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Understanding how in eukaryotic cells thousands of proteins are sorted from each other through the secretory pathway and delivered to their correct destinations is a central issue of cell biology. We have further investigated in yeast how two distinct types of cargo proteins are sorted into different endoplasmic reticulum (ER) exit sites (ERES) for their differential ER export to the Golgi apparatus. We used an optimized protocol that combines a live cell dual-cargo ER export system with a 3D simultaneous multi-color high-resolution live cell microscopy called Super-resolution Confocal Live Imaging Microscopy (SCLIM). Here, we describe this protocol, which is based on the reversible ER retention of two de novo co-expressed cargos by blocking COPII function upon incubation of the thermo-sensitive COPII allele sec31-1 at restrictive temperature (37°C). ER export is restored by shifting down to permissive temperature (24°C) and progressive incorporation of the two different types of cargos into the fluorescently labelled ERES can be then simultaneously captured at 3D high spatial resolution by SCLIM microscopy. By using this protocol, we have shown that newly synthesized glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchored proteins having a very long chain ceramide lipid moiety are clustered and sorted into specialized ERES that are distinct from those used by transmembrane secretory proteins. Furthermore, we showed that the chain length of the ceramide present in the ER membrane is critical for this sorting selectivity. Therefore, thanks to the presented method we could obtain the first direct in vivo evidence for lipid chain length-based protein cargo sorting into selective ERES., MM, BFU2017-89700-P, FEDER/Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades-Agencia Estatal de Investigación, https://www.ciencia.gob.es/portal/site/MICINN/aei AN and KK, JP25221103, JP17H06420 and JP18H05275, Japan Society for the Promotion of Science (JSPS), https://www.jsps.go.jp/english/index.html

Glycosylphosphatidylinositol (GPI) anchoring of proteins is an essential post-translational modification in all eukaryotes that occurs at the endoplasmic reticulum (ER) and serves to deliver GPI-anchored proteins (GPI-APs) to the cell surface where they play a wide variety of vital physiological roles. This paper describes a specialized method for purification and structural analysis of the GPI glycan of individual GPI-APs in yeast. The protocol involves the expression of a specific GPI-AP tagged with GFP, enzymatic release from the cellular membrane fraction, immunopurification, separation by electrophoresis and analysis of the peptides bearing GPI glycans by mass spectrometry after trypsin digestion. We used specifically this protocol to address the structural remodeling that undergoes the GPI glycan of a specific GPI-AP during its transport to the cell surface. This method can be also applied to investigate the GPI-AP biosynthetic pathway and to directly confirm predicted GPI-anchoring of individual proteins., MM. BFU2017-89700-P. FEDER/Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades—Agencia Estatal de Investigación. http://www.aei.gob.es/. MN and KF. JP19H02922. Japan Society for the Promotion of Science. https://www.jsps.go.jp/english/.

[ES]La transición de células B (CB) a células plasmáticas (CP) implica profundas modificaciones transcripcionales que dan como resultado el fenotipo de CP, caracterizado por una capacidad de supervivencia a largo plazo, y la producción y secreción de anticuerpos. Los defectos en el desarrollo de las CP pueden provocar enfermedades graves. De hecho, la interrupción del proceso de diferenciación de la CB, como consecuencia de mutaciones en factores clave en su maduración, se ha asociado con la transformación maligna de las CB. Aunque el conocimiento de las bases moleculares que regulan la formación de la CP ha avanzado en los últimos años, muchos de los mecanismos implicados en el mantenimiento de las CP de larga duración, que son las células que se acumulan anormalmente en la medula ósea de los pacientes con MM, son aún desconocidos. Profundizar en el conocimiento de los factores implicados en la maduración de las CP podría ayudarnos a comprender la patogenia del MM y, por tanto, brindar nuevas perspectivas para el desarrollo de estrategias terapéuticas más efectivas que ayuden a bloquear la actividad tumoral de las CP en el MM. En un análisis previo de expresión génica mediante microarrays, habíamos observado que el ARNm que codifica DEPTOR e IRE1 estaba sobreexpresado en las CP normales y en las células del mieloma múltiple (MM) en comparación con los linfocitos B normales. Por este motivo, planteamos la hipótesis de que la expresión variable de las proteínas DEPTOR e IRE1 podría contribuir a inducir diferentes estados de maduración de las células del MM. DEPTOR es un inhibidor de mTOR que está sobreexpresado en los MM con translocaciones de CCND1 o CCND3, o MAF o MAFB. En estas células, se observó que se necesitaba una alta expresión de DEPTOR para mantener la activación de PI3K y AKT, y que la reducción de los niveles de DEPTOR conducía a la apoptosis. Sin embargo, no se ha descrito el posible papel de DEPTOR en la maduración de la CP. Se ha demostrado que el sensor de estrés en el retículo endoplásmico, IRE1, es necesario durante la diferenciación temprana y tardía de las CB. Por un lado, es fundamental en la etapa de células pro-B para la recombinación de los segmentos V(D)J de los genes de las inmunoglobulinas, y por otro lado, se ha demostrado que IRE1 es indispensable para la diferenciación terminal de la CB en CP a través de la activación de XBP1. En los últimos años, se ha descubierto que numerosos microRNAs participan en la maduración de las CB. Este hecho nos llevó a pensar que la expresión tanto de DEPTOR como de IRE1 también podría estar regulada a nivel postranscripcional por microRNAs. Además de participar en la maduración de la CP, también se ha demostrado que IRE1 es capaz de degradar algunos ARNm de una manera diferente a como lo hace con XBP1. Este mecanismo conocido como “regulated IRE1-dependent decay (RIDD)” puede depender de la naturaleza de los estímulos de estrés y del tejido donde se produzca. Diferentes investigaciones sugieren que aún quedan muchas dianas de RIDD por identificar. En las células de mieloma, la única diana de RIDD que se ha identificado es el ARNm de BLOC1S1. Nuestra hipótesis era que podrían existir muchas otras dianas RIDD en el MM y que algunas de ellas podrían regular la supervivencia o proliferación de las células del MM.

Protein sorting in the secretory pathway is crucial to maintain cellular compartmentalization and homeostasis. In addition to coat-mediated sorting, the role of lipids in driving protein sorting during secretory transport is a longstanding fundamental question that still remains unanswered. Here, we conduct 3D simultaneous multicolor high-resolution live imaging to demonstrate in vivo that newly synthesized glycosylphosphatidylinositol-anchored proteins having a very long chain ceramide lipid moiety are clustered and sorted into specialized endoplasmic reticulum exit sites that are distinct from those used by transmembrane proteins. Furthermore, we show that the chain length of ceramide in the endoplasmic reticulum membrane is critical for this sorting selectivity. Our study provides the first direct in vivo evidence for lipid chain length-based protein cargo sorting into selective export sites of the secretory thway., This research was funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (MINECO; grant number BFU2017-89700-P to M.M.), “VI Own Research Plan” of the University of Seville (VIPPIT-2020-I.5 to M.M.), and Grants-in-Aid for Scientific Research from Japan Society for the Promotion of Science (JP25221103, JP17H06420, and JP18H05275 to A.N. and K. K.; and JP19H02922 to M.N. and K.F.). S.V. and V.Z. acknowledge support from the Swiss National Science Foundation (grant no. 163966) and from the Swiss National Supercomputing Centre (CSCS) under project IDs s726 and s842. H.R. is supported by the Swiss National Science Foundation and the NCCR Chemical Biology (grants 184949 and 185898). This research was funded by the “VI Own Research Plan “of the University of Seville (VIPPIT-2020-I.5); “V Own Research Plan” of the University of Seville (VPPI-US) contract (cofounded by the European Social Fund) to S.L.; University of Seville fellowship to S.R.-G.; Ministry of Education, Culture, and Sport (MECD) fellowship to S.S.-B.; and contract from the University of Seville by the Youth Employment Initiative to A.C.-G.

