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La présente recherche vise à examiner l’emplacement des éléments qui font partie d’un système de fortification sur le territoire littoral et insulaire de l’Adriatique orientale attribué le plus souvent à l’époque de l’empereur byzantin Justinien Ier. Les analyses réalisées par le biais d’un SIG permettent d’examiner la visibilité et l’intervisibilité – deux facteurs indispensables pour tout système de fortification et de signalisation – entre les forts connus, les forts supposés et les endroits désignés du toponyme Straža (« Garde ») suggérant l’emplacement d’un poste de guet. Les résultats d’analyse de visibilité sont présentés et interprétés dans le contexte de la communication entre les forts ainsi que dans le contexte de leur emplacement par rapport aux routes maritimes utilisées depuis l’Antiquité. Nous examinons également la capacité de communication visuelle au sein du système de fortification, qui pouvait être accomplie par le biais d’utilisation des signaux de feu et de fumée. La recherche consiste en une approche d’investigation non-invasive et vise à contribuer à la connaissance des systèmes de fortifications tardo-antique en Dalmatie.

International audience; Le lactate a pendant de trop nombreuses années été considéré comme un simple déchet du métabolisme glycolytique, potentiellement délétère pour les organes étant donné le lien entre sa production et l’acidification du microenvironnement. Cette vision a été remise en cause par des études récentes qui placent le métabolisme du lactate au centre de l'homéostasie énergétique de l’organisme, et qui participent à sa réhabilitation en tant que métabolite majeur situé au carrefour du métabolisme glycolytique et oxydatif. De plus, cette littérature très dynamique ne cesse de mettre en lumière de nouveaux mécanismes par lesquels le lactate régule la physiologie cellulaire et notamment les processus de plasticité , en réponse aux modifications environnementales et métaboliques. Ainsi, il apparait que le lactate assure une communication métabolique inter-cellulaire et inter-tissulaire, non seulement par le transport de carbones et d’électrons entre différents compartiments, mais aussi grâce à son rôle de molécule de signalisation.

Starch is by far the major storage compound accumulated by plants and algae, one of the most abundant polysaccharides present on earth and principal source of dietary calories in the human and animal diet. Starch synthesis occurs during the day, using global outputs of photosynthesis and its degradation starts as night falls to sustain energy-demanding cellular functions. Little is known about the regulatory mechanisms governing starch metabolism in microalgae and current knowledge is lim-ited to factors impacting starch accumulation under adverse environmental conditions such as nitro-gen limitation. A link between light perception and starch accumulation has been suggested in the case of higher plants: Mutants devoid of Phytochrome have a reduced CO2 uptake but over-accumulate daytime sucrose and starch while PHOT has been found to mediate starch degradation in guard cells in the light to energize stomatal opening. Light perception and metabolism have not been associated in microalgae. Here we present a detailed PHOT-dependent signalling cascade, linking blue light perception with starch accumulation in the green microalga Chlamydomonas reinhard-tii:Pathway 1: Blue light, via PHOT, represses the bHLH domain-containing transcription factor (TF) GAPr4, an activator of GAP1, (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, involved in glycolysis and in photosynthetic CO2 fixation). Both the PHOT knock-out mutant phot and GAP1 over-expressing lines accumulate high amounts of starch.Pathway 2: Blue light, via PHOT, activates the RWP5 TF (belonging to the RWP-K family of TFs), a re-pressor of starch accumulation in a GAP1-independent manner.Pathway 3: PHOT-dependent phosphorylation of the serine/threonine kinase Blue Starch Kinase 1 (BSK1; orthologue of the Arabidopsis HT1 kinase that controls stomatal movements in response to CO2) mediates GAP1 and starch accumulation levels in a GAPr4-independent manner.Our work advances the current understanding of how light signaling controls metabolism in microal-gae. It also adds one more aspect in the multifaceted role of PHOT so far reported to control gameto-genesis at low nitrogen, expression of genes encoding chlorophyll and carotenoid biosynthesis, the size of the eyespot and photoprotection., L'amidon est non seulement, et de loin, le principal composé de stockage accumulé par les plantes et les algues, mais c’est également l'un des polysaccharides les plus abondants sur terre. De plus, il s’agit de la principale source de calories dans l'alimentation humaine et animale. La synthèse de l'amidon est un des produits finaux de la photosynthèse et sa synthèse se déroule pendant la journée, alors que sa dégradation commence à la tombée de la nuit pour soutenir les fonctions cellulaires exigeantes en énergie. On sait peu de choses sur les mécanismes de régu-lation qui régissent le