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Diese Arbeit beschäftigte sich mit der Charakterisierung der putativen mitochondrialen Nuklease 2 MNU2 durch in vivo und in vitro Analysen. MNU2 besitzt neben zwei potentiellen RNA-bindenden Lotus-Domänen und einer putativen NYN-Nuklease-Domäne zwei weitere Domänen, die WW- und OHA-Domäne genannt werden. Da ein Knockout von MNU2 das Transkriptlevel und -muster der ccmFN2-, nad3-rps12 und nad9-Transkripte beeinflusst, wurde davon ausgegangen, dass MNU2 die Funktion einer Nuklease in Bezug auf die 5´-Prozessierung mitochondrialer Transkripte übernehmen könnte. Northern-Blot-Analysen der nad3-rps12-mRNA Prozessierung von MNU2-Mutanten mit Veränderungen einzelner Bereiche in den Domänen deuteten darauf hin, dass eine Deletion der WW- beziehungsweise OHA-Domäne von MNU2 nicht mit dessen Funktion interferierte. Dagegen führte die Deletion größerer Teile des Proteins mit mehreren Domänen stets zu einer Inaktivierung von MNU2. Während die Mutation konservierter Aminosäuren innerhalb der Lotus2-Domäne keinen Einfluss auf die Prozessierung der nad3-rps12-mRNA hatte, führte die Mutation der Lotus1-Domäne zur Aufhebung der MNU2-Funktion. Ein Austausch konservierter Aspartat- und Glutamat-Reste innerhalb der NYN-Domäne führten dagegen nur in einem Teil der untersuchten Pflanzen zu einer Inaktivierung von MNU2. In vitro Analysen eines Fusionsproteins aus der Arabidopsis RNaseP PRORP1 und der NYN-Domäne aus MNU2 konnten keine Nukleaseaktivität in Bezug auf ein Minimalsubstrat von PRORP1 aufdecken. Die Untersuchung von rekombinanten, partiell aufgereinigten MNU2 selbst deutete auf eine endonukleolytische Prozessierung eines ssRNA-Substrats hin. Dagegen konnte diese Prozessierung nicht für dsRNA oder ein ssRNA-Substrat mit abweichender Fluoreszenzmarkierung beobachtet werden. Auch RNA-Substrate mit interner Sekundärstruktur zeigten keine Prozessierung durch MNU2. Zusätzlich konnte die Untersuchung potentieller Protein-Protein-Interaktionen auf eine schwache Interaktion zwischen MNU1 und PRORP1, sowie MNU2 und PRORP1 hinweisen, nicht aber auf eine Interaktion zwischen MNU1 und MNU2. In einer weiteren Analyse der subzellulären Lokalisation der beiden putativen mitochondrialen Nukleasen MNU3, MNU5 und MNU6 gelang der Nachweis einer mitochondrialen Lokalisation von MNU3 und MNU6, nicht aber für MNU5. Auch der Versuch zur Etablierung einer Vierfachmutante durch den Knockout der Gene MNU3 und MNU6 mit Hilfe des CRISPR-Cas9-Systems in der Doppelknockoutmutante mnu1-2/mnu2-1 blieb ohne Erfolg., The main focus of this thesis was the characterisation of the putative mitochondrial nuclease MNU2 by in vivo and in vitro experiments. MNU2 contains two potential RNA-binding Lotus-domains as well a NYN-domain with a putative nuclease function. As a knockout of MNU2 affects the transcript level and pattern of ccmFN2, nad3-rps12 and nad9, MNU2 was thought to act as a nuclease regarding 5´-processing of mitochondrial transcripts. The Northern blot analyses of total RNA from different MNU2 mutants indicated that a deletion of the WW- or OHA-domain does not interfere with protein function. In contrast, the deletion of different domain combinations always inactivated MNU2. While the mutation of conserved amino acids in the Lotus2-domain had no influence on the processing of the nad3-rps12-transcript, the mutation of analogue amino acids in the Lotus1-domain abolished the function of MNU2. However, the mutation of conserved aspartate- and glutamate-residues in the NYN-domain caused an inactivation of MNU2 only in some of the investigated plants. In vitro analyses of a fusion protein consisting of the Arabidopsis RNaseP PRORP1 and the NYN-domain of MNU2 could not detect a nuclease activity for the PRORP1 minimal substrate. Processing assays with recombinant, partially purified MNU2 indicate an endonucleolytic cut within a ssRNA substrate, whereas no processing of a dsRNA or another ssRNA with a different fluorescent labelling could be observed. Also, MNU2 did not process RNA substrates with an internal secondary structure. Additionally, the investigation of potential protein-protein interactions suggested a weak interaction between MNU1 and PRORP1 as well as between MNU2 and PRORP1. An interaction between MNU1 and MNU2 could not be detected. In an additional analysis of the subcellular localisation of the putative mitochondrial nucleases MNU3, MNU5 and MNU6, a mitochondrial localisation was found for MNU3 and MNU6, but not MNU5. Furthermore, the attempt to establish a quadruple mutant by a knockout of MNU3 and MNU6 in the double knockout mutant mnu1-2/mnu2-1 using the CRISPR-Cas9 system was not successful.

In Arabidopsis thaliana werden viele mitochondriale RNAs posttranskriptional gereift. An diesen Modifikationen sind u.a. Pentatricopeptid Repeat Proteine (PPR) beteiligt. In der vorliegenden Arbeit wurden die mitochondrialen Transkripte nad3-rps12, nad4L-atp4 und atp6-2, für die in verschiedenen Arabidopsis Akzessionen mRNA-Polymorphismen auftreteten, dahingehend untersucht, welche Faktoren jeweils an der Reifung der Transkripte beteiligt sind. RNA Prozessierungsfaktor 8 (RPF8) ist dabei maßgeblich an der Prozessierung von nad3-rps12-mRNAs mit 5'-Ende bei -141 in Van-0 und Pi-2* beteiligt, während ohne RPF1 eine effiziente Generierung des 5'-Termini bei -318 in nad4L-atp4-Transkripten nicht erfolgen kann. Für die beiden untersuchten Ko-Transkripte existieren weitere Faktoren, die an der Bildung weiterer Traskript-Spezies beteiligt sind. Bei atp6-2 handelt es sich um ein nicht essentielles Gen, das in vielen Akzessionen nicht vorhanden ist. Ökotypen, die atp6-2-DNA besitzen weisen stark unterschiedliche Transkriptmengen und -muster auf. Ein ursächlicher Faktor ist auf dem unteren Arm von Chromosom 1 zu suchen. Auch bei der Bildung von atp6-2-mRNAs spielen mehrere Faktoren eine Rolle.

Biosensoren sind ein weitverbreitetes analytisches Werkzeug und stellen mit ihrem einmaligen Funktionsprinzip einen Schl��ssel f��r innovative Technologien dar. Als kommerzielles Produkt sind eine Vielzahl an Modifikationen von Biosensoren der zweiten Generation erh��ltlich. Dennoch besteht ein gro��es Interesse an der Weiterentwicklung der Glucosesensoren hin zur dritten Generation, welche auf eine mediatorfreie und somit direkte ��bertragung der Elektronen setzen. Trotz der zahlreichen Fortschritte stellt die kommerzielle Verf��gbarkeit von Biosensoren der dritten Generation eine gro��e Herausforderung dar, da die Sensoren meist auf den fachgerechten Gebrauch im Labor ausgerichtet sind. Dies macht sie f��r eine kosteng��nstige Produktion im gro��en Ma��stab und mit hoher St��ckzahl ungeeignet. Daher werden verfahrenstechnische Kernkompetenzen ben��tigt, die die Prozessierung von Biosensorl��sungen sowohl im kleinen Batch-Ma��stab als auch kontinuierlich im gro��technischen Rahmen erlauben. Das nachhaltige Entwicklungspotential, das dadurch geboten werden kann, ist Gegenstand dieser Arbeit.