10 p. Aging has been related with a decline in the ability to handle protein folding, which leads to endoplasmic reticulum stress and alterations in unfolded protein response (UPR). Importantly, physical activity could activate the UPR and attenuate or prevent age-induced endoplasmic reticulum (ER) dysfunction. The current study evaluated the effects of a resistance exercise on UPR and mitochondrial functions in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from elderly subjects. Thirty healthy women and men (age, 72.8, sx− = 2.2 years) were randomized to a training group, which performed an 8-week resistance training programme, or a control group, which followed their daily routines. The phosphorylation of PERK and IRE1, as well as ATF4, and XBP1 protein expression, significantly increased following the training, while expression of BiP, AFT6 and CHOP remain without changes. Additionally, the intervention also induced an increase in PGC-1α and Mfn1 protein levels, while no changes were found in Drp1 expression. Finally, the resistance protocol was not able to activate PINK1/Parkin and Bnip3/Nix pathways. The results obtained seem to indicate that 8-week resistance exercise activates the UPR, stimulates mitochondrial biogenesis, maintains mitochondrial dynamics and prevents mitophagy activation by unfolded proteins in PBMCs from elderly subjects. SI

[ES] Los ácidos biliares desempeñan un papel determinante en la función digestiva y excretora del hígado, pero, además, son importantes moléculas de señalización implicadas en la regulación del metabolismo energético y de los procesos inflamatorios y regenerativos del hígado. Existe una gran variedad de patologías asociadas a fallos en el metabolismo de los ácidos biliares. Se trata, en la mayor parte de los casos, de afecciones muy graves y poco frecuentes, que no sólo afectan al tejido hepático, sino que pueden acompañarse también de trastornos neurológicos, renales y endocrinos debido a la acumulación de metabolitos intermediarios con potencial toxicidad. En esta Tesis Doctoral se describe y estudia el caso de un paciente adolescente con hipertransaminasemia idiopática persistente. Tras descartar las patologías asociadas a daño hepático más comunes, el análisis genético permitió identificar una mutación (c.673C>T) en la región codificante del gen ACOX2, cuyo producto es la variante R225W de la enzima implicada en la síntesis de novo de los ácidos biliares acil-CoA oxidasa 2 (ACOX2). Los estudios funcionales en modelos celulares in vitro revelaron que la mutación causa una reducción de la actividad de esta enzima peroxisomal que acarrea una deficiencia de ácidos biliares maduros y la acumulación de metabolitos intermediarios tóxicos, capaces de inducir estrés oxidativo y de retículo endoplásmico. Los resultados del estudio sugieren que la deficiencia parcial de ACOX2 (APD) podría ser un trastorno más frecuente que las patologías asociadas al metabolismo de los ácidos biliares descritas hasta ahora y estar implicada en la etiología de otros casos de hipertransaminasemia persistente de causa no filiada, así como constituir un factor predisponente a la toxicidad por fármacos. Asimismo, la deficiencia de ACOX2 podría agravar la progresión de enfermedades hepáticas comunes que cursan con inflamación, como la esteatohepatitis no alcohólica. En esta Tesis Doctoral se ha desarrollado un modelo animal “avatar” de la enfermedad, mediante la edición del genoma del ratón con CRISPR/Cas9. Esta valiosa herramienta permitirá el desarrollo de nuevos estudios que ayudarán a caracterizar la fisiopatología de la APD, a evaluar nuevos tratamientos terapéuticos y a determinar el papel de ACOX2 en otras patologías hepáticas.

9 p. The endoplasmic reticulum (ER) is a dynamic and multifunctional organelle responsible for protein biosynthesis, folding, assembly and modifications. Loss of protein folding regulation, which leads to unfolded or misfolded proteins accumulation inside the ER lumen, drives ER stress (ERS) and unfolded protein response (UPR) activation. During aging, there is a decline in the ability of the cell to handle protein folding, accumulation and aggregation, and the function of UPR is compromised. There is a progressive failure of the chaperoning systems and a decline in many of its components, so that the UPR activation cannot rescue the ERS. Physical activity has been proposed as a powerful tool against aged-related diseases, which are linked to ERS. Interventional studies have demonstrated that regular exercise is able to decrease oxidative stress and inflammation and reverse mitochondrial and ER dysfunctions. Exercise-induced metabolic stress could activate the UPR since muscle contraction is directly involved in its activation, mediating exercise-induced adaptation responses. In fact, regular moderate-intensity exercise-induced ERS acts as a protective mechanism against current and future stressors. However, biological responses vary according to exercise intensity and therefore induce different degrees of ERS and UPR activation. This article reviews the effects of aging and exercise on ERS and UPR, also analyzing possible changes induced by different types of exercise in elderly subjects. SI

