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Plants perceive and react to their environment. Upon iron deficiency, plants activate the iron-deficiency machinery which is controlled by the master regulator FIT and its four interaction partners the bHLH038, bHLH039, bHLH100 and bHLH101 from the subgroup Ib(2). This work reports the influence of bHLH039 overexpression (39Ox) in iron uptake and homeostasis as well as in pathogen and high iron responses. Physiological investigation of 39Ox plants revealed that they exhibit iron-deficiency responses and simultaneously iron overload and oxidative stress. Crosses of 39Ox with FIT knock-out and FIT overexpression plants confirmed that FIT is essential for the activation of the iron-uptake machinery. A Catma v6 microarray was performed with 39Ox plants at + Fe and at -Fe. More than 700 FIT and Fe-regulated genes have been identified. This data showed that the expression of genes coding for proteins involved not only in the absorption, internal transport and storage of iron, but also in the circadian clock, light response, pathogen response and oxidative stress were greatly increased. GUS experiments indicated that the FIT promoter was more active when bHLH039 was overexpressed. Consequently, the binding of bHLH039 to the promoter of Fe-related genes was investigated. However, ChIP experiments showed no direct binding of bHLH39 to the different promoter regions of the tested genes. This work shows the importance of bHLH039 in the regulation of iron homeostasis and the processes mentioned above. Pflanzen empfinden und reagieren auf Umweltveränderungen. Bei Eisenmangel aktivieren die Pflanzen die Eisenmangel-Maschinerie, die vom Masterregulator FIT und seinen vier Interaktionspartnern bHLH038, bHLH039, bHLH100 und bHLH101 aus der Untergruppe Ib (2) gesteuert wird. Diese Arbeit befasst sich mit dem Einfluss der bHLH039 Überexpression (39Ox) auf die Eisenaufnahme und -homöostase sowie die Auswirkungen auf die Pathogen- und Eisenüberflussantwort. Durch Kreuzungen der Linie 39Ox mit FIT knock-out und FIT Überexpressionslinien wurde bestätigt, dass FIT eine zentrale Rolle in diesen Prozessen spielt. Mit einem Catma v6 Microarray wurden die Transkripton von 39Ox Pflanzen unter + Fe und - Fe untersucht und verglichen. Mehr als 700 Gene wurden identifiziert, welche unabhängig von FIT und Eisenversorgung reguliert werden. Eine umfassende Analyse dieser Daten zeigte, dass in 39Ox Pflanzen nicht nur Gene mit Beteiligung an Eisenaufnahme, -transport und -lagerung stark hochreguliert waren, sondern auch Gene, die in der circadian clock, der Pathogenantwort und bei oxidativen Stress eine Rolle spielen. Promotor-GUS Experimente zeigten, dass der FIT Promotor in 39Ox Pflanzen stärker aktiviert sein könnte. Auf dieser Grundlage wurde die Bindung von bHLH039 an die Promotoren von bekannten stark eisenmangelregulierten Genen wie FIT, IRT1, FRO2, AT3g12900, AT3g07720 und AT3g58810 untersucht. ChIP-Experimente gaben jedoch keine Hinweise auf eine direkte Bindung von bHLH39 an verschiedene Promotorregionen der getesteten Gene. Diese Arbeit zeigt die Bedeutung von bHLH039 bei der Regulierung der Eisenhomöostase und der oben erwähnten Prozesse.