Die angeborene, wie auch die adaptive Immunantwort sind maßgeblich entscheidend für die spontane Ausheilung einer Hepatitis-C-Infektion. Man geht aktuell davon aus, dass eine erfolgreiche Impfung gegen HCV vor allem CD8+ T-Zellen als wichtigen Teil der zellulären Immunabwehr aktivieren sollte. Interessanterweise ist bislang nur wenig bekannt über die optimale Sequenz zum Primen und Aktivieren der HCV-spezifischen CD8+ T-Zellen. Diese Arbeit untersucht den Einfluss der flankierenden Sequenzen von HCV-Epitopen auf die Prozessierung und Antigenpräsentation, welche letztlich essentiell sind für die T-Zellantwort. Es wurden drei verschiedene HLA-A*02 restringierte CD8+ T-Zell-Epitope (Core₁₃₂₋₁₄₀, NS3₁₄₀₆₋₁₄₁₅ und NS5B₂₅₉₄₋₂₆₀₂) für diese Studie ausgewählt. Diese werden reproduzierbar von Patienten mit Hepatitis-C-Infektion erkannt, das NS3-Epitop hiervon sogar immundominant. Die flankierenden Regionen dieser drei Epitope wurden mit einem HLA-A*02 Inluenza-Epitop fusioniert. Hiermit wurden Plasmide generiert, welche für ein HCV-GFP-Fusionsprotein codieren. Nach Transfektion dieser Plasmide in PBMCs wurden GFP-positive Zellen sortiert, um Targetzellen zu erhalten, welche das ausgewählte Antigen exprimieren. Durch diese Targetzellen wurden Influenza Epitop-spezifische T Zellen stimuliert. Die vorliegenden Ergebnisse deuten auf eine reproduzierbare Hierarchie der Antigenpräsentation hin, welche abhängig ist von den verschiedenen flankierenden Regionen (core > NS3 > NS5B). Weitere Experimente mit modifizierten flankierenden Sequenzen deuten darauf hin, dass die C-terminal flankierende Region den ausschlaggebenden Einfluss auf die Antigenpräsentation hat. Vergleicht man das Influenza-Epitop mit einem immundominanten CMV-Epitop, scheint die Immundominanz des CMV-Epitops den Einfluss der flankierenden Region zu überwiegen. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass eine Modifikation der flankierenden Sequenzen von CD8+ T-Zellepitopen zu einer verbesserten Prozessierung und Antigenpräsentation und damit zu einer verstärkten Immunogenität führen könnte, was wiederum potenziell bedeutend ist für die Entwicklung einer Impfung gegen HCV., Both, innate and adaptive immune responses, are essential for spontaneous containment of HCV replication. It is believed, that a successful vaccine will need to activate CD8+ T cells as an important component of the cellular immune response against HCV. Interestingly, little is known about the optimal antigen sequence for priming and activating HCV-specific CD8+ T cells. This project addresses the influence of flanking sequences of HCV-epitopes on the processing and the presentation of antigens, which are essential for initiating the CD8+ T cell response. Three different HLA-A*02 restricted CD8+ T cell epitopes of HCV (Core₁₃₂₋₁₄₀, NS3₁₄₀₆₋₁₄₁₅ and NS5B₂₅₉₄₋₂₆₀₂) were selected for this study. All three epitopes are reproducibly targeted in patients with HCV infection, of which the NS3 epitope is being immunodominant. The flanking regions of all three epitopes were fused to an HLA-A*02-restricted flu epitope and different expression plasmids coding for a HCV-GFP fusion protein were constructed. Upon transfection of these plasmids into PBMCs, GFP-positive cells were sorted to yield target cells in which the selected antigens were expressed. Target cells were co-cultured with specific T cells directed against the flu epitope. These experiments indicated a reproducible hierarchy in antigen presentation of the flu epitope in the context of different flanking regions (core > NS3 > NS5B). Further experiments using modified flanking regions indicated that the C-terminal flanking region was of specific importance in orchestrating the antigen presentation. By comparing the flu epitope with an immunodominant CMV epitope, the immunodominance of the CMV epitope prevailed the effect of the flanking region. In conclusion, the modification of the flanking region of CD8+ T cell epitopes might enhance antigen processing and presentation and thereby immunogenicity with potential implications for vaccine development.

Übertragen, Speichern und Prozessieren gelten als die drei zentralen Medienfunktionen. ›Übertragen‹ meint die Fähigkeit der Medien, räumliche Distanzen zu überwinden. Das ›Speichern‹ steht für die Überwindung der Zeit, für Traditionsbildung und kulturelle Kontinuierung. Was aber ist mit der dritten Medienfunktion, dem Prozessieren? Der Begriff stammt aus dem Umfeld des Computers; Computer übertragen und speichern Daten nicht nur, sondern sie verknüpfen sie, verändern sie und formen sie um. Aber handelt es sich tatsächlich um eine dritte Medienfunktion, die gleichrangig ist mit Speichern und Übertragen? Das Buch untersucht, was Prozessieren auf dem Terrain der Medien bedeutet.

The CRISPR/Cas-system represents an adaptive, heritable immune system found in prokaryotes to defend themselves against viruses and other invasive genetic elements. An essential part of this system is the biogenesis of small RNA molecules, so called crRNAs, which mediate the specificity during the degradation of foreign nucleic acids. This thesis deals with the characterization of these crRNA processing events in the archaeal model organism Haloferax volcanii. To be able to detect proteins of the CRISPR/Cas-system, polyclonal antibodies against the proteins Cas5, Cas6 and Cas7 were obtained by the immunization of mice. Moreover, it was investigated by in vivo and in vitro studies, which Cas-proteins are required for the processing and stabilization of the crRNA and whether these proteins interact with each other in a complex. By mutational analysis of the Cas6 protein several amino acid residues were identified which are essential for the function of the protein. At last, the processing- and crRNA-binding activity of Cas6 from the bacterium Caldicellulosiruptor lactoaceticus was analyzed in vitro. Here it was shown that this protein interacts with repeat-RNA, but does not cleave it.

Zur Suche möglicher neuer Biomarker-Kandidaten für das Pankreaskarzinom wurden umfangreiche Kataloge freigesetzter Proteine von Tumorzellen und einem Normalzellmodell ausgewertet. In den Fokus traten dabei die zwei Membranproteine EGFR und CDCP1, die in Sekretomen und Exosomen (etwa 100 nm großen Membranvesikeln) verstärkt nachgewiesen wurden. Durch die detaillierte Analyse von massenspektrometrischen Daten und mittels spezifischer Antikörper konnten Aufschlüsse über die proteolytische Prozessierung von EGFR und CDCP1 in Pankreaskarzinom-Sekretomen und -Exosomen gewonnen werden. Es konnte gezeigt werden, dass Pankreaskarzinomzellen spezifisch lösliche Isoformen der Membranproteine über Ektodomänen-Shedding, aber auch membranständige Isoformen über Exosomen in die Umgebung abgeben. Diese beschriebenen Isoformen könnten sowohl als potentielle neue Biomarker als auch funktionell, wie z.B. in der Signaltransduktion oder einem möglichen exosomalen Transfer, von großer Relevanz sein.

In dieser Arbeit wurden Interaktionspartneranalysen des darmspezifischen Cadherin-17 und Analysen zum Mechanismus des Ektodomänen-Sheddings des Fat1-Cadherins, sowie dessen Verwendbarkeit als Tumorbiomarker für das Pankreaskarzinom untersucht. Mit Hilfe von Co-Immunopräzipitation Cadherin-17 positiver Proteinkomplexe und anschließender massenspektrometrischer Analyse dieser, wurden vier Kataloge mit über 800 Proteinen erstellt. Exemplarisch wurden die Proteine pIgR und Keratin8 als mögliche Interaktionspartner getestet. Beide Proteine interagieren nicht. Am Fat1-Ektodomänen-Shedding sind die Proteasen ADAM9, ADAM10 und PCSK5 beteiligt und alle Proteine zeigen eine erhöhte Expression in Pankreastumoren. Lösliches Fat1 konnte erstmals im Serum von Pankreaskarzinompatienten gezeigt und mit einem, in Kooperation entwickelten Sandwich-ELISA, sensitiv nachgewiesen werden. Nur wenige Patienten zeigten einen erhöhten Fat1-Spiegel, die meisten davon aber einen geringen Spiegel für CA19-9. In this thesis analysis of possible interaction partners of the intestine specific cadherin Cadherin-17 as well as analysis of the mechanism of the cadherin Fat1 ectodomain and its possible usability as a novel biomarker for pancreatic cancer were analyzed. Four protein catalogues with over 800 proteins were generated using co-immunoprecipitation and a possible interaction between Cadherin-17 and the proteins pIgR and keratin8 were tested. Unfortunately the proteins do not interact. The ectodomain of the giant cadherin fat1 is shed by the proteases ADAM9, ADAM10 and PCSK5 and all those proteins show an increased expression in pancreatic cancer. A sensitive Sandwich-ELISA was established to detect soluble fat1 in sera through a cooperation. Fat1 could be used as a panel marker with CA19-9 for the patients with the highest Fat1-level showed diminished CA19-9-levels.

Proinsulin ist eines der wichtigsten Autoantigene des Typ 1 Diabetes mellitus (T1DM). Durch Prozessierung von Proinsulin entstehen Proinsulin-spezifische T-Zell Epitope, welche autoreaktive T-Zellen aktivieren. Professionelle Antigen-präsentierende Zellen, vor allem myeloide dendritische Zellen (mDC1), übernehmen eine wichtige Funktion in der Prozessierung von Proinsulin und in der Aktivierung von autoreaktiven T-Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit wurden lysosomale Proteasen (Cathepsine) aus mDC1 mit Proinsulin inkubiert und die entstandenen Bruchstücke analysiert. Die Untersuchung des Verdaumusters ergab, dass der Anteil der Cathepsin G spezifischen Schnittstellen am häufigsten war. Die durch den Verdau entstandenen Proinsulinfragmente wurden neu synthetisiert und hinsichtlich ihrer T-Zell Reaktivität in einem T-Zell Assay untersucht und das Cytokinprofil ausgewertet. Die hier dargestellten Ergebnisse dienen als Basis für weitere Untersuchungen zur Entwicklung neuer zielgerichteter Therapieansätze, z.B. durch den Einsatz von Cathepsin G Inhibitoren, die die Reduzierung von autoreaktiven T-Zellen des T1DM bewirken könnten.

