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PurposeThe first aim of the trial is to study feasibility of combined programmed death protein ligand 1/cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4 inhibition concomitant to radiotherapy. In addition, efficacy of the entire treatment scheme consisting of induction chemoimmunotherapy followed by chemotherapy-free radioimmunotherapy (RIT) after intratumoral CD8 +immune cell-based patient selection will be analyzed.MethodsPatients with stage III–IVB head and neck squamous cell carcinoma were eligible for this multicenter phase II trial. Treatment consisted of a single cycle of cisplatin 30 mg/m² days 1–3, docetaxel 75 mg/m² day 1, durvalumab 1500 mg fix dose day 5 and tremelimumab 75 mg fix dose day 5. Patients with increased intratumoral CD8 +immune cell density or pathological complete response (pCR) in the rebiopsy entered RIT up to a total dose of 70 Gy. Patients received further three cycles of durvalumab/tremelimumab followed by eight cycles of durvalumab mono (every 4 weeks). The intended treatment for patients not meeting these criteria was standard radiochemotherapy outside the trial. Primary endpoint was a feasibility rate of patients entering RIT to receive treatment until at least cycle 6 of immunotherapy of ≥80%.ResultsBetween September 2018 and May 2020, 80 patients were enrolled (one excluded). Out of these, 23 patients had human papilloma virus (HPV)-positive oropharyngeal cancer. Median follow-up was 17.2 months. After induction chemoimmunotherapy 41 patients had pCR and 31 had increased intratumoral CD8 +immune cells. Of 60 patients entering RIT (primary endpoint cohort), 10 experienced imiting toxic (mainly hepatitis) and four discontinued for other reasons, resulting in a feasibility rate of 82%. The RIT cohort (n=60) had a progression-free survival (PFS) rate at one and 2 years of 78% and 72%, respectively, and an overall survival rate at one and 2 years of 90% and 84%, respectively. Patients with HPV-positive oropharyngeal cancers had greater benefit from RIT with a 2-year PFS rate of 94% compared with 64% for HPV-negative oropharyngeal cancers and other locations. In the entire study cohort (n=79) the 2-year PFS rate was 68% (91% for HPV-positive oropharynx vs 59% for others). Toxicity grade 3–4 mainly consisted of dysphagia (53%), leukopenia (52%) and infections (32%).ConclusionsThe trial met the primary endpoint feasibility of RIT. Induction chemo-immunotherapy followed by chemotherapy-free RIT after intratumoral CD8 +immune cell-based patient selection has promising PFS.Trial registration numberThe trial was registered with ClinicalTrials.gov (identifier: NCT03426657). The trial was conducted as investigator-sponsored trial (IST)., publishedVersion

Ziel: Das Ziel dieser Studie war es, zwei Kriterien für die Evaluation des Ansprechens im 18F-FDG-PET (PET-Scan) nach Radioimmuntherapie mit 90Y Ibritumomab Tiuxetan bei Patienten mit rezidivie-rendem oder refraktärem follikulärem Non-Hodgkin-Lymphom (FL) zu vergleichen. Methode: Wir haben die Daten von 27 rezidivierenden oder refraktären FL-Patienten, die mit 90Y-ibritumomab tiuxetan (Zevalin®) in drei verschiedenen nuklearmedizinischen Abteilungen in Deutsch-land behandelt wurden, retrospektiv analysiert. Die Patienten erhielten jeweils ein PET-Scan vor und ein nach der RIT. Das Ansprechen wurde im PET-Scan 3 Monate  6 Wochen nach RIT anhand der Kriterien des internationalen Harmonisierungsprojekts (IHP) und Deauville (D5PS) bewertet. Das pro-gressionsfreie Überleben (PFS) und das Gesamtüberleben (OS) wurden mit dem Ansprechen auf RIT korreliert, welches aus den beiden oben genannten Kriterien abgeleitet wurde. Ergebnisse: Von 27 Patienten waren 12 Responder (Gruppe I), 9 waren Non-Responder nach beiden Kriterien (Gruppe II) und 6 Patienten waren Responder nach IHP, aber gleichzeitig Non-Responder nach D5PS (Gruppe III). Alle Responder nach D5PS waren auch Responder nach IHP-Kriterien. Die Patienten wurden für 8 bis 150 (Median = 49,7) Monaten beobachtet. Die PFS der Gruppen I, II und III betrugen NE (wurde nicht erreicht), 5 Monate (95%-CI: 3-8) bzw. 6 Monate (95%-CI:6-8). OS der Gruppen I, II und III waren NE (wurde nicht erreicht), 39 Monate (95%-CI: 21-77) bzw. 31 Monate (95%-CI:20-135). Die Kaplan-Meier Survival-Analyse wurde verwendet, um die PFS und OS dieser Gruppen zu vergleichen, diese für die Gruppe II und III signifikant kürzer waren als für die Gruppe I. Es gab keinen statistisch signifikanten Unterschied zwischen dem PFS oder OS der Gruppe II im Ver-gleich zu denen der Gruppe III (p=0,98 und 0,54). Schlussfolgerung: Die Evaluation des Ansprechens auf die Radioimmuntherapie bei refraktärem oder rezidivierendem FL mittels 18F-FDG-PET-Scan mit D5PS-Kriterien kann das Outcome (PFS und OS) besser prädiktieren als mit IHP-Kriterien. Aim: The aim of this study is to compare two criteria for evaluation of response on 18F-FDG-PET (PET) after radioimmunotherapy with 90Y ibritumomab tiuxetan (RIT) on patients with non-Hodgkin follicular lymphoma (FL). Materials and Methods: We retrospectively analyzed the data on 27 relapsed or refractory FL pa-tients treated with 90Y-ibritumomab tiuxetan (Zevalin) in three different nuclear medicine depart-ments of Germany, who had a PET study carried out before and after RIT. Response was assessed on PET, performed 3 months  6 weeks after RIT using the international harmonization project (IHP) and Deauville (D5PS) Criteria. Progressions-free survival (PFS) and overall survival (OS) were corre-lated with the response to RIT, derived from the two criteria stated above. Results: Out of 27 patients, 12 were responder (Group I) und 9 were non-responder based on both criteria (Group II) and 6 patients were responders based on IHP but non-responders based on D5PS (Group III). All responders based on D5PS were also responders based on IHP criteria. Patients were followed for 8 to 150 (median= 49,7) months. PFS of Groups I, II and III were NE (has not been reached), 5 months (95%-CI: 3-8) and 6 months (95%-CI:6-8), respectively. OS of Groups I, II and III were NE (has not been reached), 39 months (95%-CI: 21-77) and 31 months (95%-CI:20-135), re-spectively. Kaplan-Meier Survival analysis was used to compare the PFS and OS of these groups, which were significantly shorter for Group II and III compared to those for Group I. There was no sta-tistically significant difference between the PFS or OS of Group II in comparison to those of Group III (p=0.98 and 0.54). Conclusions: The response to radioimmunotherapy of refractory or recurrent FL using 18F-FDG-PET-Scan based on D5PS Criteria predicts outcome (PFS/OS) more accurately than the evaluation based on the IHP Criteria.