métabolisme de l'amidon chez les micro-algues et les connaissances ac-tuelles se limitent aux facteurs qui ont un impact sur l'accumulation d'amidon dans des condi-tions environnementales défavorables telles que par exemple la disponibilité en azote. Un lien entre la perception de la lumière et l'accumulation d'amidon a été suggéré dans le cas des plantes supérieures : Les mutants dépourvus de Phytochrome ont une absorption réduite de CO2 tandis qu’ils accumulent de façon anormale du saccharose et de l'amidon pendant la journée. De plus, il a été découvert que PHOT jouait un rôle dans ce processus en servant de médiateur à la dégradation de l'amidon dans les cellules de garde à la lumière pour stimuler l'ouverture des stomates. Toutefois et jusqu’à présent, la perception de la lumière et le métabo-lisme n'ont pas été associés chez les micro-algues. Nous présentons ici une cascade de signali-sation détaillée dépendante de PHOT, reliant la perception de la lumière bleue à l'accumula-tion de l'amidon dans la microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii :Voie 1 : La lumière bleue, via PHOT, réprime le facteur de transcription (TF) GAPr4 conte-nant le domaine bHLH, un activateur de GAP1, (glyceraldehyde-3-phosphate déshydrogé-nase, impliqué dans la glycolyse et dans la fixation photosynthétique du CO2). Le mutant PHOT knock-out phot et les lignées surexprimant GAP1 accumulent de grandes quantités d'amidon.Voie 2 : La lumière bleue, via PHOT, active le TF RWP5 (appartenant à la famille des TFs RWP-K), un répresseur de l'accumulation d'amidon d'une manière indépendante de GAP1.Voie 3 : la phosphorylation dépendante de PHOT de la sérine/thréonine kinase Blue Starch Kinase 1 (BSK1 ; orthologue de la kinase HT1 d'Arabidopsis qui contrôle les mouvements stomatiques en réponse au CO2) sert de médiateur entre les niveaux de GAP1 et l’accumulation d'amidon d'une manière indépendante de GAPr4.Notre travail a fait progresser la compréhension actuelle de la façon dont la signalisation lumi-neuse contrôle le métabolisme chez les micro-algues. Il ajoute également une nouvelle fonction aux multiples rôles jouée par PHOT dont le contrôle de la gamétogenèse à faible teneur en azote, l'expression des gènes codant pour la synthèse de la chlorophylle et celle des caroté-noïdes, ainsi que la taille du stigma et la photoprotection.

Transmembrane receptors are proteins that translate extracellular information into intracellular signals. These proteins are categorised based on the way they transduce signals through the plasma membrane. In many cases such transduction involves the formation of dimers, either ligand-induced or constitutive dimers. For example, while the enzyme-linked receptors, such as the Epidermal Growth Factor (EGF) receptor, may be ligand-induced dimers, the G protein-coupled receptors (GPCR) activated by the neurotransmitter glutamate are covalently linked constitutive dimers. Understanding how a signal can be transduced from the extracellular domain into the cell is important to develop novel drugs targeting such receptors.The EGF receptor is a member of the receptor tyrosine kinase (RTK) class and is involved in cell differentiation and proliferation. Inhibition of the EGF receptor by medication is used as a successful treatment for a variety of cancers, but side effects and resistance to medication remain common major obstacles. The full-length EGF receptor crystal structure is unknown, which leaves ambiguity to the precise activation process and the effect of inhibitors. Its activation mechanism has been described as either ligand-induced dimerization or conformational changes within pre-assembled dimers. This is followed by phosphorylation of the intracellular domain of the receptor and the generation of intracellular signalling cascades. By generating a fluorescent conformational biosensor, we showed that the activation of the EGF receptor by its endogenous agonists results from ligand-induced dimerization. We also found that some non-competitive tyrosine kinase (TK) inhibitors also induce dimer formation, without activating the receptor, through a direct contact of the TK domains. Strikingly, internalization induced by its endogenous ligand is not blocked by the non-competitive inhibitors, demonstrating it does not require TK domain activity and is likely mainly dependent on receptor dimer conformation. This is supported by our observation that TK inhibitors promoting dimer formation slowed down the internalization process. This finding shows that the activation/dimerization process of the EGF receptor can be changed by inhibitors and that internalization of the EGF receptor is regulated by monomeric/dimeric conformations rather than by phosphorylation of the receptor.In contrast to the EGF receptor, the metabotropic glutamate (mGlu) 4 receptor is a constitutive dimer that is important for the regulation of many synapses in the brain. Recently, an mGlu2-mGlu4 heterodimer was proven to exist in the brain, but its function remains unknown due to the lack of tools selectively controlling it. To further investigate mGlu4 homo- and heterodimers, an innovative