[EN] Heart failure is a multifactorial syndrome characterized by alterations in ventricular function and cardiac chambers dilation, being a cause of increase of morbidity, mortality and health costs. Dilated and ischemic cardiomyopathies are frequent causes of this syndrome. Despite the progress in treatment of heart failure, the prognosis has not improved significantly in the last years, because of that, we need a development of novel treatment strategies, given the limited efficacy of current therapies. This syndrome can be associated to alterations in heart contraction. Endoplasmic reticulum is the major intracellular calcium storage necessary for heart contraction onset. On the other hand, ion channels regulate heart contraction and are responsible for the ion currents that determine and influence the action potential of heart muscle. In this Thesis we aimed to study, in a group of patients with heart failure, the changes existing in the structural and stress response proteins of the endoplasmic reticulum, as well as the gene expression of cardiac ion channels, relating these alterations with ventricular dysfunction of these patients. Our results showed the presence of alterations in the majority of structural and stress proteins of the endoplasmic reticulum, being the structural protein RRBP1 related to ventricular dysfunction and also to the stress protein XBP1. This evidences a specific dependency between stress and structure in this organelle and an influence of structural changes in ventricular function of patients. Additionally, we showed different expression changes of a large number of cardiac ion channels through microarrays and RNA sequencing techniques. Of these channels, down-regulation of CACNG8 related to ventricular function improvement and increased levels of KCNJ2 and KCNN3 with ventricular dysfunction in dilated cardiomyopathy. In ischemic cardiomyopathy, reduced levels of TRPM7 channel were related to a better ventricular function. Differential gene expression of this category in both cardiomyopathies, could explain the changes in the different ion currents that affect the myocardial contraction process in heart failure. In conclusion, we show alterations in the expression of two key components of cardiac muscle contraction that could provide novel basis for their study and regulation as possible therapeutic targets for the improvement of cardiac contractility in patients with heart failure., [ES] La insuficiencia cardíaca es un síndrome multifactorial que se acompaña de alteraciones en la función ventricular y dilatación de las cámaras cardíacas, siendo causa de aumento de morbilidad, mortalidad y gasto sanitario. Las miocardiopatías dilatada e isquémica son causas muy frecuentes de este síndrome. A pesar de los avances que se han producido en el tratamiento de la insuficiencia cardíaca, el pronóstico no ha mejorado significativamente en los últimos años. Es por ello, que existe una necesidad de desarrollar nuevas estrategias para su tratamiento, dada la eficacia limitada de las terapias actuales. Este síndrome puede estar asociado a alteraciones en la contracción del corazón. El retículo endoplásmico es el principal almacén de calcio intracelular necesario para el inicio del proceso de contracción del corazón. Por otro lado, los canales iónicos regulan la contracción del músculo cardíaco y son responsables de las corrientes de iones que determinan e influyen sobre el potencial de acción cardíaco. En esta Tesis nos planteamos estudiar, en un grupo de pacientes con insuficiencia cardíaca, los cambios existentes en las proteínas que conforman la estructura y participan en la respuesta a estrés del retículo endoplásmico, así como analizar la expresión génica de canales iónicos cardíacos y relacionar estas alteraciones con la disfunción ventricular de estos pacientes. Nuestros resultados muestran la presencia de alteraciones en la mayoría de proteínas estructurales y de respuesta a estrés del retículo endoplásmico, siendo RRBP1 la que presenta relaciones significativas con la disfunción cardíaca de los pacientes y también con la proteína de estrés XBP1. Ello evidencia una dependencia específica entre estructura y estrés de este orgánulo y una influencia de estas alteraciones estructurales sobre la función ventricular de los pacientes. Además, mostramos diferentes cambios de expresión en un gran número de canales iónicos cardíacos mediante microarrays y secuenciación de ARN. De estos canales, en la miocardiopatía dilatada encontramos que los niveles reducidos de CACNG8 se relacionan con una mejora en la función y los niveles aumentados de KCNJ2 y KCNN3 se relacionan con una mayor disfunción ventricular. En el caso de estas alteraciones en la miocardiopatía isquémica, los niveles reducidos del canal TRPM7 favorecen una mejora de la función del ventrículo izquierdo. La expresión génica diferencial de esta categoría en ambas miocardiopatías, podría explicar las alteraciones en las diferentes corrientes iónicas que afectan al proceso de contracción del miocardio en la insuficiencia cardíaca. En conclusión, demostramos la presencia de alteraciones en dos componentes clave para la contracción del miocardio que pueden proporcionar nuevas bases para su estudio y regulación como diana de posibles tratamientos para la mejora de la alteración en la contractilidad del corazón en pacientes con insuficiencia cardíaca., [CA] La insuficiència cardíaca és una síndrome multifactorial que s'acompanya d'alteracions en la funció ventricular i dilatació de les cambres cardíaques, a més de ser causa d'augment de morbiditat, mortalitat i cost sanitari. Les miocardiopatíes dilatada i isquèmica són causes molt freqüents d'esta síndrome. A pesar dels avanços que s'han produït en el tractament de la insuficiència cardíaca, el pronòstic no ha millorat significativament en els últims anys. És per això que hi ha una necessitat de desenvolupar noves estratègies per al seu tractament, donada l'eficàcia limitada de les teràpies actuals. Esta síndrome s'associa amb alteracions en la contracció del cor. El reticle endoplàsmic és el principal magatzem de calci intracel·lular necessari per a l'inici del procés de contracció del cor. D'altra banda, els canals iònics regulen la contracció del múscul cardíac i són responsables dels corrents d'ions que determinen i influïxen sobre el potencial d'acció cardíac. En esta Tesi ens plantegarem estudiar, en un grup de pacients amb insuficiència cardíaca, els canvis existents en les proteïnes que conformen l'estructura i participen en la resposta a estrés del reticle endoplàsmic, així com analitzar l'expressió gènica de canals iònics cardíacs i relacionar estes alteracions amb la disfunció ventricular dels pacients. Els nostres resultats mostren la presència d'alteracions en la majoria de proteïnes estructurals i de resposta a estrés del reticle endoplàsmic, sent la proteína estructural RRBP1 la que presenta relacions significatives amb la disfunció cardíaca dels pacients i també amb la proteïna d'estrés XBP1. Aixó evidencia una dependència específica entre estructura i estrés d'este orgànul i una influència d'estes alteracions estructurals sobre la funció ventricular dels pacients. A més, mostrem diferents canvis d'expressió en un gran nombre de canals iònics cardíacs per mitjà de microarrays i sequenciació d'ARN. D'estos canals, trobem que els nivells reduïts de CACNG8 es relacionen amb una millora en la funció i els nivells augmentats de KCNJ2 i KCNN3 es relacionen amb una major disfunció ventricular en la miocardiopatía dilatada. En el cas d'estes alteracions en la miocardiopatía isquèmica, els nivells reduïts del canal TRPM7 afavorixen una millora de la funció del ventricle esquerre. L'expressió gènica diferencial d'esta categoria en ambdós miocardiopatíes, podria explicar les alteracions en els diferents corrents iònics que afecten el procés de contracció del miocardi en la insuficiència cardíaca. En conclusió, demostrem la presència d'alteracions en dos components clau per a la contracció del miocardi que poden proporcionar noves bases per al seu estudi i regulació com a diana de possibles tractaments per a la millora de l'alteració en la contractilitat del cor en pacients amb insuficiència cardíaca.

Las proteínas de membranas corresponden a una fracción significativa, entre un 20-30%, del proteoma eucariota y están implicadas en una variedad de funciones celulares. Sin embargo, muchas veces su estudio es complicado, con respecto a sus contrapartes citoplasmáticas, debido principalmente a su naturaleza hidrofóbica. En el presente trabajo se caracterizó a Rot1, una proteína de membrana esencial de Saccharomyces cerevisiae. Esta proteína posee un dominio transmembrana (TM) en su extremo C-terminal necesario tanto para anclarse a la membrana del retículo endoplásmico (RE) como para la función de la proteína, la cual se desconoce, aunque se ha visto relacionada con diferentes procesos celulares como el metabolismo de la pared celular o el control del ciclo celular. Aquí, se determinaron los residuos esenciales dentro del dominio TM, importantes para que la proteína funcione correctamente, así como las regiones de la proteína implicadas en su proceso de señalización al RE y su mecanismo de degradación. Además, se propuso la realización de una búsqueda de posibles proteínas que interaccionen con Rot1, para intentar establecer a nivel molecular la función que cumple Rot1 en S. cerevisiae.

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica Submitted by Alexandra Bastos (alexandrabastos@ua.pt) on 2015-06-24T14:56:36Z No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 1534823 bytes, checksum: 1cf336e0876846e30fc366ee9e719161 (MD5) Made available in DSpace on 2015-06-24T14:56:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese.pdf: 1534823 bytes, checksum: 1cf336e0876846e30fc366ee9e719161 (MD5) Previous issue date: 2014-12-19

