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Das Killertoxin K28 ist ein viral codiertes A/B-Toxin der Hefe Saccharomyces cerevisiae, das nach endozytotischer Aufnahme und retrogradem Transport zum ER gelangt. Nach Retrotranslokation äußert sich der letale Effekt in Abhängigkeit zur applizierten Konzentration entweder in einem G1/S-Zellzyklusarrest oder der Apoptose. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die ER-Zytosol-Dislokation des Dimers durch das Chaperon BiP sowie die Isomerase-Aktivität der Protein-Disulfidisomerase und eine ausgeglichene Ca2+-Konzentration katalysiert wird. Die Überwindung der ER-Membran wird vermutlich durch Sec61p vermittelt und findet unabhängig von ERAD-Komponenten, UPR sowie Autophagozytose oder der Synthese von „lipid droplets“ (LD) statt. Die Expression der α Untereinheit führt ebenfalls zu einem G1/S-Arrest der Zielzelle. Auch hier werden Kar2p sowie eine intakte Ca2+-Homöostase zur effizienten Retrotranslokation in das Zytosol benötigt. Sec61p sowie Der1p des ERAD-L-Pathways bilden wahrscheinlich die potentielle Dislokationspore, wobei der ER-Export auch mit der LD-Synthese in Zusammenhang gebracht werden kann. Die gängigen zellulären Degradations-Prozesse wie ERAD, HiP und Autophagie tragen jedoch ausschließlich zum Abbau des Toxins bei. Die Wirkung der K28α-Untereinheit auf höhere Eukaryonten resultiert in der Induktion der Apoptose. UPS scheint im Säuger den ER-Export von K28α zu unterstützen, da die Substitution interner Lysinreste mit einer Reduktion der Toxizität einhergeht. The killer toxin K28 is a viral encoded A/B toxin of the yeast Saccharomyces cerevisiae which is taken up by endocytosis and is transported retrogradely to the ER. After retrotranslocation the lethal effect culminates either in a G1/S cell cycle arrest or in apoptosis depending on the toxin concentration. In this work it was shown that ER-cytosol dislocation of the α/β dimer is catalyzed by the chaperone BiP and the isomerase activity of protein disulfide isomerase Pdi1p and requires balanced intracellular Ca2+ levels. Passing the ER-membrane is assumed to be mediated by Sec61p and is independent of ERAD components, UPR, autophagy or the synthesis of "lipid droplets" (LDs). The expression of the plasmid-driven K28α-subunit also leads to a G1/S-arrest of the target cell. Kar2p and an intact Ca2+ homeostasis are also required for efficient retrotranslocation into the cytosol. As part of the ERAD-L pathway, Sec61p and Der1p are likely to form the potential dislocation pore whereupon ER export of K28α can also be associated with LD-synthesis. However, all major cellular degradation processes such as ERAD, HiP and autophagy contribute exclusively to the degradation of the toxin. The effect of K28α expression in higher eukaryotes results in the induction of apoptosis. In this case, the UPS seems to support ER export of K28α since the substitution of internal lysine residues is accompanied by a reduction of toxicity.

Das virale A/B-Toxin K28 aus Saccharomyces cerevisiae tötet sensitive Hefen in einem rezeptorvermittelten Prozess durch Induktion eines Zellzyklusarrestes. Nach endozytotischer Internalisierung durchläuft das Toxin den Sekretionsweg retrograd über Golgi und ER. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der ER/Cytosol-Retrotranslokation von K28 im Detail untersucht. Durch die Expression einer letalen K28alpha-Variante im ER-Lumen ausgewählter Deletionsmutanten konnte nachgewiesen werden, dass K28alpha nach Eintritt in den Sekretionsweg mit Hilfe von Erv29p und Bst1p in COPII-Vesikel verpackt und zum Golgi transportiert wird, wo die pro-Region durch die Aktivität der Endoprotease Kex2p entfernt wird. Dieser Schritt ist zwingend notwendig für die in vivo Toxizität von alpha. Im Gegensatz zu exogen appliziertem A/B-Toxin nutzt K28alpha den zellulären ERAD-Qualitätskontrollmechanismus, um aus dem ER in das Cytosol zu gelangen. Es konnte gezeigt werden, dass die Funktion des HRD1-Komplexes (im Unterschied zu CDC48) von essenzieller Bedeutung für die Toxizität von alpha ist. Wurde eine Polyubiquitinierung von K28alpha durch Austausch der internen Lysinreste verhindert oder eine Ubiquitinmutante, die keine Polyubiquitinketten mehr bilden kann, simultan überexprimiert, so kam es in beiden Fällen zu einem Verlust der Toxizität. Die Ubiquitinierung von K28alpha scheint somit für die Toxin-Retrotranslokation wichtig zu sein; ein direkter biochemischer Nachweis hierfür konnte bislang jedoch noch nicht erbracht werden. K28, a viral A/B toxin produced by killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae, kills sensitive yeasts in a receptor mediated process by inducing a cell cycle arrest. After endocytotic uptake the toxin passes the secretory pathway in reverse via Golgi and ER. In this study, toxin retrotranslocation from the ER into the cytosol has been investigated in detail by regulated expression of a lethal K28alpha variant in the ER of selected deletion mutants. By this means it became evident that K28alpha is packaged into COPII vesicles and transported to the Golgi by the help of Erv29p and Bst1p which normally recruit lumenal ERAD substrates. Within a late Golgi removal of the pro-region by endopeptidase Kex2p cleavage is crucial for the in vivo toxicity of K28alpha. In contrast to exogenously applied A/B toxin, K28alpha reaches the cytosol by abusing components of the ER quality control pathway ERAD. Sensitivity assays further indicated that HRD1 (in contrast to CDC48) complex components play a central role in K28alpha in vivo toxicity. Preventing polyubiquitination of K28alpha either by substitution of all internal lysine residues or by simultaneous overexpression of mutant ubiquitin, unable to form polyubiquitin chains, severely impaired in vivo toxicity. Thus, ubiquitination of K28alpha seems to be essential for its retrotranslocation, although a direct biochemical proof is still missing.

