durch das Sec61/SecY-Translokon zeigt, dass 1) die ineffiziente Translokation von intrinsisch unstrukturierten Proteinen durch Sec evolutionär konserviert ist und 2) das SecY Proteine mit intrinsisch unstrukturierten Domänen (IDD) nicht effizient translozieren kann. Weiterhin wurde gezeigt, dass 3) die konservierte alpha-Helix (L3) bakterieller Porine ein Motiv negativ geladener Aminosäuren beinhaltet, das essentiell für eine SecY-Translokation ist, und welches Teil eines neuen Qualitätskontrollmechanismus in der Biosynthese bakterieller Porine zu sein scheint.

Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung einer Interaktion zwischen der Thylakoidmembran-Insertase Alb3 mit Chloroplasten-Ribosomen und insbesondere dem Protein uL4c der großen ribosomalen Untereinheit \(\underline {der}\) \(\underline {Chloroplasten}\). Alb3 und sein Homolog Alb4 wurden in Nanodiscs rekonstituiert. Es wurde gezeigt, dass Alb3 über die positiv geladenen C-Terminus Motive III und IV, sowie weiteren Proteinregionen außerhalb des C-Terminus mit chloroplastidären Ribosomen interagiert. eine ladungsabhängige Interaktion zwischen dem unstrukturierten Alb3 C-terminus und einem negativ geladenen, ebenfalls unstrukturierten C-terminalen Abschnitt des ribosomalen Proteins uL4c wird vermutet und experimentell belegt. Aus diesen Daten wird eine Anpassung des derzeitigen Modells der kotranslationalen Membranprotein-Insertion vorgeschlagen, wobei der Alb3 C-Terminus als flexibles Bindeglied für die Ausrichtung und Fixierung des Komplexes aus Ribosom und naszenter Kette betont wird., The aim of this work was to study an interaction between the thylakoid membrane insertase Alb3 with chloroplast ribosomes and, in particular, the chloroplast large ribosomal subunit protein uL4c. Alb3 and its homolog Alb4 were reconstituted in nanodiscs. Alb3 has been shown to interact with chloroplast ribosomes via the positively charged C-\(\underline {terminal}\) motifs III and IV, as well as additional protein regions outside the C-terminus. A charge-dependent interaction between the unstructured Alb3 C-terminus and a negatively charged, also unstructured C-\(\underline {terminal}\) segment of the ribosomal protein uL4c is suspected and experimentally demonstrated. From these data, an adaptation of the current model of cotranslational membrane protein insertion is proposed, emphasizing the Alb3 C-terminus as a flexible link for alignment and fixation of the ribosome-nascent chain complex.

Um neue an der peroxisomalen Biogenese beteiligte Proteine zu identifizieren, wurden 65 Mutanten, basierend auf einem genomweiten Screening einer Einzelgen-Deletionsbibliothek von \(\textit {S. cerevisiae}\), durch Wachstumstests analysiert. Dies identifizierte 32 Mutanten mit einem spezifischen und 15 mit einem generellen Wachstumsdefekt. Ein neuer, hoch sensitiver \(\textit {in vivo}\) Importassay wurde zur Detektion partieller peroxisomaler Matrixprotein-Importdefekte etabliert. Die Analyse von 48 nicht-pex-Mutanten, basierend auf dem primären Screening, identifizierte 17 Stämme mit partiellem Importdefekt. Es wurden 8 Mutanten unter zu Hilfenahme von biochemischen und biophysikalischen Methoden charakterisiert. Im letzten Teil dieser Arbeit, wurde ein biochemischer Assay entwickelt um die relative Geschwindigkeit des peroxisomalen Matrixproteinimports zu ermitteln, sowie ein wachstumsbasierter Assay um Importdefekte zu ermitteln, welcher für ein Hochdurchsatzsscreening von Hefe Stämmen eingesetzt werden kann.

Die Membran einer jeden Zelle bildet eine Begrenzung für diese kleinste Einheit einer Lebensform. Eine solche sehr einfache einzellige Lebensform stellt dabei auch ein gramnegatives Bakterium dar und deswegen ist auch Escherichia coli (E. coli) ein Modellorganismus für eine lebende Zelle. Durch deren innere Membran, werden dessen Zellbestandteile in unmittelbarer Nähe zusammengehalten und vom extrazellulären Milieu abgegrenzt. Die meisten Stoffe können diesen Lipidbilayer, der die Membran bildet, nicht einfach passieren, weshalb ein Import- und Exportsystem geschaffen werden musste, das dieses bewerkstelligt. Für dieses Import- und Exportsystem werden sehr komplexe teilweise mehrspännige Transmembranproteine benötigt. Beispiele dafür sind Ionenkanäle und Ionenpumpen, oder große Kanalkomplexe, über die die Energiegewinnung, die Sekretion von Toxinen und Botenstoffe stattfindet. Aber auch Proteine mit Funktionen im Periplasma oder der äußeren Membran müssen von ihrem Syntheseort Zytoplasma an ihren Zielort gelangen. Für diese vielseitigen Prozesse müssen Proteine in die innere Membran inseriert oder über diese transloziert werden. Vom Gesamtproteom in Prokaryoten werden etwa 25 bis 30 % entweder in die innere Membran inseriert oder sekretiert. In dieser Arbeit konnten einige Komponenten identifiziert werden, die für die Insertion des „minor coat“ Proteins G3P des M13 Bakteriophagen notwendig sind. Dieses Protein liegt für die Assemblierung des Phagenpartikels mit dem äußersten C-Terminus über ein einzelnes Transmembransegment in der inneren Membran verankert vor, während der Hauptteil des etwa 42 kDa großen Proteins im Periplasma ist. Mit Hilfe eines N-terminalen abspaltbaren Signalpeptids wird der Hauptanteil von G3P mit Hilfe von SecA und dem Membranpotential über SecYEG in das Periplasma transloziert. Das Targeting hingegen konnte nicht eindeutig einem der bekannten post- oder kotranslationalen Signalwegen zugeordnet werden. Zwar konnte in vivo über arretierte RNCs ein Kontakt mittels Disulfid Crosslinkstudien zu Ffh, der Proteinkomponente des Ribonukleoproteins SRP gezeigt werden, allerdings war die Insertion in die Membran in vivo unabhängig von Ffh und auch bei gestörter Interaktion zwischen SecY und FtsY, dem Rezeptor für SRP an der Membran, konnte G3P mittels SecYEG inseriert werden. Das Chaperon SecB konnte zwar in vitro an G3P binden, in vivo inserierte G3P ebenfalls SecB unabhängig. Möglich wäre für G3P auch ein SecA abhängiges Targeting. Für den Membraneinbau von G3P konnte gezeigt werden, dass in vivo neben SecYEG auch YidC benötigt wird. Mit Hilfe von Disulfid Crosslinkstudien konnte gezeigt werden, dass G3P zunächst über das Signalpeptid von G3P mit der Plug-Domäne TM2b und dem lateralen Tor (TM2a und TM7) in Kontakt tritt und schließlich das C-terminale Transmembransegment von G3P mit YidC über die TM3 und TM5 der hydrophilen Rutsche in die Membran gelangt. Anhand dieser Kontaktpunkte wurde ein mögliches Insertionsmodel bestätigt, wobei SecY und YidC definierte Schritte im Insertionsprozess vermitteln und somit neue Einblicke in diesen weitestgehend unbekannten Prozess liefern. The membrane of every cell forms a spacial limitation for this smallest unit of a life form. Such a very simple unicellular life form is also the Gram-negative bacterium Escherichia coli (E. coli) and is therefore a valid model organism for a living cell. Due to the inner membrane the cellular components are held together in close proximity and are separated from the extracellular environment. Most substrates cannot pass the lipid bilayer, which forms the membrane, so an import and export system had to be developed to accomplish this. For these import and export systems, very complex, polytopic transmembrane protein complexes are needed. Examples are ion channels, ion pumps or large complexes through which energy production, secretion of toxins and the transfer of nutrients are catalysed. Moreover, proteins with functions in the periplasm or outer membrane must also travel from their site of synthesis in the cytoplasm to their destination. For these different processes proteins must be inserted into or translocated across the inner membrane. Of the total proteome in prokaryotes approximately 25 to 30% is either inserted into or secreted across the inner membrane. This work identified several components required for the insertion of the "minor coat" protein G3P of M13 bacteriophage. This protein is important for the assembly of the phage particle that occurs in the inner membrane. The outermost C-terminus of G3P is anchored in the inner membrane via a single transmembrane domain, while the bulk of the approximately 42 kDa protein is located in the periplasm. Using an N-terminal cleavable signal peptide, the major portion of G3P is translocated into the periplasm via SecYEG with the help of SecA and the membrane potential. Targeting, on the other hand, could not be clearly assigned to one of the known post- or co-translational pathways. Although contact via disulfide crosslink studies to Ffh, the protein component of the ribonucleoprotein SRP, was observed via stalled ribosome nascent chains (RNCs), insertion into the membrane in vivo was independent of Ffh. Even when the interaction between SecY and FtsY, the receptor for SRP at the membrane, was impaired, G3P was inserted via SecYEG. Although the chaperone SecB was able to bind to G3P in vitro, G3P inserted independently of SecB in vivo. For membrane incorporation of G3P, it was shown that YidC is required in vivo in addition to SecYEG. Disulphide crosslink studies demonstrated that G3P first contacts the plug domain TM2b and lateral gate (TM2a and TM7) via the signal peptide of G3P, and finally the C-terminal transmembrane domain of G3P contacts YidC via TM3 and TM5 of the hydrophilic slide. Based on these contact sites, a possible insertion model was confirmed, with SecY and YidC mediating defined steps in the insertion process, providing new insights into this largely unknown process.

Der co-translationale Proteintransport von Membranproteinen ist ein entscheidender Prozess zur Aufrechterhaltung der Membranintegrität, um somit die Lebensfähigkeit der Zelle zu gewährleisten. In \(\textit {Escherichia coli}\) wird der co-translationale Proteintransport durch den konservierten Signalerkennungspartikel (SRP-Komplex) vermittelt. Der SRP-Komplex ist ein Ribonukleoprotein, welches aus dem Ffh-Protein und der 4,5S RNA besteht. In der vorliegenden Arbeit wurde die Lon-abhängige Proteolyse von Ffh in \(\textit {E. coli}\) untersucht. Freies Ffh, welches nicht an die 4,5S RNA gebunden ist, wird der Proteolyse zugeführt. Die Proteolyse erfolgt solange, bis eine minimale Ffh-Konzentration in der Zelle erreicht ist. Für die Erkennung von Ffh durch Lon, scheint die RNA-Bindefähigkeit des Ffh-Proteins ausschlaggebend zu sein. Durch die Proteolyse von Ffh ist die AAA\(^{+}\)-Protease Lon in die Aufrechterhaltung des co-translationalen Proteintransports als auch der Membranintegrität involviert.