The continuous improvement in semiconductor technology requires field effect transistor scaling while maintaining acceptable leakage currents. This study analyzes the effect of scaling on the leakage current and defect distribution in peripheral DRAM transistors.The influence of important process changes, such as the high-k gate patterning and ecapsulation as well as carbon co-implants in the source/drain junction are investigated by advanced electrical measurements and TCAD simulation. A complete model for trap assisted leakage currents in the silicon bulk of the transistors is presented. Für einen kontinuierlichen Fortschritt in der Halbleitertechnologie werden skalierte Feldeffekttransistoren mit niedrigen Leckströmen benötigt. Die stetige Skalierung verändert auch die Leckströme und Defektverteilung in peripheren DRAM Transistoren. In dieser Arbeit wird der Einfluss wichtiger Prozessänderungen auf diese Parameter mittels fortgeschrittenen elektrischen Messungen und TCAD Simulationen untersucht. Wichtige Prozessänderungen erfolgen bei der Strukturierung und Einkapselung des High-k - Metall Gates, und bei einer zusätzlichen Kohlenstoffimplantation in der Source bzw. Drain. Ein vollständiges Model für die Defekt assistierten Leckströme im Silizium Bulk wird vorgestellt.

Ribonukleasen sind die Enzyme, welche für Prozessierung und Degradation der RNA-Moleküle in einer Zelle verantwortlich sind. Die zu diesen Enzymen zählende RNase J wurde erst vor einigen Jahren in B. subtilis identifiziert und unterscheidet sich von den bisher bekannten bakteriellen RNasen in zweierlei Hinsicht. Erstens kann dieses Enzym RNA sowohl endo- als auch exo-ribonukleolytisch spalten und zweitens besitzt die exoribonukleolytische Aktivität eine bislang für bakterielle Ribonukleasen nicht bekannte 5´-3´ Orientierung. In B. subtilis ist die RNase J1 essentiell und spielt zusammen mit der paralogen RNase J2 eine Schlüsselrolle bei der Prozessierung und Degradation vieler RNAs in diesem Gram-positiven Organismus. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten erste Einblicke in die Aktivität und Funktion des RNase J homologen Proteins von R. sphaeroides gewonnen werden.Bei den in vitro RNA-Degradationsstudien mit rekombinant aufgereinigter RNase J konnte gezeigt werden, dass dieses Enzym eine äußerst prozessive exoribonukleolytische Aktivität besitzt und hierbei eine Präferenz für RNA-Substrate mit einem monophosphorylierten 5´-Ende aufweist. Eine für die RNase J von B. subtilis beschriebene, nahezu vollständige Inhibition der exoribo-nukleolytischen Aktivität durch ein triphosphoryliertes 5´-Ende wurde während dieser Arbeit jedoch nicht beobachtet. Die außergewöhnliche 5´-3´ Orientierung der RNA-Degradation durch die RNase J konnte prinzipiell auch für das homologe Enzym in R. sphaeroides bestätigt werden. Eine endo¬ribo¬nukleolytische Aktivität der RNase J ließ sich während der in vitro RNA-Degradationsstudien jedoch nur in geringem Umfang feststellen. Die beobachteten ribonukleolytischen Charakteristika der RNase J von R. sphaeroides werden vergleichend zu bekannten Eigenschaften von RNase J Homologen aus anderen Organismen diskutiert. Zusätzlich werden einige Aspekte der ribonukleolytischen Aktivität auf der Basis veröffentlichter RNase J Protein-Struktur Daten näher erläutert.Die RNase J von R. sphaeroides ist unter Standardwachstumsbedingungen nicht essentiell und eine Deletionsmutante wies keinen veränderten Phänotyp zum Wildtyp auf. Auf der RNA-Ebene führte die Deletion der RNase J zum Ausbleiben der finalen Reifung der 5´- als auch 3´-Enden der ribosomalen 23S rRNA-Fragmente. Mit Hilfe von in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass die RNase J von R. sphaeroides für die finale 5´-Prozessierung der 23S rRNA-Fragmente ver-antwortlich ist. Der sekundäre Effekt auf die Reifung der 3´-Enden führte zur Erstellung eines Modells für den Ablauf der einzelnen RNA-Reifungs Vorgänge an den 23S rRNA-Fragmenten.Die im Rahmen dieser Arbeit begonnene Auswertung einer RNASeq Transkriptom Analyse einschließlich erster Northern Blot Validierungen ergab, dass der RNase J möglicherweise eine weitere Funktion bei dem finalen Abbau einzelner Intermediate der RNA-Degradation in R. sphaeroides zukommt.

ATP dependent chromatin remodeling complexes are multifactorial complexes that utilize the energy of ATP to rearrange the chromatin structure. The changes in chromatin structure lead to either increased or decreased DNA accessibility. SWI/SNF is one of such complex. The SWI/SNF complex is involved in both transcription activation and transcription repression. The ATPase subunit of SWI/SNF is called SWI2/SNF2 in yeast and Brahma, Brm, in Drosophila melanogaster. In mammals there are two paralogs of the ATPase subunit, Brm and Brg1. Recent studies have shown that the human Brm is involved in the regulation of alternative splicing. The aim of this study was to investigate the role of Brm in pre-mRNA processing. The model systems used were Chironomus tentans, well suited for in situ studies and D. melanogaster, known for its full genome information. Immunofluorescent staining of the polytene chromosome indicated that Brm protein of C. tentans, ctBrm, is associated with several gene loci including the Balbiani ring (BR) puffs. Mapping the distribution of ctBrm along the BR genes by both immuno-electron microscopy and chromatin immunoprecipitation showed that ctBrm is widely distributed along the BR genes. The results also show that a fraction of ctBrm is associated with the nascent BR pre-mRNP. Biochemical fractionation experiments confirmed the association of Brm with the RNP fractions, not only in C. tentans but also in D. melanogaster and in HeLa cells. Microarray hybridization experiments performed on S2 cells depleted of either dBrm or other SWI/SNF subunits show that Brm affects alternative splicing and 3´ end formation. These results indicated that BRM affects pre-mRNA processing as a component of SWI/SNF complexes. 1, ATP abhängige Chromatin Remodelling Komplexe bestehen aus diversen Faktoren, welche die bei der Umsetzung von ATP freiwerdende Energie dazu nutzen, die Chromatinstruktur neu zu ordnen. Diese Veränderungen führen zu einer Zu- bzw. Abnahme in der Zugänglichkeit der DNA. Ein Beispiel dafür ist der SWI/SNF-Komplex, der sowohl in die Aktivierung als auch die Inhibierung der Transkription involviert ist. Die ATPase-Untereinheit von SWI/SNF heißt in Hefe SWI2/SNF2 und in Drosophila melanogaster Brahma (Brm). Im Gegensatz dazu besitzen Säuger zwei Paraloge der ATPase-Einheit, nämlich Brm und Brg1. Neueste Studien haben gezeigt, dass das humane Brm in der Regulation des Alternativen Spleißen beteiligt ist. Ziel dieser Arbeit ist es, die Rolle von Brm in der prä-mRNA-Prozessierung zu untersuchen. Als Versuchssysteme wurden Chironomus tentans und D. melanogaster herangezogen. Dabei eignete sich C. tentans vor allem für die in situ Studien während bei D. melanogaster das vollständig sequenzierte Genom von Vorteil war. Immunfluoreszenzfärbungen von Polytän-Chromosomen zeigen eine Assoziation von Brm von C. tentans, ctBrm; mit unterschiedlichen Genloci, einschließlich der Balbiani-Ringe (BR). Mit Hilfe von Immun-Elektronenmikroskopie und Chromatin-Immunpräzipitation (ChIP) wird die Verteilung von ctBrm entlang der BR-Gene untersucht. Dabei zeigt ctBrm eine weite Streuung. Die Ergebnisse lassen außerdem darauf schließen, dass ein Teil des ctBrm-Proteins mit naszierenden BRprä- mRNPs interagiert. Biochemische Fraktionierungs-experimente bestätigen die Assoziation von Brm mit RNP-Fraktionen nicht nur in C. tentans, sondern auch in D. melanogaster und in HeLa-Zellen. Microarray-Untersuchungen in S2-Zellen, in denen entweder dBrm oder eine andere Untereinheit von SWI/SNF depletiert war, zeigen, dass BRM als eine Komponente des SWI/SNF-Komplexes sowohl Alternatives Spleißen und die Formierung des 3´ Endes, als auch die prä-mRNA-Prozessierung beeinflusst.