nanobody that discriminates between these receptors was developed. The nanobody is selective for the human mGlu4 receptor, and stabilizes the active homodimer conformation, making it a full agonist. By combining molecular dynamics simulations and site-directed mutagenesis, the epitope and mechanism of action of the nanobody were identified, revealing a new way of activating mGlu receptors. Conversely, this nanobody is incapable of activating heterodimeric mGlu2-mGlu4, where it acts as positive allosteric modulator through asymmetric activation of the heterodimer. This nanobody is the first pharmacological tool that discriminates between homo- and heterodimers.Overall, our studies revealed how important is the conformation of dimeric receptors to control their signalling, as shown with the TK inhibitors controlling to conformation of the TK domain-induced dimers and the internalization process of the EGF receptor, or by showing that nanobodies can control specifically a receptor dimer made of specific subunits. These findings show the importance of allosteric and asymmetric regulation of dimeric transmembrane receptors., Les récepteurs transmembranaires traduisent les informations extracellulaires en signaux intracellulaires sont classés en fonction de leur mécanisme de transmission des signaux à travers la membrane plasmique. Nombre de ces récepteurs sont assemblés en dimères constitutifs ou induits par le ligand. Si les récepteurs liés à une enzyme, tels que le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGF), peuvent être des dimères induits par le ligand, les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) activés par le neurotransmetteur glutamate sont des dimères constitutifs liés de manière covalente. Il est important de comprendre comment ces récepteurs transmettent le signal pour développer des médicaments les ciblant. Le récepteur de l'EGF est un récepteur à domaine tyrosine kinase (RTK) impliqué dans la différenciation et la prolifération des cellules. Son inhibition par des médicaments est utilisée dans le traitement de cancers, mais les effets secondaires et la résistance aux traitements restent des obstacles majeurs. Sa structure tridimensionnelle complète étant inconnue, son processus d'activation n’est pas complétement compris et résulterait soit d’une dimérisation induite par le ligand soit de changements de conformation au sein de dimères pré-assemblés. Ceci est suivi par la phosphorylation du domaine intracellulaire du récepteur et la génération de cascades de signalisation intracellulaire. En générant un biocapteur conformationnel fluorescent, nous avons démontré que l'activation du récepteur par l’EGF résulte de sa dimérisation induite par le ligand. Nous avons également découvert que certains inhibiteurs non compétitifs du domaine tyrosine kinase (TK) induisent la formation de dimères par un contact des domaines TK, mais sans activer le récepteur. Il est à noter que l'internalisation induite par l’EGF n'est pas bloquée par les inhibiteurs des TKs (ITK), ce qui démontre qu'elle ne nécessite pas l'activité du domaine TK et qu'elle dépend probablement de la conformation du dimère. Ceci est soutenu par l’observation que les ITKs favorisant la formation de dimères ralentissent l'internalisation. Ce résultat montre que le processus d'activation/dimérisation du récepteur de l'EGF peut être modifié par des ITKs et que son internalisation est régulée par sa conformation monomère/dimère plutôt que par sa phosphorylation. Le récepteur métabotropique du glutamate (mGlu) 4 est un dimère constitutif qui joue un rôle important dans la régulation de nombreuses synapses dans le cerveau. Récemment, l'existence d'un hétérodimère mGlu2-mGlu4 a été prouvée dans le cerveau, mais sa fonction reste inconnue en raison du manque d'outils permettant de le contrôler sélectivement. Pour approfondir l'étude des homo- et hétérodimères mGlu4, un nanocorps innovant qui discrimine ces récepteurs a été développé. Ce nanocorps est sélectif pour le récepteur mGlu4 humain et stabilise la conformation active de l'homodimère, ce qui en fait un agoniste complet. En combinant des simulations de dynamique moléculaire et une mutagenèse dirigée, l'épitope et le mécanisme d'action du nanocorps ont été identifiés, révélant une nouvelle façon d'activer les récepteurs mGlu. À l'inverse, ce nanocorps est incapable d'activer les hétérodimères mGlu2-mGlu4, sur lesquels il agit comme un modulateur allostérique positif par une action asymétrique sur l'hétérodimère. Ce nanocorps est le premier outil pharmacologique qui permet de distinguer les homo- et les hétérodimères. Nos études ont révélé l'importance de la conformation des récepteurs dimériques pour contrôler leur signalisation, comme le montrent les ITKs contrôlant la conformation des dimères induits par les domaines TK et le processus d'internalisation du récepteur de l'EGF, ou en montrant que les nanocorps peuvent contrôler spécifiquement un dimère de récepteur composé de sous-unités spécifiques. Ces résultats montrent l'importance de la régulation allostérique et asymétrique des récepteurs transmembranaires dimériques.