Mestrado em Bioquímica - Bioquímica Clínica Breast cancer is the most prevalent cancer among women and also one of the oncologic pathologies that causes more deaths. In the last decades several studies have reported that solid tumors generate an immunosuppressive microenvironment. This microenvironment (acidosis, hypoxia, glucose deprivation and cytokines) is favourable to endoplasmic reticulum (ER) stress induction. ER stress is primarily a response towards the re-establishment of homeostasis; however if not resolved it usually results in cell death by apoptosis. Nevertheless, ER stress and unfolded protein response (UPR) play a paradoxical role in cancer physiopathology: the three branches of UPR, PERK, IRE1 and ATF6 actively contribute to signalling of survival and metastasis mechanisms. Recently it was reported a possible transmission of ER stress from tumor cells to immune cells, modulating the phenotype and function of recipient cells. Thus, the aim of the present work is to assess the ability and the respective mechanisms by which T-47D tumor cells transmit ER stress to THP-1 monocytes, and the consequences of this transmission. ER stress transmission was only observed when pharmacological ER stress inducers were used, such as tunicamycin, contrarily to physiological stimulation, as glucose deprivation. Additionally, it was found that tunicamycin seems to be transported within exosomes which, in turn, directly induces ER stress on monocytes. It was also observed that exosomes derived from glucose deprived T-47D cells do not transmit ER stress; however these exosomes conduct monocytes towards a particular proinflammatory profile, accompanied by the decrease of its maturation status. Overall, our results question the ER stress mechanism originally described, showing that pharmacological ER stress inducers can be transported within exosomes and directly inducing ER stress on recipient cells. O cancro da mama é o cancro de maior incidência entre as mulheres, sendo também uma das situações oncológicas que mais mortes causa. Na última década inúmeros estudos têm demonstrado que os tumores sólidos geram um microambiente favorável à evasão/subversão do sistema imune. Esse microambiente (acidose, hipoxia, deprivação de glucose, citoquinas) é muita das vezes propicio à indução de stress do reticulo endoplasmático (RE). O stress do RE é primariamente uma resposta no sentido de restabelecer a homeostasia no entanto se não resolvido resulta normalmente na morte celular por apoptose. O stress do RE e a respetiva resposta às proteínas mal conformadas (UPR), desempenham um papel paradoxal na fisiopatologia do cancro: os três ramos da UPR, PERK, IRE1 e ATF6, contribuem ativamente para a sinalização de alguns mecanismos de sobrevivência e metastização. Recentemente, foi descrita uma possível transmissão do stress do RE das células tumorais para as células do sistema imunitário, modulando a ação destas. Desta forma, pretendeu avaliar-se com o presente trabalho a capacidade e os mecanismos pelos quais células tumorais T-47D transmitem o stress do RE para células monocíticas THP-1, e quais as consequências desta transmissão. A transmissão foi apenas observada aquando da utilização de indutores farmacológicos como a tunicamicina, não se registando para estímulos fisiológicos como a deprivação de glucose. Por outro lado, verificou-se que a tunicamicina parece ser transportada via exossomas e desta forma induzir diretamente stress do RE nos monócitos. Observou-se ainda que os exossomas provenientes das células T-47D em stress do RE por deprivação de glucose apesar de não transmitirem o referido stress conduzem os monócitos para um perfil pró-inflamatório específico diminuindo ainda a sua capacidade de maturação. Em geral, os nossos resultados questionam seriamente o mecanismo de transmissão de stress ER tal como originalmente descrito, mostrando que no uso de indutores farmacológicos o que parece ocorrer é o transporte do fármaco em vesículas e a indução direta nas células recetoras.

Mestrado em Bioquímica - Métodos Biomoleculares As doenças cardiovasculares representam a principal causa de mortalidade nos países desenvolvidos. Na sua génese encontra-se frequentemente a aterosclerose, um processo inflamatório crónico de origem multifatorial caracterizado pela acumulação e oxidação de lipoproteínas e recrutamento de macrófagos para o subendotélio arterial. A progressão da patologia encontra-se intimamente ligada à disfunção e morte dos macrófagos após fagocitose de lipoproteínas oxidadas. Embora não totalmente conhecido sabe-se que este processo envolve o desenvolvimento de stress do reticulo e ativação dos vários ramos da unfolded protein response (UPR). Neste contexto definiram-se dois objetivos a serem desenvolvidos no presente trabalho. No primeiro pretendeu-se compreender a influência do stress do retículo no metabolismo lipídico de macrófagos e as suas possíveis relações com a progressão da aterosclerose. Para tal foi usada como modelo experimental a linha celular de macrófagos de murganho RAW 264.7 estimulada com os indutores de stress Tunicamicina e 7-Cetocolesterol. Através de uma abordagem lipidómica determinou-se o efeito do stress do retículo no perfil lipídico do macrófago e através de qPCR foi avaliado o seu efeito num painel de genes envolvidos no metabolismo lipídico. Sucintamente, verificou-se o aumento da percentagem relativa das classes de fosfolípidos PI, LPC, PS, CL e PG, sendo em contrapartida observada uma diminuição de PC, SM e PE, consistente para ambos os estímulos. Ao nível dos ácidos gordos, verificou-se a alteração no rácio de saturados/insaturados, com aumento relativo dos primeiros. A diminuição observada na percentagem de ácidos gordos insaturados, a qual sugere a oxidação dos mesmos, foi corroborada pelo aumento detetado na percentagem de hidroperóxidos lipídicos e pela formação de espécies reativas de oxigénio para ambos os estímulos. A análise do efeito do stress do retículo na transcrição de genes envolvidos no metabolismo lipídico mostrou existirem diferenças substanciais no perfil obtido para cada um dos estímulos usados. A segunda parte do trabalho prendeu-se no estudo da capacidade dos fosfolípidos oxidados em induzir stress do retículo endoplasmático. Para tal tratou-se as células RAW 264.7 com o fosfolípido 1-palmitoil-2-linoleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (PLPC) oxidado em condições de Fenton. No entanto os resultados preliminares alcançados não permitiram inferir conclusões no que respeita à capacidade do fosfolípido PLPC oxidado em ativar os diversos ramos da UPR. Cardiovascular diseases are the main cause of mortality in developed countries. In its origin is often atherosclerosis, a multifactorial inflammatory process characterized by the accumulation and oxidation of lipoproteins and recruitment of macrophages to the endothelium space. The progression of the pathology is intimately linked to dysfunction and dead of macrophages after phagocytosis of oxidized lipoproteins. Although not fully disclosed, this process evolves the development of endoplasmic reticulum stress and activation of the diverse branches of the unfolded protein response (UPR). In this context we established two main objectives for the present work. In the first we intended to understand the influence of endoplasmic reticulum stress in the lipid metabolism of macrophages and its possible relations to atherosclerosis progression. For this, murine macrophage cellular line RAW 264.7 stimulated with the stress inductors Tunicamycin and 7-Ketocholesterol was used as experimental model. Through a lipidomic approach it was determined the effect of reticulum stress on macrophage lipid profile and by qPCR it was estimated the effect in a panel of genes related with lipid metabolism. Briefly, it was observed an increase in the relative percentage of PI, LPC PS, CL and PG, phospholipid classes, while PC, SM and PE were decreased, consistent for both stimulus. In fatty acids analysis, we observed an alteration in saturated/unsaturated ratio, being the first only slightly increased. The observed decrease in the percentage of unsaturated fatty acids suggested their oxidation, and this hypothesis was supported by an observed increase of lipid hydroperoxide percentage and reactive oxygen species formation for both stimulus. The analysis of the effect of endoplasmic reticulum stress in the transcription of genes related with lipid metabolism showed substantial differences in the profile obtained for each stimulus used. The second part of the work it was based in the study of the ability of oxidized phospholipids to induce stress in endoplasmic reticulum. RAW 264.7 cells were treated with the phospholipid 1-palmitoyl-2-linoleoyl-sn-glycero-3- phosphocholine (PLPC) oxidized under Fenton reaction. Nevertheless the preliminary results do not allowed to conclude about the ability of oxidized PLPC in activating the diverse branches of UPR.

La UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT) es el sensor de la conformación de las glicoproteínas en el “Control de Calidad de Plegamiento de Glicoproteínas” ya que sólo presenta actividad sobre glicoproteínas que no se encuentran en su conformación nativa. Las glicoproteínas que presentan oligosacáridos monoglucosilados interaccionan con lectinas-chaperonas presentes en el Retículo endoplásmico (RE) como Calnexina y Calreticulina lo cual previene que los intermediarios de plegamiento inmaduros continúen su camino hacia el Aparato de Golgi. En C. elegans existen dos genes, uggt-1 y uggt-2, homólogos a los que codifican para las UGGT en diferentes organismos. La expresión de las proteínas UGGT-1 y UGGT-2 en S. pombe alg6 gpt1-, que carece de actividad de UGGT, permitió demostrar que uggt-1 codifica para una UGGT activa (CeUGGT-1), mientras que la proteína codificada por uggt-2 carece de actividad de UGGT (CeUGGT-2). Mediante la construcción de proteínas quiméricas, se determinó que el dominio C-terminal de CeUGGT-2 es incapaz de transferir glucosa a proteínas mal plegadas. El estudio del gusano mutante de uggt-2 (VC1961) reveló que CeUGGT-2 es esencial para la viablidad del nematodo ya que los gusanos uggt-2 -/- se arrestan en estadíos embrionarios y en L1 mostrando un tamaño menor y posibles defectos en la cutícula. Mediante Real Time PCR observamos que ambos genes se expresan durante todo el ciclo de vida de C. elegans. Mediante la construcción de gusanos transgénicos pudimos detectar expresión de CeUGGT-1 en todas las células y tejidos del nematodo. uggt-1 se induce en condiciones de estrés de RE a través de la vía de señalización de ire-1 en la respuesta a proteínas mal plegadas (UPR), mientras que uggt-2 no lo hace. El silenciamiento de la expresión de la proteína UGGT-1 y UGGT-2 por ensayos de RNAi produjeron un retraso en el desarrollo en gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) y resultaron en una disminución de la sobrevida de gusanos uggt-1(RNAi). CeUGGT-1 y CeUGGT-2 juegan un rol protector ante condiciones de estrés de RE ya que con 10 μg/ml de Tunicamicina (TN) se arrestó el crecimiento de gusanos uggt-1(RNAi) y uggt-2(RNAi) en L2/L3 pero no el de gusanos control. Además ensayos de RNAi a bajas concentraciones de TN en ausencia de ire-1, sugirieron que CeUGGT-2 es importante para aliviar los bajos niveles de estrés de RE en ausencia de esta vía de la UPR. Estos resultados indicarían que ambos homólogos de UGGT de C. elegans poseerían distintas funciones biológicas. The UDP-Glc:glycoprotein glucosyltransferase (UGGT) is the sensor of glycoprotein conformations in the glycoprotein folding quality control as it exclusively glucosylates glycoproteins not displaying their native conformations. Monoglucosylated glycoproteins thus formed may interact with the lectin-chaperones calnexin and calreticulin. This interaction prevents premature exit of folding intermediates to the Golgi. Bioinformatic analysis showed that in C. elegans there are two genes, uggt-1 and uggt-2, coding for UGGT homologues. Expression of both genes in S. pombe mutants devoid of UGGT activity showed that uggt-1 codes for an active UGGT protein (CeUGGT-1). On the other hand, uggt-2 coded for a protein (CeUGGT-2) apparently not displaying a canonical UGGT activity and conversely to what happens in humans, the C-terminal domain of CeUGGT-2 is inactive. However, uggt-2 is not a pseudogene as we can detect its expression along the entire development. The study of the mutant worm VC1961 revealed that CeUGGT-2 is essential for viability. Worms uggt-2 -/- were arrested in embryonic and L1 stages and they showed smaller size and possible defects in the cuticle. Furthermore, Real-time PCR analysis showed that both uggt-1 and uggt-2 genes are expressed during the entire C. elegans life cycle. Moreover, transgenic worms constructed by fosmid recombineering technique carrying the gfp under the control of uggt-1 promoter indicated that that CeUGGT-1 is expressed in all cells and tissues of the nematode. uggt-1, but not uggt-2, is upregulated under ER stress through the ire-1 arm of the unfolded protein response (UPR). RNAi-mediated depletion of CeUGGT-1 but not of CeUGGT-2 resulted in a reduced lifespan and that of CeUGGT-1 and CeUGGT-2 in a developmental delay. We found that both CeUGGT1 and CeUGGT2 play a protective role under ER stress conditions, since 10 μg/ml tunicamycin (TN) arrested development at the L2/L3 stage of both uggt-1(RNAi) and uggt-2(RNAi) but not of control worms. Furthermore, we found that the role of CeUGGT-2 but not CeUGGT-1 is significant in relieving low ER stress levels simulated with TN in the absence of the ire-1 unfolding protein response signaling pathway. Our results indicate that both C. elegans UGGT homologues may have distinct biological functions. Fil: Buzzi, Lucila Inés. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

[EN] The Charcot-Marie-Tooth (CMT) disease, a hereditary motor and sensory neuropathy, shows a wide genetic heterogeneity with more than forty genes involved. The CMT forms due to mutations in the GDAP1 gene are the most frequent variants in our population. These clinical forms also presents with a large clinical heterogeneity, so that some families have a severe clinical picture while others are asymptomatic. The GDAP1 gene codifies for an outer mitochondrial membrane protein related to fission pathway of mitochondrial dynamics. Recently, GDAP1 has also been related to calcium homeostasis, in a process known as store-operated calcium entry (SOCE). Silencing of GDAP1 produce the disruption of calcium entry related to failures in mitochondria relocation near calcium entry domains. Previous results have showed that JPH1 could be a functional modifier of GDAP1. In that way, using neuroblastoma GDAP1-silenced cells, the overexpression of JPH1 produce the recovery of the SOCE as overexpression of GDAP1 did. Surprisingly, expression of JPH1 has only been described in muscular tissues. The aim of this work is to understand how the overexpression of JPH1 could recover a mechanism that is dependent of plasma membrane and mitochondria, even when JPH1 is an endoplasmic reticulum protein. In the present work, we show how the JPH1 gene is expressed in several cell lines with non-muscular origin. Moreover, we show that JPH1 is also present in such cell lines and its expression is different as expected by mRNA levels, suggesting a traductional regulation. In other way, we show that JPH1 colocalizes with endoplasmic reticulum in neuroblastoma cells and is associated to mitochondria. Finally, the induction of endoplasmic reticulum calcium release produce the relocation of JPH1 in structures as STIM1, the activator of SOCE, does. These findings could explain the mechanism by which overexpression of JPH1 recovers SOCE in GDAP1-silenced cells., [ES] La enfermedad de Charcot-Marie-Tooth (CMT), una neuropatía hereditaria sensitivo motora, presenta una amplia heterogeneidad genética con más de cuarenta genes implicados. Las formas de CMT causadas por mutaciones en el gen GDAP1 son de las más prevalentes en nuestro país. Estas formas clínicas cursan también con una gran heterogeneidad clínica, de modo que existen desde familias con una notable afectación a familias asintomáticas. El gen GDAP1 codifica para una proteína de membrana mitocondrial externa relacionada con procesos de fisión mitocondrial. Recientemente se ha relacionado con la homeostasis de Ca2+, concretamente en el proceso conocido como entrada capacitativa de Ca2+ (SOCE, Store-Operated Calcium Entry), de modo que la ausencia de GDAP1 anula la entrada de Ca2+ por el SOCE por fallos en la relocalización de mitocondrias en los dominios en donde se produce la entrada de Ca2+. Resultados previos del laboratorio muestran la posibilidad de que la proteína JPH1 sea un modificador funcional de la enfermedad. En este sentido, utilizando células de neuroblastoma humano silenciadas para GDAP1, la sobreexpresión de JPH1 rescata el SOCE a unos niveles similares a la sobreexpresión de GDAP1. Sin embargo, JPH1 se ha descrito principalmente en músculo esquelético y su función en tejido nervioso se desconoce. El objetivo del trabajo ha sido entender como la sobrexpresión de JPH1 puede rescatar un fenómeno dependiente de membrana plasmática y mitocondrias, aún cuando la proteína JPH1 es residente de la membrana del retículo endoplásmico. En este trabajo mostramos cómo el gen JPH1 se expresa en diferentes líneas celulares tanto de origen muscular como de origen neural. Además, hemos comprobado que la proteína está presente en estas líneas celulares pero a un nivel diferente del esperado por los niveles de mRNA, lo que sugiere procesos de regulación de la expresión génica. Por otra parte, demostramos que la proteína JPH1 se encuentra colocalizando con el retículo endoplásmico y además, se encuentra asociada a mitocondrias. Por último, la inducción de la salida de Ca2+ del retículo provoca la reorganización de la proteína de una manera similar a la proteína STIM1, el activador del SOCE, lo que podría explicar el mecanismo por el cual la sobreexpresión de JPH1 recupera la entrada capacitativa de Ca2+.