Zur Behandlung von Tumorerkrankungen sind radioaktiv markierte Antikörper als hochaffine und selektive Radioimmuntherapeutika von zunehmender Bedeutung. Allerdings ist der Einsatz solcher radioaktiv markierter Antikörper bei der Behandlung strahlenresistenter solider Tumore limitiert, weil infolge ihrer hohen Blutverweildauer und nur langsamen Anreicherung im Zielgewebe, bedingt durch ihre Molekülgröße, der gesamte Organismus einer hohen Strahlenbelastung ausgesetzt wird. Eine Alternative dazu stellt die Strategie des Pretargeting von Tumoren dar. Die Intention dieses Prinzips besteht darin, mittels einer mehrstufigen Applikationsfolge die Injektion eines targetspezifischen Antikörper-Konjugates und einer kleinen radioaktiv markierten Verbindung zu trennen, welche zueinander ein komplementäres System bilden. Eine Substanzklasse die erstmals von Wissenschaftlern des Helmholtz-Zentrums Dresden-Rossendorf (HZDR) als potentielles komplementäres System für Tumor-Pretargeting-Anwendungen untersucht wurden ist, sind spiegelbildliche bzw. L konfigurierte Oligonukleotide. Aufgrund ihrer hohen metabolischen Stabilität, geringen Immunogenität und sehr geringen Spezifität zu natürlich vorkommenden potentiellen Bindungspartnern sind L-Oligonukleotide, im speziellen L-DNA-Derivate, das ideale System bzgl. der In-vivo-Hybridisierung zwischen einem tumorspezifischen Antikörper und der radioaktiv markierten Chelateinheit. Das verwendete Pretargeting-System besteht aus den Radionuklid markierbaren Komponenten NOTA-L-DNA-(0-20kDa)-PEG 6a-e sowie DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d und aus der targetspezifischen Antikörper-Einheit, deren Entwicklung eines der Aufgabengebiete der vorliegenden Arbeit darstellte. Als Antikörper wurde dabei der klinisch zugelassene chimäre monoklonale Antikörper Cetuximab (Handelsname Erbitux®, C225) verwendet, welcher mit sehr hoher Affinität an das Oberflächenprotein „Epidermaler Wachstumsfaktor Rezeptor“ (Epidermal Growth Factor Receptor, EGFR) bindet. Die Zielstellung dieser Arbeit beinhaltete vor allem die In-vitro- und In-vivo-Charakterisierung des L-DNA basierenden Pretargeting-Systems im Hinblick darauf, ob das Internalisierungsverhalten von Cetuximab einen limitierenden Faktor für seine Anwendung in Pretargeting-Experimenten darstellt. Es konnten zwei mit der komplementären L-DNA (c-L-DNA) modifizierte Cetuximab-Derivate mit einem niedrigen (n = 1,5) und einem hohen (n = 5) Konjugationsgrad an c-L-DNA hergestellt werden. Zur radiopharmakologischen Charakterisierung wurden beide Konjugate zusätzlich mit NOTA funktionalisiert und entsprechende Verfahren zur Markierung mit dem Radiometallnuklid 64Cu erarbeitet. Die Reaktionsparameter sowohl bei der Synthese als auch bei der Radiomarkierung wurden hinsichtlich des pH-Wertes, der Temperatur und der mechanischen Beanspruchung so gewählt, dass einerseits der Affinitätsverlust in Bezug zum nativen Cetuximab möglichst gering gehalten wird und andererseits die erarbeiteten Protokolle sich perspektivisch auch auf andere Antikörper übertragen lassen. Die zentrale Fragestellung dieser Arbeit bestand darin, die Internalisierungsgeschwindigkeit der beiden Cetuximab-Konjugate NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 im Hinblick auf deren Eignung für In vivo-Pretargeting-Experimente zu bewerten. Dabei wurde festgestellt, dass bereits nach 24 h an A431- und FaDu-Zellen 50 - 70% des auf der Zelloberfläche gebundenen Antikörpers nicht mehr für die Bindung der radioaktiv markierten Komponente zur Verfügung stand. 72 h nach der Antikörperapplikation waren sogar 80 - 90% des extrazellulär gebundenen Antikörpers internalisiert. Besonders diese hohe Internalisierungsrate könnte im Hinblick auf In-vivo-Anwendungen problematisch sein und eine geringe Tumorakkumulation der radioaktiv markierten Komponente bewirken. Infolge der Konjugation von Cetuximab mit p-SCN-Bn-NOTA 3, GMBS 9 und 17mer-c-L-DNA 2 war eine Änderung der pharmakologischen Eigenschaften von Cetuximab nachweisbar. Insbesondere dadurch, dass die Antikörpermodifikation vorrangig an den Aminogruppen der Lysin-Einheiten erfolgte und durch das 17fach negativ geladene Phosphatrückgrat des Oligonukleotids, wurde eine starke Anionisierung der Oberflächenladung und damit eine Verringerung des isoelektrischen Punktes festgestellt. Dennoch bestätigten Kompetitionsbindungsstudien an A431- und FaDu-Gesamtzellhomogenat für alle untersuchten Antikörper-Derivate unabhängig vom Konjugationsgrad deren sehr hohe Affinität zum EGFR. Auch die an intakten Zellen berechneten