Les lymphocytes T orchestrent la réponse immunitaire adaptative afin de nous protéger contre les pathogènes. Les lymphocytes T sont dotés d’un récepteur de surface, le récepteur de cellules T (TCR), qui transmet le signal de stimulation vers l’intérieur de la cellule afin d’amorcer la cascade d’activation des cellules T. Le TCR est un complexe multimérique composé des dimères TCRαβ, CDεγ, CD3εδ et CD3ζζ. Les chaînes TCRαβ reconnaissent les antigènes pathogéniques tandis que les chaînes CD3 initient la cascade de signalisation des cellules T par la phosphorylation de leurs chaînes cytoplasmiques. Il est toujours incompris comment le signal d’activation du TCR est transmis des chaînes TCRαβ jusqu’aux domaines cytoplasmiques des chaînes CD3. Chez les lymphocytes T au repos, les chaînes CD3ε et CD3ζ sont associées au feuillet interne de la membrane plasmique (MP). Le domaine cytoplasmique de CD3ε et CD3ζ est riche en acides aminés basiques, ce qui permet leur association électrostatique avec les phospholipides acides de la MP. La phosphatidylsérine (PS) est le phospholipide acide le plus abondant de la MP. La PS est redistribuée exclusivement à la face cytoplasmique de la MP. Lors de l’activation des lymphocytes T, les chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs doivent se détacher de la PS pour leur phosphorylation. La dissociation membranaire d’un grand nombre de chaînes CD3 est essentielle à l’amplification de l’activation des lymphocytes T. Un mécanisme de dissociation des chaînes CD3ε et CD3ζ des TCRs proposé dans la littérature est par l’élévation intracellulaire de calcium. Un influx robuste de calcium est généré suivant la stimulation des cellules T. En plus d’être essentiel à l’activation efficace des cellules T, il a été proposé que le calcium neutralise les phospholipides acides de la MP afin de dissocier les chaînes CD3. Le calcium est également un co-facteur dans l’activité de plusieurs enzymes, comme la scramblase lipidique TMEM16F. TMEM16F redistribue la PS à la MP suivant l’élévation du calcium intracellulaire, ce qui résulte en la réduction de la PS au feuillet interne. Nous avons donc émis l’hypothèse que le calcium régule la dissociation des chaînes CD3 par l’activation de TMEM16F. Notre étude démontre que la redistribution calcium-dépendante de la PS par TMEM16F est essentielle à la dissociation membranaire de CD3ε dans la lignée de cellules T Jurkat. La réduction de l’expression de TMEM16F par ARN interférant (shTMEM16F) empêche la dissociation massive des chaînes CD3ε suivant la stimulation des cellules T. De plus, les cellules shTMEM16F démontrent une diminution de la phosphorylation des molécules de signalisation des cellules T. En contraste, l’expression d’une forme constitutivement active de TMEM16F augmente la redistribution de PS à la MP, la dissociation membranaire des chaînes CD3ε et la phosphorylation des molécules de signalisation. Notre étude démontre que la redistribution de la PS par la scramblase calcium-dépendante TMEM16F régule la dissociation membranaire des chaînes CD3 du TCR afin d’amplifier l’activation des cellules T. Enfin, nous avons confirmé les défauts d’activation dans des cellules T murines primaires exprimant shTMEM16F lors d’une réponse immunitaire. En conclusion, notre étude démontre le rôle de la régulation de la PS dans l’activation des cellules T. Nous avons démontré que nous pouvons modifier le niveau d’activation des cellules T en modulant la PS à la MP. Nos résultats ont ainsi plusieurs implications pour la conception et l’amélioration des immunothérapies basées sur les cellules T., T lymphocytes protect us against pathogens by orchestrating the adaptive immune response. T lymphocytes possess a specific surface receptor, the T cell receptor (TCR), which conveys the stimulation signal towards the cytoplasm for the initiation of the T cell activation cascade. The TCR is a multimeric complex composed of the TCRαβ, CDεγ, CD3εδ and CD3ζζ dimers. The TCRαβ chains recognize the pathogenic antigens while the CD3 chains initiate the T cells signaling cascade through the phosphorylation of their cytoplasmic tails. It is not yet understood how the TCR activating signal is transmitted through the membrane from the TCRαβ chains towards the cytoplasmic tails of the CD3 chains. In resting T cells, the CD3ε and CD3ζ chains are associated to the inner leaflet of the plasma membrane (PM). The cytoplasmic tails of CD3ε and CD3ζ are rich in basic amino acids, which allow electrostatic association with acidic phospholipids at the PM. Phosphatidylserine (PS) is the most abundant acidic phospholipid and is exclusively distributed towards the cytoplasmic PM leaflet. During T cell activation, the CD3ε and CD3ζ cytoplasmic tails have to dissociate from PS for their phosphorylation. The membrane dissociation of a large number of CD3 chains is essential for the amplification of T cell activation. A mechanism of CD3ε and CD3ζ chain dissociation that has been proposed in the literature is through intracellular calcium elevation. A robust calcium influx is generated following T cell stimulation. In addition to its essential role in regulating T cell activation, it has been proposed that calcium ions neutralize the PM acidic phospholipids for CD3 chain dissociation. Calcium is also an essential cofactor for the activity of many enzymes, such as the phospholipid scramblase TMEM16F. TMEM16F redistributes PS at the PM following intracellular calcium mobilization, resulting in a reduction of inner leaflet PS. We propose that calcium regulates CD3 chain dissociation through TMEM16F activity. Our study demonstrates that calcium-dependent PS redistribution by TMEM16F is required for CD3ε membrane dissociation in the Jurkat T cell line. Reduction of TMEM16F expression by shRNA targeting (shTMEM16F) prevents massive CD3ε chain dissociation following 8 T cell stimulation. The shTMEM16F cells show a reduction in the phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. In contrast, expression of a constitutively active mutant of TMEM16F increases PS redistribution, CD3ε chain dissociation and phosphorylation of TCR-proximal signaling molecules. Our study demonstrates that PS redistribution by the calcium-dependent TMEM16F scramblase regulates CD3 chain dissociation for the amplification of T cell activation. In addition, we have confirmed T cell activation defects in shTMEM16F murine primary T cells during an immune response. In conclusion, our study demonstrates the role of PS regulation by TMEM16F in T cell activation. We showed that we could modify the level of T cell activation by modulating the concentration of PS at the inner leaflet of the PM. Our results thus have important implications for the development and improvement of immune receptor-based cancer immunotherapies.