Plant innate immunity is triggered when a pathogen invades the cell and pathogen associated molecular patterns (PAMPs) are recognized by plant pattern recognition receptors (PRRs). Contrasting to the large amount of PAMPs identified so far, only a limited number of PRRs are known. RsE2 is a novel PAMP that was partially purified from the bacterial pathogen, Ralstonia solanacearum (Melzer, 2013). This pathogen colonizes xylem of plants and causes wilt in a wide range of host species. RsE2 could be effectively identified and elicits several early immunity responses such as ethylene response, oxidative burst in the plants and extracellular alkalization in cell suspensions of Arabidopsis thaliana. Further studies disclosed substantial natural variation in the RsE2-mediated ethylene response among different ecotypes of Arabidopsis thaliana. I hypothesized that the genetic variation in the RsE2-recognizing PRR gene in ecotypes is responsible for the phenotypical variation in the RsE2- caused response. To identify the RsE2-recognizing PRRs, I screened for RsE2-induced/triggered ethylene response in multiple Arabidopsis thaliana ecotypes and conducted a genome wide associated study (GWAS). Meanwhile, I developed a F2 mapping population. Using a NGS-assisted (Next Generation Sequencing) QTL (Quantitative Trait Locus) mapping approach, I mapped RsE2 sensitivity to an 1.1 Mb region on Chr 3. This region overlaps with one of four candidate framed in GWAS as significant. Forward genetic analysis further identified that receptor like protein RLP32 is the receptor of RsE2 in Arabidopsis. My work showed great advantages to identify the RsE2-recognizing PRR using genomic tools. Furthermore, I showed that RLP32-mediated RsE2 perception was compromised in the bak1/bkk1 double mutant or sobir1 mutant. The RLP32/Bak1/SOBIR1 tripartite-receptor provides a good system to study how a RLP-type PRR mediates signal transduction during PAMP-triggered immunity (PTI). Finally, the transient expression of RLP32 from Brassiaceae plant family in N. benthamiana seedling could confer the capability of elicitor perception in Solanaceae plant family, which suggests the potential application of engineered RsE2-recognizing system to enhance plant disease resistance.

Die Ribonuklease P (RNase P) ist ein aus verschiedenen Blickwinkeln sehr interessantes Biomolekül, das für die 5‘-Maturierung von Vorläufer-tRNAs (Prä-tRNAs) verantwortlich ist. Das bakterielle Enzym ist ein Ribozym, das aus einer RNA- und einer kleinen Protein-Untereinheit besteht, wobei die RNA-Untereinheit der katalytisch aktive Teil ist. Damit unterscheidet sich das bakterielle Enzym architektonisch signifikant von RNase P-Enzymen aus den anderen Domänen des Lebens (Archaea und Eukarya), die einen deutlich erhöhten Proteinanteil besitzen. In höheren Eukaryonten wurden zudem RNase P-Enzyme gefunden, die aus einem singulären Protein bestehen und über keine RNA-Untereinheit mehr verfügen. Im menschlichen Organismus existieren zwei verschiedene RNase P-Enzyme. Die nukleäre RNase P besitzt einen RNA-Anteil und darüber hinaus zehn zusätzliche Proteinuntereinheiten. Die mitochondriale RNase P besteht aus einem ternären Proteinkomplex ohne RNA-Komponente. Diese Strukturunterschiede sowie die essenzielle Funktion der RNase P machen das bakterielle Enzym zu einer interessanten Zielstruktur für die Entwicklung neuer Antibiotika. Da es bisher keine Antibiotika gibt, die primär an die RNase P binden und damit die Bereitstellung maturer tRNAs für die Proteinbiosynthese hemmen, wäre ein solches Antibiotikum vermutlich eine wirksame neue Waffe gegen multiresistente Problemkeime., Bacterial Ribonuclease P (RNase P), which is responsible for the 5’-maturation of precursor tRNAs (pre-tRNA), appears as a very interesting biomolecule. It is a ribozyme that consists of a catalytic RNA and a small auxiliary protein subunit. Moreover, bacterial RNase P differs substantially from RNase P enzymes of the two other domains of life, Archaea and Eukarya, which have recruited multiple protein components during evolution with a concomitant loss of robust RNA-alone activity. In addition, RNase P enzymes that are singular proteins lacking any RNA component have been identified in four of the five eukaryal supergroups. In human, two different RNase P enzymes coexist. The nuclear RNase P contains an RNA component and ten protein subunits, while the mitochondrial RNase P consists of a ternary protein complex devoid of any RNA component. These architectural differences combined with the fact that bacterial RNase P is indispensable for cell survival make the bacterial enzyme a promising target for the development of novel antibiotics. Since no antibiotics are yet known that bind to RNase P as the primary target, inhibitors of bacterial RNase P would open up novel perspectives to combat multiresistant bacterial pathogens.