YidC/Oxa1/Alb3-Insertasen und das Sec-Translokon sind über alle drei Reiche des Lebens konserviert und stellen den wichtigsten Weg für integrale Proteine in Zellmembranen und Membranen von eukaryontischen Organellen dar. Die Insertion von Membranproteinen in die innere Membran von Gram-negativen Bakterien erfolgt hauptsächlich über die SecYEG-Translokase und die YidC-Insertase, die unabhängig voneinander oder in Kooperation miteinander agieren können. Für die kooperative Insertion wird ein enger Kontakt zwischen SecY und YidC vorausgesetzt. Aufgrund von früheren Interaktions-Studien und einer kürzlich gelösten Struktur des sogenannten Holotranslokons mit geringer Auflösung (14 Å) wird von einem Kontakt zwischen dem lateral gate von SecY und der hydrophoben Substratrutsche von YidC ausgegangen. Welche konkreten Domänen von YidC und SecY dabei direkt miteinander interagieren, war bisher nicht bekannt. Ziel dieser Arbeit war es, den Kontakt zwischen SecY und YidC detaillierter zu beschreiben. In vitro wurde über FRET-Messungen mit Fluoreszenzfarbstoff-markiertem SecY und YidC eine hohe Affinität für die Interaktion der beiden Proteine sowohl in Detergens als auch in DOPC-Proteoliposomen ermittelt. Für die Stöchiometrie der SecY/YidC-Interaktion wurde der Faktor eins bestimmt. Um die genauen Kontakte zwischen SecY und YidC zu identifizieren, wurden in vivo Disulfid-Cross-Linking-Experimente durchgeführt. Es konnten direkte Kontakte zwischen der TM3 und TM8 des SecY lateral gates und der TM3 beziehungsweise TM5 der hydrophoben Substratrutsche von YidC gezeigt werden. Zudem wurde eine YidC-Mutante mit fünf Serin-Substitutionen, die den Wachstumsdefekt eines YidC-Depletionsstamms nicht wiederherstellen konnte, charakterisiert. Obwohl die Serin-Positionen alle in der Mitte und der periplasmatischen Hälfte der hydrophoben Rutsche von YidC liegen und vier der Positionen mit Substrat-Kontaktstellen übereinstimmen, konnte keine Inhibierung der Insertion der YidC-abhängigen Substrate M13 procoat und Pf3 coat durch die 5S Mutante im Vergleich zum Wildtyp beobachtet werden. Für die YidC-only Insertion scheint ein Minimum an Hydrophobizität nötig zu sein, das bei dieser Mutante nicht unterschritten wird. In vitro FRET-Experimente zeigten eine gestörte Interaktion zwischen SecY und dieser YidC 5S Mutante und bestätigten damit erneut eine Beteiligung der hydrophoben Rutsche am SecY/YidC-Kontakt. Anhand der ermittelten Cross-Link-Kontakte und der Ergebnisse der FRET-Messungen konnte ein mögliches Kontaktmodell erstellt werden, in dem das SecY lateral gate der hydrophoben Substrat-Rutsche und der sich zwischen TM3 und TM5 öffnenden hydrophilen Tasche von YidC gegenüber steht, wodurch sich eine gemeinsame SecY/YidC-Pore bildet. Die vorliegende Arbeit liefert damit weitere Beweise, dass das lateral gate der Sec-Translokase direkt mit der hydrophoben Substratrutsche von YidC interagiert. In einem weiteren Projekt wurde ein SecY-YidC-Fusionsprotein zur Sicherstellung eines engen Kontakts, der korrekten Orientierung der Proteine zueinander und der richtigen Stöchiometrie in rekonstituierten Proteoliposomen kloniert. Für eine gemeinsame Studie mit der ETH Zürich wurden Proteoliposomen, die das Fusionsprotein, SecYEG, YidC oder SecYEG zusammen mit YidC enthielten, von mir in Hohenheim hergestellt. Die schrittweise Insertion des Sec/YidC-abhängigen Substrats LacY in diese Proteoliposomen wurde von einer Arbeitsgruppe der ETH Zürich mithilfe der AFM-basierten Einzelmolekül-Kraftspektroskopie beobachtet. Die LacY-Insertion wird im Falle des Fusionsproteins und SecYEG in Kombination mit YidC von der Sec-Translokase dominiert, während YidC vermutlich nur eine unterstützende Rolle bei der Proteinfaltung einnimmt. YidC/Oxa1/Alb3-insertases and the Sec-translocase are conserved across all three kingdoms of life and constitute the most important pathway for integral proteins into cell membranes and membranes of eukaryotic organelles. The insertion of membrane proteins into the inner membrane of Gram-negative bacteria occurs mainly via the SecYEG-translocase and the YidC-insertase acting independently or in cooperation. For the cooperative insertion a close contact between SecY and YidC is assumed. Previous interaction-studies and a recently solved low-resolution structure of the so-called holo-translocon (14 Å) indicate a contact between the lateral gate of SecY and the hydrophobic substrate slide of YidC. Which specific domains of YidC and SecY thereby interact directly with each other was unknown so far. The aim of this study was to describe the contact between SecY and YidC in more detail. A high affinity for the interaction of the two proteins in detergent and in DOPC-proteoliposomes was determined via FRET measurements with fluorescently labeled SecY and YidC. For the stoichiometric ratio of the SecY/YidC-interaction a factor of one was calculated. To identify the specific contacts between SecY and YidC in vivo disulphide cross-linking experiments were performed. Direct interactions between the transmembrane domain (TM) 3 and TM8 of the SecY lateral gate and TM3 and TM5 of the hydrophobic slide of YidC were found, respectively. Furthermore, a YidC mutant with five serine substitutions, which was unable to rescue a YidC depletion strain, was investigated. Even though the serine positions are located in the middle and the periplasmic half of the hydrophobic slide of YidC and four of the positions are identical with substrate contact sites, no inhibition of insertion for the YidC-dependent substrates M13 procoat and Pf3 coat by the 5S mutant compared to the wildtype YidC was observed. For the YidC-only pathway a minimum of hydrophobicity seems to be required sufficient to allow the insertion of these substrates. In vitro FRET measurements showed an impaired interaction between SecY and the YidC 5S mutant and confirmed once again an involvement of the hydrophobic slide in the SecY/YidC-contact. Based on the cross-linking contacts and the results of the FRET measurements a possible model of the SecY/YidC-contact was established, which shows the SecY lateral gate vis-à-vis of the hydrophobic slide and the hydrophilic groove between TM3 and TM5 of YidC generating a combined SecY/YidC-cavity. Taken together, the present study provides further evidence that the lateral gate of the Sec-translocase directly interacts with the hydrophobic slide of YidC. In a further project, a SecY-YidC fusion protein was cloned to ensure the two proteins are in close proximity, the correct orientation and proper stoichiometry after reconstitution into proteoliposomes. For a collaboration with the ETH Zürich, proteoliposomes hosting the fusion protein, SecYEG, YidC or SecYEG and YidC together were prepared by myself in Hohenheim. The stepwise insertion of the Sec/YidC-dependent substrate LacY into these proteoliposomes was observed by a collaborating group of the ETH Zürich using AFM–based single-molecule force spectroscopy. The insertion of LacY was observed for the different cases but for the fusion protein and SecYEG combined with YidC the insertion process is dominated by the Sec-translocase, whereas YidC probably only has a supporting function in the folding of the protein.

Ein homologes \(\textit {in vitro}\) Translationssystem aus \(\textit {Pisum sativum}\) ermöglichte die Herstellung stabiler, arretierter Insertionsintermediate von D1-Verkürzungen in Gegenwart isolierter Thylakoidmembranen. Translationsversuche in Anwesenheit von rekombinantem Vipp1-his zeigten erstmalig eine Stimulation der cotranslationalen Insertion von D1-Verkürzungen durch Vipp1 um bis zu 80 %. Weiterhin wurde mittels Saccharosedichtegradientenzentrifugation die Interaktion zwischen angereicherten Ribosomen aus \(\textit {Pisum sativum}\) mit rekombinantem his-cpSRP54 untersucht. Es wurden mehrere Ribosomen-Bindebereiche innerhalb des cpSRP54 identifiziert. Massenspektrometrische Analysen der chemischen Vernetzung angereicherter Ribosomen mit endogenem cpSRP54 aus \(\textit {Pisum sativum}\) mittels isotopenmarkiertem BS\(_3\) offenbarte eine Interaktion zwischen cpSRP54 und RPL4, die durch weitere Untersuchungen verifiziert wurde.

Mutationen im Glycintransporter 2 (GlyT2) stellen die präsynaptische Komponente der neurologischen Erkrankung Hyperekplexie oder Startle Disease dar. Der neuronale Na+/Cl- -abhängige GlyT2 ist für das Recycling von Glycin verantwortlich und bildet an inhibitorischen glycinergen Synapsen die Hauptquelle des freigesetzten Transmitters. Dominante, rezessive und zusammengesetzte heterozygote Mutationen wurden bereits identifiziert, von denen die meisten zu einer beeinträchtigten Glycinaufnahme führen. In dieser Arbeit konnten wir eine neue pathogene Mutation innerhalb des neuronalen Glycintransporter-2-Gens (SLC6A5, OMIM604159) in einer Familie identifizieren, in der beide Elternteile heterozygote Träger waren. Ein homozygotes Kind litt an schweren neuromotorischen Defiziten, wohingegen Heterozygote keine Symptome aufwiesen. Die neue rezessive Mutation c.1286C>T erzeugte einen missense Aminosäureaustausch von Prolin gegen Leucin an Position 429 (pP429L) in der Transmembrandomäne 5. Wir haben die GlyT2P429L-Variante mittels Homologiemodellierung, immuncytochemischer Färbungen, Western Blot Analysen, Biotinylierung und funktioneller Glycinaufnahmetests charakterisiert. Der mutierte GlyT2 zeigte beim Proteintransport durch verschiedene intrazelluläre Kompartimente zur Zelloberfläche keine Defizite. Die gesamte Proteinexpression war jedoch signifikant verringert. Obwohl GlyT2P429L an der Zelloberfläche vorhanden ist, zeigte er einen Verlust der Proteinfunktion. Die Co-Expression der Mutante mit dem Wildtyp-Protein, die die Situation der Eltern widerspiegelte, hatte keinen Einfluss auf die Transporterfunktion und erklärte somit ihren nicht symptomatischen Phänotyp. Wenn jedoch die Mutante im Vergleich zum Wildtyp-Protein im Überschuss exprimiert wurde, war die Glycinaufnahme signifikant verringert. Die Strukturanalyse ergab, dass der eingeführte Leucinrest an Position 429 zu Konformationsänderungen in der α-Helix 5 führt, die in unmittelbarer Nähe zur Natriumbindungsstelle des Transporters lokalisiert sind. Dies deutet darauf hin, dass die Zugangsmechanismen des GlyT2 gestört sein könnten und einen vollständigen Verlust der Transportaktivität verursachen. Unsere Ergebnisse belegen, dass P429 in GlyT2 ein strukturell wichtiger Aminosäurerest ist, der eine wichtige funktionelle Rolle beim Glycintransport spielt., Glycine transporter 2 (GlyT2) mutations represent the presynaptic component of the neurological disease hyperekplexia or startle disease. The neuronal Na+/Cl- -dependent GlyT2 is responsible for glycine recycling and establishes the main source of releasable transmitter at inhibitory glycinergic synapses. In humans, dominant, recessive and compound heterozygous mutations have been identified, most of them leading to impaired glycine uptake. In this study, we identified a novel pathogenic mutation within the neuronal GlyT2 gene (SLC6A5, OMIM604159) in a family with both parents being heterozygous carriers. A homozygous child suffered from severe neuromotor deficits, whereas heterozygous individuals did not reveal any symptoms. The novel recessive mutation c.1286C>T generated a missense amino acid exchange of proline to leucine at position 429 (pP429L) in transmembrane domain 5 of the protein. We characterized the GlyT2P429L variant using homology modeling, immunocytochemical stainings, Western blot analysis, biotinylation, and functional glycine uptake assays. The mutated GlyT2 revealed no deficits in protein trafficking through various intracellular compartments to cellular surface. However, the whole cell protein expression was significantly decreased. Although present at cellular surface, GlyT2P429L showed a loss of protein function. Co-expression of the mutant with the wild-type protein, reflecting the situation in the parents, did not affect transporter function, thus explaining their non-symptomatic phenotype. Nevertheless, when the mutant was expressed in excess compared with the wild-type protein, glycine uptake was significantly reduced. Structural analysis revealed that the introduced leucine residue at position 429 leads to conformational changes in α-helix 5 which is localized in close proximity to the sodium-binding site of the transporter. The data suggest that the gating mechanism of GlyT2 might be disturbed and causes a complete loss of transport activity. Thus, our results support P429 in GlyT2 as structurally important residue displaying a key functional role in glycine transport.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem peroxisomalen Matrixproteinimport, sowie der peroxisomalen Qualitätskontrolle. Neben der Charakterisierung eines peroxisomalen Importkanals für Proteine mit peroxisomaler Signalsequenz Typ 2 in der Hefe \(\textit {S. cerevisiae}\) wurde ebenfalls ein putativer Proteinkanal in menschlichen Peroxisomen charakterisiert. Zusätzlich wurde eine neue Interaktionsstelle der Porenkomponenten PEX5 und PEX14 funktionell charakterisiert, deren Verlust zu einem partiellem PTS1-Importdefekt führt und eine Destabilisierung von PEX5 zu Folge trägt. Es wird vermutet, dass die neue Bindestelle einen Einfluss auf die Interaktion von PEX5 mit dem Export‐Komplex besitzt. Zusätzlich konnte erstmalig ein Interaktionspartner der AAA\(_+\)‐ATPase ATAD1 an der peroxisomalen Membran beschrieben werden, dabei handelt es sich um PEX5. Es wurden Hinweise gefunden, dass ATAD1 PEX5 aus der Membran entfernt, welches anschließend proteasomal abgebaut wird.

