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Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto-Silva Tese (doutorado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Neurociência e Cognição, Santo André, 2018. Os Peptídeos Potenciadores de Bradicinina (BPPs) são oligopeptídeos presentes na fração de baixo peso molecular (FBP) do veneno da serpente Bothrops jararaca (Bj). Estes peptídeos são descritos como inibidores naturais da Enzima Conversora de Angiotensina. Porém, eles também alteram a atividade catalítica e a expressão da argininosuccinato sintetase (AsS), favorecendo a síntese de Larginina. Este aminoácido participa de várias vias metabólicas importantes, incluindo a formação de poliaminas e agmatina com atividade neuroprotetora amplamente descrita. Além disso, FBP apresenta atividade neuroprotetora contra o estresse oxidativo induzido em cultura de células do hipocampo de ratos. Com isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar a possível atividade neuroprotetora da FBP e BPPs sintéticos contra o estresse oxidativo induzido por H2O2 em cultura de células humanas de linhagem SH-SY5Y. A citotoxicidade do veneno bruto (VB), FBP (0,001 ¿ 10 µg/mL) e BPPs [BPP-5a; BPP-7a; BPP-10c; BPP-11e, BPP-12b e BPP-AP (0,1 ¿ 10 µM)] por 3, 6, 12, 24 e 48 h foi avaliada pelo teste de MTT. Para os ensaios de neuroproteção, a cultura de células foi previamente tratada com BPPs (1 µM) ou FBP (0,1 µg/mL) por 4 horas. Em seguida, foi adicionado H2O2 450 µM para indução do estresse oxidativo. Após 20 horas, foram realizados os ensaios de viabilidade celular. Os resultados indicaram que todos os BPPs, com exceção da FBP, foram neuroprotetores. Em especial, os peptídeos BPP-5a, BPP-7a e BPP-10c foram os mais eficientes. Os mecanismos envolvidos na neuroproteção foram avaliados pela análise das espécies reativas de oxigênio (EROs ¿ DCFH), peroxidação lipídica (TBARS), expressão da AsS e iNOS, níveis de nitrito (Griess) e o potencial de membrana mitocondrial (TMRM). Os três peptídeos reduziram a geração de EROs, síntese de NO, expressão de NF-?B e a peroxidação lipídica. Entretanto, apenas o BPP-10c aumentou os níveis de expressão da AsS. Este resultado sugere que o aumento da disponibilidade de L-arginina pode estar relacionado com o seu efeito neuroprotetor. Ainda, o BPP-10c e BPP-5a reduziram as alterações no potencial de membrana mitocondrial frente ao estresse oxidativo, um importante mecanismo na neuroproteção. Curiosamente, o BPP-7a na presença do H2O2 não reduziu a síntese de NO. Este dado sugere a inibição da oxidação do cofator enzimático BH4, um significativo ativador da NOS. Os resultados obtidos até o momento sugerem que os mecanismos envolvidos na neuroproteção são distintos, apesar destes peptídeos possuírem semelhanças estruturais. Este foi o primeiro estudo a demonstrar que os BPPs apresentam atividade neuroprotetora contra o estresse oxidativo. The Bradykinin Potentiating Peptides (BPP), present in Low Molecular Weight Fraction (LMWF) of Bothrops jararaca (Bj), are described as natural inhibitors of angiotensin conversing enzyme (ACE) and argininossucinate synthase (AsS) activators, improving L-arginine synthesis, the agmatine and polyamines formation, which have neuroprotective properties. Have been demonstrated that LMWF show neuroprotective action on rat hippocampal cell culture. The aim of this study is to evaluate the possible neuroprotective activity of LMWF and BPPs against oxidative stress induced by H2O2 in SHSY5Y human cell line. Initially, the crude venom (CV), LMWF (0.001 ¿ 10 µg/mL) and [BPP-5a; BPP7a; BPP-10c; BPP-11e, BPP-12b e BPP-AP (0.1 ¿ 10 µM)] cytotoxicity were analyzed after 3, 6, 12, 24 e 28 h using MTT assay. For the neuroprotection assays, the cell culture was treated with BPPs (1 µM) or LMWF (0.1 µg/mL) and, after 4 h, H2O2 450 µM was added to induce oxidative stress. The cell viability assay was performed 20 h later. Our results suggest that all BPPs tested (excepting LMWF) were neuroprotective and the peptides BPP-5a, BPP-7a and BPP-10c were the most efficient. The neuroprotection mechanisms were assessed by the reactive oxygen species (ROS ¿ DCFH), lipid peroxidation (TBARS), AsS and iNOS expression, levels of nitrite (Griess) and mitochondrial membrane potential (TMRM) analyses. BPP-5a, BPP-7a and BPP-10c reduced the ROS, NO, NF-?B expression, and the lipid peroxidation. However, only BPP-10c enhanced the AsS expression, suggesting that the increase of L-arginine availability might be related to neuroprotection. In addition, BPP-10c and BPP-5a avoided the mitochondrial membrane potential promoted by H2O2. Interestingly, there is the hypothesis that only BPP-7a inhibited the co-factor BH4 oxidation because did not decrease NO synthesis. Overall, we demonstrated for the first time that the neuroprotective mechanisms of BPPs against oxidative stress could be distinct.