Das HIV-1-Protein p6 ist im C-terminalen Bereich von Gag lokalisiert und besitzt trotz seiner geringen Größe von nur 52 Aminosäuren eine komplexe strukturelle und funktionelle Organisation. Es bindet mindestens zwei zelluläre Buddingfaktoren (Tsg101 und ALIX) sowie zwei virale Proteine (Vpr und Env) und übt eine Vielzahl biologischer Funktionen aus. Außerdem besitzt p6 sowohl C- als auch N-terminal jeweils eine L-Domäne, welche unter anderem den letzten Schritt in der Abschnürung des naszierenden Virions von der Zellmembran, in einem bis heute noch nicht vollständig geklärten Mechanismus, regulieren. Neben den Modifikationen der Ubiquitinylierung und Sumoylierung fungiert p6 außerdem als Substrat für verschiedene Kinasen: Im Jahr 2002 wurde p6 als Hauptphosphoprotein in HIV-1-Partikeln identifiziert und es konnte gezeigt werden, dass p6 durch die MAP-Kinase ERK-2 an der Position Thr-23 phosphoryliert wird. Weiter gibt es Hinweise, dass die genannte Kinase durch die Phosphorylierung an Thr-23 von p6 den Viruszusammenbau sowie die Virusfreisetzung reguliert. Zur Identifikation weiterer potentieller Kinasen wurde zu Beginn dieser Arbeit eine in silico Analyse durchgeführt und schließlich mittels in vitro Experimenten mit synthetischem und viralem p6-Peptid die Proteinkinase C, welche spezifisch Ser-Reste an Position 14, 25 und 40 in p6 phosphoryliert, identifiziert. Vergleicht man die Konsensussequenzen verschiedener HIV-1-Isolate der M-Hauptgruppe, so ist eine absolute Konservierung von Ser-40 festzustellen, was auf eine mögliche biologische Funktion dieser Stelle hindeutet. Zur Untersuchung der biologischen Funktion der Phosphorylierungsstellen in p6 wurden Konstrukte kloniert, die an den identifizierten Ser-Resten mutiert wurden. Die Substitution aller Ser-Reste einzeln zeigte in Infektionsstudien, dass nur die Mutation von Ser-40 zu einer verminderten Replikationskapazität in T-Zellen sowie in primären humanen Zellen führte. Die Mutation von Ser-14 und Ser-25 zeigte keinen Effekt auf die Replikation von HIV-1. Die Mutation aller drei PKC-Stellen zusammen führte hingegen zu einem kompletten Verlust der Replikationsfähigkeit. Obwohl die Mutation der Phosphoakzeptorstellen die Freisetzung der Viruspartikel nicht beeinflusste, sind die produzierten Virionen der Ser-40-Mutante weniger infektiös und die Dreifachmutation führte sogar zu einem kompletten Verlust der Infektiösität. Als molekularer Mechanismus hinter diesem Phänomen konnte in Pulse-Chase Experimenten beobachtet werden, dass die CA-Prozessierung von p25 zu p24 im Fall der Ser-40-Mutante gestört ist. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten, dass der Defekt in der CA-Prozessierung zu einer irregulären Core-Morphologie und zur Bildung einer elektronendichten Struktur außerhalb des Cores führt. Die erhaltenen Ergebnisse belegen eine neue, bis heute unbekannte Funktion von p6, die nicht die Virusfreisetzung, sondern die Gag-Prozessierung betrifft. Das konservierte Ser-40 reguliert auf noch unbekannte Weise, womöglich durch PKC-Phosphorylierung, die CA-Reifung und somit die Infektiösität von HIV-1. Neben den verschiedenen Bindungsstellen für virale und zelluläre Proteine sowie den Modifikationsstellen besitzt p6 die inhärente Fähigkeit zur Ausbildung oligomerer Formen. Diese wurden durch die Behandlung von sp6 und vp6 mit chemischen Crosslinkern und anschließender Western Blot Analyse untersucht. Es zeigte sich, dass das C-terminale Fragment von p6 oligomere Strukturen ausbildet. Somit konnte der in silico Befund, dass p6 eine im C-terminalen Bereich lokalisierte Oligomerisierungsdomäne besitzt, bestätigt werden. Ob diese Oligomerisierungsdomäne in p6 zur Gag-Gag-Multimerisierung, welcher eine wichtige Rolle in der Gag-Assemblierung und der Produktion von Viruspartikeln zukommt, beiträgt, sie eine ganz andere funktionelle Relevanz hat oder gar funktionslos ist, ist bislang nicht bekannt. The HIV-1 protein is located at the C-terminus of Gag and despite its small size of 52 amino acids it comprises a quite complex structural and functional organization: it binds at least two cellular budding factors (Tsg101 and ALIX) as well as two viral proteins (Vpr and Env) and it exerts a variety of biological functions. Among others, it regulates the final abscission step of the nascent virion from the cell membrane by the action of two different l domains, one located at the C- and one located at the N-terminus of the peptide, in a yet not completely elucidated mechanism. Besides the ubiquitinylation and sumoylation p6 acts as a substrate for distinct kinases: 2002 p6 was identified as the major phosphoprotein found in HIV-1 particles and it could be shown that phosphorylation of p6 by MAP-kinase ERK-2 at position Thr-23 regulates the assembly and release of progeny virions. To identify further potential kinases an in silico analysis was performed and finally in vitro experiments with synthetic and viral p6 identified PKC to specifically phosphorylate Ser residues in position 14, 25 and 40 in p6. When the consensus sequences derived from various HIV-1 group M isolates were compared, one can see that Ser-40 is absolutely conserved. Therefore, the biological function of this site has to be identified. To analyze the biological function of the identified phosphorylation sites, different constructs carrying mutations of the identified Ser residues were generated. Individual substitutions of the Ser residues revealed that only mutation of Ser-40 reduced virus replication in T-cell lines and in primary human cells, while mutation of Ser-14 and Ser-25 had no effect on the replication. In contrast, mutation of all three PKC-sites completely abrogated replication. Although mutation of PKC sites had no influence on virus release, the infectivity was reduced for the Ser-40 mutant and completely lost for the triple mutant. As molecular mechanism behind this phenomenon pulse-chase experiments illustrated that the efficiency in final processing of CA from p25 to p24 was dependent on the integrity of Ser-40. Electron micrographs showed that the defect in CA processing led to an irregular morphology of the virus core and the formation of an electron dense extra core structure. Thus, the obtained results support a novel, till this day unknown function of p6, that does not affect virus release but concerns Gag processing. The conserved Ser-40 regulates in a yet unknown manner CA maturation and thereby infectivity of HIV-1 in a process that might involve PKC phosphorylation. In addition to the different binding sites for viral and cellular proteins and the modification sites p6 displays the inherent ability to undergo oligomerization. This observation was analyzed by incubating sp6 and vp6 with chemical crosslinkers and western blotting. It turned out that the C-terminal fragment of p6 has the propensity to form oligomeric structures. This is consistent with in silico analysis, which predicts an oligomerization domain in the C-terminus of p6. Whether this oligomerization domain in p6 contributes to the Gag-Gag multimerization, which has an important role in Gag assembly and virus particle production, or whether it has a complete different functional relevance or it is totally out of any function is previously not known.

Several gene disruption mutants of B. japonicum showing symbiotic phenotypes arose from recombination experiments using a bank of gene-marker-fusions. Using three different experimental approaches the significance of genes coding for extracytoplasmic proteins in establishing a functional symbiosis with soy bean (G. max) was examined. Specific DNA amplification was used to verify the correct manipulation of the disrupted gene regions. Second, a strategy was developed to mutagenise the nex18 gene region. This gene region exists twice in the B. japonicum genome showing absolute sequenc homology, thus procedures previously used to mutagenise other gene regions were uneffective. To test for a substrate specificity of the three signal peptidases of B. japonicum, a third project was initiated to replace the lepB gene of E. coli by one of the B. japonicum signal peptidase genes (sipF, sipS, sipX)., Aus Vorarbeiten mit ausgesuchten rekombinanten Klonen einer E-Tag Expressionsgen-Fusionsbank gingen mehrere Genunterbrechungsmutanten von B. japonicum hervor, die einen auffälligen symbiotischen Phänotyp aufwiesen. In drei voneinander verschiedenen methodischen Ansätzen wurde die Bedeutung von Genen für extrazytoplasmatische Proteine aus B. japonicum bei der Ausbildung einer effektiven Symbiose mit der Sojabohne (Glycine max) untersucht. Zum einen wurde durch ein spezifisches DNA-Amplifikationsverfahren der Nachweis erbracht, dass die untersuchten Stämme jeweils tatsächlich die vermuteten Manipulationen der betroffenen Genregionen aufwiesen. Zum zweiten wurde in dem Sonderfall der nex18-Genregion, die im B. japonicum Genom zwei Mal in identischer Form – jedoch an verschiedenen Positionen – vorliegt, eine Mutationsstrategie mit dem Ziel entwickelt, Einzel- und Doppelmutanten zu konstruieren. Das im Wurzelknöllchen (nodule) exprimierte Gen nex18 wurde zunächst in S. meliloti identifiziert und als bedeutsam für eine effektive Symbiose beschrieben. Die flankierenden Bereiche der entsprechenden Genregionen aus B. japonicum wurden amplifiziert und mit zentralen Resistenzkassetten (SmR bzw. KmR) ausgestattet. Durch zweifache homologe Rekombination wurde der intakte ORF bll5191 durch die Streptomycin-Resistenzkassette ersetzt. Das zweite Gen (blr2474) konnte bislang nicht durch eine entsprechend vorbereitete KmR-Kassette eliminiert werden. Die Klone der E-Tag Expressionsgenbank kodieren in der Regel für Proteine mit N terminalem Signalpeptid. Da in B. japonicum drei verschiedene Signalpeptidasegene existieren und Mutationen in diesen Genen sich unterschiedlich auf die Symbioseeigenschaften auswirken, sollte die Frage untersucht werden, ob und wie eine Substratspezifität zwischen den Signalpeptidasen und den noch zu prozessierenden Vorläuferproteinen ausgeprägt ist. Um einen möglichst großen Teil der E-Tag- Fusionsproteine aus B. japonicum in E. coli testen zu können, sollten genetisch stabile und definierte Stammderivate konstruiert werden, in denen jeweils eine der drei Signalpeptidasen aus B. japonicum die singuläre Leaderpetidase von E. coli ersetzt. Obwohl durch spezifische PCR-Technik und DNA-Sequenzierung gezeigt werden konnte, dass der Genaustausch wie erwünscht erfolgt ist, beweisen DNA-Hybridisierungen und PCR-Amplifikate, dass die Stammkonstrukte weiterhin eine intakte lepB Kopie beinhalten. Ob hier eine vollständige oder partielle Duplikation des Bakterienchromosoms vorliegt, bleibt zur Klärung durch weiterführende Experimente offen.