Tese de doutoramento, Ciências Biomédicas (Neurociências), Universidade de Lisboa, Faculdade de Medicina, 2014 Submitted by amelia Janeiro (ajaneiro@reitoria.ul.pt) on 2014-02-18T15:10:01Z No. of bitstreams: 1 ulsd067354_tese.pdf: 2682955 bytes, checksum: f4dfefd34d4ddeed6f8c967b891f9dbb (MD5) Made available in DSpace on 2014-02-20T18:05:18Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ulsd067354_tese.pdf: 2682955 bytes, checksum: f4dfefd34d4ddeed6f8c967b891f9dbb (MD5) Fundação para a Ciência e a Tecnologia (FCT, SFRH/BD/18046/2004/ e SFRH/BD/21589/2005); School of Behavioral Cognitive Neurosciences (BCN)

La Glucosidasa II (GII) cumple un rol fundamental en la biogénesis de glicoproteínas en el retículo endoplásmico (RE). Es responsable por la remoción secuencial de los dos residuos de glucosa (Glc) más internos del glicano (Glc3Man9GlcNAc2) transferido a los residuos de Asn en las glicoproteínas nacientes en la vía secretoria. GII participa en los ciclos de Calnexina (CNX)/Calreticulina (CRT) ya que remueve el residuo de Glc agregado a intermediarios de plegamiento por la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (UGGT). La GII un es un heterodímero soluble del RE cuya subunidad α (GIIα) posee el sitio catalítico mientras que el rol de la subunidad β (GIIβ) es controvertido, si bien ha sido involucrada en la retención en el RE de GII y en el plegamiento de GIIα. En esta tesis demostramos que en ausencia de GIIβ, la subunidad catalítica GIIα de la levadura de fisión Schizosaccharomyces pombe (un organismo que posee un mecanismo de control de calidad de plegamiento de proteínas similar al presente en células de mamíferos) adopta una conformación activa y es capaz de hidrolizar el análogo de sustrato p-nitrofenil-α-D-glucopiranósido. Sin embargo GIIβ es necesaria para la correcta localización de GII en el RE y para la deglucosilación eficiente de los sustratos fisiológicos Glc2Man9GlcNAc2 y Glc1Man9GlcNAc2. El dominio homólogo al dominio lectina del receptor de Manosa 6-fosfato presente en el C-terminal de GIIβ interacciona con manosas en las ramas B y/o C de los N-glicanos mediando la hidrólisis del sustrato por GIIα. Demostramos, también, que el dominio G2B del N-terminal de GIIβ es necesario para la interacción GIIα-GIIβ. Por último, demostramos que una reducción en el contenido de manosas de los N-glicanos disminuyó significativamente la deglucosilación in vivo mediada por GII pero no afectó la glucosilación in vivo mediada por UGGT, favoreciendo la formación de derivados monoglucosilados. Esto sugiere que GII funcionaría como un regulador de la permanencia en los ciclos de CNX/CRT de las glicoproteínas que se pliegan muy lentamente, y por lo tanto han sido demanosiladas, otorgando más oportunidades de plegamiento a las proteínas antes de enviarlas a degradación. Glucosidase II (GII) plays a key role in glycoprotein biogenesis in the endoplasmic reticulum (ER). It is responsible for the sequential removal of the two innermost glucose residues from the glycan (Glc3Man9GlcNAc2) transferred to Asn residues in proteins. GII participates in the Calnexin (CNX)/Calreticulin (CRT) cycle as it also removes the single glucose unit added to folding intermediates and misfolded glycoproteins by the UDPGlc: glycoprotein glucosyltransferase (UGGT). GII is a heterodimer whose α subunit (GIIα) bears the glycosyl hydrolase active site, whereas its β subunit (GIIβ) role is controversial and has been reported to be involved in GIIα ER retention and folding. Here, we report that in the absence of GIIβ, the catalytic subunit GIIα of the fission yeast Schizosaccharomyces pombe (an organism displaying a glycoprotein folding quality control mechanism similar to that occurring in mammalian cells) folds to an active conformation able to hydrolyze p-nitrophenyl- α-D-glucopyranoside. However, GIIβ is required for correct GII ER retention and for efficient deglucosylation of the physiological substrates Glc2Man9GlcNAc2 and Glc1Man9GlcNAc2. The interaction of the mannose 6-phosphate receptor homologous domain present in the Cterminal of GIIβ and mannoses in the B and/or C arms of the glycans mediates N-glycan hydrolysis enhancement. We also found that the N-terminal GIIβ G2B domain is essential for GIIα-GIIβ interaction. Finally, we show that a decrease in the N-glycan mannose content significantly diminished in vivo GII-mediated deglucosylation but did not affect in vivo UGGT activity. This suggests that GII may be an in vivo regulator of misfolded and slow-folding glycoprotein permanence in the ER as these glycoproteins are characterized by a detectable ER mannosidase(s)-catalyzed N-glycan demannosylation and therefore, an increased possibility of displaying monoglucosylated structures able to interact with CNX or CRT for longer time periods is likely to occur. Fil: Stigliano, Ivan Daniel. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Context: Adipose tissue hypoxia and endoplasmic reticulum (ER) stress may link the presence of chronic inflammation and macrophage infiltration in severely obese subjects. We previously reported the up-regulation of TNF-like weak inducer of apoptosis (TWEAK)/fibroblast growth factor-inducible 14 (Fn14) axis in adipose tissue of severely obese type 2 diabetic subjects. Objectives: The objective of the study was to examine TWEAK and Fn14 adipose tissue expression in obesity, severe obesity, and type 2 diabetes in relation to hypoxia and ER stress. Design: In the obesity study, 19 lean, 28 overweight, and 15 obese nondiabetic subjects were studied. In the severe obesity study, 23 severely obese and 35 control subjects were studied. In the type 2 diabetes study, 11 type 2 diabetic and 36 control subjects were studied. The expression levels of the following genes were analyzed in paired samples of sc and visceral adipose tissue: Fn14, TWEAK, VISFATIN, HYOU1, FIAF, HIF-1a, VEGF, GLUT-1, GRP78, and XBP-1. The effect of hypoxia, inflammation, and ER stress on the expression of TWEAK and Fn14 was examined in human adipocyte and macrophage cell lines. Results: Up-regulation of TWEAK/Fn14 and hypoxia and ER stress surrogate gene expression was observed in sc and visceral adipose tissue only in our severely obese cohort. Hypoxia modulates TWEAK or Fn14 expression in neither adipocytes nor macrophages. On the contrary, inflammation up-regulated TWEAK in macrophages and Fn14 expression in adipocytes. Moreover, TWEAK had a proinflammatory effect in adipocytes mediated by the nuclear factor-κB and ERK but not JNK signaling pathways. Conclusions: Our data suggest that TWEAK acts as a pro-inflammatory cytokine in the adipose tissue and that inflammation, but not hypoxia, may be behind its up-regulation in severe obesity.