Many Aeschynomene sp. belonging to the Dalbergioids family, like Arachis hypogea, can develop a nitrogen-fixing root symbiosis with photosynthetic bradyrhizobia. Among them, certain strains are lacking the nod genes operon which is essential for Nod Factor biosynthesis. First genetic analysis in Aeschynomene evenia revealed that many genes involved in bacterial perception in model legumes are not functionals in the Nod-independent symbiosis whereas the genes involved in signal transduction are mainly conserved.In the aim to better understand how Nod-independent nodulation has been set up, we searched to identify new genes using forward genetics on A. evenia. An EMS mutagenized population has been generated leading to the isolation of 250 stable mutant lineages affected in the nodulation process. Among these mutants, half of them are totally unable to nodulate and are qualified by « Nod- ».A Targeted-Sequence-Capture analysis has been realized on the Nod- mutants and allows the identification of mutations in many known genes of the « Nod signaling pathway » This kind of analysis is possible thanks to a reference genome which has been sequenced and annotated recently. Mutations have been found in AePOLLUX, AeCCaMK, AeCYCLOPS, AeNIN, and AeNSP2 genes whereas no mutations have been found in any LysM-RLK (Nod factor receptors). Gene expression analysis by Q-PCR on different mutants have been realized to observe eventual deregulation of other symbiotic genes.Concerning Nod- mutants for which no known symbiotic gene has been associated, we performed a Mapping-by-Sequencing approach that is combining cartography and whole-genome sequencing to localize homozygous mutations. For some mutants with the same phenotype, we identify mutations on a gene coding a Receptor-Like Cytoplasmic Kinase (RLCK). This gene underwent a specific duplication event that is only observed in Nod-independent Aeschynomene species, suggesting a role of this cytoplasmic kinase during the Nod-independent symbiosis. This kind of protein devoid of the extracellular domain and belonging to a family known for associates with Receptor-Like Kinase (RLK) to transduce the signal and activation of genetic programs of development, reproduction, growth, and immunity. However, this is one of the first times that a protein of this family is shown to be involved in nitrogen-fixing symbiosis (except for LjNiCK4 in 2019).Furthermore, the Mapping-by-sequencing approach allows the identification of 3 other new symbiotic genes (AeCRK, AeRINRK, AeMLRR-RLP) that are not described in model legumes (except LjRINRK1 in 2019). In this manuscript, the results of these analyses will be presented and discussed in order to understand the molecular mechanisms governing the nodulation in the absence of Nod factors.; Plusieurs espèces appartenant au genre tropical Aeschynomene développent une symbiose fixatrice d’azote originale avec des Bradyrhizobium photosynthétiques, qui ne passe pas par la reconnaissance des facteurs Nod rhizobiens et la formation de cordons d’infection. Pour mettre à jour les mécanismes moléculaires de cette symbiose dite Nod-indépendante, une approche de génétique directe est mise en œuvre chez Aeschynomene evenia. Elle combine le crible d’une population de mutagenèse EMS, ayant permis d’isoler 250 mutants de nodulation, au séquençage du génome d’A. evenia pour faciliter l’identification de gènes symbiotiques à partir de ces mutants. Au cours de ma thèse, j’ai mis à profit le génome nouvellement disponible d’A. evenia en menant une analyse comparative de gènes symbiotiques afin d’obtenir une vue d’ensemble des mécanismes potentiellement conservés ou divergents entre A. evenia et les légumineuses modèles M. truncatula et L. japonicus. Ce travail a mis en exergue des différences génétiques importantes, notamment au niveau des étapes de reconnaissance des rhizobiums et d’infection. Ensuite, pour déterminer quels gènes connus chez les légumineuses modèles sont aussi impliqués dans la symbiose Nod-indépendante, j’ai recherché des mutations par Targeted Sequence Capture de ces gènes sur les 250 mutants de nodulation d’A. evenia. Cette approche a révélé que nombreux mutants Nod-, qui sont bloqués dans les étapes les plus précoces de l’interaction, sont altérés dans plusieurs gènes de la voie de signalisation symbiotique activée par les rhizobiums : AePOLLUX, AeCCaMK, AeCYCLOPS, AeNIN et AeNSP2. En revanche, aucune mutation n’a été trouvée dans les gènes codant des récepteurs symbiotiques.Pour identifier chez A. evenia de nouveaux gènes clé de la symbiose Nod-indépendante, j’ai appliqué une approche sans a priori, le Mapping-by-Sequencing, sur les mutants Nod- n’ayant pas de gène connu associé. Cette stratégie a été fructueuse pour identifier deux gènes : AeRLCK, qui code un Receptor-Like Cytoplasmic Kinase (RLCK), et