vorgelegt von: Bianca Arzberger Zsfassung in engl. Sprache FH Campus Wien, Masterstudiengang Bautechnische Abwicklung internationaler Großprojekte, Masterthesis, 2014

This work deals with the differential protein and gene expression depending from iron supply and the availability of the regulator of iron uptake in Arabidopsis thaliana, FIT (FER-LIKE IRON DEFICIENCY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR), to find more FIT-regulated genes by comparison of the respective expression patterns with those of the FIT-regulated genes IRT1 and FRO2. Additionally, a possible post-transcriptional regulation of FIT is investigated to further elucidate the regulation of iron uptake in A. thaliana. Protein and RNA samples from roots of wild type plants, a fit knock-out mutant and a FIT over-expressing line have been analyzed with two-dimensional electrophoresis and CATMA v6 microarrays. Besides IRT1 and FRO2, six more FIT-regulated genes could be identified with this approach. The gene AHA2 which has been described as FIT-regulated showed a FIT-independent regulation in this work. Nine proteins have been found in distinct forms which possibly result from post-translational modification or alternative splicing, respectively. Ten more singly identified proteins displayed a post-transcriptional regulation. The investigation of a possible post-translational modification of FIT has been performed with one and two-dimensional techniques. FIT is present in at least two forms. It could be demonstrated that FIT is post-translationally modified by phosphorylation and possibly by ubiquitinylation. Diese Arbeit befasst sich mit der differenziellen Protein- und Genexpression in Abhängigkeit von der Eisenversorgung und der Verfügbarkeit des Regulators der Eisenaufnahme in A. thaliana, FIT (FER-LIKE IRON DEFICIENCY-INDUCED TRANSCRIPTION FACTOR), um durch Vergleich der Protein- und Gen-Expressionsmuster mit jenen der FIT-regulierten Gene IRT1 und FRO2 weitere von FIT regulierte Gene zu finden. Außerdem wird die posttranskriptionale Regulation von FIT untersucht, um die Regulation der Eisenaufnahme in A. thaliana weiter aufzuklären. Protein- und RNA-Proben aus Wurzeln von Wildtyp-Pflanzen, einer fit-Knock-out- und einer FIT-Überexpressionslinie wurden mit zweidimensionaler Elektrophorese sowie mit CATMA v6 Microarrays analysiert. Es konnten so neben IRT1 und FRO2 sechs weitere, FIT-regulierte Gene ermittelt werden. Das als von FIT reguliert beschriebene Gen AHA2 zeigte in dieser Arbeit eine FIT-unabhängige Regulation. Neun Proteine wurden in verschiedenen Formen gefunden, die möglicherweise das Resultat posttranslationaler Modifikation oder alternativen Splicings sind. Zehn weitere einfach identifizierte Proteine zeigten eine posttranskriptionale Regulation. Die Untersuchung einer möglichen posttranslationalen Modifikation von FIT erfolgte unter Anwendung ein- und zweidimensionaler Techniken. FIT liegt in mindestens zwei Formen vor. Es konnte gezeigt werden, dass FIT durch Phosphorylierung und möglicherweise auch durch Ubiquitinylierung posttranslational modifiziert wird.