KD-Werte unterstreichen dies. Einzig die Bindungskapazität weist dabei eine Abhängigkeit zum Konjugationsgrad auf, sodass trotz sehr guter Ki- und KD-Werte auf eine Verringerung der Affinität infolge der Antikörpermodifikation zu schließen ist. Interessant ist auch, dass nach einem Zeitraum > 4 h eine zweite Bindungsphase auftritt, welche möglicherweise durch eine Reexpression des EGFR aus intrazellulären Kompartimenten, infolge der Internalisierung des Rezeptor-Antikörperkomplexes, hervorgerufen wird. Außerdem wurde untersucht, inwieweit die unterschiedlichen und sterisch sehr anspruchsvollen PEG-Substituenten der 17mer-L-DNA die Hybridisierung am Antikörper sowie am Rezeptor-Antikörper-Komplex an A431- und FaDu-Zellen beeinflussen. Dabei stellte sich heraus, dass die Hybridisierung am Immunkomplex in Abhängigkeit des PEGylierungsgrades vom nicht PEGylierten Konjugat [64Cu]Cu6a zum 20kDa-PEG-Derivat [64Cu]Cu6e sukzessive abnimmt. Hingegen scheint der PEGylierungsgrad bei der Hybridisierung am im Phosphatpuffer und im humanen Vollblut inkubierten Antikörper keinen Einfluss zu haben. Weiterhin wurde im Zellversuch gezeigt, dass am hoch modifizierten Cetuximab-Konjugat NOTA3-C225-(c L-DNA)5 in Abhängigkeit des Konjugationsgradunterschiedes zum niedrig modifizierten Derivat NOTA3-C225-(c L-DNA)1,5 ca. dreimal mehr Ligand hybridisiert. Erste In-vivo-Pretargeting-Untersuchungen bestätigten, dass NOTA-L-DNA-10kDa-PEG 6d der ideale „Kandidat“ für das Pretargeting-Konzept basierend auf L-konfigurierten Oligonukleotiden ist. Besonders die wesentlich höhere Tumorakkumulation von [68Ga]Ga6d (10kDa-PEG) im Vergleich zu den anderen untersuchten L-DNA-Konjugaten [68Ga]Ga 6a-c (0, 2, 5kDa PEG) und [68Ga]Ga6e (20kDa-PEG) ist dabei von besonderer Bedeutung. Zukünftige Pretargeting-Studien sollten demnach ausschließlich mit der 10kDa-PEG modifizierten 17mer-L-DNA durchgeführt werden. Die Substitution des bifunktionalen Chelators p-SCN-Bn-NOTA 3 durch DOTA-GA-Mal 7 ermöglicht den Einsatz eines breiten Spektrums therapeutisch relevanter Radionuklide wie beispielsweise 90Y, 177Lu oder auch 67Cu. Dies konnte anhand eines ersten Pretargeting-Experimentes mit NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 und [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG [177Lu]Lu8d bestätigt werden. Zusammenfassend muss aber festgestellt werden, dass Cetuximab als Antikörper für das Pretargeting aufgrund seiner Internalisierungscharakteristik nicht geeignet ist. Es zeigte sich zwar, dass nach 24 h mittels Pretargeting eine verringerte Leberakkumulation im Vergleich zum direkt markierten Cetuximab-Derivat [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 erzielt werden kann, allerdings fällt die Tumorakkumulation ebenfalls um ca. 40 – 70% niedriger aus und demnach wird eine deutlich geringere Dosis im Tumor angereichert. Dies lässt den Rückschluss zu, dass in vivo eine ähnlich hohe Internalisierung auftritt wie im In-vitro-Zellversuch ermittelt. Das Pretargeting-Intervall musste demnach auf 24 h festgesetzt werden, auch wenn zum Zeitpunkt der Applikation der radioaktiv markierten Komponente der Antikörper immer noch im vaskulären System zirkulierte. Kleintier-PET-Aufnahmen lassen allerdings vermuten, dass eine Applikation der radioaktiv markierten Komponente 48 h nach der Antikörper-Gabe bessere Verteilungsverhältnisse ergeben hätte. Der eigentliche Vorteil des Pretargetings, innerhalb weniger Stunden eine ähnlich hohe Tumorakkumulation zu erzielen, wie sie direkt markierte Antikörper erst nach mehreren Tagen aufweisen, konnte mit Cetuximab nicht verwirklicht werden.:Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 1 2 Zielstellung 7 3 Theoretischer Teil 9 3.1 Monoklonale Antikörper 9 3.2 Endoradionuklidtherapie mit Hilfe radiomarkierter Antikörper 11 3.3 Pretargeting-Konzepte zur Anwendung in der Radioimmuntherapie 12 3.3.1 Kennzeichen des Tumor-Pretargeting 12 3.3.2 Pretargeting unter Nutzung bispezifischer monoklonaler Antikörper 13 3.3.3 Das (Strept)avidin/Biotin-System 16 3.3.4 Komplementäre Oligonukleotide 20 3.3.4.1 D-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als komplementäres System für Pretargeting-Anwendungen 20 3.3.4.2 L-Konfigurierte Oligonukleotid-Derivate als potentielle und stabile Komponenten für das Pretargeting von Tumoren 23 3.3.4.3 Pretargeting-Konzept mit L-konfigurierten Oligonukleotiden – Bisherige Arbeiten im HZDR 24 3.4 Der epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR) als potentielles Target für Pretargeting-Anwendungen 28 3.4.1 Die Biologie des EGFR und dessen Funktion in der Onkogenese 28 3.4.2 Der anti-EGFR-Antikörper Cetuximab 30 3.4.3 Antikörper vermittelte Rezeptorinternalisierung - ein Ausschlusskriterium für das Pretargeting? 