Body weight in seasonal animals such as the Siberian hamster (Phodopus sungorus) is regulated by a complex interaction of neuropeptides in a hypothalamic network of neurons that integrates environmental photoperiod inputs. Most of these energy balance-regulating neuropeptides derive from larger biologically inactive precursors and have to undergo post-translational processing by endo- and exoproteolytic cleavage. In the current PhD thesis we investigated the effect of photoperiod on the expression of prohormone convertases 1 (PC1/3), 2 (PC2), carboxypeptidase D and E (CPD and CPE) and the proteolytic processing of the neuropeptide precursor pro-opiomelanocortin (POMC) within key energy balance regulating centres of the hypothalamus. We compared mRNA levels and protein distribution of the enzymes PC1/3, PC2, CPD and CPE and the neuropeptide precursor POMC and its derived peptides ACTH, a-MSH and ß-endorphin in selected hypothalamic areas of either long day (LD, 16h light: 8h dark) or short day (SD, 8h light: 16h dark) acclimated Siberian hamsters. Messenger RNA and immunoreactivity of PC1/3 enzyme and neuropeptides cleaved by PC1/3 such as ACTH in the ARC, and orexin A in the LH, were not affected by photoperiod changes. In contrast increased levels of PC2 mRNA and protein were associated with a higher abundance of the mature neuropeptides a-MSH and ß-endorphin in SD. CPE immunoreactivity was increased in SD and after leptin injection suggesting increased terminal activation of neuropeptides subsequent to processing by PC2. The photoperiod-driven regulatory mechanism by differential activity of the major neuroendocrine enzymes on a posttranslational level observed in this study could be an additional universal control point for selective maturation of energy balance related neuropeptides., Das Körpergewicht saisonaler Säugetiere, wie des Djungarischen Zwerghamsters, zeigt einen ausgeprägten photoperiodisch abhängigen Jahresrhythmus welcher über ein komplexes neuronales Netzwerk reguliert wird. Die hauptsächlich im Hypothalamus lokalisierten Regelkreisläufe, welche Informationen über die vorherrschende Photoperiode (Verhältnis von Hell/Dunkel) und die Verfügbarkeit von körpereigenen Energiereserven (z.B. durch das im Fettgewebe synthetisierte Hormon Leptin) integrieren, verrechnen diese Informationen mit Hilfe orektisch und anorektisch wirkender Neuropeptide. Ein Großteil dieser Neuropeptide liegt jedoch zunächst in Form inaktiver Vorläuferpeptide vor und muss eine Reihe post-translationaler Modifizierungen durch endo- und exoproteolytisch schneidende Enzyme durchlaufen, bevor die letztendlich bioaktiven Neuropeptide entstehen. In dieser Studie untersuchten wir den Effekt der Photoperiode auf die Expression der Prohormonkonvertasen 1/3 und 2 (PC1/3, PC2), sowie der Carboxypeptidasen D und E (CPD, CPE) und ihren Einfluss auf die Prozessierung Energiemetabolismus regulierender Neuropeptidvorläufer, wie Pro-opiomelanocortin (POMC). Messenger-RNA und Immunoreaktivität (-ir) des Enzymes PC1/3 und der durch PC1/3 generierten Neuropeptide ACTH und Orexin-A waren nicht von den photoperiodische Veränderungen beeinflusst. Im Gegensatz dazu resultierte aus einer Verkürzung der Lichtperiode (Kurztag, 8h Licht : 16h Dunkel) gesteigerte PC2-ir, welche mit erhöhter ir der POMC Produkte a-MSH and ß-Endorphin einherging. Unsere Ergebnisse demonstrieren, dass die Reifung biologisch aktiver Neuropeptide in P. sungorus selektiv durch die Aktivität der hormonprozessierenden Enzyme PC1/3, PC2 und CPE auf post-translationaler Ebene reguliert wird. Dieser Prozess ist photoperiodisch gesteuert und stellt somit, neben der Genexpressionsregulation auf transkriptioneller Ebene des Vorläuferpeptids selbst, eine weitere Kontrollinstanz bei der Regulation der Proteinbiosynthese von Neuropeptiden dar.

In this thesis it is demonstrated that furin is required for constitutive processing of RPTPk within the secretory pathway. We next showed that k is specifically targeted by two additional cleavages that we named S2 and S3 to specify the result of processing at sites 2 and 3, sites downstream of S1. Processing at S2 is mediated by metalloproteases and results in RPTPk shedding. It was found to be promoted by cell density and phenothiazine exposure and k’s extracellular subunit was required for shedding induced by both stimuli. Moreover, conditions that blocked the functionality of caveolae-dependent receptor internalisation into endocytic compartments diminished S2 cleavage, indicating that it proceeds in the course of internalisation via caveolae. In addition, Presenilin 1 was shown to further cleave P2, the product of S2 processing, thereby generating the cytoplasmic k isoform P3, accumulation of which is diminished by more than 90% in 10 out of 25 primary human kidney tumors. Plasminogen was identified as RPTPkMAM domain binding protein. Binding studies performed with kMAM derived peptide libraries demonstrated that Plasminogen targets the palindromic sequence DFSYLLYSQK and substitutional analysis revealed that the residues D, Y, Y and K are involved in binding. Similar motifes were identified in proteins derived from pathogenic bacteria. In der vorliegenden Arbeit wurde gezeigt, dass die konstitutive proteolytische Prozessierung der RPTPk durch die Protein Convertase Furin erfolgt. Es wurden weitere, spezifische Prozessierungen der RPTPk identifiziert, die als S2- und S3- Spaltungen bezeichnet wurden. Die S2-Prozessierung erfolgt durch Metalloproteasen und resultiert in der Freisetzung des extrazellulären Fragments in das Zellmedium. Als Stimuli dieser Prozessierung konnten hohe Zelldichten und Phenothiazine identifiziert werden. Für die Induktion der S2-Spaltung durch beide Stimuli ist das Vorhandensein des RPTPk extrazellulären Fragments notwendig. Ein zweiter, notwendinger Faktor ist die Funktionalität von Endozytose-Prozessen die von Caveolae (Cholesterol-reiche Membranareale) abhängig sind. Das S2-Spaltprodukt P2 wird durch Presenilin-1 weiter prozessiert (S3), was schliesslich zur Freisetzung der cytoplasmatischen k-Isoform P3 führt, deren Akkumulierung in 10 von 25 primären, humanen Nierentumoren um mehr als 90% verringert ist. Plasminogen wurde als ein mit der MAM-Domäne der RPTPk interagierendes Protein identifiziert. Plasminogen bindet an die palindromische Sequenz DFSYLLYSQK und die Aminosäurereste D, Y, Y und K sind direkt in die Interaktion involviert. Ähnliche Sequenzmotive konnten in Proteinen von pathogenen Bakterien identifiziert werden.

Mit DMIF1 wurde erstmals in Dictyostelium ein zur Familie der mitochondrialen F1F0-ATPase-Inhibitoren zählendes Homolog gefunden. Diese verhindern die letale ATP-Verarmung durch Hemmung der ATP-Hydrolyse, der Umkehrreaktion der ATP-Synthase, die bei Zusammenbruch des Membranpotentials abläuft. Das helicale, hochgeladene DMIF1-Monomer hat eine N-terminale Targeting-Domäne, die den Transfer des im Zytoplasma gebildeten Precursors in die Mitochondrien bewirkt, wo das reife Protein durch Abspalten der Domäne nach einem modifizierten R-2-Motiv durch die Protease MPP entsteht. Sterische Störung der Targeting-Domäne durch die Fusion an GFP führt zum Transfer in die pericentrosomale Region, wo das ungefaltete Protein in Aggresomen degradiert wird. Die C-terminale Coiled coil-Domäne dient potentiell der Assemblierung zum inhibitorisch aktiven Dimer, helicale Bereiche der inhibitorischen Region zur Bildung des inaktiven Tetramers. Gemäß Restriktions- und Sequenzanalyse-Daten ist ein bisher nicht charakterisiertes homologes Protein DMIF2 wahrscheinlich. The DMIF1 protein found in Dictyostelium is homologous to members of the F1F0-ATPase inhibitory protein family. Those inhibitors protect cells from uncontrolled ATP hydrolysis and thus from letal ATP deprivation. Activation of the hydrolysis pathway, the reversed function of F1F0, is caused by membrane potential breakdown. The helical, highly charged DMIF1 protein monomer contains an N-terminal targeting domain to transfer the precursor, synthesized in the cytoplasm, to mitochondria. In the matrix the targeting domain is cleaved off by a mitochondrial protease MPP following an R-2 processing motif. Sterical blocking of the targeting domain by the reporter protein GFP fused to DMIF1 N-terminus targets the protein to aggresomes in the pericentrosomal region, where the unfolded protein is degradated. The inhibitory active homodimer is built by mutual interaction of the C-terminal Coiled-coil domain, whereas a helical part of the inhibitory do-main serves as an interaction region to assemble the inactive homotetramer. According first data from re-striction enzyme digestion experiments and DNA sequence analysis a putative inhibitory protein DMIF2, homologous to DMIF1, is presumed.