Die Biosynthese von fragmentierten Fettsäuren (kurzkettige Dicarbonsäuren und deren Oxocarbonsäure-Vorstufen) ist in den meisten Pflanzen noch unklar. Wichtige, bekannte Dicarbonsäuren sind Pimelinsäure (PIM) und Azelainsäure (AZA) mit den putativen Vorstufen 7-Oxo¬heptanonsäure (OHA) und 9-Oxononanonsäure (ONA). Es besteht großes Interesse die Biosynthese¬mechanismen und die Regulation der Synthese dieser Substanzen aufzuklären, da Fettsäure¬fragmente an wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind. PIM ist eine essentielle Vorstufe von Biotin in Mikroben, Pilzen und Pflanzen. Bisher konnte die Biosynthese von PIM nur in Bakterien (E. coli und B. subtilis) aufgeklärt werden. Es gibt keine Hinweise auf einen analogen Mechanismus in Pflanzen. Eine biologische Aktivität von AZA bei Pflanzen konnte erst vor kurzem beschrieben werden. Eine Forschergruppe identifizierte AZA als Metabolit, der nach Infektion mit dem Pathogen Pseudomonas syringae vermehrt im Phloemsaft von Arabidopsis vorhanden ist und der in Pflanzen eine lokale und systemische Resistenz gegenüber dem Pathogen induziert. In Tieren sind Fettsäurefragmente ebenfalls Gegenstand aktueller Forschung. Es ist bekannt, dass eine nichtenzymatische oxidative Fragmentierung von Fettsäurehydroperoxiden in komplexen Membranlipiden als Folge von oxidativem Stress abläuft. Phospholipide mit veresterter ONA / AZA spielen aufgrund ihrer Struktur eine Rolle als endogene Liganden bei Reaktionen des angeborenen Immunsystems. Ziel dieser Arbeit war es, die Mechanismen der Oxidation von Fettsäuren und deren Fragmentierung in Pflanzen aufzuklären. Weiterhin sollte die Rolle der oxidierten Fragmente in der Immunantwort der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht werden. In Pflanzen wurden fragmentierte Fettsäuren im Rahmen dieser Arbeit erstmals in komplexen Lipiden identifiziert und verschiedene Hypothesen zur Bildung von Fettsäurefragmenten experimentell überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass die Biosynthese der Fettsäurefragmente in A. thaliana ausgehend von zwei- oder dreifach ungesättigten Fettsäuren stattfindet. 9- und 13-Lipoxygenasen (LOX1, LOX5 und LOX2) spielen dabei keine essentielle Rolle. Die Fettsäurefragmente konnten in Arabidopsis in freier Form und in komplexen Lipiden verestert (ausschließlich in Galactolipiden) detektiert werden. Applikationsexperimente zeigten, dass die Biosynthese der Fettsäurefragmente in den komplexen Lipiden auf nichtenzymatischem Wege in situ stattfindet. Dabei wird in Übereinstimmung mit den experimentellen in vitro und in vivo Daten als Reaktionsmechanismus die Dimer-Hypothese der Arbeitsgruppe um Alan Brash vorgeschlagen. In grünen Pflanzenteilen verläuft die Biosynthese demzufolge in drei Schritten ab: Im ersten Schritt entsteht ein „Pool“ von oxidierten Galactolipiden mit Hydroperoxid-Acylketten (mit konjugierten Dienen). Diese Hydroperoxide entstehen fortlaufend durch Oxidation der Fettsäureacyle mittels Singulett Sauerstoff in Plastiden. Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae (avirulenter Stamm) wird der „Pool“ von Galactolipidperoxiden durch die katalytische Einwirkung von freien Radikalen und der LOX2 erhöht. Im zweiten Schritt findet eine Radikal-katalysierte Addition von Peroxylradikalen an Fettsäurehydroperoxide statt, wobei Lipid-Peroxid-Dimere gebildet werden. Diese instabilen Zwischenprodukte zerfallen spontan in vier Produkte, darunter zwei Aldehyd-Fragmente, ein Alkoxyradikal und ein Hydroxylradikal. Bemerkenswert ist, dass durch die Fragmentierung des Dimers weitere Radikale de novo entstehen. Im dritten Schritt können die in Galactolipiden veresterten Oxocarbonsäuren zu Dicarbonsäuren oxidiert werden. Hydroperoxide, die Vorläufer der Fettsäurefragmente, wurden in freier Form und in komplexen Lipiden verestert analysiert. Unter basalen Bedingungen liegt sowohl bei den freien, als auch bei den veresterten Hydroxyfettsäuren ein fast komplett Singulett Sauerstoff abhängiger Oxidationsmechanismus vor. Drei Galactolipid Hauptspezies (Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG)-18:3-16:3, Digalactosyldiacylglycerol (DGDG)-18:3-18:3 und DGDG-18:3-16:3) sind hoch oxidiert (5 bis 9 Mol-%, relativ zur jeweiligen Vorstufe). MGDG-18:3-18:3, ebenso wie Phosphatidylglycerol-, Phosphatidylinositol- und Triacylglycerol-Hydroxyfettsäurespezies liegen basal nur schwach oxidiert vor (< 2 Mol-%). Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae kommt es zu einer massiven Lipid Biosynthese und Oxidation durch die 13-Lipoxygenase LOX2, Singulett Sauerstoff und freie Radikale. Der Oxidationsgrad der Hydroxyfettsäuren in den Galactolipiden ändert sich kaum. Innerhalb der Triacylglycerole kommt es zu einem großen Anstieg der oxidierten Spezies (auf 12 bis 38 Mol-%). Die Oxidation und Fragmentierung der Fettsäuren in den Galactolipiden unter basalen Bedingungen und induziert durch die Pathogenbehandlung, stellen einen wichtigen biochemischen Prozess dar, auf dem PIM und AZA entstehen., The biosynthesis of fragmented fatty acids (short chain bicarboxylic acids and their precursor oxoacids) has not been established in plants. Important and common bicarboxylic fatty acids are pimelic acid and azelaic acid (PIM and AZA) and their putative precursors 7-oxoheptanoic acid (OHA) and 9-oxononanoic acid (ONA). Interest in the biogenetic origin of these unusual fatty acids stems from the fact that these fragmented fatty acids are involved in important biological processes. PIM is an established precursor of biotin in bacteria, fungi and plants. PIM biosynthesis has only recently been clarified in bacteria (E. coli and B. subtilis) and there is yet no evidence that an analogous pathway is operative in plants. Moreover, AZA has been identified as a pathogen-induced metabolite in Arabidopsis vascular sap that has been reported to prime local and systemic resistance against the pathogen Pseudomonas syringae. In animals, non-enzymatic fragmentation of fatty acid hydroperoxides is known to occur in complex membrane lipids during oxidative stress. ONA and AZA comprising phospholipids serve as endogenous pattern recognition ligands in the innate immune system of animals. The aim of this work was to clarify the mechanisms of fatty acid oxidation and fragmentation as well as the function of the oxidized fragments in the immune response of the model plant Arabidopsis thaliana. Within this work, fragmented fatty acids have been identified in complex lipids of plants for the first time and different hypotheses for the biosynthesis of fragmented fatty acids were examined. It could be shown that dienoic or trienoic fatty acids are precursors of fatty acid fragments in Arabidopsis thaliana. 9- and 13-lipoxygenases (LOX1, LOX5 and LOX2) are not essential for biosynthesis. In Arabidopsis fragmented fatty acids could be identified in free form and esterified in complex lipids, exclusively galactolipids. Application experiments revealed that biosynthesis of fatty acid fragments takes place in galactolipids in situ in a non-enzymatic way. Interpretation of in vitro and in vivo results lets suggest a reaction mechanism due to dimer hypothesis from Alan Brashs working group. The fragmentation process in green organelles was found to proceed through three steps. An initial and essential event is the formation of a pool of galactolipids comprising acyl hydroperoxides with conjugated dienes. These hydroperoxides are generated continuously in plastids through oxidation of fatty acyls by singlet oxygen. After infection with the avirulent strain of Pseudomonas syringae pathovar tomato the pool of galactolipid-peroxides is increased by catalytic impact of free