32 4 Ergebnisse und Diskussion 35 4.1 Verwendete komplementäre L-DNA-Leitstruktur, Chelatoren und Radionuklide 35 4.2 Darstellung der Radionuklid markierbaren Komponente des Pretargeting Systems 39 4.2.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 39 4.2.2 Konjugation von 17mer-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 1a-e mit NOTA-Bn-thioharnstoff-ethyl-maleinimid 5 und DOTA-GA-Mal 7 41 4.3 Darstellung der targetspezifischen Komponente – Funktionalisierung von Cetuximab mit komplementärer L-DNA 44 4.3.1 Synthesestrategie 44 4.3.2 NOTA-Funktionalisierung von Cetuximab 46 4.3.2.1 Syntheseplanung und Durchführung 46 4.3.2.2 Analytische Charakterisierung des Derivates 47 4.3.3 Maleinimid-Funktionalisierung von NOTA3-C225 51 4.3.3.1 Syntheseplanung und Durchführung 51 4.3.3.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 53 4.3.4 Konjugation von NOTA3-C225-Malk mit komplementärer 17mer-L-DNA 2 55 4.3.4.1 Syntheseplanung und Durchführung 55 4.3.4.2 Analytische Charakterisierung der Derivate 56 4.4 Radiochemische Synthesen 61 4.4.1 68Ga-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 61 4.4.2 64Cu-Markierung von NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG 6a-e 63 4.4.3 64Cu-Markierung NOTA funktionalisierter Cetuximab-Derivate 65 4.4.3.1 Entwicklung einer Methode zur schonenden Radiomarkierung von Antikörpern mit 64Cu 65 4.4.3.2 Analytische Charakterisierung der 64Cu-markierten Cetuximab-Derivate mittels SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese 67 4.4.4 177Lu-Markierung von DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG 8d 70 4.5 In-vitro-Charakterisierung und Bewertung des Pretargeting-Systems auf dessen Eignung für In-vivo-Anwendungen 72 4.5.1 Vorüberlegungen 72 4.5.2 Untersuchungen zur Oberflächenladung modifizierter Cetuximab- Derivate 74 4.5.3 Schmelzpunktbestimmung zur Bewertung der Hybridstabilität 77 4.5.3.1 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/c-L-DNA- Hybride 77 4.5.3.2 Die Schmelztemperatur der L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 77 4.5.3.3 Die Schmelztemperatur der NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG/NOTA3-C225-(c L DNA)n-Hybride 78 4.5.4 Untersuchungen zur Bestimmung der Abhängigkeit von PEG-Substituenten unterschiedlicher Größe auf das Hybridisierungs- verhalten 79 4.5.4.1 Vorbetrachtung 79 4.5.4.2 Hybridisierungsuntersuchungen in Phosphatpuffer 79 4.5.4.3 Hybridisierungsuntersuchungen in humanem Vollblut 81 4.5.5 Kompetitionsbindungsstudien zur Bestimmung der Affinität von konjugierten Cetuximab-Derivaten 82 4.5.5.1 Vorbetrachtung 82 4.5.5.2 Kompetitionsbindungsstudien an A431-Zellhomogenaten 83 4.5.5.3 Kompetitionsbindungsstudien an FaDu-Zellhomogenaten 84 4.5.5.4 Schlussfolgerungen 85 4.5.6 Sättigungsbindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 87 4.5.6.1 Vorbetrachtung 87 4.5.6.2 Sättigungsbindungsstudien an A431-Zellen 88 4.5.6.3 Sättigungsbindungsstudien an FaDu-Zellen 91 4.5.6.4 Schlussfolgerungen 95 4.5.7 Pretargeting-Bindungsstudien von NOTA3-C225-(c-L-DNA)1,5 und NOTA3-C225-(c-L-DNA)5 mit [64Cu]Cu6a-e an A431- und FaDu-Zellen 98 4.5.7.1 Vorbetrachtung 98 4.5.7.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 99 4.5.7.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 101 4.5.7.4 Schlussfolgerungen 103 4.5.8 Internalisierungs-Bindungsstudien konjugierter Cetuximab-Derivate 103 4.5.8.1 Entwicklung eines geeigneten Internalisierungsassays basierend auf dem Pretargeting-Konzept 103 4.5.8.2 Pretargeting-Bindungsstudien an A431-Zellen 106 4.5.8.3 Pretargeting-Bindungsstudien an FaDu-Zellen 113 4.5.8.4 Schlussfolgerungen 119 4.6 In-vivo-Pretargeting-Studien 121 4.6.1 Untersuchung der In-vivo-Stabilität und Bluteliminierung von [64Cu]Cu-NOTA-L-DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) 121 4.6.2 Kleintier-PET-Untersuchung von [64Cu]Cu-NOTA-C225-(c-L-DNA)1,5 zur Ermittlung der Pretargeting-Wartezeit 123 4.6.3 Pretargeting-Kleintier-PET-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [68Ga]Ga-NOTA-L-DNA-(0-20)kDa-PEG ([68Ga]Ga6a-e) in Mäusen 125 4.6.4 Pretargeting-Studien von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [64Cu]Cu-NOTA-L DNA-10kDa-PEG ([64Cu]Cu6d) in Mäusen 129 4.6.4.1 Kleintier-PET-Untersuchungen an FaDu tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 129 4.6.4.2 Bioverteilung nach Pretargeting-Experimenten an A431 