Der Proteintransport zum Lysosomen bzw. der Vakuole erfolgt über das Endomembransystem (EMS), das sich in seiner einfachsten Form aus endoplasmatischen Retikulum, Golgi-Apparat, und Endosomen zusammensetzt. Die Membranen des EMS stehen über Vesikel, die durch Abschnüren und der Fusion mit der Zielmembran in Verbindung stehen. Damit ein Protein zu seinem Zielkompartiment gelangt, werden spezifische Targetingsignale benötigt, die entweder N-terminal, C-terminal oder innerhalb der Aminosäuresequenz des zu transportierenden Proteins lokalisiert sind. Diese Targetingsequenzen werden entweder von spezifischen Rezeptoren oder von Adapterprotein-Komplexen erkannt, die im späten sekretorischen Weg den Transport über Clathrin-umhüllte Vesikel vermittelt. Über den Proteintransport in die zentrale Vakuole der Diatomee Phaeodactylum tricornutum war bisher nichts bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinzusammensetzung der zentralen Vakuole über in silico und in vivo-Ansätze untersucht. Potentielle Vakuolenproteine wurden über bioinformatischen Analysen hinsichtlich N-terminaler Zielsteuerungssequenzen, Transmembrandomänen, konservierten Proteindomänen und potentiellen Targetingsignalen untersucht und anschließend mithilfe von exprimierten eGFP-Fusionenproteinen auf ihre subzelluläre Lokalisation untersucht. Dabei konnten neben den bereits bekannten vakuolären Membranproteinen neun weitere Vakuolenproteine identifiziert werden, die unter anderem auf einen Im-oder Export von Sekundärmetaboliten, Kationen und Polysacchariden hindeutet. Diese Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die zentrale Vakuole neben der Speicherung von Chrysolaminarin auch lytische Funktionen hinsichtlich der Proteindegradation und bei der Detoxifizierung von Xenobiotika übernimmt. Ein weiterer Teil beschäftigte sich mit der Untersuchung des Proteintransports in die zentrale Vakuole sowie der Identifizierung von Targetingsignalen. Durch die Generierung von Aminosäureaustausch-Mutanten und Chimären gelang es mehrere Targetingsingale zu identifizieren und zu verifizieren. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Tyrosin- oder Dileucinmotive für den vakuolären Proteintransport relevant sind. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass der Proteintransport zur zentralen Vakuole von P. tricornutum ähnlich wie in Pflanzen- oder Säugerzellen ablaufen könnte., Protein transport to vacuoles or lysosomes takes place via the endomembrane system (EMS). The EMS is composed of the endoplasmic reticulum (ER), the Golgi apparatus and endosomes in its simplest constellation. The compartments of the EMS are connected by vesicles. These vesicles bud off the EMS and allow to transfer cargo proteins among the EMS. To find their final destination proteins need specific targeting signals located at the N-terminus, C-terminus or within the protein sequence. Those targeting signals can be recognized either by receptors or adaptor protein complexes, which mediates the transport of cargo proteins via clathrin coated vesicles in the late secretory pathway. However, Targeting of proteins to the central vacuole of the diatom Phaeodactylum tricornutum is poorly investigated. As part of this study the protein composition of the central vacuole was analyzed by using in silico and in vivo approaches. Putative vacuolar proteins were investigated by bioinformatic analyses regarding to N-terminal targeting sequences, trans-membrane domains, conserved protein domains and putative targeting signals. Subsequently, the candidates were expressed as eGFP fusion proteins for investigating their subcellular localization. Beside the already known vacuolar membrane proteins in P. tricornutum, this screen resulted in the identification of nine proteins in total new vacuolar membrane proteins, which might be involved in import or export of secondary metabolites, cations and carbohydrates. Apart from storing chrysolaminarin, the results of this work indicate that the central vacuole is a lyctic compartment in respect to protein degradation and detoxification of xenobiotics. A further part of this study dealt with the investigation of protein targeting to the central vacuole as well as the identification of targeting motifs. By generating mutated versions of the vacuolar membrane located proteins, the results indicate that tyrosine and dileucine motifs are relevant for vacuolar transport. Furthermore, the results suggest that the protein transport to the central vacuole of P. tricornutum are comparable to those in plants or mammals.

Schon länger besteht der Wunsch nach spezifischen Therapieformen, die nur betroffene Zellpopulationen beeinflussen sollen. Nebenwirkungen durch unselektive Aufnahme in diverse Gewebe eines Organismus könnten so minimiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde dazu der Transport Histidin-markierter Proteine über an C3 gekoppeltes, mutiertes Protektives Antigen (C3mPA) untersucht. C3 ist ein von Clostridien und Staphylokokken produziertes Toxin. Protektives Antigen (PA) ist die Bindungs- und Transportuntereinheit des Anthraxtoxins von Bacillus anthracis. C3mPA ist ein selektives Transportsystem für monozytäre Zellen. Dabei wurde bestätigt, dass der Transport von His-markierten Proteinen, in dieser Arbeit His-C2I (Toxinuntereinheit von Clostridium botulinum) und His-TccC3 (Toxinuntereinheit von Photorhabdus luminescens), über Wildtyp-PA in das Zytosol effektiv funktioniert. In Zellversuchen mit J774A.1 und RAW 264.7 (zwei Makrophagen-Zelllinien) konnte dies anhand der Morphologieänderung der Zellen nachgewiesen werden. Allerdings konnte dieses Ergebnis nicht auf His-PTS1 (His gekoppelter, enzymatisch aktiver Teil des Pertussistoxins) übertragen werden. Auch der Transport von His-markierten Proteinen über den untersuchten Transporter C3mPA konnte im Zellversuch nicht verwirklicht werden. Die mit C3mPA und einer enzymatischen Komponente vergifteten Zellen zeigten keine typische Morphologieänderung wie in den Kontrollen mit Wildtyp-PA. Die daraufhin durchgeführten Versuche sprechen allerdings dafür, dass C3mPA an den Zielzellen binden kann und in die Zellen aufgenommen wird.

In this study, a novel and unexpected role of the armadillo repeat protein p0071 in cellular transport is described. P0071 abrogation in cultured cells significantly interferes with secretion of various secretory cargo proteins. This effect is specifically targeting cargo substrates of the microtubule based heterotrimeric kinesin-2 complex, which comprises of KIF3A, KIF3B and KAP3. Impairment of both p0071 and KIF3B leads to aberrant movement of chromogranin A granules in neuroendocrine tumor cells due to impaired directional persistence of vesicle transport. This effect is likely explained by a potential function of p0071 as a stabilizing linker within the kinesin-2 complex since it could be shown that p0071 mediates the interaction between the motor subunit KIF3B and the cargo-adaptor subunit, KAP3.

Peroxisomes are near-ubiquitous eukaryotic organelles with a prominent function in the breakdown of fatty acids and hydrogen peroxide. Peroxisomal β-oxidation is characterized by a close metabolic connection between peroxisomes and mitochondria. Peroxisomal acetyl-CoA is transported to mitochondria where it enters the tricarboxylic acid cycle. In the yeast Saccharomyces cerevisiae almost all peroxisomal matrix proteins contain a peroxisomal targeting signal type 1 (PTS1) at their extreme C-terminus. This signal is recognized by the cytosolic receptor Pex5, which can translocate matrix proteins across the peroxisomal membrane in a fully folded state and even as oligomers. In this work the protein phosphatase Ptc5 was shown to display a dual localization to mitochondria and peroxisomes. Peroxisomal localization of the phosphatase was dependent on a functional PTS1, the import receptor Pex5 and an intact peroxisomal import machinery. Surprisingly, processing by the mitochondrial inner membrane peptidase (IMP) complex was another prerequisite for the peroxisomal localization of Ptc5. More detailed analysis revealed that sorting of Ptc5 involves simultaneous interaction with the import machineries of peroxisomes and mitochondria resulting in a molecular tug-of-war like mechanism. This can also establish contacts between mitochondria and peroxisomes. Fusion of a PTS1 to the C-terminus of the ER-resident membrane protein Sec63 created a synthetic tether generating contacts between the ER and peroxisomes. Analysis of the biological relevance of tug-of-war like protein sorting revealed that indirect import of Ptc5 in peroxisomes prevents deleterious phosphatase activity in the cytosol. Additional data indicate that intraperoxisomal Ptc5 dephosphorylates glycerol-3-phoshpate dehydrogenase Gpd1 to regulate its activity. Molecular tug-of-war between import machineries of two compartments represents a novel protein sorting mechanism. Furthermore, this mechanism enables organelle contacts and might facilitate interorganellar communication., Peroxisomen sind nahezu ubiquitäre eukaryotische Zellorganellen, die eine wichtige Rolle beim Abbau von Fettsäuren und des dabei gebildeten Wasserstoffperoxids spielen. Während der peroxisomalen Oxidation von Fettsäuren kooperieren Peroxisomen eng mit Mitochondrien. Das in Peroxisomen gebildete Acetyl-CoA wird in den mitochondriellen Zitronensäure-Zyklus eingespeist. In der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae enthalten die meisten peroxisomalen Matrixproteine ein carboxy-terminales Zielsteuerungs-Signal (peroxisomales targeting signal type 1, PTS1). Das PTS1 wird vom cytosolischen Importrezeptor Pex5 gebunden, der die Matrixproteine in gefaltetem Zustand und sogar als Oligomere in das peroxisomale Lumen importieren kann. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Protein-Phosphatase Ptc5 eine duale Lokalisierung in Mitochondrien und Peroxisomen aufweist. Die peroxisomale Lokalisierung des Proteins hängt von einem funktionellen PTS1-Signal, dem Importrezeptor Pex5 und der peroxisomalen Importmaschinerie ab. Überraschenderweise ist die proteolytische Spaltung durch den mitochondriellen Peptidase-Komplex der inneren Membran (IMP-Komplex) eine weitere Voraussetzung für den Import der Phosphatase in Peroxisomen. Bei der genaueren Charakterisierung des intrazellulären Transports von Ptc5 wurde festgestellt, dass das Protein gleichzeitig mit der mitochondriellen und der peroxisomalen Importmaschinerie interagiert, was zu einem molekularen Tauziehen zwischen den Import-Komplexen führt. Darüber hinaus kann dieser Tauziehmechanismus Kontakte zwischen Mitochondrien und Peroxisomen erzeugen. Die Fusion eines PTS1 an den C-Terminus des ER-ständigen Membranproteins Sec63 erzeugte einen künstlichen Proteinanker, der sowohl in S. cerevisiae als auch in dem Basidiomyceten Ustilago maydis Kontakte zwischen dem ER und Peroxisomen vermittelte. Die Untersuchung der biologischen Relevanz des molekularen Tauziehens zeigte, dass der indirekte Import von Ptc5 in Peroxisomen die zellschädigende Phosphatase-Aktivität im Cytosol verhindert. Einige Daten deuten darauf hin, dass die Phosphatase in Peroxisomen die Aktivität der Glycerol-3-phosphat Dehydrogenase Gpd1 durch Dephosphorylierung reguliert. Molekulares Tauziehen zwischen zwei Import-Komplexen stellt einen neuartigen Mechanismus zur Verteilung von Proteinen zwischen zwei Organellen dar. Der Mechanismus kann Kontakte zwischen Organellen herstellen und dient womöglich ebenfalls deren Kommunikation.