radicals and lipoxygenases. In a second step, peroxy radical addition to fatty acid hydroperoxides results in dimerization of peroxides thereby forming an unstable intermediate that spontaneously decomposes to yield two aldehyde fragments, an alkoxy radical and a hydroxy radical. Notably, decomposition of the dimer leads to a de novo production of radicals. In a third step oxoacids esterified in galactolipids could be oxidized into bicarboxylic acids in a radical catalyzed process. Hydroperoxides, precursors of fatty acid fragments, were analyzed reduced to hydroxy fatty acids, in free form and esterified in complex lipids. Under basal conditions, some complex lipids were found to be highly and almost exclusively oxidized by singlet oxygen. Three galactolipid species (monogalactosyldiacylglycerole (MGDG)-18:3-16:3, digalactosyldiacylglycerole (DGDG)-18:3-18:3 and DGDG-18:3-16:3) showed highest level of oxidation with 5 to 9 mol-% (relative to their precursors). MGDG-18:3-18:3, as well as phosphatidylglycerol, phosphatidylinositol and triacylglycerol species are only slightly oxidized (< 2 mol-%). After P. syringae infection, massive lipid biosynthesis and oxidation by 13-lipoxygenase LOX2, singlet oxygen and free radicals was observed. Degree of oxidation in galactolipids was almost the same but hydroxylated triacylglycerol species showed a strong increase (up to 12 until 38 mol-%). Basal and pathogen-induced fatty acyl oxidation and fragmentation in galactolipids might be an important and general biochemical process yielding the essential biotin precursor PIM and AZA, which has previously been shown to prime the local and systemic immune response of A. thaliana.

Cryptochromes are photolyase-like blue/UV-A light receptors that regulate various light developmental responses in plants. Arabidopsis thaliana cryptochrome 2 (Atcry2) is the major photoreceptor mediating blue light regulation of flowering induction. Although the biological role of crys in plants is well-known, the initial photochemistry underlying cryptochrome activation and regulation remain poorly understood. In the present work we addressed several aspects in the early activation events of cry 2. Many members of the photoreceptor families and components of the light signalling transduction pathway dimerize. Therefore, we studied wheter Atcry2 dimerizes, too. Immunoprecipitation studies of transgenic Arabidopsis extracts expressing both, cry2-GFP and cry2 revealed that full-lenght Atcry2 is a homodimer in vivo in a light-independent fashion. The identity of the domains involved in cry2 homodimerization were investigated, and both CNT2 and CCT2 were found as monomers. Because of the sequence similarity of cry2 with cry1, heterodimerization between cry1 and cry2 was also studied, but no cry1-cry2 heterodimers were found in our experiments. The in vivo effect of dimerization was investigated using Arabidopsis transgenic lines expression either CCT2-GFP or cry2-GFP in addition of the endogenous cry2. Cry2-GFP dimers showed phosphorylation and degradation under blue light in the same way as the endogenous cry2, whereas under the same conditions the CCT2-GFP monomers remained stable and unphosphorylated. Moreover, cry2-GFP was able to promote early flowering in plants kept under short day conditions. Whereas under the same conditions CCT2-GFP expressing transgenic Arabidopsis flowered as late as wild-type. Crys purified from Escherichia coli contain two chromophores, which were identified as flavin adenine dinucleotide (FAD) and methenyltetrahydrofolate (MTHF), whereas the presence of MTHF was not found for Atcrys purified from an eukaryotic source as insect cells. The detailed knowledge of which chromophore(s) are attached under natural conditions is important for the interpretation of spectroscopic data of these receptors. Therefore, we