tumortragenden NMRI nu/nu Mäusen 132 4.6.5 Pretargeting-SPECT-Untersuchungen von NOTA3-C225-(c L DNA)1,5 mit [177Lu]Lu-DOTA-GA-L-DNA-10kDa-PEG ([177Lu]Lu8d) 134 4.7 Abschließende Bewertung von Cetuximab auf dessen Eignung als Antikörper für das Tumor-Pretargeting 135 5 Zusammenfassung und Ausblick 137 6 Experimenteller Teil 141 6.1 Material 141 6.1.1 Chemikalien 141 6.1.2 Puffergemische und Lösungen 143 6.1.3 Synthetische L-Oligonukleotide 146 6.1.4 Radionuklide 146 6.1.5 Zellkulturen 146 6.1.5.1 A431-Zelllinie 146 6.1.5.2 FaDu-Zelllinie 147 6.1.6 Tiermodelle 147 6.1.7 Geräte 148 6.2 Analytische Methoden 149 6.2.1 NMR-Spektroskopie 149 6.2.2 Massenspektrometrie 149 6.2.2.1 ESI-MS 149 6.2.2.2 Maldi-TOF 150 6.2.3 UV/Vis-Spektroskopie 150 6.2.4 Chromatographie 151 6.2.4.1 Dünnschichtchromatographie (DC) 151 6.2.4.2 Hochleistungsflüssigchromatographie 151 6.3 Synthesevorschriften und analytische Daten 153 6.3.1 Synthese von NOTA-Bn-thioharnstoff-ethylmaleinimid 5 153 6.3.2 Synthese der NOTA und DOTA funktionalisierten 17mer-L-DNA- Verbindungen 154 6.3.3 Synthese konjugierter Cetuximab-Derivate 157 6.3.4 Radiochemische Synthesen 161 6.3.4.1 68Ga-Radiomarkierungen 161 6.3.4.2 64Cu-Radiomarkierungen 163 6.3.4.3 177Lu-Radiomarkierungen 167 6.4 Biologisch-chemische Methoden 168 6.4.1 Schmelzpunkt-Bestimmung Fehler! Textmarke nicht definiert. 6.4.2 Gelelektrophorese 168 6.4.2.1 Polyacrylamid-Gelelektrophorese 168 6.4.2.2 Agarosegelelektrophorese 169 6.4.2.3 Isoelektrische Fokussierung (IEF) 170 6.4.3 Zellkultur 170 6.4.3.1 Auftauen und Anzüchten von kryokonservierten Zellen 170 6.4.3.2 Kryokonservierung von Zelllinien 170 6.4.3.3 Subkultivierung 171 6.4.3.4 Zellzahlbestimmung 171 6.4.3.5 Herstellung von Zellhomogenat 172 6.4.4 Hybridisierungs- und Bindungsassays 172 6.4.4.1 In-vitro-Hybridisierungsuntersuchungen 172 6.4.4.2 Kompetitionsassay an Zellhomogenat 173 6.4.4.3 Sättigungsbindungsstudien an intakten Zellen 174 6.4.4.4 Pretargeting-Bindungsstudien 175 6.4.4.5 Internalisierungs-Bindungsstudien 176 6.4.4.6 Bicinchoninsäure-Assay (BCA) zur Proteinbestimmung 177 6.4.4.7 Gammacounter 177 6.4.5 Metabolitenanalytik 178 6.4.6 Bioverteilungsuntersuchungen 178 6.4.7 Positronen-Emissions-Tomographie (PET) 179 6.4.8 Single-Photonen-Emissions-Tomographie (SPECT) 179 7 Anhang 180 7.1 Originaldaten 180 7.1.1 Schmelzkurven 180 7.1.2 Gelelektrophorese und Autoradiographie 181 7.1.3 Bioverteilungsdaten 186 7.2 Übersicht der Substanzen 188 7.3 Abkürzungsverzeichnis 191 7.4 Literaturverzeichnis 194 7.5 Pubblikationen, Poster und Vorträge 209 7.6 Danksagung 212

Despite complex treatment schedules for cancer, the occurrence of resistances and relapses is a major concern in oncology. Hence, novel treatment options are needed. In this thesis, different approaches using radioimmunotherapy and the opioid D,L-methadone alone or in combination with doxorubicin were analyzed regarding their cytotoxic potential and the triggered signalling pathways in sensitive and resistant leukaemia and non-Hodgkin lymphoma (NHL). The radioimmunoconjugates [Bi-213]anti-CD33 and [Bi-213]anti-CD20 for treatment of acute myeloid leukaemia (AML) or NHL, respectively, were applied exemplary for the use of targeted alpha-therapies (TAT). Depending on the analyzed cell lines, the used activity concentrations and specific activities (MBq/µg antibody) apoptosis was induced abrogating radio- and chemo-cross-resistances specifically. The cell death was caspase-dependent activating the mitochondrial pathway and was executed by downregulation of the anti-apoptotic proteins XIAP and Bcl-xL. D,L-Methadone induces apoptosis in vitro and in vivo in opioid-receptor (OR) expressing cells depending on the OR density and the used concentrations. Resistances could be overcome and proliferation was inhibited. In combination with doxorubicin, a synergistic effect regarding cytotoxicity in ex vivo patient cells and cell lines was observed. This effect depends on the increase of doxorubicin uptake co-administering D,L-methadone whereas doxorubicin enhances OR expression. The activation of OR leads to the downregulation of cAMP playing a pivotal role in apoptosis induction. In vivo, the therapeutic potential of D,L-methadone alone or in combination with doxorubicin could be proven as mice transplanted with human T-ALL-cells could be identified as tumour free. In summary, these studies show that TAT using [Bi-213]anti-CD33 and [Bi-213]anti-CD20 as well as the opioid D,L-methadone harbour the potential to optimize conventional treatment modalities for leukaemia and NHL.