AeCRK, codant une Cysteine-rich Receptor-like Kinase (CRK). Il est notable que ces deux gènes ne sont pas retrouvés chez les légumineuses modèles et qu’ils appartiennent à deux familles d’acteurs de signalisation précoce pouvant participer à la formation de complexe récepteurs avec des Receptor-Like Kinases (RLK) pour assurer la transduction d’un signal extracellulaire. Une caractérisation de ces deux nouveaux acteurs symbiotiques a révélé qu’AeRLCK est issu d’une duplication en tandem propre aux Aeschynomene Nod-indépendantes et qu’AeCRK est soumis à une sélection purifiante chez ces mêmes espèces, ce qui suggère qu’ils pourraient fonctionner spécifiquement dans la symbiose Nod-indépendante. Pour préciser leur rôle et les positionner par rapport à la voie de signalisation symbiotique conservée avec les légumineuses modèles, j’ai également initié une analyse comparative fine au niveau phénotypique et moléculaire. La découverte d’AeRLCK et AeCRK représente une avancée importante dans notre compréhension des mécanismes moléculaires qui contrôlent l’établissement de la symbiose Nod-indépendante. Elle ouvre maintenant la voie à une analyse fonctionnelle de ces deux acteurs symbiotiques et à une recherche des récepteurs symbiotiques avec qui ils peuvent interagir.

Le diabète de type 2 (DT2) est caractérisé par une résistance à l’action de l’insuline et une dysfonction des cellules β pancréatiques. Il apparait lorsque la cellule β devient incapable d’augmenter sa masse fonctionnelle afin de compenser la résistance périphérique à l’action de l’insuline. L’identification de molécules capables de stimuler la réplication des cellules β et ainsi de préserver leur masse fonctionnelle aurait donc un intérêt thérapeutique majeur. Nous avons établi un modèle d’excès de nutriments in vivo chez le rat, dans lequel nous avons observé qu’une augmentation de la prolifération des cellules β associée à une augmentation de l’expression du facteur de croissance « heparin-binding EGF-like growth factor » (HB-EGF). L’objectif de cette thèse était de valider l’effet mitogène du HB-EGF sur les cellules β de rats et humaines, puis d’identifier le mécanisme d’activation de la voie HB-EGF-EGFR. Dans une première étude, nous avons démontré ex vivo que le facteur croissance HB-EGF stimule la prolifération des cellules β pancréatiques d’îlots isolés de rats et humains via l’activation de son récepteur EGFR. Nous avons également observé que la stimulation de la prolifération des cellules β de rats par le glucose nécessite l’activation de la voie de signalisation HB-EGF-EGFR par un mécanisme qui implique à la fois une augmentation de l’expression du gène codant pour HB-EGF via le facteur de transcription ChREBP, et l’activation du récepteur EGFR via une protéine de la famille des protéines Src tyrosine kinase. Les cellules β des îlots humains étant réfractaires à la prolifération, il est essentiel de confirmer les résultats obtenus chez les rongeurs dans des tissus humains. Nous avons observé un effet mitogène d’HB-EGF sur les cellules β humaines. En revanche, nous n’avons pas pu détecter de manière reproductible un effet stimulant du glucose sur la prolifération des cellules β humaines. Notre deuxième étude a donc consisté à identifier la technique la plus appropriée pour mesurer la prolifération des cellules β humaines. Nous avons comparé systématiquement la mesure de la prolifération en réponse à divers stimuli par cytométrie en flux ou par immunohistochimie sur des îlots intacts ou dispersés. Nous avons testé trois facteurs mitogènes soit le glucose, l’HB-EGF et l’harmine. Nous avons observé que l’HB-EGF et l’harmine stimulent la prolifération des cellules β et non β indépendamment de la méthode utilisée. En revanche, l’action mitogène du glucose semble être dépendante de la méthode. En conclusion, nous avons d’abord démontré que l’effet mitogène du glucose nécessite l’activation de la voie de signalisation HB-EGF-EGFR. Ensuite, nous avons observé que la mesure de la prolifération des cellules β humaines par cytométrie en flux offre plusieurs avantages par rapport à l’immunohistochimie., Type 2 diabetes (T2D) is characterized by peripheral insulin resistance and pancreatic β-cell dysfunction. T2D occurs when β cells become unable to increase their functional mass in order to compensate for insulin resistance. The identification of molecules capable of stimulating β-cell replication to preserve their functional mass would therefore be of major therapeutic interest. We previously established a model of nutrient excess in which we observed an increase in β-cell proliferation associated with enhanced expression of the growth factor "heparin-binding EGF-like growth factor" (HB-EGF). The objective of the work presented in this thesis was to test the hypothesis that HB-EGF stimulates both rodent and