The plasma membrane of epithelial cells shows an asymmetric organization, characterized by a functionally and morphologically distinct apical and basolateral domain. This polarity is a prerequisite for the integrity of an epithelial tissue and for the directional transport. The establishment and the maintenance of cellular polarity depend on a highly specialized cellular sorting and transport machinery. Microtubules are an important component of this transport machinery and they provide tracks for the vesicular transport. Important features of microtubules are diverse posttranslational modifications. The detyrosination represents a form of modification that occurs on the C-terminus of α-tubulin. Within the tyrosination/detyrosination-cycle the tyrosine is removed by a vasohibin/chaperon complex and subsequently re-added by tubulin tyrosine ligase (TTL). As part of this work, the influence of tubulin detyrosination on cellular polarity of MDCK kidney epithelial cells was studied. Knocking out TTL resulted in a dramatically increase in the level of detyrosinated tubulin as well as acetylated tubulin. Changing tubulin contents towards detyrosinated or tyrosinated microtubules by modulating TTL expression affected the epithelial morphology. Interestingly, TTL knockout cells were more mobile than cells overexpressing TTL. Furthermore, detyrosinated microtubule possibly influenced the number and size of focal adhesions. The presented observations indicate that a dynamic adaptation of detyrosinated and tyrosinated microtubules is essential for the regulation of cellular polarization, migration and adhesion. Beside microtubules, the sorting and transport machinery consist of a diverse set of proteins, which are crucial for cargo delivery to the correct membrane domain. These include motor proteins, adaptor proteins, lectins, Rab-GTPases and cargo molecules. Among these components, the large GTPase Myxovirus Resistance Protein 1 (Mx1), a member of the dynamin superfamily, was identified on apical post-Golgi vesicles. Mx- proteins are known as interferon induced proteins, which are expressed after viral infection. In MDCK cells, Mx1 shows no antiviral activity and is constitutively expressed. Mx-proteins exhibit many characteristic properties that suggest functions in basic cellular processes. The large GTPase was identified as an important regulatory component of the apical transport system. Thereby, the large GTPase associates with compartments of the early and late secretory pathway. Since vesicular structures positive for Mx1 are highly dynamic, the influence of the microtubule cytoskeleton on this motility was studied using live cell imaging. Microtubule disruption induced by nocodazole, inhibits long-range trafficking. Using biochemical and fluorescence microscopic methods, the association of canine Mx1 with α-tubulin was verified. Furthermore, it was demonstrated for the first time that Mx1 interacts with the motor protein Kif5B. In agreement with these observations the knockout of Mx1 or mutation in the membrane interaction motif of the unstructured L4 loop decreased the efficiency of apical cargo delivery. The L4 loop mutant still interacts with Kif5B, however the mutation causes elongation of Mx1-positive compartments. It is thus conceivable that Mx1 functions in the fission of transport vesicles based on structural similarities to classical dynamins. For the first time, this work shows a functional role of the large GTPase Mx1 in the apical protein trafficking. Mx1 not only stabilizes the interaction between Kif5B, microtubules and apical transport carriers, but also aids in vesicle fission., Die Plasmamembran von polaren Epithelzellen besitzt eine asymmetrische Organisation, die durch eine funktionell und morphologisch unterscheidbare apikale und basolaterale Domäne charakterisiert ist. Diese Polarität ist Voraussetzung für die Integrität des Epithelgewebes und den gerichteten Proteintransport. Die Entstehung und Aufrechterhaltung der zellulären Polarität hängt von einer hochspezialisierten zellulären Sortier- und Transportmaschinerie ab. Die Mikrotubuli sind ein wichtiger Bestandteil der Transportmaschinerie und stellen die Transportwege für die Beförderung von Vesikeln bereit. Wichtige Merkmale von Mikrotubuli sind die vielfältigen posttranslationalen Modifikationen. Eine dieser Modifikationen stellt die Detyrosinierung am C-Terminus des α-Tubulins dar. Im Kreislauf der Tyrosinierung und Detyrosinierung wird dieses Tyrosin durch einen Vasohibin/ Chaperon-Komplex entfernt und kann durch die Tubulin Tyrosin Ligase (TTL) wieder angefügt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss der Detyrosinierung auf die Zellpolarität von MDCK-Zellen, Epithelzellen der Hundeniere, untersucht. Der TTL- Knockout führte zu einer dramatischen Erhöhung der detyrosinierten Tubulin-Menge sowie zu einem Anstieg an acetyliertem Tubulin. Die Veränderung des Tubulin-Gehalts hin zu detyrosiniertem oder tyrosiniertem Tubulin durch Modulation der TTL-Expression beeinflusste die epitheliale Morphologie der Zellen. Interessanterweise waren TTL-Knockout Zellen mobiler als TTL-überexprimierende Zellen. Darüber hinaus scheinen detyrosinierte Mikrotubuli die Anzahl und Größe von fokalen Adhäsionen zu beeinflussen. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass eine dynamische Anpassung von detyrosinierten und tyrosinierten Mikrotubuli für den regulierten Ablauf der Zellpolarisierung, der Migration sowie der Adhäsion essentiell ist. Neben Mikrotubuli besteht die Sortier- und Transportmaschinerie aus einem breiten Spektrum bestimmter Proteine, die für die Sortierung und Beförderung zur jeweiligen Membrandomäne wichtig sind. Dazu zählen Motorproteine, Adapterproteine, Lektine, Rab-Proteinen und die zu transportierenden Proteine. Darunter befindet sich auch die große GTPase Myxovirus Resistance Protein 1 (Mx1), ein Mitglied der Dynamin- Superfamilie. Dieses Protein wurde auf apikalen post-Golgi Vesikeln identifiziert. Mx- Proteine gelten als streng Interferon-reguliert, die nur nach einer viralen Infektion exprimiert werden. In MDCK-Zellen besitzt Mx1 keine antivirale Aktivität und es wird konstitutiv exprimiert. Viele charakteristische Eigenschaften der Mx-Proteine lassen auf eine Funktion in grundlegenden, zellulären Prozessen schließen. So wurde die große GTPase als wichtige regulatorische Komponente des apikalen Transportsystems identifiziert. Dabei befindet sich die große GTPase auf frühen und späten sekretorischen Kompartimenten. Da Mx1-positive Strukturen sehr beweglich sind und ein dynamisches Verhalten aufweisen, wurde mit Hilfe von Lebendzellaufnahmen die Dynamik dieser Strukturen in Abhängigkeit des Mikrotubuli-Zytoskeletts untersucht. Die Depolymerisation der Mikrotubuli durch Nocodazol führte zu einem eingeschränkten Langstreckentransport. Mittels biochemischer und fluoreszenzmikroskopischer Methoden war es möglich, die Assoziation von caninem Mx1 mit α-Tubulin nachzuweisen. Außerdem konnte zum ersten Mal gezeigt werden, dass Mx1 mit dem Kinesin- Motorprotein Kif5B interagiert. In Übereinstimmung mit dieser Beobachtung führte der Knockout von Mx1 oder die Mutation im Membraninteraktions-Motiv der unstrukturierten L4-Schleifenregion zu einem verminderten apikalen Proteintransport. Diese Mx1-Mutante war trotz mutiertem Membraninteraktions-Motiv in der Lage an Kif5B zu binden. Jedoch führte die Mutation zur Elongation der Mx1-positiven Kompartimente. Es ist daher denkbar, dass Mx1 aufgrund der Strukturähnlichkeiten mit den klassischen Dynaminen auch eine Funktion in der Abschnürung von Transportvesikeln besitzt. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals die funktionale Rolle der großen GTPase Mx1 im apikalen Proteintransport aufgezeigt werden. Mx1 stabilisiert nicht nur die Assoziation zwischen Kif5B, den Mikrotubuli und apikalen Transportvesikeln sondern unterstützt auch die Vesikelfission.

In dieser Arbeit wurden verschiedene Aspekte der Biogenese von Peroxisomen untersucht. In den frühen Stadien der Peroxisomenformation wurde die Existenz von präperoxisomalen Vesikeln (PPVs) in \(\textit {Saccharomyces cerevisiae pex3}\)-Deletionsmutanten gezeigt. Die Rolle von Vph2p und der vakuolären H\(^{+}\)-ATPase bei der peroxisomalen Biogenese wurde analysiert und führte zu einer funktionalen Verbindung zwischen peroxisomaler und vakuolärer Funktion. Potentielle Interaktionspartner von Pex3p wurden bezüglich Lokalisation und Einfluss auf die peroxisomale Funktion analysiert. Zudem fokussiert sich diese Arbeit auf Alternativrouten des Matrixproteinimports in Peroxisomen. Die funktionale Beziehung zwischen Pex5p und Pex9p, dem "klassischen" und dem "alternativen" PTS1-Protein-Rezeptor, wurde untersucht. Außerdem wurde gezeigt, dass der Import von Mdh2p in Peroxisomen über Mdh3p- und Pex5p-vermittelten "Huckepack"-Transport stattfindet. Zudem wurde eine Rolle von Mdh2p in Peroxisomen vorgeschlagen. In this work, different aspects of the biogenesis of peroxisomes are investigated. The existence of preperoxisomal vesicles (PPVs) in the early stages in peroxisome formation was shown in \(\textit {Saccharomyces cerevisiae pex3}\)-deletion mutant cells. The role of Vph2p and the vacuolar H\(^{+}\)-ATPase in the biogenesis of peroxisomes is analyzed, establishing a functional connection between peroxisomal and vacuolar function. Potential Pex3p’s interaction partners were analyzed to determine their localization and their influence in peroxisomal function. The second part is focused on alternative routes for the matrix protein import into peroxisomes. The functional relationship between Pex5p and Pex9p, the "classical" and the "alternative" PTS1-protein receptors, in matrix protein import was studied. Finally, the import of Mdh2p into peroxisomes was shown to occur via Mdh3p- and Pex5p-mediated "piggyback" transport. A role of Mdh2p in peroxisomes was suggested.

Peroxisomen zählen zu den Zellorganellen, da sie jedoch über keine eigene DNA verfügen müssen sämtliche Matrixproteine posttranslational importiert werden. Die meisten peroxisomalen Proteine verfügen über eine PTS1-Sequenz und werden anhand dieser durch den Import-Rezeptor Pex5p erkannt und in die peroxisomale Matrix transportiert. Bei diesem Prozess wird Pex5p in die peroxisomale Membran inseriert. Für den Export des Rezeptors zurück ins Cytosol dient Ubiquitinylierung als Signal. Ein Austausch des für die Monoubiquitinylierung und anschließenden Export essentiellen Cysteins durch ein Lysin führte zu einer verstärkten Polyubiquitinylierung sowie erhöhtem proteasomalen Abbau von Pex5p. Besonders stark ist dieser Effekt in Abwesenheit des deubiquitinylierenden Enzyms Ubp15p. Dies hat jedoch keinen negativen Einfluss auf die Funktionalität des Rezeptors. Des Weiteren spielt Pex4p, das Ubiquitin konjugierende Enzym der Monoubiquitinylierung, auch bei der Polyubiquitinylierung eine Rolle.