Diese Arbeit fasst die Ergebnisse einer pädiatrischen Pilotstudie zusammen, bei der die Radioimmuntherapie (RIT), die gezielte Bestrahlung des Knochenmarks (KM) mit radioaktiv beladenen Antikörpern bei 26 pädiatrischen Patienten mit malignen (n = 11) und nicht-malignen (n = 15) Erkrankungen vor hämatopoetischer Stammzelltransplantation (HSCT) eingesetzt wurde. Hierzu wurden ambulant markierte, monoklonale Antikörper gegen CD66-Antigen 12 - 15 Tage vor HSCT verabreicht. Es wurde eine selektive Bestrahlung des Knochenmarks erreicht mit einer mittleren KM-Dosis von 29 Gy bei malignen Erkrankungen und von 17 Gy bei nicht-malignen Erkrankungen. Im Anschluss erfolgte bei Patienten mit hohem Rezidivrisiko und maligner Grundkrankheit (n = 7) zusätzlich eine konventionelle myeloablative Konditionierung mit TBI (total body irradiation) und/oder Busulfan, um den antileukämischen Effekt der Therapie zu intensivieren. Bei Patienten mit hoher Begleitmorbidität (n = 19), für die eine konventionelle myeloablative Konditionierung ein unzumutbares höheres Risiko dargestellt hätte, wurde die RIT in Kombination mit einer sog. toxizitätsreduzierten Konditionierung durchgeführt (in der Mehrzahl mit Fludarabin und Melphalan). 25/26 Patienten zeigten ein primäres Anwachsen des Transplantats. Die RIT zeigte keine spezifischen Kurzzeitnebenwirkungen und die nicht rezidivassoziierte Mortalität (NRM) war bei diesen Hochrisiko-Patienten mit 2/26 Patienten gering. 19/26 Patienten überlebten. Die RIT konnte damit als ein vielversprechender Ansatz zur Konditionierung pädiatrischer Patienten mit hoher Begleitmorbidität und/oder hohem Rezidivrisiko etabliert werden. Es konnte erstmals die Durchführbarkeit, myeloablative Effektivität und Ausmaß der geringen spezifischen Toxizität der RIT im Rahmen der HSCT bei pädiatrischen Hochrisiko-Patienten gezeigt werden. Späte Langzeittoxizität und antileukämische Effektivität dieses Therapieansatzes müssen in prospektiven Langzeitstudien weiter untersucht werden.

Ziel der Arbeit war die Quantifizierung der Zytotoxizität von Bi-213-Immunkonjugaten in vitro abhängig von der Bindung und Internalisierung an ein tumorzellspezifisches Antigen (delta9-E-Cadherin) mittels klonogenem Test und Analyse von Chromosomenaberrationen. Die Überlebenskurven zeigten eine exponentielle Dosis-Wirkungsbeziehung, wobei Zellen mit tumorspezifischem Antigen allgemein stärker geschädigt wurden als Zellen ohne delta9-E-Cadherin. Auch bei den Chromosomenaberratioenen ergab sich qualitativ und quantitativ eine Abhängigkeit von der Spezifität der Bindeung der Bi-213-Immunkonjugate. Abschließender Teil der Arbeit war eine Abschätzung der Strahlendosis der verabreichten Bi-213-Immunkonjugate unter Berücksichtigung der Absättigung der Antigene mit Radioimmunkonjugaten. The aim of this study was to quantify in vitro cytotoxicity of Bi-213-immunoconjugates due to targeting a tumor cell-specific antigen (delta9-E-cadherin). Binding and internalizatiuon of the antibodies were also explored. Cytotoxicity was quantified by clonogenic aassays and analysis of chromosomal aberrations. The survival curves showed an exponential function of dose. Cells expressing the tumor cell-specific antigen were eliminated more efficiently than cells without the targeted antigen. Number and quality of chromosomal aberrations were also dependent on specific binding of the Bi-213-immunoconjugates. What dose wasreached by incubating the cells with radioimmunoconjugates was estimated depending on how many binding sites were saturated with Bi-213- immunoconjugates.

Bei der Radioimmuntherapie sollen Tumorzellen durch die antikörpervermittelte Bindung geeigneter Radionuklide selektiv abgetötet werden. In dieser Arbeit wurde der alpha-Strahler Bi-213 gekoppelt an einen Antikörper verwendet, der an ein mutiertes Adhäsionsmolekül bindet. Dieses veränderte E-Cadherin (d9-E-Cad) kommt auf Zellen des diffusen Magenkarzinoms vor, nicht aber auf Normalgewebe. Die therapeutische Wirksamkeit der tumorspezifischen Antikörper-Bindung an antigenexprimierende Tumorzellen wurde anhand von strahleninduzierten Veränderungen der Zellkernmorphologie untersucht. Darüber hinaus wurde die Wirkung der alpha-Radioimmuntherapie mit dem Effekt von Röntgenbestrahlung verglichen. Die Quantifizierung der Radiotoxizität erfolgte mit Hilfe des MAA-Assay. Dazu wurde fluoreszenzmikroskopisch der Prozentsatz mikrokernhaltiger (M), apoptotischer (A) und abnormaler Zellen (A) zu verschiedenen Zeitpunkten nach der Inkubation mit Radioimmunkonjugaten oder nach Röntgenbestrahlung ermittelt, um die verschiedenen Arten des Zelltods zu erfassen. Untersucht wurden zum einen transfizierte Mäusefibroblasten, die entweder Wildtyp-E-Cad (L929 wt) oder d9-E-Cad (L929 d9) exprimieren. Die Zellen wurden mit Bi-213-Immunkonjugaten gegen d9-E-Cad (Bi-213-6H8) inkubiert. Nach Inkubation mit 160 kBq/ml Bi-213-6H8 nahm die Anzahl an MAA-Zellen bei den L929 d9-Zellen signifikant auf 13+/-3 % zu, während bei den L929 wt-Zellen und den nicht mit Bi-213-6H8 inkubierten Kontrollen höchstens 2+/-1 % MAA-Zellen gezählt wurden. Zum anderen wurden menschliche Magenkarzinomzellen (HSC-45M2) getestet, die d9-E-Cad natürlicherweise exprimieren. Die Induktion von MAA-Zellen durch Bi-213-6H8 war abhängig von der Aktivitätskonzentration und der Inkubationszeit. Inkubation mit 160 kBq/ml für 10 bzw. 90 min führte zu 12+/-1,3 % bzw. 19+/-3,3 % MAA-Zellen. Inkubation mit 640 kBq/ml induzierte die Bildung von 21+/-3,6 % (10 min Inkubation) und 33+/-5,7 % MAA-Zellen (90 min Inkubation). Eine Gruppe der HSC-Zellen wurde vor der Zugabe von Bi-213-Radioimmunkonjugaten mit dem nicht markierten Antikörper vorinkubiert, um die Kompetitierbarkeit der Bindung von Bi-213-6H8 zu untersuchen. Eine weitere Gruppe der HSC-Zellen wurde mit einem unspezifischen, mit Bi-213 beladenen Antikörper inkubiert. In beiden Gruppen wurden bei der niedrigen Aktivitätskonzentration (160 kBq/ml) signifikant weniger MAA-Zellen gebildet als bei den mit Bi-213-6H8 bei gleicher Aktivitätskonzentration inkubierten Zellen, während bei Inkubation mit 640 kBq/ml durch den crossfire Effekt kein Unterschied nachweisbar war. Zusätzlich wurden L929-d9 und HSC-Zellen mit verschiedenen Dosen von Röntgenstrahlung exponiert und ebenfalls mit Hilfe des MAA-Assay beurteilt. Bei beiden Zelllinien (L929 d9 und HSC) wurde die Bildung von MAA-Zellen in etwa gleichem Ausmaß induziert. 1 Gy führte zu etwa 12 %, 2 Gy zu 20 % und 4 Gy zu 30 % MAA-Zellen. Antigenexprimierende Tumorzellen wurden durch die Inkubation mit tumorspezifischen, Bi-213-markierten Antikörpern abhängig von der Aktivitätskonzentration und der Inkubationszeit selektiv geschädigt, während Inkubation mit den unspezifischen Konjugaten oder Inkubation nach der Vorinkubation mit unmarkiertem Antikörper weniger Zellschäden induzierte. Dadurch wird gezeigt, dass die Radioimmuntherapie mit Bi-213-gekoppelten Antikörpern gegen d9-E-Cadherin bei geeigneten Aktivitätskonzentrationen eine neue Behandlungsmöglichkeit des diffusen Magenkarzinoms bieten kann. The concept of radioimmunotherapy is to selectively eliminate tumor cells due to specific targeting with appropriate nuclides. In this study we used the alpha-emitter Bi-213 coupled to an antibody that binds to a mutated adhesion molecule. This altered E-cadherin (d9-E-cad) is expressed by diffuse type gastric cancer cells but not by normal tissue. The aim was to demonstrate specific therapeutic efficiency of antibody targeting by quantification of alpha-particle induced cell death. Furthermore the effects of alpha-radioimmunotherapy were compared to those of X-ray irradiation. The radiotoxicity was quantified via the MAA assay. At various time points after incubation with radioimmunoconjugates or after X-ray irradiation, cells were scored for the percentage of micronucleus formation (M), apoptosis (A), and abnormal cells (A) to evaluate different modes of cell death. We tested murine fibroblasts transfected with either wildtype E-cad (L929 wt) or mutant d9-E-cad (L929 d9) for radioinduced alterations in nuclear morphology. The cells were incubated with Bi-213-immunoconjugates directed against d9-E-cad (Bi-213-6H8). The MAA peak frequency was 13+/-3 % in L929 d9 cells with L929 wt cells and unirradiated controls not exceeding 2+/-1 %. Furthermore, we investigated human gastric cancer cells (HSC-45M2) constitutively expressing d9-E-cad. MAA formation occurred in a dose and time dependent manner with a maximum of 12+/-1.3 % after 10 minutes incubation and 19+/-3.3 % after 90 minutes incubation with 160 kBq/ml Bi-213-6H8. Incubation with 640 kBq/ml led to 21+/-3.6 % (10 minutes incubation) and 33+/-5.7 % MAA cells (90 minutes incubation). A group of HSC cells had been preincubated with unlabeled anti-d9-E-cad-antibody prior to application of Bi-213-6H8 to examine competitive inhibition of radioimmunoconjugate binding. An unspecific antibody labeled with Bi-213 was applied to another group of HSC cells to evaluate unspecific cell damage. Preincubation with unlabeled 6H8-antibody before application of Bi-213-6H8 as well as incubation with unspecific Bi-213-immunoconjugates significantly reduced cell death at the low activity concentration (160 kBq/ml) compared to incubation with Bi-213-6H8. At 640 kBq/ml, no difference was observed, most likely due to crossfire irradiation. Additionally, L929 d9 cells and HSC cells were irradiated with different X-ray doses. X-ray irradiation with 0, 1, 2, and 4 Gy equally induced MAA cells in both HSC and L929 d9 cells with about 12 % after irradiation with 1 Gy, 20 % with 2 Gy, and 30 % with 4 Gy. Tumorspecific Bi-213-labeled antibodies selectively induce cell death in antigen-expressing tumor cells depending on activity concentration and incubation time, whereas incubation with the unspecific radioimmunoconjugate or incubation with Bi-213-6H8 following preincubation with the unlabeled antibody had less effect. Thus, radioimmunotherapy with Bi-213-labeled specific antibodies targeting d9-E-cadherin may at appropriate activity concentrations provide a new strategy in the treatment of diffuse type gastric cancer.