Die ER-assoziierte Proteindegradation (ERAD) ist Teil des Qualitätskontrollsystems am ER, um der Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER entgegenzuwirken. Hierbei werden ERAD-Substrate mit Hilfe von E3-Ligasen wie z.B. HRD1 ubiquityliert und anschließend durch den p97-Ufd1-Npl4 Komplex aus der ER-Membran extrahiert. Im Zytosol werden diese extrahierten Proteine vom 26S Proteasom abgebaut. Für die Retrotranslokation von ERAD- Substraten werden zudem die Membranproteine Derlin-1 und VIMP benötigt, welche mit p97 assoziieren und einen Proteinkomplex bilden. HERP ist ein ER-lokalisiertes Protein, dessen Synthese durch den UPR (unfolded protein response) als Antwort auf die Akkumulation von fehlgefalteten Proteinen im ER induziert wird. Dies deutet auf eine Rolle von HERP im ERAD hin. Interessanterweise besitzt HERP eine sogenannte UBL-Domäne. Für andere Proteine mit UBL-Domäne konnte eine Interaktion dieser Domäne mit dem Proteasom nachgewiesen werden. Daher kann angenommen werden, dass HERP ebenfalls mit dem Proteasom interagiert und dies zur ER- Membran rekrutiert, wo es für den Abbau von ERAD-Substraten benötigt wird. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Rolle von HERP innerhalb des UPR zu ermitteln. Die hier präsentierten Daten zeigen, dass HERP essentiell für den Abbau des ERAD-Modell- Substrates CD3-delta ist. Somit hat HERP tatsächlich eine Rolle im ERAD. Außerdem wird eine direkte Interaktion von HERP mit der E3-Ligase HRD1 nachgewiesen. Es wird zudem gezeigt, dass HERP und HRD1 einen Proteinkomplex mit p97, Derlin-1 und eventuell auch mit VIMP bilden. Dieser ERAD Komplex ist folglich sowohl für die Ubiquitylierung als auch die Retrotranslokation von ERAD-Substraten verantwortlich und garantiert somit die effiziente Prozessierung von Proteinen aus dem ER. Zudem wird gezeigt, dass die UBL-Domäne von HERP im Gegensatz zu anderen UBL- Domänen nicht mit dem Proteasom interagiert. Somit kann nicht mehr davon ausgegangen werden, dass Proteasombindung eine Gemeinsamkeit aller Proteine mit UBL-Domäne ist. Dagegen wird eine Interaktion der UBL-Domäne von HERP mit dem deubiquitylierenden Enzym USP7 nachgewiesen. Dies deutet darauf hin, dass auch Deubiquitylierung eine wichtige Rolle im ERAD-Prozess spielt. ER-associated protein degradation (ERAD) is part of the ER quality control system dealing with the accumulation of misfolded proteins in the ER. This process requires polyubiquitylation of ERAD substrates involving E3 ligases, such as HRD1, and their subsequent extraction from the ER membrane by the p97-Ufd1-Npl4 complex. Retrotranslocation of substrates into the cytosol for degradation by the 26S proteasome also involves the membrane proteins Derlin-1 and VIMP, which are associated with p97 to form a protein complex. The ER-resident protein HERP was shown to be upregulated by the unfolded protein response pathway (UPR) upon the accumulation of misfolded proteins in the ER. It was therefore considered to function in ERAD. Interestingly, HERP contains a UBL domain. In other proteins this domain facilitates an interaction with the proteasome, suggesting that HERP might recruit the proteasome to the ER membrane for efficient ERAD. The aim of this study was to investigate the function of HERP within the UPR. The findings presented here demonstrate that HERP is essential for the degradation of a model ERAD substrate. Thus, HERP indeed has a role in ERAD. Moreover, the data show that HERP directly interacts with the E3 ligase HRD1 and the two proteins form a common protein complex with p97, Derlin-1 and possibly also with VIMP. This suggests that both ubiquitylation and retrotranslocation of ER proteins are performed by one protein complex, enabling an efficient processing of ERAD substrates. This study also demonstrates that the UBL domain of HERP does not share the proteasome binding property of other UBL domains, suggesting that proteasome binding cannot be considered a general feature of all UBL domains. Instead, the HERP UBL domain is able to interact with the deubiquitylating enzyme USP7. Therefore, deubiquitylation might also be an important aspect in the proteasome-dependent degradation of misfolded ER proteins.