Prion-Erkrankungen sind tödlich verlaufende neurodegenerative Krankheiten, deren Ursache die Umfaltung des zellulären Prion-Proteins (PrP\(^{C}\)) in eine abnormal gefaltete Form (PrP\(^{Sc}\)) ist. PrP\(^{C}\) kann Dimere ausbilden, welche mit einer protektiven Funktion assoziiert werden. In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die neurotoxische Mutation (A113V, A115V, A118V) keinen Einfluss auf die Homo- und Heterodimerisierung mit PrP hat. Die Umwandlung von PrP\(^{C}\) zu PrP\(^{Sc}\) wird jedoch durch die Ausbildung von Dimeren verhindert. Der Transport sekretorischer Proteine, wie beispielsweise von PrP, in das Endoplasmatische Retikulum erfolgt in Eukaryoten durch das Sec61-Translokon. In Prokaryoten ermöglicht der homologe Translokationskanal (SecY), den Transport sekretorischer Proteine in den periplasmatischen Raum. Wir konnten zeigen, dass die beeinträchtigte Sec-Translokation intrinsisch unstrukturierter Proteine ein konserviertes evolutionäres Merkmal zwischen Säugerzellen, Hefe und \(\textit {E.coli}\) ist.

Plastiden sind von zentraler Bedeutung für die pflanzliche Zelle. Der überwiegende Anteil der plastidären Proteine ist im Kern der Zelle kodiert und muss über eine doppelte Hüllmembran importiert werden. Den Hauptimportweg bilden Translokationskomplexe an der äußeren (TOC) und inneren (TIC) Hüllmembran des Plastiden. Proteine die über diesen Importapparat importiert werden sollen, verfügen zur Erkennung über ein N-terminales Transitpeptid. Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Transitpeptide der einzelligen Alge Cyanophora paradoxa denen von Arabidopsis thaliana gegenübergestellt. Es war festzustellen, dass sich die Transitpeptide der beiden Organismen trotz der großen evolutionären Distanz überraschend ähnlich sind. Was ein Beleg ist, wie gut die grundlegenden Prinzipien des Imports konserviert sind. Des Weiteren wird im Rahmen der Arbeit demonstriert, dass ein Defekt der Importkomponente Tic56 in Arabidopsis kaum Auswirkungen auf den Proteinimport hat, der Verlust dieser Komponente jedoch zu einer gestörten Biogenese plastidärer Ribosomen führt. Dadurch konnte eine Verbindung zwischen Proteinimport und Translation aufgezeigt werden., Plastids are substantial parts of plant cells. Major parts of plastid proteins are nucleus encoded and have to be imported across the two envelop membranes. The main import pathway consists of translocation complexes at the outer (TOC) and inner (TIC) envelop membrane of the plastid. Plastid proteins that need to be imported via this import apparat contain an N-terminal transit peptide. In this study transit peptides of the unicellular algae Cyanophora paradoxa are compared with those of Arabisopsis thaliana. Despite the wide evolutionary distance between both organisms their transit peptides are surprisingly similar. This is an evidence for the good conservation of the basic principles of import. Furthermore it is demonstrated that a defect of the import component Tic56 has no dramatic consequences for protein import, but that the loss of the component leads to a disturbed biogenesis of plastid ribosomes. This reveals a connection between protein import and translation.

submitted by Anny Fis Arbeit gesperrt Universität Linz, Dissertation, 2018

Die Frage nach der Existenz alternativer Importwege in Peroxisomen der Hefe \(\textit {Saccharomyces cerevisiae}\) wurde in zwei unterschiedlichen Projekten bearbeitet. Im ersten Projekt wurde demonstriert, dass der Transport des peroxisomalen Enzyms Gpd1p (Glycerin-3-phosphat Dehydrogenase) spezifisch von dem Korezeptorprotein Pex21p über den PTS2-Importweg vermittelt wird. Die Analyse von Gpd1p-Komplexen führte weiterhin zur Identifikation des Gpd1p-Interaktionspartners Pnc1p (Nikotinamidase), welcher trotz eines fehlenden Importsignals in Peroxisomen lokalisiert ist. Untersuchungen des Pnc1p-Transports ergaben einen peroxisomalen Import von Pnc1p durch die Bildung eines Komplexes mit dem Enzym Gpd1p. Im zweiten Teil der Arbeit konnte das putative Rezeptorprotein Ymp8p (YMR018w) erstmals immunologisch unter spezifischen Umweltbedingungen nachgewiesen sowie Lokalisation und Topologie aufgeklärt werden. Die Funktionalität als Importrezeptor wurde an Hand spezifischer Kargoproteine demonstriert.

Diese Arbeit beschäftigt sich mit den Typ II AAA\(^{+}\)-ATPasen Pex1p und Pex6p der Hefe \(\textit {S. cerevisiae}\), die als Motor der Matrixprotein-Importmaschinerie die Rückführung des PTS1-Rezeptors Pex5p von der Peroxisomen-Membran zurück in das Zytosol katalysieren. Elektronenmikroskopische Strukturanalysen zeigen eine Nukleotid-abhängige Formierung hetero-hexamerer AAA\(^{+}\)-Komplexe mit alternierend organisierten Pex1p und Pex6p Untereinheiten. Durch ATP-Hydrolyse-Ereignisse induzierte Konformationsänderungen konservierter "Pore Loops" deuten auf einen Mechanismus hin, bei dem Pex5p durch die zentrale Pore des AAA\(^{+}\)-Komplexes geführt wird. Dabei vermitteln die konservierten D2 Domänen von Pex6p die hauptsächliche ATPase-Aktivität. Ein Ausschalten dieser ATPase-Aktivität in Folge einer Pex6p Walker B Punktmutation resultiert in einer stabilisierten Anbindung des AAA\(^{+}\)-Komplexes an den Membrananker Pex15p und deutet auf einen mit dem Pex5p-Export verknüpften Pex1/6p-Pex15p Dissoziationsmechanismus hin.

USP2 liegt in vier Isoformen vor, die verschiedenste Funktionen, insbesondere bei der Regulation der Apoptose, innehaben. Eine Überexpression der drei kurzen Isoformen 2, 3 und 4 führte zu einer verstärkten Caspase-Aktivität. Alle vier Isoformen des USP2 werden PEX5 abhängig über ein PTS1-Signal in die peroxisomale Matrix transportiert. Dieser Import ist aufgrund einer geringen Affinität zu PEX5 nicht sehr effizient, so dass ein großer Teil des USP2 im Zytosol verbleibt. Durch Mutation des PTS1 von USP2-3 konnte die Affinität zum Rezeptor und somit die peroxisomale Importeffizienz erhöht werden. Daraufhin zeigte sich eine Verringerung der Caspase-Aktivität, woraus sich schließen lässt, dass USP2-3 nur im Zytosol seine pro-apoptotische Funktion ausführen kann. Dies legt nahe, dass die eigentliche Funktion des peroxisomalen Imports von USP2-3 einen Regulationsmechanismus der Apoptose darstellt, indem es von seinen Interaktionspartnern in Zytosol und Zellkern räumlich getrennt wird.

Zur Analyse des Einflusses von cpSRP-Wegs Komponenten auf den PSII-Reparaturzyklus wurden entsprechende Mutanten von \(\textit {A. thaliana}\) hinsichtlich ihrer PSII-Regeneration nach Wachstum unter Hochlicht analysiert. Die präsentierten Daten zeigen, dass der PSII-Reparaturzyklus in \(\textit {ffc/chaos}\) und \(\it cpftsy\) stark beeinträchtigt war. Untersuchungen von \(\it psbA\)-mRNA-Gehalt, D1-Translationsinititation und D1-Proteinstabilität in diesen Mutanten deuten auf einen Defekt im D1-Proteintransport hin. Weiterhin wurde der D1-Insertionsprozess durch die Herstellung und Analyse stabiler und arretierter D1-Insertionsintermediate in einem chloroplastidären \(\textit {in vitro}\) Translationssystem in Gegenwart von isolierten Thylakoidmembranen untersucht. Massenspektrometrische Untersuchungen angereicherter D1-Insertionsintermediate zeigten unter anderem die Anwesenheit von VIPP1. Folgende biochemische Untersuchungen erbrachten Hinweise auf einen nativen Komplex in der Thylakoidmembran bestehend aus cpSecY, Alb3, cpFtsY und Vipp1.

Das vakuolisierende Zytotoxin VacA des humanpathogenen Bakteriums \(\it Helicobacter\) \(\it pylori\) besteht aus den beiden Untereinheiten p55 und p33. Ungeklärt ist bislang über welchen Mechanismus die toxische Untereinheit p33 in die Innenmembran der Mitochondrien gelangt. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die 32 N-Terminalen hydrophoben Aminosäuren \(\it in\) \(\it vivo\) für eine Lokalisation zu den Mitochondrien ausreichend sind, während die Translokation in die Innenmembran interne Strukturen erfordert, die den Import in einer \(\it loop\)-Struktur vermitteln. Bei Expression des p33 in der Bäckerhefe \(\it S.cerevisiae\) kommt es zur Entstehung einer erhöhten Menge an reaktiven Sauerstoff-Spezies (ROS) und zur positiven Regulation von Proteinen, die mit der Reparatur von oxidativen DNA-Schäden assoziiert sind. Mit den Ergebnissen dieser Arbeit konnte erstmals ein Mechanismus postuliert werden, welcher VacA für die Entstehung von Mutationen in \(\it Helicobacter\) \(\it pylori\) infiltriertem Gewebe mitverantwortlich macht. The vacuolating cytotoxin VacA of the human pathogenic bacterium \(\it Helicobacter\) \(\it pylori\) consists of the two subunits p55 and p33. It is still unknown which mechanism is used by the toxic subunit p33 to translocate into the inner mitochondrial membrane. In this work it was possible to confirm that the N-Terminus of p33 is sufficient for an \(\it in\) \(\it vivo\) translocation to the mitochondria. The passage across the outer membrane and the insertion into the inner membrane are dependent of internal elements, which facilitate the import in a \(\it loop\)-structure. After expression of p33 in the budding yeast \(\it S.cerevisiae\) an increased production of reactive oxygen species (ROS) and upregulation of proteins involved in the repair of oxidatively damaged DNA was observed. The results from this thesis allowed to postulate a possible mechanism, by which p33/VacA is responsible for the accumulation of mutations in \(\it H.\) \(\it pylori\) infiltrated tissue.

Als ein kleines G-Protein, ist Rho1p der Bäckerhefe an diversen essentiellen Prozessen der Zelle beteiligt. Deshalb ist das Protein an verschiedenen zellulären Kompartimenten lokalisiert, vermutlich auch an Peroxisomen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die Lokalisation von Rho1p unter ölsäureinduzierenden Bedienungen verändert. In fluoreszenzmikroskopischen Analysen zeigt sich dieses in dem Auftreten von zusätzlichen punktierten Mustern. Eine Lokalisation von Rho1p an Peroxisomen konnte jedoch nicht verifiziert werden. Dagegen konnte gezeigt werden, dass Rho1p unter ölsäureinduzierenden Bedienungen an \(\textit {Lipid bodies}\) lokalisiert ist. Weiter konnten Defekte in der Biogenese von \(\textit {Lipid bodies}\) und der Lipid-Homöostasis aufgrund eines Fehlens von Rho1p beobachtet werden, was auf eine mögliche Funktion von Rho1p an der Biogenese dieser Organellen hindeutet. Abschließend konnte Tus1p als möglicher \(\textit {Lipid body}\)-spezifischer Rho1p-GEF identifiziert werden.