Orientador: Prof. Dr. Carlos Alberto Silva Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. Os peptideos potenciadores de bradicinina (BPPs) presentes na fracao de baixo peso molecular (FBP) do veneno da serpente Bothropoides jararaca (Bj) foram os primeiros inibidores da enzima conversora de angiotensina descritos. Recentes estudos demonstram que estes peptideos promovem a ativacao da enzima argininosuccinato sintetase, aumentando a disponibilidade de L-arginina e consequentemente a sintese de oxido nitrico, poliaminas e agmatina, essenciais para o crescimento, diferenciacao celular e neuroprotecao. Considerando os possiveis efeitos farmacologicos da FBP, o presente estudo tem como objetivo avaliar a atividade citoprotetora da FBP do veneno da serpente Bj em cultura primaria de celulas do hipocampo. Os resultados sugerem que a FBP nao e citotoxica nas condicoes experimentais avaliadas. Evidencias demonstram que as celulas tratadas com FBP 0,1 ¿Êg/mL e posteriormente com peroxido de hidrogenio H2O2 50¿ÊM apresentam maior viabilidade e menor expressao de caspase 3 clivada que as celulas tratadas apenas com H2O2 50¿ÊM, tambem e possivel observar que as celulas previamente tratadas com FBP apresentam morfologia normal, caracterizada pela presenca de neuritos, ja as celulas tratadas apenas com H2O2 50¿ÊM apresentam morfologia compativel com processos de morte celular. Em sintese os resultados sugerem que a FBP apresenta atividade citoprotetora contra o estresse oxidativo promovido por H2O2 50¿ÊM. O presente estudo abre novas perspectivas da aplicacao dos BPPs presentes na FBP da Bj para o desenvolvimento de novas pesquisas na area de neurociencia, com foco no desenvolvimento de farmacos aplicados ao tratamento de doencas neurodegenerativas. The bradykinin potentiating peptides (BPPs) in the low molecular weight fraction (LMWF) from the venom of the Bothropoides jararaca (Bj) were the first angiotensin-converting enzyme inhibitors described. Recent studies have demonstrated that these peptides promote the activation of the enzyme argininosuccinate synthetase, increasing the availability of L-arginine and therefore the synthesis of agmatine, nitric oxide, polyamines essential for the growth, cell differentiation and neuroprotection. Considering the possible pharmacological effects of the LMWF, the present study aims to evaluate the cytoprotective activity of LMWF from Bj in primary cultured hippocampal cells. The results suggest that the LMWF is not cytotoxic in all experimental conditions. Evidence has shown that cells treated with LMWF 0.1 ìg/mL and then with hydrogen peroxide H2O2 (50ìM) show higher viability and lower expression of cleaved caspase 3 cells than the treated just with H2O2 (50ìM). Is also observed that cells pretreated with LMWF have normal morphology characterized by the presence of neurites, cells treated with H2O2 (50ìM) showed morphology compatible with cell death processes. In summary the results suggest that LMWF has cytoprotective activity against oxidative stress caused by H2O2 (50ìM). This study opens new perspectives of application of BPPs present in the LMWF from Bj for the development of new research in neuroscience, focusing on the development of drugs applied to the treatment of neurodegenerative diseases.