To maintain homeostasis under diverse metabolic conditions, it is necessary to coordinate nutrient-sensing pathways with the immune response. This coordination requires a complex relationship between cells, hormones, and cytokines in which inflammatory and metabolic pathways are convergent at multiple levels. Recruitment of macrophages to metabolically compromised tissue is a primary event in which chemokines play a crucial role. However, chemokines may also transmit cell signals that generate multiple responses, most unrelated to chemotaxis, that are involved in different biological processes. We have reviewed the evidence showing that monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1 or CCL2) may have a systemic role in the regulation of metabolism that sometimes is not necessarily linked to the traffic of inflammatory cells to susceptible tissues. Main topics cover the relationship betweenMCP-1/CCL2, insulin resistance, inflammation, obesity, and related metabolic disturbances., A. Rull is the recipient of a fellowship fromthe Generalitat de Catalunya (FI-G 0503).

We have identified a novel Cyclin, called Cyclin O, which is able to bind and activate Cdk2 in response to intrinsic apoptotic stimuli. We have focused on the study of Cyclin Oα and Cyclin Oβ, alternatively spliced products of the gene. Upon treatment with different stress stimuli, transfected Cyclin Oα accumulates in dense aggregations in the cytoplasm compatible with being Stress Granules (SGs). Furthermore, we have seen that Cyclin Oβ and a point mutant of the N-terminal part of the protein constitutively localize to the SGs. Although both alpha and beta isoforms are proapoptotic, only Cyclin Oα can bind and activate Cdk2. On the other hand, we have demonstrated that Cyclin O is upregulated by Endoplasmic Reticulum (ER) stress and is necessary for ER stress-induced apoptosis. Cyclin O activates specifically the PERK pathway and interacts with the PERK inhibitor protein p58IPK. Moreover, Cyclin O participates in the activation of other eIF2α kinases. We have also observed that a pool of Cyclin O is located in active mitochondria, suggesting a function of the protein linked to oxidative metabolism.Hemos identificado una nueva Ciclina, llamada Ciclina O, que es capaz de unirse y activar Cdk2 en respuesta a estímulos apoptóticos intrínsecos. Nos hemos centrado en el estudio de la Ciclina Oα y la Ciclina Oβ, productos de splicing alternativo del gen. En respuesta a diferentes tipos de estrés, la Ciclina Oα se acumula en agregaciones citoplásmicas densas que podrían corresponder a Gránulos de Estrés (SGs). Además, hemos visto que la Ciclina Oβ y un mutante puntual de la parte N-terminal de la proteína se localizan constitutivamente en los SGs. Aunque las dos isoformas alfa y beta son proapoptóticas, solo la Ciclina Oα es capaz de unirse y activar Cdk2. Por otro lado, hemos demostrado que los niveles de Ciclina O se incrementan en respuesta al estrés de Retículo Endoplásmico (RE) y que esta proteína es necesaria para la inducción de apoptosis dependiente de estrés de RE. La Ciclina O activa específicamente la vía de PERK e interacciona con la proteína inhibidora de PERK p58IPK. Además, la Ciclina O participa en la activación de otras quinasas de eIF2α. La Ciclina O se localiza en mitocondrias activas, lo que sugiere una función de la proteína ligada al metabolismo oxidativo.

El retículo endoplásmico (RE) es el compartimiento celular donde las proteínas que son secretadas o las que residen a lo largo de las vías endo y exocíticas o en la membrana plasmática se pliegan y sufren diversas modificaciones postraduccionales. Para evitar que las proteínas viajen por el camino secretorio sin haber adquirido su conformación nativa, el RE cuenta con sistemas de control de calidad de plegamiento (QC) capaces de distinguir los polipéptidos mal plegados y retenerlos en el RE para que eventualmente se plieguen o terminen siendo degradados. Uno de los principales sistema de QC depende de la presencia de un Nglicano unido a la proteína que se está plegando. El glicano que se transfiere cotraduccionalmente al polipéptido naciente en la mayoría de las células eucariotas tiene la estructura Glc3Man9GlcNAc2. Los dos primeros residuos de glucosa son escindidos por acción de las glucosidasas I y II (GI y GII). El glicano monoglucosilado resultante (G1M9N2) es reconocido por dos lectinas residentes del RE, la calnexina (CNX) y la calreticulina (CRT). Esta interacción se interrumpe cuando la GII remueve la glucosa restante pero puede restituirse gracias a la acción de otra enzima residente del RE, la UDP-Glc:glicoproteína glucosiltransferasa (GT). La GT vuelve a glucosilar sólo a aquellas glicoproteínas que no adquirieron su conformación nativa permitiendo su unión con las lectinas y así aumentando sus posibilidades de plegarse correctamente. En Trypanosoma cruzi se han identificado los tres componentes que forman el sistema de QC de glicoproteínas, GT, GII y CRT (este organismo no posee CNX). En este parásito, a diferencia de lo que ocurre en células de mamíferos, G1M9N2 sólo se forma por acción de la GT, puesto que el glicano transferido a las proteínas nascientes no contiene residuos de glucosa. Dada la gran importancia que diversas glicoproteínas poseen para el ciclo de vida de este parásito, se decidió estudiar si el facilitamiento del plegamiento mediado por CRT de la cruzipaína (CZ), uno de los factores de virulencia de T. cruzi, era esencial para la viabilidad, diferenciación y capacidad infectiva del parásito. Para ello, se identificó y secuenció el gen que codifica para la GT y se obtuvieron T. cruzi mutantes nulos para este gen. Así, se comprobó que la eliminación del sistema de QC de glicoproteínas no afectó el crecimiento de la forma epimastigote del parásito, aunque redujo la capacidad infectiva de la forma trypomastigote. El contenido celular de CZ sólo disminuyó parcialmente (5-20%) a pesar de que en células salvajes más del 90% de estas moléculas interaccionan con CRT. En los T. cruzi carentes de GT no pudo detectarse interacción entre CRT y CZ aún en condiciones muy suaves de inmunoprecipitación sin embargo se verificó un retraso en la llegada de la proteinasa a los lisosomas. Este retraso se debió a la inducción del sistema alternativo de QC basado en BiP/Grp78, cuya interacción con CZ se prolongó. Estos resultados ponen de manifiesto la gran plasticidad de la maquinaria de plegamiento del RE, la cual le permite al párasito sobreponerse a la falta del sistema de QC específico para glicoproteínas. Por otra parte, además de su función como chaperona, CRT es la principal proteína de unión de calcio en el RE. Dado que el nivel de calcio del RE fluctúa de forma considerable se estudió la relación entre ambas funciones de la CRT. La afinidad de CRT por G1M9N2 determinada por equilibrio de diálisis y por anisotropía de fluorescencia no se afectó con modificación de la concentración de calcio presente en el medio. La unión de CRT a neoglicoproteínas que presentan una conformación nativa o de tipo glóbulo fundido también fue independiente de la concentración del ión. En este mismo sentido, se comprobó que el calcio y G1M9N2 estabilizan a CRT frente a la desnaturalización térmica o inducida por urea de manera independiente y aditiva. Además, la capacidad de CRT de inhibir la agregación de IgY desnaturalizada tampoco se modificó al variar los niveles de calcio. En una aproximación in vivo, se observó que al disminuir los niveles de calcio del RE de T. cruzi no se altera la unión entre CRT y CZ. Estas observaciones demuestran que las funciones de chaperona y de unión de calcio de CRT son mutuamente independientes. Por último, se observó que la variación de los niveles de calcio del RE afectaba la localización subcelular de CRT, provocando un aumento de la concentración de esta en el citosol. The endoplasmic reticulum (ER) is the site of folding for proteins destined for compartments of the secretory and endocytic pathways, the plasma membrane and secretion. Only native proteins are released from the ER. Folding intermediates, orphan subunits of oligomeric complexes, and misfolded polypeptides are retained in the ER and eventually forwarded to degradation in a complex series of events denominated Quality Control (QC). N-glycans are directly involved in QC. Nglycosylation occurs in most eukaryotic cells by addition of a preassembled core glycan (Glc3Man9GlcNAc2) to nascent polypeptides emerging into the ER lumen. Rapid trimming of the two outermost glucose residues by ER-resident enzymes glucosidases I (GI) and glucosidase II (GII) generates a monoglucosilated protein bound N-glycan (G1M9N2) which is recognized by the ER lectins calnexin (CNX) and calreticulin (CRT). Release from CNX/CRT is followed by GII cleavage of the innermost glucose residue. The folding sensor UDP-glucose:glycoprotein glycosyltransferase (GT) adds back a terminal glucose to promote re-association of non-native polypeptides with the lectins, thus prolonging their retention in the ER folding environment. The three components involved in QC of glycoprotein folding, i.e. GT, GII and CRT, have been described in Trypanosoma cruzi (this parasite lacks CNX). However, contrary to what happens in most eukaryotic cells, in trypanosomatid protozoa G1M9N2 is exclusively formed by GT action because unglucosylated Nglycans are transfered to nascent polypeptides. The gene coding for GT was identified and sequenced. Even though several of this parasite glycoproteins have been identified as essential components of differentiation and mammalian cell invasion processes, disruption of both GT-encoding alleles did not affect cell growth rate of epimastigote form parasites and partially affected differentiation and mammalian cell invasion of the trypomastigote form. The cellular content of one of the already identified T. cruzi glycoprotein virulence factors (cruzipain, CZ, a lysosomal proteinase) only showed a partial (5-20%) decrease in GT null mutants in spite of the fact that >90% of all CZ molecules interacted with CRT during their folding process in wild-type cells. Although extremely mild cell lysis and immunoprecipitation procedures were used, no CRT-CZ interaction was detected in GT-null mutants, but secretion of the proteinase was nevertheless delayed because of a lengthened interaction with BiP/Grp78 probably caused by the detected induction of this chaperone in GT null mutants. This result provides a rationale for the absence of a more drastic consequence of GT absence. It was concluded that T. cruzi ER folding machinery presents an exquisite plasticity that allows the parasite to surmount the absence of the glycoprotein-specific folding facilitation mechanism. Besides being a chaperone, CRT is one of the main calcium buffers in the cell. Here, we study the interplay between these roles of CRT. The affinity of CRT for G1M9N2 measured in solution by equilibrium dialysis or fluorescence anisotropy was not affected by the absence of calcium. Binding of CRT to monoglucosylated neoglycoproteins displaying either native or molten globule-like conformations was also independent of calcium concentrations. Moreover, calcium and G1M9N2 stabilized CRT structure in an apparent additive, independent manner when the protein was subjected to thermal or urea-induced denaturation. In addition, the ability of CRT to decrease the level of aggregation of a chemically denatured monoglycosylated and nonglycosylated IgY was also independent of calcium level. From an in vivo point of view, a decrease in ER calcium concentration in T. cruzi cells did not alter CRT-CZ binding. Thus, chaperone and calcium binding activities of CRT are independent. On the other hand, changes in ER calcium levels influenced CRT location, leading to an increase in CRT in the citosol of T. cruzi cells. Fil: Conte, Ianina Laura. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Lipid droplets (LDs) are organelles that coordinate lipid storage and mobilization, both processes being especially important in cells specialized in managing fat, the adipocytes. Proteomic analyses of LDs have consistently identified the small GTPase Rab18 as a component of the LD coat. However, the specific contribution of Rab18 to adipocyte function remains to be elucidated. Herein, we have analyzed Rab18 expression, intracellular localization and function in relation to the metabolic status of adipocytes. We show that Rab18 production increases during adipogenic differentiation of 3T3-L1 cells. In addition, our data show that insulin induces, via phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K), the recruitment of Rab18 to the surface of LDs. Furthermore, Rab18 overexpression increased basal lipogenesis and Rab18 silencing impaired the lipogenic response to insulin, thereby suggesting that this GTPase promotes fat accumulation in adipocytes. On the other hand, studies of the badrenergic receptor agonist isoproterenol confirmed and extended previous evidence for the participation of Rab18 in lipolysis. Together, our data support the view that Rab18 is a common mediator of lipolysis and lipogenesis and suggests that the endoplasmic reticulum (ER) is the link that enables Rab18 action on these two processes. Finally, we describe, for the first time, the presence of Rab18 in human adipose tissue, wherein the expression of this GTPase exhibits sex- and depot-specific differences and is correlated to obesity. Taken together, these findings indicate that Rab18 is involved in insulin-mediated lipogenesis, as well as in b-adrenergic-induced lipolysis, likely facilitating interaction of LDs with ER membranes and the exchange of lipids between these compartments. A role for Rab18 in the regulation of adipocyte biology under both normal and pathological conditions is proposed.