Der peroxisomale Matrixproteinimport basiert auf zyklisierenden Rezeptoren, die zwischen dem Cytosol und der peroxisomalen Membran pendeln. Ein wichtiger Schritt im Rahmen dieses Zyklus ist die ATP-abhängige Freisetzung des Rezeptors, bewerkstelligt durch einen Proteinkomplex bestehend aus Pex1p und Pex6p. Bei diesen beiden Proteinen handelt es sich um Mitglieder der AAA ("ATPases associated with various cellular activities")-Familie, die im Rahmen dieser Arbeit näher charakterisiert wurden. Mithilfe eines speziellen \(\textit {Escherichia coli}\)-Expressionssystems wurden Pex1p und Pex6p der Bäckerhefe \(\textit {Saccharomyces cerevisiae}\) rekombinant gewonnen. Das Reinigungsverfahren konnte derart optimiert werden, dass die Kriterien für funktionelle als auch strukturelle Untersuchungen in Qualität und Quantität erfüllt wurden. Funktionell konnte mit den isolierten Proteinen deren Assemblierung zu einem heterohexameren Komplex gezeigt werden.

YidC of Escherichia coli belongs to the evolutionarily conserved proteins of the Oxa1/YidC/Alb3 insertase family. The transmembrane regions of the core domain, comprising of TM2-6, are the most conserved parts among the homologs and are crucial for the function as a membrane insertase. This is particularly true for the TM2, TM3 and TM5 (KUHN et al., 2003; KIEFER & KUHN, 2007). In bacteria, YidC acts as an independently working membrane insertase and, as well, in cooperation with the Sec translocon for the biogenesis of various membrane proteins. YidC is required for the biogenesis of respiratory complexes, ATP synthase and for example the mechanosensitive channel protein MscL. Also, the coat proteins of filamentous phage Pf3 and M13 require YidC for membrane insertion. The best studied substrate is the Pf3 coat protein of phage Pf3 infecting Pseudomonas aeruginosa – i.e. a small protein of 44 amino acids in length. In the context of this thesis, the YidC-dependent biogenesis of Pf3 coat was analyzed to gain better insight into the entire insertion process. In doing so, a set of more than 100 single cysteine mutants in distinct domains of YidC and Pf3 coat were generated. To study the insertion of Pf3 coat under physiological conditions, an in vivo cross-linking assay was established for capturing YidC-Pf3 interactions within a short period of time after the onset of synthesis (1 minute) using 35S-Met pulse-labelling methods. YidC binds inserting Pf3 coat protein in distinct regions of the highly conserved TM domains involving four of the six TM helices. It was verified that TM3 is indispensable for the function of YidC since four contacting residues were found in this TM helix. A helical wheel projection of substrate binding helices reveals the localization of the contacting residues of each TM segment on one helical face. This implies a helix arrangement of the transmembrane core domain which enables binding of inserting substrate proteins and interactions with transmembrane domains over the entire membrane-spanning part of YidC. The serial mutation of nine from twelve contacting residues, which are strongly hydrophobic in most cases, to serines impaired the function of YidC, whereas the single mutations had no effect. Additionally, the insertion process of translocation deficient Pf3 coat mutants was analyzed for intermediate states of the insertion process. It has been shown that the insertion deficient Pf3 coat mutants are inhibited at a late step of membrane insertion, i.e. forming the YidC contacts in the periplasmic leaflet. Based on this work, further studies confirmed that the identified substrate contacting regions of YidC play a key role in YidC-mediated insertion. The mechanosensitive channel protein MscL, M13 procoat, nascent Foc and the polytopic membrane protein LacY contact YidC at exactly the same positions (NEUGEBAUER et al., 2012; SPANN & KUHN, unpublished results; WICKLES et al., 2014; ZHU et al., 2013b). YidC von Escherichia coli gehört zu den evolutionär konservierten Proteine der Oxa1/ YidC/Alb3 Insertase Familie. Die Transmembranbereiche (TM) der Kerndomäne, die die TM2-6 umfasst, sind die konserviertesten Bereiche unter den Homologen und sind entscheidend für ihre Funktion als Membraninsertase. Dies gilt insbesondere für die TM2, TM3 und TM5 (KUHN et al., 2003; KIEFER & KUHN, 2007). In Prokaryonten wirkt YidC als unabhängig arbeitende Membraninsertase und in Zusammenarbeit mit dem Sec-Translokon in Prozessen der Biogenese von Membranproteinen. YidC wird für die Assemblierung von Komplexen der Atmungskette, der ATP-Synthase und beispielsweise für die Biogenese des mechanosensitiven Kanalproteins MscL benötigt. Außerdem benötigen die Hüllproteine der fadenförmigen Phagen Pf3 und M13 YidC für die Membraninsertion. Das am besten untersuchte Substrat ist das Hüllprotein des Phagen Pf3, der Pseudomonas aeruginosa infiziert – es ist ein kleines Protein mit einer Länge von 44 Aminosäuren. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die YidC-abhängige Biogenese des Pf3 coat Proteins untersucht, um einen besseren Einblick in den Mechanismus des gesamten Insertionsprozesses zu gewinnen. Dabei wurden mehr als 100 Einzelcysteinmutanten in verschiedenen Domänen des YidC und Pf3 coat Proteins erzeugt. Für die Untersuchung der Pf3 coat Insertion unter physiologischen Bedingungen wurde eine in vivo Quervernetzungsmethode etabliert, die es ermöglichte YidC-Pf3 Interaktionen inner-halb der Dauer von einer Minute nach Synthesebeginn in „35S-Met-Pulse-labelling“ Experimenten zu untersuchen. YidC bindet inserierendes Pf3 coat Protein in unterschiedlichen Bereichen der hoch-konservierten Transmembrandomänen. Die Bindung erfolgt an vier der sechs Transmembrandomänen. Die Wichtigkeit der TM3 für die Funktion von YidC wurde bestätigt. In dieser TM wurden vier substratbindende Aminosäuren identifiziert. Die „helical-wheel projection“ der substratbindenden Helices zeigte, dass die kontaktie-renden Aminosäuren jeder Transmembrandomäne auf einer Seite der jeweiligen Helix lokalisieren. Dies impliziert eine Anordnung der membranständigen Kerndomäne, die eine Bindung des inserierenden Substratproteins und Wechselwirkungen zwischen Transmembrandomänen über den gesamten membranspannenden Teil von YidC ermöglicht. Die gleichzeitige Mutation von neun der zwölf kontaktierenden, meist stark hydrophoben Aminosäuren zu der leicht polaren Aminosäure Serin beeinträchtigte die Funktion von YidC, während die Einzelmutationen keinen Effekt zeigten. Zusätzlich wurde der Insertionsprozess von translokationsinhibierten Pf3 coat Mutanten untersucht. Es wurde gezeigt, dass die Bindung von insertionsdefizienten Pf3 coat Proteinen an YidC in einem späteren Schritt der Membraninsertion gehemmt ist. Auf der Grundlage dieser Arbeit, konnten weitere unabhängige Studien bestätigen, dass die identifizierten substratbindenden Bereiche von YidC eine universelle Funktion in der YidC-abhängigen Insertion besitzen. Es wurde gezeigt, dass das mechanosensitive Protein MscL, M13 procoat, naszierendes Foc Protein und das polytope Membranprotein LacY YidC an genau den gleichen Positionen kontaktiert (NEUGEBAUER et al. 2012; SPANN & KUHN, unveröffentlichte Ergebnisse; WICKLES et al., 2014; ZHU et al., 2013).