The development of analytical methods, suitable for the detection and quantification of GMO contents in agricultural commodities and processed products is essential to support the control of compliance with regulatory provisions concerning the use of GMO and GMO-derived material for the production of food and feed. DNA-based assays for the detection of GMO within the food and feed chain must cope with a number of challenges that are linked either to the background of the genetic modification and the genetic composition of the GMO, or to adverse effects of technological parameters and manufacturing practices on the availability of target sequences. Among the latter, limitations are mainly given by the complexity of food composition and by the degradation/elimination of analytes during manufacturing processes. In the presented studies the effects of food processing on the quantification of GMO contents were investigated. In addition to the assessment of established PCR-based technologies for the quantification of DNA sequences, an alternative ligation-dependent modular system for the qualitative and quantitative detection of GMO in composed and processed food products was developed. Die Entwicklung analytischer Methoden zur Detektion und Quantifizierung gentechnisch veränderter Organismen (GVO) in landwirtschaftlichen Rohstoffen und ihren Verarbeitungsprodukten ist ein wesentlicher Bestandteil von Maßnahmen zur Kontrolle der Kennzeichnung von Lebens- und Futtermitteln, die unter Verwendung von GVO oder daraus hergestellten Materialien gewonnen wurden. DNA-basierende Methoden zum Nachweis von GVO in der Lebens- und Futtermittelkette müssen eine Reihe analytischer Herausforderungen erfüllen; diese können sich sowohl aus den Hintergründen der gentechnischen Veränderung und der genetischen Zusammensetzung unterschiedlicher GVO-Linien als auch aus negativen Effekten lebensmitteltechnologischer Prozesse auf die Verfügbarkeit von DNA ergeben. Limitierungen im Hinblick auf die Analytik prozessierter Lebens- und Futtermittel ergeben sich hauptsächlich durch die Komplexität der Produktzusammensetzungen sowie durch die Degradierung/Eliminierung von Analyten im Laufe unterschiedlicher Verarbeitungsprozesse. In der vorliegenden Arbeit wurden Effekte lebensmitteltechnologischer Verfahren auf die Bestimmung von GVO-Anteilen untersucht. Dabei wurden zunächst etablierte PCR-Technologien zur Quantifizierung von DNA Sequenzen eingesetzt. Darüber hinaus wurde ein alternatives System auf der Basis einer modularen ligationsabhängigen Reaktion entwickelt, welches für den qualitativen und quantitativen Nachweis von GVO in zusammengesetzten und prozessierten Lebensmitteln eingesetzt werden kann.

Das Proteasom spielt eine zentrale Rolle beim Proteinabbau und der Antigen-Generierung für die adaptive Immunantwort. Vertebraten exprimieren zwei Typen des proteolytischen 20S-Kernkomplexes: das konstitutive c20S (mit den aktiven Untereinheiten beta 1, 2, 5) und das Immunoproteasom i20S (mit den Immunountereinheiten LMP2, MECL-1, LMP7). Die i20S-Expression wird durch Interferon_gamma (IFNg) induziert, was die Antigen-Präsentation auf MHC Klasse I und die Immunantwort gegen infizierte bzw. maligne entartete Zellen durch cytotoxische T-Zellen steigert. Proteasomen werden über komplexe, bisher unvollständig verstandene Biogenese-Prozesse formiert. Die initialen Schritte der humanen 20S-Formation wurden in dieser Arbeit untersucht und eine Methode zur Isolation früher Assemblierungsintermediate (EPIs) etabliert. Die 20S-Biogenese bedarf der Assistenz von Hilfsfaktoren wie dem Proteasom-Maturierungsprotein POMP. Diese Komponente von Precursorkomplexen stellt das erste Substrat gereifter c20S dar. In dieser Arbeit konnte erstmalig gezeigt werden, dass POMP ebenfalls die i20S-Formation vermittelt und sich die Biogenese von c20S und i20S hinsichtlich der Maturierungskinetik unterscheidet. POMP wird durch IFNg induziert und interagiert mit der Immunountereinheit LMP7. Dieses molekulare Zusammenspiel bewirkt eine schnellere Maturierung von i20S- im Vergleich zu c20S- Precursorkomplexen, wodurch POMP einem schnelleren Abbau unterliegt. Die forcierte i20S-Biogenese ist eine intrinsische Eigenschaft und unabhängig von weiteren, IFNg-induzierten Faktoren. Nur die LMP7_E2-Variante vermittelt die schnelle Degradation von POMP, während das nicht funktionelle LMP7_E1 mit einer anderen Prosequenz nicht in i20S-Vorläufer inkorporiert wird. Somit führt die alleinige LMP7_E1-Expression in IFNg-stimulierten Carcinom-Zellen zu einer i20S-Defizienz, was eine mögliche Immunevasions-Strategie darstellt. Weiterhin besitzen beide 20S-Typen unterschiedliche Halbwertszeiten: i20S sind, unabhängig von weiteren IFNg-induzierten Proteinen, signifikant instabiler als c20S. Somit werden i20S sowohl schneller formiert als auch zügiger wieder abgebaut als c20S, womit sie typische Eigenschaften cytokin-regulierter Proteine aufweisen. Die i20S-Formation ist also eine transiente Antwort und stellt ein effizientes Instrument zur schnellen Reaktion auf immunologische Herausforderungen wie z.B. eine Infektion dar. Nach einer wirksamen Immunantwort erlaubt die geringere i20S-Stabilität eine schnelle Rückkehr zur standardmäßigen c20S-Expression. The proteasome plays a crucial role in protein degradation and antigen generation for the adaptive immune response. Vertebrates express two types of the proteolytic 20S core complex: the constitutive proteasome c20S (with the active subunits beta 1, 2 and 5) and the immunoproteasome i20S (with the immunosubunits LMP2, MECL-1 and LMP7). Interferon_gamma (IFNg) induces the i20S expression, that supports a more efficient MHC class I antigen presentation and an effective immune response against infected or malignant cells by cytotoxic T-cells. Proteasomes are formed by a complex and not well understood biogenesis program. The initial steps in the human 20S formation have been analyzed in this thesis and a method for the isolation of ´early proteasome assembly intermediates´ (EPIs) has been established. The 20S biogenesis requires the assistance of accessory factors like the proteasome maturation protein POMP. This component of precursor complexes becomes the first substrate of the matured c20S. The described experiments demonstrate for the first time that POMP mediates the i20S formation and that biogenesis of c20S and i20S differ in their maturation kinetics. POMP is induced by IFNg and interacts with the immunosubunit LMP7. This molecular interplay provokes a faster maturation of i20S compared to c20S precursor complexes, whereby POMP becomes subject to a faster degradation. The accelerated i20S biogenesis is an intrinsic characteristic and independent of additional IFNg-induced factors. Exclusively the LMP7_E2 variant causes the rapid degradation of POMP, whereas the non-functional LMP7_E1 bearing another prosequence is not incorporated into i20S precursor complexes. Thus, LMP7_E1 expression in IFNg-stimulated carcinoma cells leads to a i20S deficiency pointing out a possible immune evasion strategy. In addition, both 20S types display different half-life values: i20S are, independent of other IFNg-induced proteins, significantly less stable than c20S. Thus, i20S are not only faster assembled, but also more quickly decomposed compared to c20S, showing typical attributes of proteins regulated by cytokines. Consequently, i20S formation is a transient response and represents an efficient instrument for a rapid adjustment to varying immunological challenges like an infection. Once the immune response has been effective, the lower stability of i20S permits an expeditious return to the standard c20S expression.

Im Rahmen dieser Arbeit wurde die \(\it trans\)-Spleißmutante TR72 der einzelligen Grünalge \(\textit {Chlamydomonas reinhardtii}\) charakterisiert. Ausgehend von einem Cosmid-Klon wurde durch Subklonierungen zwei benachbarte Gene, \(\it Rat1\) und \(\it Rat2\), identifiziert, welche zusammen den Mutanten-Phänotyp komplementieren. Die Expression des \(\it Rat1\)-Gens wurde mit Hilfe von Primer-Extension-Analysen und RT-PCR untersucht. Ausgehend von der cDNA-Sequenz des \(\it Rat1\)-Gens wurden in der abgeleiteten Aminosäuresequenz des Polypeptids Homologien zu einer NAD\(^{+}\)-Bindedomäne nachgewiesen. Eine funktionelle Charakterisierung dieser Domäne wurde mittels ortsgerichteter Mutagenesen durchgeführt. Durch Epitop-Tagging und Western-Analysen konnte die plastidäre Lokalisation des \(\it Rat1\)-Polypeptides nachgewiesen werden. Ektopische Effekte der Mutation in TR72 auf die Genexpression des Zellkerns wurden mit Hilfe der DNA-Macroarray-Technik untersucht.