overexpressed epitope-tagged cry2 in planta. Specific immuno-precipitation of the tagged cry2 protein allowed purification of sufficient amounts of the photoreceptor to identify its chromophores. Based on fluorescence emission data we found that cry2 binds indeed FAD and MTHF in planta. In addition, energy transfer from MTHF to FAD was observed. Because of their similarity in aminoacid sequence and structure, photolyases have been taken as a model for crys photocycle. However, crys were shown to undergo a photocycle in which semireduced flavin (FADHo) accumulates upon blue light irradiation in contrast to photolyase that accumulates fully reduced FADH-. Green light irradiation of cry2 causes a change in the equilibrium of flavin oxidation states, and attenuates cry2-controlled responses such as flowering. Here, we provided in vivo evidence for semireduced flavin (FADHo) being the active FAD redox state in Atcry2 by analysis of the expression of flowering genes, linking in vitro with physiological studies. In order to address further insight into the role of phosphorylation on Atcry2 activity, cry2 protein purification from the plant source following mass spectroscopy was performed. Pitifully, the obtained amounts were too small to allow clear results. Genes that are specifically blue-light induced in cell cultures were identified by PCR and qRT-PCR that can be used in future studies as reporters for transient studies monitoring cry activity., Cryptochrome sind mit DNA-Photolyasen eng verwandte UV-A/Blaulicht-Photorezeptoren, die zahlreiche Entwicklungsprozesse in Pflanzen steuern. Arabidopsis thaliana Cryptochrom 2 (cry2) spielt hierbei eine zentrale Rolle bei der photoperiodischen Regulation der Blühinduktion. Obwohl die biologischen Funktionen von Cryptochromen in Pflanzen gut untersucht sind, sind deren photochemischen Prozesse, die zur Aktivierung führen, wenig verstanden. In der vorliegenden Arbeit wurden zahlreiche Aspekte der Aktivierung von cry2 untersucht. Zahlreiche pflanzlichen Photorezeptoren und Komponenten der Lichtsignaltransduktion dimerisieren. Entsprechend wurde hier untersucht, ob dies auch für cry2 der Fall ist. Immunpräzipitationsstudien an Proteinextrakten transgener Arabidopsis Pflanzen, die cry2-GFP exprimieren, zeigten, dass cry2 in vivo als Dimer vorliegt. Licht scheint keinen Einfluss auf die Dimerisierung zu haben. Bei der Analyse, welche Domänen von cry2 für Dimerisierung notwendig sind, konnten keine eindeutigen Befunde erzielt werden, da sowohl die N-terminale Domäne (CNT2) als auch die C-terminale Domäne (CCT2) als Monomer gefunden wurden. Aufgrund der hohen Sequenzähnlichkeit von cry2 mit cry1 wurde untersucht, ob diese Heterodimere bilden. Die vorliegenden Befunde gaben darauf keinen Hinweis. Um die Rolle der Dimerisierung von cry2 auf dessen biologische Funktion zu untersuchen, wurden transgene Linien untersucht, die neben dem endogenen cry2 zusätzlich CCT2-GFP oder cry2-GFP exprimieren. Cry2-GFP Dimere wurden lichtabhängig phosphoryliert und abgebaut, ähnlich dem endogenen cry2. Im Gegensatz hierzu, blieben die CCT2-GFP Monomere unphosphoryliert und stabil. Weiterhin führte die Expression von cry2-GFP zu einer Beschleunigung des Blühens unter Kurztag-Bedingungen im Vergleich zum Wildtyp, nicht aber die Expression von CCT2-GFP. Pflanzliche Cryptochrome, die in E. coli exprimiert wurden, tragen zwei Chromophore (FAD und MTHF). Nach Expression in eukaryontischen Systemen wie Insektenzellen konnte bislang allerdings keine Bindung von MTHF an cry nachgewiesen werden. Kenntnisse darüber, welche Chromophore an cry in planta gebunden sind, sind für die Interpretation der spektroskopischen Daten dieser Photorezeptoren bedeutsam. Deshalb wurde in der vorliegenden Arbeit Epitop-markiertes cry2 in Pflanzen exprimiert und spezifisch über Immunpräzipitation in