Members of the YidC/Oxa1/Alb3 protein family catalyze the insertion of integral membrane proteins into the lipid bilayer of the bacterial plasma membrane (YidC), the inner mitochondrial membrane (Oxa1), and the chloroplast thylakoid membrane (Alb3) (Saller et al., 2012; Dalbey et al., 2014). The insertase homologs are comprised of a conserved core region of 5 transmembrane domains, but are provided with additionally flanking N- and C-terminal regions of variable lengths and functions. The Gram-negative YidC is characterized by an additional N-terminal domain, while Gram-positive bacteria, mitochondria and plastids developed C-terminally extended insertase-domains. These domains are involved e.g. in direct interaction with ribosomes and facilitate a functional overlap with the co-translational SRP-targeting pathway. An extended C-terminal highly positively charged tail region was also found in the YidC homologs of the Gram-negative marine bacteria Rhodopirellula baltica and Oceanicaulis alexandrii, but not in Escherichia coli. The primary subject of this work was to characterize and analyze in detail the C-terminally extended YidC chimera, composed of the E. coli YidC and the C-terminally extended domains of the marine YidC homologs. Biochemical binding assays with the purified YidC proteins and isolated, vacant E. coli 70S ribosomes showed that the C-tails mediate specific binding to ribosomes independently of the translational state of the ribosome. Furthermore, a ribosome-bound insertase complex was visualized by cryo-electron microscopy. The enhanced affinity of the C-terminally extended YidC was used to isolate stable complexes with stalled ribosomes, carrying a nascent polypeptide chain of a YidC substrate protein (MscL). The cryo-EM structure of a YidC-ribosome nascent chain complex (RNC) was solved to a 8,6 Å resolution and allowed the visualization of the nascent chain from the peptidyl transferase center through the ribosomal exit tunnel into the YidC density. The structure revealed the helix H59 of the 23S rRNA and the two ribosomal proteins L24 and L29 as the major contacts sites of YidC at the ribosomal tunnel exit. Pull down assays confirmed a significantly interaction of the C-terminal ribosome binding domain and the ribosomal protein L29, while L24 seems to be a universal contact site for the YidC-insertase core domain. Strikingly, the cryo-EM structure clearly showed a single monomer of YidC bound to the translating ribosome. This suggests that monomeric YidC might be the minimal functional unit for YidC-dependent, co-translational insertion of inner membrane proteins. In addition to the in vitro tests, a possible role of the C-terminal YidC extensions in co-translational protein targeting was tested in vivo in E. coli. For that purpose the targeting and localization of the SRP-dependent YidC-substrate protein MscL (Facey et al., 2007) was investigated as a GFP fusion protein via fluorescence microscopy. In addition, the proper membrane insertion of MscL was analyzed in radioactive pulse chase experiments via AMS gel shift assays, either in the absence of a functional SRP or SRP receptor (FtsY). Both in vivo assays clearly showed that the C-terminal ribosome binding domain of the R. baltica YidC homolog can partially substitute for the SRP receptor function in E. coli, while the cytosolic signal recognition particle is still required for correct insertion of the MscL protein. Therefore, a new co-translational targeting and insertion model of YidC-only substrates was proposed. This works also highlights evolutionary aspects of the accessory YidC domains and indicates that the C-terminal extended tail of YidC in the planctomycete group may be an ancestral remnant of a primordial translocation system operating without a typical SRP receptor. The second part focuses on the interaction of the signal recognition particle with SRP signal sequences. Isolated mutant signal sequence peptides were used to determine the specificity of SRP recognition in proteins. The interaction studies were established in an in vitro system and binding affinities of purified SRP to the isolated signal sequence peptides were determined via microscale thermophoresis (MST). A short sequence of 27 amino acid residues at the very N-terminal tail of the large cytoplasmic domain of KdpD was identified as a SRP signal sequence. Furthermore, a direct influence of the amino acid composition in the signal peptide on its SRP binding affinity in vitro was demonstrated. This confirms a low influence of an altered charge in the N-terminal region while mutations in the hydrophobic core region causes significantly reduced binding affinities to SRP. Taken together, this study contributes to the understanding of the molecular mechanisms of co-translational membrane protein biogenesis in bacteria. Proteine aus der YidC/Oxa1/Alb3-Famile vermitteln die direkte Insertion von integralen Membranproteinen in den Lipid-Bilayer der bakteriellen Plasmamembran (YidC), in die innere Mitochondrien-Matrix (Oxa1) und in die Thylakoidmembran von Chloroplasten (Alb3) (Saller et al., 2012; Dalbey et al., 2014). Die Homologe dieser Insertase-Familie besitzen eine konservierte Kernregion aus 5 Transmembrandomänen und zusätzliche N- und C-terminale Regionen, die sich in ihrer Länge und Funktion stark voneinander unterscheiden. Charakteristisch für das YidC aus Gram-negativen Bakterien ist eine zusätzliche N-terminale Transmembrandomäne, während Mitochondrien und Plastide C-terminal verlängerte, hydrophile Domänen an ihren Insertasen besitzen. Diese C-terminalen Domänen sind zum Beispiel an der direkten Bindung von Ribosomen beteiligt und verleihen der Insertase co-translationale Funktionen die sich mit dem SRP-Targetingmechanismus überschneiden. Im Gegensatz zur YidC-Insertase aus E. coli, besitzen die Gram-negativen, marinen Bakterien Rhodopirellula baltica und Oceanicaulis alexandrii YidC Homologe mit C-terminal erweiterten, positiv geladenen, hydrophilen Domänen. Ziel dieser Arbeit war die detaillierte Charakterisierung und Analyse von C-terminal erweiterten YidC-Chimären. Die YidC-Chimären bestehen aus Fusionen des E. coli YidC Proteins und den C-terminalen Domänen der marinen YidC Homologe. Biochemische Bindungsstudien mit den gereinigten YidC-Proteinen und isolierten E. coli 70S Ribosomen zeigten, dass die C-terminalen Domänen eine spezifische Bindung an die Ribosomen vermitteln. Ähnlich zu der essentiellen Funktion der C-terminalen Domäne von Oxa1 war die Ribosomenbindung der YidC-Chimären unabhängig von einer translatierten Polypeptidkette am Ribosom. Des Weiteren, wurde ein Komplex aus naszierendem Ribosom (RNC) und gebundener YidC-Chimäre mittels Kryo-Elektronenmikroskopie auf 8,6 Å gelöst. In der Struktur konnte man den Weg der wachsenden Polypeptidkette vom Peptidyltransferase-Zentrum, durch den Ausgangstunnel des Ribosoms bis hinein in das YidC Protein verfolgen. Mit Hilfe der Kryo-EM Struktur wurde die Helix H59 der 23S rRNA und die beiden ribosomalen Proteine L24 und L29 als Hauptkontakte des YidCs am Ribosom identifiziert. Durch Pull-Down Versuche konnte eine signifikante Interaktion der C-terminalen Domäne mit L29 gezeigt werden, wohingegen L24 vermutlich eine Interaktion mit der YidC-Kerndomäne eingeht. Außerdem lieferte die Struktur des YidC:RNC Komplexes den Beweis, dass ein einzelnes YidC-Molekül an translatierende Ribosomen bindet und somit vermutlich die minimalste, funktionelle Einheit für die YidC-abhängige, co-translationale Insertion von Membranproteinen darstellt. Um die in vivo-Funktion der C-terminalen YidC Domänen während des co-translationalen Targetings in E. coli zu untersuchen, wurde das Membrantargeting des SRP-abhängigen YidC-Substratproteins MscL (Facey et al., 2007) als GFP-Fusionsprotein mittels Fluoreszenzmikroskopie untersucht. Parallel dazu wurde die korrekte Membraninsertion von MscL über eine AMS-Modifizierung in radioaktiven pulse-chase Experimenten analysiert. Beide in vivo Untersuchungen zeigten, dass die C-terminale Ribosomenbindedomäne des R. baltica YidC Homologs zu einem gewissen Teil die Funktion des SRP-Rezeptors in E. coli übernehmen kann. Dabei wird jedoch SRP weiterhin für die korrekte Insertion von MscL benötigt. In dieser Arbeit werden ebenfalls evolutionäre Aspekte der akzessorischen YidC-Domänen behandelt, die darauf schließen lassen, dass die C-terminale YidC-Domäne in der Gruppe der Planktomyceten eine Art Überbleibsel eines Vorfahren mit primitivem Translokationssystem ohne klassischem SRP-Rezeptor ist. Der zweite Teil dieser Arbeit behandelt die Interaktion des Signal-Erkennungs-Partikel (SRP) mit SRP-Signalsequenzen. Um die Spezifität der SRP-Erkennung von Proteinen zu bestimmen wurden isolierte Peptide mit verschiedenen Signalsequenzmutationen verwendet. Die Bindungsaffinitäten der in vitro Interaktionsstudien von SRP und den Signalsequenz-peptiden wurden mittels Microscale Thermophorese (MST) bestimmt. Eine Sequenz von 27 Aminosäureresten am Anfang der großen N-terminalen, cytoplasmatischen Domäne des KdpD Proteins wurde als SRP-Signalsequenz identifiziert. Darüber hinaus konnte ein direkter Einfluss der Aminosäurekomposition im Signalpeptid auf die Bindungsaffinität zu SRP in vitro gezeigt werden. Während die Ladungsänderung in der N-terminalen Region des Signalpeptids nur einen geringen Einfluss auf die Interaktion mit SRP hatte, zeigten Mutationen in der hydrophoben Kernregion des Peptids eine deutlich verringerte Bindeaffinität zu SRP. Beide Teilaspekte dieser Arbeit tragen zum Verständnis des molekularen Mechanismus der co-translationalen Biogenese von integralen Membran-proteinen in Bakterien bei.

1. Auswirkung von Vitamin A Defizienz (VAD) auf das olfaktorische System. Bei starker VAD sind weniger olfaktorische Neurone nachweisbar. Bei leichter VAD ist kein olfaktorisches Defizit vorhanden, während Retinae stark beeinträchtigt sind. 2. Evolution von GPRC5 Rezeptoren. Die bekannten Sequenzen aus Vertebraten stammen von einer einzelnen Sequenz ab, welche im Genom von Urochordata vorhanden ist. Duplikation eines bislang unbekannten GPRC5 Gens führte zur Evolution von GPRC5A und GPRC5D in Säugetieren. 3. Übersicht über das olfaktorische System von Parkinson Mausmodellen mit dem Ergebnis, dass die untersuchten Mausmodelle nicht geeignet sind um die präklinischen olfaktorischen Defizite der Krankheit zu untersuchen. 4. Charakterisierung von LRBA, einem Mitglied der BEACH Protein Familie. In LRBA-Ko Tieren ist signifikant weniger olfaktorisches G-Protein in den Zilien vorhanden, was auf eine Rolle von LRBA beim ziliärem Transport hindeutet.

Peroxisomen sind nahezu ubiquitäre, eukaryotische Zellorganellen, die am Abbau von Fettsäuren und an der Entgiftung des dabei entstehenden Wasserstoffperoxids beteiligt sind. Neben dieser generellen Funktion beherbergen die Peroxisomen weitere Stoffwechselwege. Dazu zählen Teile des Glyoxylatwegs in Pflanzen und Pilzen und Stoffwechselwege für die Bildung von Sekundärmetaboliten. Eine Sonderform der Peroxisomen sind die Glycosomen, die in Trypanosomen identifiziert werden konnten und einen Großteil der glykolytischen Enzyme enthalten. Peroxisomale Matrixproteine enthalten entweder carboxyterminale oder aminoterminale PTS („peroxisomal targeting signal“)-Motive (C-terminal: PTS1; N-terminal: PTS2). Diese werden von zytoplasmatischen Rezeptoren erkannt, die gefaltete und sogar im Komplex vorliegende Proteine in die Peroxisomen überführen. In dem pflanzenpathogenen Basidiomyceten Ustilago maydis konnten im Verlauf dieser Arbeit kryptische PTS1-Motive in einer Reihe von Enzymen aus der Glykolyse bzw. Gluconeogenese identifiziert werden. Peroxisomale Isoformen dieser Enzyme entstehen durch alternatives Spleißen oder durch Überlesen von Stopcodons während der Translation. Eine bioinformatische Analyse ergab, dass in einer Vielzahl von Pilzen Isoformen glykolytischer Enzyme mit PTS1-Motiv gebildet werden, wobei die Mechanismen zur Herstellung dieser Isoformen in unterschiedlichen Spezies variieren. Zudem wurden in einigen glykolytischen Enzymen ungewöhnliche PTS1-Motive gefunden, die vom bisher gültigen Konsensus für PTS1-Motive abweichen und ebenfalls eine duale Lokalisierung der Enzyme in Peroxisomen und dem Zytoplasma hervorrufen können. Bei der genaueren Charakterisierung der Peroxisomen in U. maydis fiel auf, dass diese Organellen nicht nur für die β-Oxidation von Fettsäuren benötigt werden, sondern auch eine Funktion beim Zuckerstoffwechsel und der biotrophen Interaktion mit der Wirtspflanze Mais haben. Außerdem konnte gezeigt werden, dass Peroxisomen in U. maydis an der Synthese eines extrazellulären Glykolipids beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Peroxisomen in Pilzen durch eine größere metabolische Vielfalt charakterisiert sind, als bisher angenommen wurde. Die Identifizierung kryptischer PTS1-Motive in Enzymen aus der Glykolyse lässt die Vermutung zu, dass Peroxisomen auch in anderen Organismen noch weitere unerwartete Proteine beinhalten.

Das Typ III Sekretionssystem (T3SS) ist ein Proteinkomplex den Gramnegative Bakterien nutzen um in einem Schritt Effektorproteine (Effektoren) aus dem Zytosol über die Doppelmembran zu sekretieren. Für viele Bakterien ist das T3SS ein essenzieller Virulenzfaktor, der es ihnen erlaubt mit ihrem Wirt zu interagieren und diesen zu manipulieren. Charakteristisch für das T3SS ist die strukturelle Komponente, der Nadelkomplex. Dieser ähnelt strukturell einer Spritze, deren Basalkörper die bakteriellen Membranen und das Periplasma durchspannt und einer Nadel, die vom Basalkörper aus dem Bakterium ragt. Basierend auf dem Modell einer Spritze wird angenommen, dass Effektoren entfaltet und anschließend durch Basalkörper und Nadelkanal sekretiert werden. Trotz der kontinuierlichen Forschung an T3SS entbehrt dieses Modell einer experimentellen Grundlage und der Mechanismus ist nicht vollständig erklärt. Ziel der Arbeit war es, eine experimentelle Basis für den Sekretionsmechanismus des T3SS zu schaffen. Um zu verstehen, wie das T3SS Effektoren sekretiert, wurden zunächst Fusionsproteine konstruiert, welche aus einem Effektor und einem stabil gefalteten Knotenprotein bestehen. Aufgrund des Knotens in der Fusion ist davon auszugehen, dass dieser während der Sekretion nicht entfalten kann. Die Effektordomäne wird sekretiert während der Knoten im Kanal verbleibt und diesen verstopft. Nach unseremWissen ist diese Arbeit die erste Visualisierung von Effektorfusionen an isolierten Nadelkomplexen. Die Effektorfusion wird N-terminal voran durch den Kanal sekretiert, wobei der Kanal das Substrat umschließt und gegen Proteasen und chemische Modifikationen abschirmt. Die Ergebnisse dieser Arbeit untermauern eine Grundidee der Funktionsweise des T3SS und liefern eine vielversprechende Strategie für in situ-Strukturanalysen. Dieser Ansatz lässt sich auch auf andere Proteinsekretionssysteme übertragen, bei welchen Substrate vor dem Transport entfaltet werden müssen. The Type III Secretion System (T3SS) is a complex used by Gram-negative bacteria to secrete effector proteins from the cytoplasm across the bacterial envelope in a single step. For many pathogens, the T3SS is an essential virulence factor that enables the bacteria to interact with and manipulate their respective host. A characteristic structural feature of the T3SS is the needle complex (NC). The NC resembles a syringe with a basal body spanning both bacterial membranes and a long needle-like structure that protrudes from the bacterium. Based on the paradigm of a syringe-like mechanism, it is generally assumed that effectors are unfolded and secreted from the bacterial cytoplasm through the basal body and needle channel. Despite extensive research on T3SS, this hypothesis lacks experimental evidence and the mechanism of secretion is not fully understood. This work aimed to provide an experimental basis for the model of the T3SS mechanism. In order to elucidate details of the effector secretion mechanism, fusion proteins consisting of an effector and a bulky protein containing a knotted motif were generated. It is assumed that the knot cannot be unfolded during secretion of the chimera. Consequently, these fusions are accepted as T3SS substrates but remain inside the NC channel and obstruct the T3SS. This is, to our best knowledge, the first time effector fusions have been visualized together with isolated NCs and it demonstrates that effector proteins are secreted directly through the channel with their N-terminus first. The channel encloses the substrate and shields it from a protease and chemical modifications. These results corroborate an elementary understanding of how the T3SS works and provide a powerful tool for in situ-structural investigations. This approach might also be applicable to other protein secretion systems that require unfolding of their substrates prior to secretion.