Zahlreiche Transmembranproteine existieren auch als lösliche Fragmente, die durch regulierte Prozessierung der extrazellulären Domäne dieser Moleküle entstehen. Auch für die Zelladhäsionsmoleküle NCAM und L1, die in zahlreiche essentielle Funktionen des sich entwickelnden sowie adulten Nervensystems involviert sind, wurde das Vorkommen löslicher Fragmente bestätigt. Die Entstehung löslicher Fragmente des Zelladhäsionsmoleküls NCAM mit einem Molekulargewicht von 110 kDa - 190 kDa konnte bisher nur partiell aufgeklärt werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Hypothese bestätigt, dass lösliche Fragmente des Moleküls NCAM durch regulierte Prozessierung der extrazellulären Domäne entstehen. Die Metalloprotease ADAM17 / TACE ist in der Lage, die membranständigen Isoformen NCAM140 und NCAM180 in der Nähe des Membranankers zu spalten und in Abhängigkeit des Glykosylierungsmusters des Proteins, Fragmente mit einem Molekulargewicht von 110 kDa und größer von der Membran zu lösen. Die Spaltung der extrazellulären Domäne des GPI-verankerten NCAM120 basiert dagegen auf einem anderen Mechanismus. Der Metalloproteaseinhibitor GM 6001 zeigt einen inhibitorischen Effekt auf die Freisetzung von löslichen NCAM-Fragmenten. Der darüber hinaus negative Effekt des Metalloproteaseinhibitors auf das NCAM-abhängige Neuritenwachstum, weist auf eine bedeutende funktionelle Rolle der regulierten Prozessierung des Proteins NCAM hin, die unter anderem durch Modulationen des Aktinzytoskeletts reguliert wird. Auch der Calmodulininhibitor CGS 9343 B, der die Freisetzung löslicher NCAM-Fragmente stimuliert, zeigt einen inhibitorischen Effekt auf den Prozess des NCAM-vermittelten Neuritenwachstums. Ob der durch Calmodulin vermittelte Einfluss auf das NCAMabhängige Neuritenwachstum auf einer direkten Interaktion mit seinem Bindungspartner NCAM basiert, bleibt zu klären. Zusätzlich zu der membrangebundenen 200 kDa Form des L1-Moleküls können auch lösliche L1-Fragmente nachgewiesen werden, die durch regulierte Prozessierung der extrazellulären Domäne des Moleküls entstehen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass an der Spaltung des Moleküls L1 in der dritten Fibronektindomäne und der Freisetzung des löslichen Fragmentes L1-140 die Prohormonkonvertase PC5A beteiligt ist. Eine Beteiligung der Prohormonkonvertasen Furin, PC1, PC2, PACE4 und PC7 an der Prozessierung von L1 kann ausgeschlossen werden. Das Fragment L1-140 ist im Hippocampus, jedoch nicht im Kleinhirn nachweisbar, was basierend auf dem Expressionsmuster der Konvertase PC5A die Verantwortlichkeit der Protease für die Prozessierung von L1 bestätigt. Das Fragment L1-140 verbleibt nach seiner Entstehung durch die Ausbildung eines Heterodimers mit einem membranständigen L1-200 membranassoziiert und wird erst durch die Spaltung seines Interaktionspartners von der Membran gelöst. Dies führt zu einer Dissoziation des Komplexes und zu der Freisetzung der löslichen Fragmente L1-180 und L1-140. Für die Spaltung der extrazellulären Domäne des Moleküls L1 in der Nähe des Membranankers, die durch den Kalziumsensor Calmodulin negativ beeinflusst wird, ist eine Metalloprotease verantwortlich. Der Einfluss des Metalloproteaseinhibitors GM 6001 auf das L1-vermittelte Neuritenwachstum weist auf eine bedeutende Rolle des Ectodomain Sheddings des Moleküls für das L1-vermittelte Neuritenwachstum hin. Im Rahmen dieser Studie wurden darüber hinaus weitere lösliche Fragmente des Moleküls L1 nachgewiesen, die auf zusätzliche Schnittstellen in der extrazellulären Domäne von L1 hinweisen. Die Metalloprotease MMP9 scheint an der Prozessierung und Freisetzung dieser Fragmente beteiligt zu sein. Zahlreiche Transmembranproteine werden zusätzlich zu einer Proteolyse der extrazellulären Domäne in ihrer Transmembrandomäne gespalten. Die Voraussetzung für diesen Prozess ist die Abspaltung der extrazellulären Domäne eines Moleküls durch regulierte Prozessierung eines Proteins in der Nähe des Membranankers. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass ein lösliches L1-Fragment von 15 kDa durch eine Spaltung in der Transmembrandomäne von der Plasmamembran gelöst und in den Zellkern transportiert wird. Die Funktion des zytoplasmatischen L1-Fragmentes im Zellkern und eine mögliche Beteiligung an der Regulation der Transkription von Genen sind Fragen, die zu klären bleiben., A variety of different membrane proteins also occur as a circulating, soluble form. These soluble forms are often derived from the membrane forms by proteolysis. Different soluble fragments of the transmembrane and multidomain neural cell adhesion molecules NCAM and L1 playing important functional roles in the developing and adult nervous system have been detected. The mechanism of generation of soluble NCAM fragments with a molecular range of 110 kDa to 190 kDa is poorly understood. In this study, evidence was presented that a metalloprotease is able to solubilize NCAM fragments via proteolytic processing. A member of the ADAM family of metalloproteases, the TNFa converting enzyme (TACE) cleaves the NCAM isoforms NCAM140 and NCAM180 near their membrane anchors resulting in the release of soluble NCAM fragments with a molecular weight of 110 kDa and higher depending on the glycosylation state of the extracellular domain of NCAM. The extracellular domain of the GPI-linked isoform NCAM120 is liberated from the membrane via a different mechanism. The metalloprotease inhibitor GM 6001 reduces the release of soluble NCAM fragments. Its inhibitory effect on NCAM dependent neurite outgrowth of cerebellar explants indicates that the proteolytic processing of NCAM plays an important role for NCAM dependent neurite outgrowth. Further evidence for an essential role of the ectodomain shedding of NCAM for the process of NCAM dependent neurite outgrowth was obtained in experiments showing that the calmodulin inhibitor CGS 9343 B which is able to stimulate the cleavage of membrane bound NCAM isoforms, inhibits NCAM dependent neurite outgrowth. Whether the effect of calmodulin on NCAM dependent neurite outgrowth is mediated via a direct interaction with its binding partner NCAM remains to be clarified. The cell adhesion molecule L1 is proteolytically processed at two distinct sites within the extracellular domain, leading to the generation of different soluble fragments. Evidence was presented that the proprotein convertase PC5A is the protease that cleaves L1 in the third fibronectin type III domain, whereas the proprotein convertases furin, PC1, PC2, PACE4, and PC7 are not effective in cleaving L1. This fragment was present in the hippocampus, which expresses PC5A, but was not detectable in the cerebellum, which does not express PC5A. The 140 kDa L1 fragment was found to be tightly associated with the full-length 200 kDa L1 molecule. The complex dissociated from the membrane upon cleavage by a protease acting at a more membrane-proximal site of full-length L1. This proteolytic cleavage was inhibited by the metalloprotease inhibitor GM 6001 and enhanced by a calmodulin inhibitor. L1-dependent neurite outgrowth of cerebellar neurons was inhibited by GM 6001, suggesting that proteolytic processing of L1 by a metalloprotease is involved in neurite outgrowth. In this study, it was shown that L1 is processed at further proteolytic cleavage sites in its extracellular domain resulting in the release of additional soluble fragments. The metalloprotease MMP9 seems to be one the responsible proteases involved in this process. A lot of transmembrane proteins were identified to be additionally cleaved within their transmembrane domains. The ectodomain shedding of the extracellular domain is the initial step for regulated intramembranous proteolysis. A 15 kDa fragment recognized by an antibody directed against the intracellular domain of L1 is released from the plasma membrane into the cytoplasm via proteolysis and transported to the nucleus. The question whether the intracellular domain of L1 located in the nucleus is involved in regulation of gene transcription is currently under investigation.

Zur Analyse der an der RNA-Edierung pflanzlicher mitochondrialer Transkripte beteiligten cis-Faktoren wurde in der vorliegenden Arbeit ein in vitro Elektroporations- und in organello Expressions-System für Mitochondrien von Zea mays etabliert. Mittels Elektroporation konnte Plasmid-DNA in die isolierten Organellen in Abhängigkeit von der Feldstärke und Größe der Plasmide eingebracht werden. Darüber hinaus waren die Mitochondrien bei Inkubation in einem speziellen in organello Puffer in der Lage, die Transkription endogener wie auch eingebrachter Fremdgene (Arabidopsis thaliana cox2, Sorghum bicolor atp6-1, atp9) aufrecht zu erhalten. Sowohl die mRNA endogener Gene, als auch die des cox2 Fremdgens wurden in organello vollständig prozessiert. Dem gegenüber wurden die Transkripte des atp6-1 Fremdgens nicht bzw. die des atp9 Gens nur partiell ediert vorgefunden.