Mengen aufgereinigt, die eine Identifizierung der gebundenen Chromophore ermöglichte. Die Ergebnisse von Fluoreszenz-Emissionsspektroskopie zeigten, dass cry2 in planta sehr wahrscheinlich beide Cofaktoren, FAD und MTHF, bindet. Zusätzlich ergaben diese Untersuchungen Hinweis auf Energietransfer von MTHF auf FAD. Augrund der Ähnlichkeit von Photolyasen und Cryptochromem in ihrer Aminosäuresequenz and Struktur wurde die Photochemie von Photolyasen als Modell für den Photozyklus von Cryptochromen benutzt. Allerdings zeigten in vitro Untersuchungen, dass Cryptochrome nach Anregung mit Blaulicht semireduziertes Flavin (FADHo) akkumulieren, im Gegensatz zu Photolyasen, die vollständig reduziertes Flavin (FADH-) bilden. Zu Blaulicht zusätzlich gegebenes Grünlicht verschiebt das Gleichgewicht der Oxidationszustände von Flavin hin zu oxidiertem FAD und reprimiert cry2-kontrollierte Prozesse wie die Induktion der Blütenbildung. Hier durchgeführte Untersuchungen über die Wirkung von Grünlicht auf die Expression von Blühgenen lieferten zusätzliche Hinweise darauf, dass cry2 mit semireduziertem Flavin den aktiven Zustand dieses Photorezeptors repräsentiert. Zum weiteren Verständnis der Phosphorylierung von cry2 wurde versucht, das Protein aus Pflanzen in Mengen zu isolieren, die für nachfolgende massenspektrometrische Analysen ausreichend sind. Leider wurde dieses Ziel nicht erreicht. Weiterhin wurden die Expression zahlreicher Gene in Arabidopsis Zellkulturen durch PCR- und quantitative real-time PCR-Analysen daraufhin untersucht, ob sie spezifisch durch Blaulicht reguliert werden. Einige Gene konnten hierbei identifiziert werden, die in zukünftigen Untersuchungen als Reporter genutzt werden können, um die Aktivität von Wildtyp und Mutanten Cryptochromen zu untersuchen.

Eine in Datenbankanalysen identifizierte Sequenz im Genom von A. thaliana mit hoher Ähnlichkeit zur katalytischen Domäne der E. coli RNase E führte zur Isolierung einer cDNA, die für eine putative RNase E kodiert. Durch heterologe Überexpression der RNase Domäne konnte die RNA Bindungs- und Ribonukleaseaktivität dieses Proteins gezeigt werden. Transiente Expression der AtRNase E als Fusion mit GFP und weitere Experimente legen jedoch eine Lokalisation des Proteins außerhalb der Chloroplasten nahe. Auch besitzt die Arabidopsis RNase E eine neuartige Domänenstruktur im Vergleich zu prokaryotischen und in Plastiden von Algen kodierten Enzymen. DNA-Hybridisierungsexperimente und intensive Datenbankanalysen legen den Schluss nahe, dass es sich bei dem hier identifizierten Gen um den einzigen Vertreter dieser Familie im Genom von A. thaliana handelt. In transgenen Pflanzen, deren PNPase Aktivität vom Wildtyp abweicht, war die Effektivität der 3-strich Prozessierung direkt proportional zur Menge an vorhandener PNPase. Jedoch war in diesen Pflanzen keine Veränderung in der Gesamtmenge einzelner RNAs festzustellen. Daraus folgt, dass i) die PNPase das Schrittmacherenzym in der 3-strich Prozessierung ist, dass ii) der RNA Abbau in Chloroplasten strikt reguliert wird und dass iii) neben der PNPase noch weitere Exonukleasen existieren müssen, da diese nicht hinreichend für den RNA Abbau ist. Die Prozessierungsmuster plastidärer mRNAs in Pflanzen mit verringerter PNPase Aktivität ergaben keinen Hinweis auf die Existenz einer 3-strich prozessierenden Endonuklease in vivo, so dass das bisher gültige 2-Stufen Modell der 3-strich Prozessierung nicht bestätigt werden konnte. Die für viele RNA Spezies akkumulierenden 3-strich nicht prozessierten Vorläufermoleküle, werden aktiv translatiert, wie Experimente zur Polysomenassoziation gezeigt haben. Weiterhin zeigt die RNA in diesen Pflanzen ein höheres Maß an Polyadenylierung, was als direkter Beleg für die Existenz einer plastidären Poly A Polymerase und ihrer Beteiligung am RNA Abbau gewertet werden kann.