In this work, the acetate auxotrophic mutant C. glutamicum ELB-P, a pyruvate and succinate producing strain, was engineered to become an efficient producer of pyruvate and succinate from boiled soluble potato starch, by transformation with plasmid pAmy, carrying the gene of the alpha-amylase from Streptomyces griseus. In addition to soluble potato starch also potato, corn, rice and wheat starch were tested as substrate for C. glutamicum strains carrying pAmy. These starches were tested boiled as well as raw in CgC-minimal medium as carbon and energy source for the L-lysine producer C. glutamicum DM1729(pAmy). This strain was able to utilize all the starches with growth and L-lysine production. Both for production of pyruvate and succinate as well as for production of L-lysine with C. glutamicum ELB-P(pAmy) and C. glutamicum DM1729(pAmy), respectively, not utilized carbohydrates in the medium were detected by thin layer chromatography analyses in the medium at the end of the experiments. During in vitro analysis of different starch degrading enzymes, the combination of alpha-amylase and pullulanase from Klebsiella pneumoniae showed an almost complete degradation of the remaining carbohydrates to maltose. Furthermore, the substrate was consumed almost completely by C. glutamicum. Additionally, C. glutamicum strains were constructed able to release active pullulanase in the medium. The plasmid-driven expression of the pulA-gene from K. pneumoniae with upstream signal sequence for both the Sec and the Tat secretion system resulted in an active pullulanase in cell lysate and in the cell membrane of C. glutamicum DM1729. Adding alpha-amylase to the medium of these strains resulted in an almost complete degradation of the starch. The degradation products could be utilized efficiently by C. glutamicum DM1729 for growth and L-lysine production. The construction of a strain secreting both the alpha-amylase and the pullulanase to degrade starch more efficiently was also performed.

Der Proteinimport in Peroxisomen unterscheidet sich von bekannten Translokons, indem gefaltete und sogar oligomere Proteine über die peroxisomale Membran transportiert werden. Im Mittelpunkt dieser Arbeit sollte die Identifizierung und Charakterisierung eines Pex5p-unabhängigen Kanals stehen. Der isolierte Pex18p-Komplex aus einem Pex5p-defizienten \(\textit {S. cerevisiae}\) Stamm enthält zwei Subkomplexe mit unterschiedlicher Zusammensetzung. Die identifizierten Pex18p-Subkomplexe wurden mittels \(\textit {planarer Bilayertechnik}\) auf Porenaktivität hin untersucht. Die Messungen ergaben eine Porenaktivität für den größeren Subkomplex mit Pex18p und Pex14p als Hauptbestandteile. Die unterschiedlichen Charakteristika der Pore durch Modifikation des Kargoproteins Fox3p zeigen, dass es sich um eine für PTS2-Proteine spezifische Pore handelt. Damit konnte eine weitere Pore identifiziert werden, die spezifisch für PTS2-Proteine ist und sich in ihren Eigenschaften von der PTS1-Pore unterscheidet.

Als ein kleines G-Protein, ist Rho1p der Bäckerhefe an diversen essentiellen Prozessen der Zelle beteiligt. Deshalb ist das Protein an verschiedenen zellulären Kompartimenten lokalisiert, vermutlich auch an Peroxisomen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass sich die Lokalisation von Rho1p unter ölsäureinduzierenden Bedienungen verändert. In fluoreszenzmikroskopischen Analysen zeigt sich dieses in dem Auftreten von zusätzlichen punktierten Mustern. Eine Lokalisation von Rho1p an Peroxisomen konnte jedoch nicht verifiziert werden. Dagegen konnte gezeigt werden, dass Rho1p unter ölsäureinduzierenden Bedienungen an Lipid bodies lokalisiert ist. Weiter konnten Defekte in der Biogenese von Lipid bodies und der Lipid-Homöostasis aufgrund eines Fehlens von Rho1p beobachtet werden, was auf eine mögliche Funktion von Rho1p an der Biogenese dieser Organellen hindeutet. Abschließend konnte Tus1p als möglicher Lipid body- spezifischer Rho1p-GEF identifiziert werden.

Der Proteinimport in Peroxisomen unterscheidet sich von bekannten Translokons, indem gefaltete und sogar oligomere Proteine über die peroxisomale Membran transportiert werden. Im Mittelpunkt dieser Arbeit sollte die Identifizierung und Charakterisierung eines Pex5p-unabhängigen Kanals stehen. Der isolierte Pex18p-Komplex aus einem Pex5p-defizienten S. cerevisiae Stamm enthält zwei Subkomplexe mit unterschiedlicher Zusammensetzung. Die identifizierten Pex18p- Subkomplexe wurden mittels planarer Bilayertechnik auf Porenaktivität hin untersucht. Die Messungen ergaben eine Porenaktivität für den größeren Subkomplex mit Pex18p und Pex14p als Hauptbestandteile. Die unterschiedlichen Charakteristika der Pore durch Modifikation des Kargoproteins Fox3p zeigen, dass es sich um eine für PTS2-Proteine spezifische Pore handelt. Damit konnte eine weitere Pore identifiziert werden, die spezifisch für PTS2-Proteine ist und sich in ihren Eigenschaften von der PTS1-Pore unterscheidet.

Diatomeen besitzen zwei divergente eukaryote Cytoplasmen: (i) das Cytosol der Wirtszelle, und (ii) das periplastidäre Kompartiment (PPC), welches das reduzierte Cytoplasma eines rhodophytischen Endosymbionten (komplexe Plastide) darstellt. Letzteres findet sich bei einer Vielzahl ökologisch höchst relevanter Mikroalgen und pathogener Protisten (Apicomplexa), welche komplexe Plastiden mit vier Hüllmembranen besitzen. Über die Proteinzusammensetzung und Funktion des PPC war bisher nur wenig bekannt. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Proteinkomposition des PPC der Diatomee Phaeodactylum tricornutum über einen kombinierten in silico/in vivo Ansatz untersucht. PPC-Kandidaten wurden dabei anhand der Präsenz spezifischer N-terminaler Zielsteuerungssequenzen genomisch identifiziert und über die Expression von eGFP-Fusionsproteinen auf ihre subzelluläre Lokalisation untersucht. Insgesamt konnten dadurch in dieser Arbeit 29 neue PPC-Proteine detektiert werden, welche sowohl bereits bekannte Funktionen im PPC, wie Proteintransport (SELMA), Proteinfaltung und Metabolismus, ergänzen, als auch auf bisher unbekannte putative Prozesse im PPC hindeuten. Insbesondere sind dabei Proteolyse und Degradation, Plastidenteilung, Lipidtransfer und eine potentielle strukturelle Organisation zu nennen. In gleichem Maße relevant sind Prozesse, die im Zuge bioinformatischer Analysen nicht im PPC der Diatomee detektiert werden konnten, was für klassische eukaryote Cytoskelett- und Vesikelkomponenten, sowie typische Signaltransduktionsfaktoren zutrifft. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass es sich beim PPC von P. tricornutum um ein auf natürliche Weise minimiertes eukaryotes Cytoplasma mit stark begrenzten metabolischen und zellulären Kapazitäten handelt, welches mit einem autonomen eukaryoten Cytoplasma nur wenige Gemeinsamkeiten aufweist und dessen Funktion höchstwahrscheinlich vor allem der Selbsterhaltung und Homöostase der ehemals primären Plastide dient. Ein weiteres Thema dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Identifizierung und Lokalisation von Metabolittranslokatoren in P. tricornutum, die eine Verbindung zwischen den Stoffwechselprozessen von Wirt und Symbiont ermöglichen. Dabei gelang es mittels in silico Analysen und anschließenden in vivo GFP-Lokalisationsstudien mehrere putative Triosephosphat/Phosphat Translokatoren in den Membranen der komplexen Plastide von P. tricornutum nachzuweisen. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass diese, möglicherweise durch den Transport von Triosephosphaten, eine metabolische Kommunikation zwischen Wirt und Symbiont gewährleisten könnten.

The initial stages of the P. falciparum secretory pathway appear to be similar to that in higher eukaryotes, but with some important differences. It has been noted that, although many P. falciparum proteins contain so-called “canonical” signal peptides (with a central hydrophobic region, a hydrophilic N-region and a C-terminal region), a number of secreted proteins contain an unusual N-terminal region prior to the hydrophobic signal peptide (recessed signal peptides). These N-terminal sequences appear to target proteins to the ER, but how exactly this occurs, and the function of the extension remains unknown. For reasons that are currently not well understood, recessed signal sequences are found mostly attached to proteins predicted to be transported to the cytosol of the host erythrocyte. These proteins underlie the pathology of malaria infection, as they confer novel properties to the infected host cell. In this PhD thesis, we aim to dissect such unusual secretory signal peptides, with a view to understanding their function. We shall use several P. falciparum N-terminal regions to this end, including classical signal peptides, as well as proteins containing recessed hydrophobic domains., Plasmodium falciparum exportiert Proteine in den Wirtserythrozyt, die die Wirtszelle morphologisch modifizieren. Eine wichtige Konsequenz dieser morphologischen Veränderung der Wirtszelle ist die Eigenschaft der infizierten Zellen an Rezeptoren im Endothel der Blutgefässe zu binden. Diese adhäsiven Eigenschaften sind verantwortlich für die klinischen Symptome der Malaria Krankheit. Die exportierten Proteine müssen den sekretorischen Weg des Parasiten und die den Parasiten umschließende Parasitophore Vakuole durchqueren, bevor sie das Zytosol oder die Plasmamembran der Wirtszelle erreichen. Der Fokus dieser Arbeit liegt auf dem Eintritt von Proteinen in den sekretorischen Weg des Parasiten, dabei insbesondere auf der Erkennung untypisch verlängerter Signalsequenzen. In dieser Arbeit wurde die Funktion der untypischen Signalsequenz des Glykophorin bindenden Proteins 130 (GBP 130) untersucht. Diese Signalsequenz besitzt eine ungewöhnliche Nterminale Verlängerung von 47 Aminosäuren (AS). Der Effekt dieser N-terminalen Verlängerung von GBP 130 auf die Proteinsortierung in Plasmodium wurde im Detail untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die N-terminale Verlängerung keinerlei Einfluss auf die Endbestimmung des Proteins hat und dass die Nterminale Verlängerung kompatibel mit dem Transport löslicher Proteine ist. Zudem wurde gezeigt, dass die verlängerte Signalsequenz von GBP 130 kein für Plasmodium spezifisches ER-Erkennungssignal ist, da sie auch vom sekretorischen Weg von Humanzellen erkannt wird.