In this dissertation several aspects of polymer based gene delivery were investigated. First, key issues in subcellular processing of electrostatic polymer/nucleic acid complexes were investigated and new insights into mechanisms involved in these processes were gained. Secondly, a targeted gene delivery system was developed for the specific transfection of ovarian carcinoma cells. The resulting vector exhibited a high specificity for target cells combined with low unspecific transfection and toxicity. Furthermore, a novel type of gene delivery system was synthesized. This vector exhibited a high in vitro transfection efficiency and a very low in vitro toxicity as well as favourable in vivo properties, such as reduced toxicities. Another aspect that was studied in depth was the investigation of the stability of several electrostatic vectors in vitro and when applied intravenously., In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Aspekte des polymerbasierten Gentransfers eingehend untersucht. Zunächst wurden Schlüsselereignisse der subzellulären Prozessierung von elektrostatischen Polymer/Nukleinsäure-Komplexen erforscht und neue Erkenntnisse über Mechanismen, insbesondere von zellulärer Aufnahme und subzellulärer Freisetzung aufgedeckt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Entwicklung eines zielgerichteten Gentransfersystems für die selektive Transfektion von Ovarialkarzinomzellen. Das resultierende Vektorkonstrukt zeigte bei sehr geringer unspezifischer Transfektion und Toxizität eine sehr hohe Spezifität für Zielzellen. Da eine intravenöse Anwendbarkeit von Gentransfersystemen von großer Wichtigkeit ist, wurde die Stabilität elektrostatischer Vektoren in vitro und in vivo untersucht. Weiterhin war die Entwicklung einer neuen Klasse von Transfektionsagentien Gegenstand dieser Arbeit. Diese Systeme weisen eine hohe in vitro Transfektionseffizienz kombiniert mit einer sehr niedrigen Toxizität auf. Außerdem zeigten sie nach intravenöser Gabe eine verlängerte Zirkulationszeit im Blut.In der vorliegenden Dissertation wurden verschiedene Aspekte des polymerbasierten Gentransfers eingehend untersucht. Zunächst wurden Schlüsselereignisse der subzellulären Prozessierung von elektrostatischen Polymer/Nukleinsäure-Komplexen erforscht und neue Erkenntnisse über Mechanismen, insbesondere von zellulärer Aufnahme und subzellulärer Freisetzung aufgedeckt. Ein weiterer Schwerpunkt lag auf der Entwicklung eines zielgerichteten Gentransfersystems für die selektive Transfektion von Ovarialkarzinomzellen. Das resultierende Vektorkonstrukt zeigte bei sehr geringer unspezifischer Transfektion und Toxizität eine sehr hohe Spezifität für Zielzellen. Da eine intravenöse Anwendbarkeit von Gentransfersystemen von großer Wichtigkeit ist, wurde die Stabilität elektrostatischer Vektoren in vitro und in vivo untersucht. Weiterhin war die Entwicklung einer neuen Klasse von Transfektionsagentien Gegenstand dieser Arbeit. Diese Systeme weisen eine hohe in vitro Transfektionseffizienz kombiniert mit einer sehr niedrigen Toxizität auf. Außerdem zeigten sie nach intravenöser Gabe eine verlängerte Zirkulationszeit im Blut.

The worldwide increase in solar cell production may lead to a shortage of silicon material in the foreseeable future. To overcome this problem, new silicon wafer materials with potentially lower production costs and material losses have been developed. Two of these materials are RGS (Ribbon Growth on Substrate)- and Tri-silicon. This thesis addresses the development of solar cell processes optimised to the specific properties of these two silicon materials. In addition to the development of the solar cell processes, a detailed analysis of the specific properties of both materials is presented.Firstly, a cell process is defined that uses simple process sequences but nevertheless has an eye on high efficiencies. This standard process is then used as a basis for optimisations on the specific properties of both materials. Furthermore, additional process steps and all characterisation methods used in this work are explained briefly.Due to the importance of hydrogen passivation for RGS-silicon, several parameters of an already existing microwave induced remote hydrogen plasma (MIRHP) passivation system are optimised. Theoretical considerations concerning the concentration profile of atomic hydrogen in the reactor show good agreement with experimental results. In addition, the identification of the appropriate distance between plasma and sample and different gas compositions are studied.The first material examined in detail is RGS-silicon. SIMS measurements show the concentration profile of deuteron after MIRDP passivation. Comparing the results with theoretical models leads to the conclusion that the effective diffusion of hydrogen (deuteron) is a combination of Fickian diffusion and hindered diffusion (multiple trapping).To reveal the influence of the high defect density in RGS-silicon on minority charge carriers, a new technique is developed to determine the mobilities of the minorities in silicon materials with low diffusion lengths. The mobilities are shown to be reduced by a factor of 2-3 compared to CZ silicon.By implementing the H-passivation and a front surface texturing in the solar cell process and by depositing a double antireflection coating (DARC) on the front surface, a new record efficiency of 13.2% was obtained for a 4 cm² solar cell. This is the first time ever that an efficiency over 13% was achieved with RGS-silicon material.The second material dealt with in this thesis is Tri-silicon (Tri-Si). A breakage experiment is designed and reveals a higher stability as well as a higher stiffness for Tri-Si compared to CZ silicon, so that thinner wafers can be used for solar cell production without losses in yield. However, after applying an acidic front surface texturing this advantage vanishes.Before optimising the cell process for Tri-Si, simulations are performed that demonstrate a high dependency of the efficiency of a Tri-Si solar cell on the recombination rate at the back surface. Therefore, an aluminium back surface field is implemented, based on screen printed aluminium used in industrial processes rather than evaporated aluminium used in the standard process. Additionally, the galvanisation of the front grid and a front surface texture are implemented in the cell process. After applying a DARC, record efficiencies of 18.8% with a cell area of 4 cm² were reached.

Die Aufreinigung der RNase P, des 5(Strich)-prozessierenden Enzyms der tRNA-Reifung, wurde ausgehend vom schon bestehenden Schema der partiellen Aufreinigung (Marchfelder und Brennicke 1994) fortgesetzt. Die Salzfällung kombiniert mit der hydrophoben Wechselwirkungschromatographie führt zur Abtrennung eines großen Teils des Proteins. Dabei wird ein Protein P80 (ca. 80 kd) angereichert, das im Vergleich mit den Proteingelen anderer Reinigungsschritte jedoch nicht eindeutig mit der Aktivität korreliert. Bei der Gelfiltration eluiert die RNase P im Bereich von 90 kd. Bei Auftrag einer größeren Proteinmenge ließ sich die Aktivität auch in Fraktionen mit höherer Molekülgröße beobachten. Diese Streuung der RNase P ist ein Problem der Trennung nach Größe und Form, aber auch bei adsorptiven Reinigungsschritten wie der Bluesäule. Durch die Chromatofokussierung läßt sich der pI der RNase P mit den diskutierten Einschränkungen im Bereich von pH 8-9 festlegen. Die Identifizierung des Gens durch die Hybridisierung gegen das sequenzierte Chondriom von Arabidopsis thaliana ist an dem hohen Gehalt an verschiedenen RNAs gescheitert. tRNAs und sogar mRNAs sind möglicherweise an Ribosomen gebunden über Anionen- und Kationenaustauscher mit aufgereinigt worden und ihre Hybridisierungssignale machen es unmöglich, das Fragment mit der RNase P RNA zu identifizieren. Die Mitaufreinigung von vermutlich vor allem ribosomaler RNA aller Größen hat auch die Direktsequenzierung der RNA-Untereinheit der RNase P vereitelt. In den aus den Gelen für die Sequenzierung eluierten Banden ist ein Gemisch verschiedener RNAs enthalten, die das Auslesen einer Sequenz unmöglich macht. Die Mitaufreinigung der ribosomalen RNAs erschwert es, das Gen der RNase P RNA durch Koloniehybridisierung zu identifzieren, weil dabei zu erwarten wäre, daß vor allem Klone mit den Genen dieser RNAs identifiziert werden. Aus diesem Grund wurde geprüft, ob diese Signale durch den Einsatz von Nukleinsäuren mit ribosomalen Sequenzen unterdrückt werden können. Für die 18S rRNA wurde gezeigt, daß der Einsatz unmarkierter RNA am besten geeignet ist und so wurden die rRNAs von PCR-Fragmenten transkribiert, um in weiteren Experimenten zur Abdeckung der entsprechenden Gene eingesetzt zu werden.

Mit der Entwicklung des internationalen Datennetzes ist eine vitale Debatte um den 'Computer als Medium' entstanden. In der Presse, im Netz selbst und an den Hochschulen wird die Frage diskutiert, was die Kennzeichen und Eigenschaften des neuen Mediums sind; und es erweist sich, daß der etablierte Medienbegriff den neuen Gegenstand nur sehr unzulänglich beschreibt. Die zweite Frage, damit eng verbunden, ist eine mediengeschichtliche: auf welche Weise nämlich schließt das neue Medium an die bestehenden Medien an? Das vorliegende Buch geht davon aus, daß sich gegenwärtig ein tiefgreifender mediengeschichtlicher Umbruch ereignet. Eine Öffentlichkeit, die auf die technischen Bilder (Photographie, Film und Fernsehen) geradezu eingeschworen schien, scheint nun das gesamte Paradigma fallenzulassen und sich einer völlig neuen Medienkonstellation zuzuwenden. Warum aber findet dieser Umbruch statt? Was ist es, das einen so grundsätzlichen Wechsel offensichtlich erzwingt? Der Text stellt die These auf, daß es weniger die Realitäten als bestimmte 'Wünsche' sind, die das neue Medium tragen. Diese Wünsche werden zugänglich, sobald man den Begleitdiskurs analysiert, den die gegenwärtige Implementierungswelle ausgelöst hat. Eigentümlich vorschnell und affirmativ wird dort als 'Möglichkeiten' diskutiert, was, kritischer gelesen, den Durchblick auf bestimmte Wünsche zuläßt; und zwar sehr allgemeine Wünsche, die sich in ähnlicher Weise auch schon an andere Medien gerichtet haben: das enzyklopädische Ideal, das gesamte Weltwissen an einem Ort zu versammeln, der Wunsch, ein 'Tableau', d.h. eine einheitliche Sphäre des Symbolischen zu errichten, das Erschrecken vor der Arbitrarität der Zeichen, und der Wunsch, dem Wuchern der 'natürlichen Sprachen' die Luzidität und Transparenz einer Universalsprache entgegenzusetzen. Auf dieser sehr allgemeinen Ebene lassen sich Kontinuitäten zeigen, die sehr unterschiedliche historische Medienkonstellationen miteinander verbinden. Und gleichzeitig scheinen in der Entwicklung der bisherigen Medien spezifische Probleme entstanden zu sein, die das Datenuniversum mit seinen Mitteln zu lösen verspricht; erst die Defizite der etablierten Medien, so könnte man sagen, schaffen die Lücke, in die das neue Medium eintritt.