human β-cell proliferation and to identify the underlying mechanisms. In a first study, we demonstrated ex vivo that HB-EGF stimulates pancreatic β-cell proliferation of isolated rat and human islets by activating EGFR. We also demonstrated that glucose, an important mitogen of the β cells, requires the activation of this HB-EGF-EGFR signaling pathway, ex vivo and in vivo in an infused rat model, to stimulate β-cell replication. Mechanistically, we demonstrate that glucose promotes HB-EGF gene expression via the ChREBP transcription factor and EGFR activation via a protein from the Src kinase family. Since adult human β cells tend to be refractory to proliferation, it is essential to confirm the findings obtained in rodents in human tissues. In isolated human islets, we confirmed the mitogenic action of HB-EGF but we were unable to detect a consistent stimulation of human β-cell proliferation in response to glucose. Our second study therefore consisted in identifying the most appropriate technique to measure human β-cell proliferation. We systematically compared proliferation levels measured by flow cytometry or immunohistochemistry in intact and dispersed human islets. We tested three mitogenic factors: glucose, HB-EGF and harmine. We observed that HB-EGF and harmine stimulate non-β cells and β-cell proliferation regardless of the method used. In contrast, the mitogenic action of glucose is variable depending on the method used. In conclusion, we first demonstrated that the mitogenic effect of glucose in β cells requires the activation of the HB-EGF-EGFR signaling pathway. Then we demonstrated that assessment of human β cell proliferation by flow cytometry offers several advantages over the use of immunohistochemical methods.

Dans le contexte actuel de changements climatiques, les problématiques futures de la recherche forestière fondamentale et valorisée concernent la capacité des arbres à survivre et s’acclimater à un environnement changeant. D’où une nécessité d’étudier les mécanismes sous-tendant la réponse des arbres aux variations de l’environnement qui vont générer d’une façon générale une contrainte oxydante. La synthèse de mes travaux porte ainsi sur l’étude des paramètres intervenant dans la détoxication cellulaire et à la signalisation cellulaire, afin de mieux comprendre la régulation et la nature des mécanismes impliqués dans la tolérance des arbres aux contraintes. Dans un premier temps, la capacité de détoxication foliaire a été étudiée au niveau biochimique et moléculaire en réponse à la contrainte ozone (O3) appliquée seule, avant d’intégrer une seconde contrainte (sécheresse) et la combinaison des deux. Les acteurs et la dynamique de la signalisation hormonale en réponse à ces contraintes, seules ou en combinaison ont été recherchés chez le peuplier. Enfin, afin de mieux lier la manière dont les arbres répondent et interagissent à la fois avec leur environnement abiotique mais aussi biotique, le rôle du compartiment souterrain et de la symbiose ectomycorhizienne a été intégré à l’étude de la réponse du peuplier à la contrainte. En perspectives, mon projet de recherche pour les prochaines années s’attachera à mener une approche de physiologie intégrative faisant intervenir la réponse de l’arbre à son environnement changeant (combinaison de contraintes et mise en place de l’acclimatation) et dans son environnement (rôle des mycorhizes). In the current context of climate change, the future problems of fundamental and valorized forestry research concern the ability of trees to survive and acclimatize to a changing environment. Hence, we need to study the mechanisms underlying the response of trees to variations in the environment that will generally generate oxidative stress. The synthesis of my work thus focuses on the study of parameters involved in cell detoxification and cell signaling, in order to better understand the regulation and nature of the mechanisms involved in the tolerance of trees to stress. First, the foliar detoxification capacity was studied at the biochemical and molecular level in response to the ozone (O3) constraint applied alone, before integrating a second constraint (drought) and the combination of both. The actors and dynamics of hormonal signaling in response to these constraints, alone or in combination, were investigated in poplar. Finally, in order to better link the way trees respond and interact with both their abiotic and biotic environment, the role of the underground compartment and ectomycorrhizal symbiosis was integrated in the study of poplar response to stress. My research project for the next few years will focus on an integrative physiology approach involving the response of the tree to its changing environment (combination of constraints and acclimatization) and in its environment (role of mycorrhizae).