Orientador(a): Prof(a). Dr(a). Maria Camila Almeida Coorientador: Prof. Dr. Daniel Carneiro Carrettiero Coorientadora: Prof. Dra. Marcela Bermudez Echeverry Tese (doutorado ) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós Graduação em Neurociência e Cognição. São Bernardo do Campo, 2022 A doença de Alzheimer (DA) é a demência mais comum associada ao envelhecimento e é acompanhada de neurodegeneração com comprometimento das funções cognitivas. Uma comorbidade bastante comum é a depressão maior, um transtorno de humor grave que é uma das principais causas de incapacidade em todo o mundo. Ambas as patologias são associadas às variações na temperatura corporal (Tc). O objetivo do presente trabalho é avaliar se a depressão induzida pela separação materna (SM) pode influenciar no desenvolvimento de distúrbios de memória e termorregulação associados a um modelo experimental para DA esporádica utilizando estreptozotocina (STZ) em ratos Wistar. Os animais foram submetidos à SM do 2° ao 14° dia após o nascimento durante 3 horas diárias. Aos 2 meses de idade, os animais foram submetidos aos testes comportamentais: labirinto em cruz elevado, campo aberto e natação forçada, para a análise de possíveis comportamentos exploratórios ou passivos. Posteriormente, foi realizado um procedimento cirúrgico para colocação de datalogger e injeção intracerebroventricular (icv) de STZ ou veículo. Para verificação de possíveis comprometimentos de memória espacial e de aprendizado, após 30 dias os animais foram submetidos ao labirinto de Barnes e, em seguida, a testes termorregulatórios como a análise das Tcs para cálculo do índice de perda de calor, na exposição ao frio e ao calor e no comportamento quando permitida a escolha de temperatura do solo. Após eutanásia, os encéfalos foram perfundidos para a realização de cortes e verificação da área ventricular encefálica. Os animais submetidos à SM apresentaram menor tempo gasto nos braços abertos do labirinto em cruz elevado e no centro do campo aberto e menor motivação no teste de natação forçada, o que sugere que a SM induz depressão. No labirinto de Barnes os animais tratados com STZ apresentaram comprometimento de memória e aprendizado quando comparados aos animais tratados com veículo. A SM resultou em prejuízos de memória em comparação aos controles, mas não acentuou os efeitos da STZ. Nos testes termorregulatórios observou-se que os animais submetidos à SM tratados com STZ apresentaram Tcs mais elevadas quando comparados aos tratados com veículo entre os dias 21 e 27 depois do procedimento cirúrgico. Em relação ao índice de perda de calor, observou-se que os animais tratados com STZ apresentaram menor perda de calor quando comparados aos tratados com veículo, evidenciando uma maior vasoconstrição. Não houve efeito da resposta termorregulatória em exposição ao frio ou ao calor. No desafio de seleção de temperatura, os animais tratados com STZ tiveram preferência pela temperatura neutra (26ºC) em comparação a temperatura fria (18ºC), tanto no grupo controle quanto no grupo SM. Após a eutanásia, observou-se que os animais tratados com STZ apresentaram maior área ventricular quando comparados aos animais tratados com veículo. Em conclusão, animais submetidos à SM não apresentaram respostas mais acentuadas ao efeito deletério da STZ, o que evidencia que o desenvolvimento de sintomas relacionados à depressão e à ansiedade não necessariamente potencializam comprometimentos de memória relacionados à DA de origem esporádica. Alzheimer's disease (AD) is the most common dementia associated with aging and is accompanied by neurodegeneration with impaired cognitive functions. A very common comorbidity is major depression, a serious mood disorder that is a major cause of disability worldwide. Both pathologies are associated with variations in body temperature (Tc). The aim of the present work is to evaluate whether depression induced by maternal separation (MS) can influence the development of memory and thermoregulation disorders associated with an experimental model for sporadic Alzheimer's disease using streptozotocin (STZ) in Wistar rats.The animals were submitted to MS from the 2nd to the 14th day after birth for 3 hours daily. At 2 months of age, the animals were submitted to behavioral tests: elevated plus maze, open field and forced swimming, for the analysis of possible exploratory or passive behaviors. Subsequently, a surgical procedure was performed for datalogger placement and intracerebroventricular (icv) injection of STZ or vehicle. To check for possible impairments of spatial memory and learning, after 30 days the animals were submitted to the Barnes maze and, then, to thermoregulatory tests such as the analysis of Tcs to calculate the heat loss index, in the exposure to cold and to heat and behavior when the choice of floor temperature is allowed. After euthanasia, the brains were perfused to perform sections and verify the brain ventricular area. The animals submitted to MS showed less time spent in the open arms of the elevated plus maze and in the center of the open field and less motivation in the forced swimming test, which suggests that MS induces depression. In the Barnes maze, animals treated with STZ showed memory and learning impairment when compared to animals treated with vehicle. MS resulted in memory impairments compared to controls, but did not accentuate the effects of STZ. In the thermoregulatory tests, it was observed that animals submitted to SM treated with STZ had higher Tcs when compared to those treated with vehicle between days 21 and 27 after the surgical procedure. Regarding the heat loss index, it was observed that the animals treated with STZ showed less heat loss when compared to those treated with vehicle, showing greater vasoconstriction. There was no effect of the thermoregulatory response on exposure to cold or heat. In the temperature selection challenge, animals treated with STZ had a preference for neutral temperature (26ºC) compared to cold temperature (18ºC), both in the control group and in the MS group. After euthanasia, it was observed that animals treated with STZ had greater ventricular area when compared to animals treated with vehicle. In conclusion, animals submitted to MS did not show more pronounced responses to the deleterious effect of STZ, which shows that the development of symptoms related to depression and anxiety does not necessarily potentiate memory impairments related to sporadic AD.