artículo -- Universidad de Costa Rica. Instituto de investigaciones en Salud (INISA), 1983 Lacteous fat globules with their membranes from human milk and calostrum were studied by scanning and transmission electron microscopy. The first appear as spheroidal structures with some irregularities on the surface. Under the transmission electron microscope these irregularities are composed of islets from a material morphologically similar to cytoplasm, and with structures that resemble a fragment of rugose endoplasmic reticulum. The membranes in specimens fixed immediately after secretion are tri-layered, similar in appearance to those of a single membrane, but in samples fixed between two and four hours after secretion the details are unclear. Through freeze-etching, the laminar aspect of the fat globules is observed. Se describen ultraestructuralmente los glóbulos grasos lacteos y sus membranas, a partir de leche y calostro de origen humane. Al microscopio electrónico° de barrido los glóbulos aparecen como estructuras esferoides con algunas irregularidades en su superficie. Al micriscopio electronic° de transznision se ye que esas irregularidades estan compuestas por islotes de un material morfologicamente similar al citoplasma, en el que aparecen estructuras similares a fragmentos de reticulo endoplasmatico rugoso. Las membranas en los especimenes fijados inmediatamente despues de secretados muestran un aspecto trilaminar similar al de una membrana unitaria, aspecto que no es claro en las muestras fijadas entre dos y cuatro horas post secrecion. Mediante criofractura se observa el aspecto laminar del contenido de los glóbulos grasos. Universidad de Costa Rica. UCR::Vicerrectoría de Investigación::Unidades de Investigación::Ciencias de la Salud::Instituto de Investigaciones en Salud (INISA)

Tese de doutoramento em Ciências Biomédicas (Ciências Biopatológicas), apresentada à Universidade de Lisboa através da Faculdade de Medicina, 2007 Nível de preservação: critical, Criado em: 2008-06-06 15:34:20, Criado por: super:MARTA, Alterado em: 2009-08-13 11:14:06, Modificado por: super:MARTA Made available in DSpace on 2010-07-22T08:49:18Z (GMT). No. of bitstreams: 2 16201_Joana%20Loureiro%20Tese.pdf: 8949881 bytes, checksum: 8fdaddd193d79aecb2d77c09077b014b (MD5) 16201.xml: 16810 bytes, checksum: 310fdce84d6f001c920ed7edc906c97a (MD5) Previous issue date: 2006 Fundação para a Ciência e Tecnologia (FCT) e Fundação Calouste Gulbenkian (FCG)

El reticulo endoplasmico de las celulas somatotropas del raton hepatectomizado se encuentra muy dilatado y contiene material denso en el interior de sus cisternas. Estas se observan frecuentemente en contacto con la membrana celular en zonas en que esta y el intersticio presentan un aumento de densidad. Se sugiere un mecanismo directo de secrecion de la hormona sintetizada en exceso en el reticulo endoplasmico, sin pasar previamente por el complejo de Golgi., Facultad de Ciencias Médicas