Abtötung einzelner Tumorzellen ist eine große therapeutische Herausforderung bei minimal residual disease und der disseminierten Ausbreitung von Tumorzellen in Körperhöhlen z.B. im Peritonealraum oder auf den Leptomenigen. Ein erfolgversprechender Ansatz dafür ist die Radioimmuntherapie, bei der radioaktive Nuklide mittels monoklonaler Antikörper gezielt an Tumorgewebe transportiert werden. Für die Radioimmuntherapie einsetzbar sind sowohl beta-Emitter als auch alpha-Emitter. Letztere haben sich als besonders effizient erwiesen, da bereits wenige Partikel ausreichen um Tumorzellen abzutöten. In dieser Arbeit wurden die alpha-Emitter 225Ac, 213Bi und 149Tb wahlweise an die monoklonalen Antikörper 6H8, HuM195 und 3F8 gekoppelt und die zytotoxische Wirkung der Radioimmunkonjugate an Zellkulturen quantifiziert und bewertet. 6H8 ist ein tumorspezifischer Antikörper, der an eine bestimmte Mutation des E-Cadherin (d9 E-Cad) bindet, die exklusiv beim diffusen Magenkarzinomen auftritt. HuM195 erkennt das tumorassoziierte Antigen CD33 auf Zellen der akuten myeloischen Leukämie. 3F8 ist ein Antigangliosid GD2 Antikörper, dessen Bindung an neuroektodermale Gewebe bei der Behandlung von Neuroblastomen zur Therapie genutzt wird. Die alpha-Partikel emittierenden Isotope 225Ac, 213Bi und 149Tb wurden mittels geeigneter Chelate an die Antikörper gekoppelt. Die Zytotoxizität der Radioimmunkonjugate gegenüber Zellen in Suspension, Zellpellets und Spheroiden wurde mittels 3H-Thymidininkorporierung, Tunel Assay, klonogenem Assay und Chromosomenaberrationen evaluiert. Die experimentellen Resultate bezüglich der Zytotoxizität von 213Bi-6H8 und 149Tb-6H8 gegenüber Zellsuspensionen wurde verglichen mit theoretisch ermittelten Ergebnissen, mit Hilfe eines Monte Carlo Algorithmus für Mikrodosimetrie. Die untersuchten Zelllinien unterschieden sich in ihrer Sensibilität gegenüber alpha-Partikeln sowie hinsichtlich des Auftretens von Apoptose. Um je 50% der Zellen einer Zelllinie mittels alpha-Emitter abzutöten (LD50) bedarf es für MDA Zellen einer 4,5 fach hohen Anzahl an alpha-Partikeln verglichen zu NMB7 und HL60 Zellen. Ein positiver Apoptosenachweis mittels Tunel Assay konnte jedoch nur für die HL60 Zellen geführt werden. Die zytotoxische Wirkung der alpha-Immunkonjugate erwies sich als abhängig von der Expression des entsprechenden Antigens, der Antigendichte auf der Zelloberfläche, der Affinität der verwendeten Antikörper zu den Antigenen, sowie der Rate der Internalisierung. So ändert sich der LD50-Wert der NMB7 Zellen durch die selektive Bindung des Radioimmunkonjugates 225Ac-3F8 an Zellen in Suspension von 30 Bq/ml auf 3,3 Bq/ml. Im Gegensatz dazu ist bei der Zelllinie MDA, die deutlich weniger Antigene exprimiert und diese auch fast nicht internalisieren, der LD50-Wert nach selektiver Bindung von 213Bi-6H8 an die Einzelzellen von 444 kBq/ml auf 130 kBq/ml gesunken. Nach Inkubation mit 740 kBq/ml 213Bi waren in 50% der MDA Zellen schwere Chromosomenaberrationen nachweisbar. Korrespondierend dazu lag bei 444 kBq/ml eine Verminderung der Proliferationsfähigkeit um 50% vor und bei 814 kBq eine Einschränkung der klonogenen Potenz der Zellen auf 50%. 149Tb-6H8 und 213Bi-6H8 zeigten trotz unterschiedlicher Partikelenergien (4 MeV versus 8 MeV) ähnliche Zytotoxizität gegenüber Zellsuspensionen. Gegenüber Zellpellets und Spheroiden dagegen zeigte nur 213Bi-6H8 einen starken zytotoxischen Effekt, aufgrund eines ausgeprägten Crossfire-Effekts. Die mikrodosimetrische Simulation der Experimente an Zellsuspension war in guter Übereinstimmung mit der experimentell ermittelten Zytotoxizität. Nur für 213Bi wurde eine im Vergleich zum Experiment etwas höhere Zytotoxizität berechnet. Die Erhöhung der Zytotoxizität der alpha-Immunkonjugate im Zellmodell durch selektive Bindung ist für die therapeutische Anwendung ein sehr vielversprechendes Ergebnis. Vor einer klinischen Untersuchung können weitere Einflussgrößen, die die Auswahl der Nuklide und der Antikörper bestimmen im Tierexperiment evaluiert werden und an individuellen Tumorzellen Antigendichte, Internalisierung und Sensibilität gegenüber alpha-Emittern bestimmt werden. Aber erst in klinischen Studien werden sich eventuelle Überlegenheiten der alpha-Radioimmuntherapie gegenüber etablierten Therapien endgültig beweisen lassen. Treatment of minimal residual disease and loco-regional dissemination or tumors is a challenge in the course of most cancers. One promising treatment approach is radioimmunotherapy utilizing alpha emitting nuclides. Alpha emitting nuclides possess the advantage of very short range in tissue and a high linear energy transfer leading to selective damage at the site of decay. In this study the alpha emitting isotopes Ac-225, Bi-213 and Tb-149 were coupled to the monoclonal antibodies 6H8, HuM195 and 3F8. 6H8 binds to d9 mutated E-cadherin expressed in 10% of diffuse type gastric cancer, HuM195 is binding to CD33, found on 90% of acute myeloic leukemias and 3F8 is an anti-ganglioside GD2 antibody binding to some tumors of neuroendocrine origin. Cytotoxicity of these alpha immunoconjugates towards cells in suspension, cell pellets and tumor cell spheroids were investigated using H-3-Thymidine incorporation, Tunel Assay, clonogenic assay and chromosomal aberration assay. In addition the experimental findings were compared to microdosimetric predictions calculated by a Monte Carlo algorithm. Radiosensitivity of the investigated tumor cell lines after alpha irradiation varied by a factor of up to 4.5 and only HL60 leukemia cells died by apoptosis. Also antibody affinity, antigen expression and rate of internalisation played major roles in determination of the cytotoxic effect caused by the alpha immunoconjugates. For example, LD50 values - after incubation with Ac-225-3F8 - of NMB7 neuroblastoma cells, displaying approx. 5 million internalising binding sites changed from 3,3 Bq/ml to 30 Bq/ml when binding sites were blocked by excess unlabeled 3F8. Incubation with 740 kBq/ml Bi-213-6H8 caused in 50% of MDA breast cancer cells multiple and heavy chromosomal aberrations. In analogy, proliferation capacity was reduced to 50% by 444 kBq/ml and clonogenic capacity of 50% was caused by 814 kBq/ml. Tb-149-6H8 and Bi-213-6H8 showed - despite different particle energies (4 MeV and 8 MeV) - identical cytotoxicity in cell suspensions. In contrast, in cell clusters only Bi-213-6H8 was able to cause preferential cell killing of binding site expressing cell pellets or spheroids. Theoretical calculations matched these findings with reasonable accuracy. Thus the potency of alpha immunoconjugates could be shown on single cell and small tumor cell cluster state and further in vivo or clinical studies will determine eventual benefits of alpha immunotherapy in cancer treatment.