Actin network architecture and dynamics play a central role in cell contractility and tissue morphogenesis. Local modulations of Actomyosin network dynamics depend largely on the activation of the RhoA activation cascade. In my thesis, I combined quantitative microscopy using TIRFM, single-molecule imaging, numerical simulations and simple mathematical modeling, to explore the dynamic network architecture underlying pulsed contractions in a simple model, the C. elegans early embryo. Focusing on the Actin elongator Formin, we observed that F-Actin elongation was catalyzed by a specific subpopulation of cortical Formins – termed elongating Formins – that displayed a characteristic ballistic mobility. My results also showed that Formin-mediated F-Actin elongation rate was dependent on the phase of the cell cycle and embryonic stage. We subsequently showed that elongating Formins saturate available barbed ends of Actin filaments, converting a local biochemical gradient of RhoA activity into a polar network architecture. In second study, focusing on the kinetics of the RhoA activation cascade, we developed and functionally challenged a simple numerical model. This model takes advantage of the measurements of the dynamical parameters of the Myosin, downstream effector of the RhoA activation cascade, to predict the temporal evolution of this cascade. I propose that this simple and generic model – which can in essence fit any activation cascade – offers a simple mathematical framework to understand the temporal dynamics of signaling cascades, and the delay and change in the shape of the response which can be observed between the input and the output of a cascade., L’architecture et la dynamique du cortex d’Actine joue un rôle central dans la contractilité cellulaire et la morphogénèse des tissus. La modulation locale de la dynamique du réseau d’Actomyosine dépend majoritairement de la cascade d’activation de RhoA. Dans ma thèse, j’ai combiné des approches de microscopie quantitative en TIRFM, de l’imagerie en molécule unique, des simulations numériques et de la modélisation mathématique simple pour explorer l’architecture dynamique du réseau sous-jacent aux contractions pulsées dans un modèle simple : le jeune embryon de C. elegans. En se concentrant sur la Formine, élongateurs de l’Actine, nous avons observé que l’élongation de la F-Actine était catalysée par une population spécifique de Formines corticales – appelées Formines élongatrices – qui montrent une mobilité de type balistique. Nous avons ensuite montré que les Formines saturent les extrémités barbées disponibles et convertissent un gradient biochimique local de l’activité de RhoA en un réseau d’architecture polaire. Dans une seconde étude, en se concentrant sur la cinétique de la cascade d’activation de RhoA, nous avons développé un modèle numérique simple. Celui-ci tire profit des mesures des paramètres dynamiques de la Myosine, un effecteur terminal de la cascade d’activation de RhoA, pour prédire l’évolution temporelle de cette cascade. Je propose ici que ce modèle simple et générique – qui peut par essence s’adapter à n’importe quelle cascade – offre un cadre mathématique simple pour comprendre la dynamique temporelle des cascades d’activation, et le délai et changement dans la forme de la réponse qui peuvent être observés entre l’entrée et la sortie.

Actin network architecture and dynamics play a central role in cell contractility and tissue morphogenesis. Local modulations of Actomyosin network dynamics depend largely on the activation of the RhoA activation cascade. In my thesis, I combined quantitative microscopy using TIRFM, single-molecule imaging, numerical simulations and simple mathematical modeling, to explore the dynamic network architecture underlying pulsed contractions in a simple model, the C. elegans early embryo. Focusing on the Actin elongator Formin, we observed that F-Actin elongation was catalyzed by a specific subpopulation of cortical Formins – termed elongating Formins – that displayed a characteristic ballistic mobility. My results also showed that Formin-mediated F-Actin elongation rate was dependent on the phase of the cell cycle and embryonic stage. We subsequently showed that elongating Formins saturate available barbed ends of Actin filaments, converting a local biochemical gradient of RhoA activity into a polar network architecture. In second study, focusing on the kinetics of the RhoA activation cascade, we developed and functionally challenged a simple numerical model. This model takes advantage of the measurements of the dynamical parameters of the Myosin, downstream effector of the RhoA activation cascade, to predict the temporal evolution of this cascade. I propose that this simple and generic model – which can in essence fit any activation cascade – offers a simple mathematical framework to understand the temporal dynamics of signaling cascades, and the delay and change in the shape of the response which can be observed between the input and the output of a cascade., L’architecture et la dynamique du cortex d’Actine joue un rôle central dans la contractilité cellulaire et la morphogénèse des tissus. La modulation locale de la dynamique du réseau d’Actomyosine dépend majoritairement de la cascade d’activation de RhoA. Dans ma thèse, j’ai combiné des approches de microscopie quantitative en TIRFM, de l’imagerie en molécule unique, des simulations numériques et de la modélisation mathématique simple pour explorer l’architecture dynamique du réseau sous-jacent aux contractions pulsées dans un modèle simple : le jeune embryon de C. elegans. En se concentrant sur la Formine, élongateurs de l’Actine, nous avons observé que l’élongation de la F-Actine était catalysée par une population spécifique de Formines corticales – appelées Formines élongatrices – qui montrent une mobilité de type balistique. Nous avons ensuite montré que les Formines saturent les extrémités barbées disponibles et convertissent un gradient biochimique local de l’activité de RhoA en un réseau d’architecture polaire. Dans une seconde étude, en se concentrant sur la cinétique de la cascade d’activation de RhoA, nous avons développé un modèle numérique simple. Celui-ci tire profit des mesures des paramètres dynamiques de la Myosine, un effecteur terminal de la cascade d’activation de RhoA, pour prédire l’évolution temporelle de cette cascade. Je propose ici que ce modèle simple et générique – qui peut par essence s’adapter à n’importe quelle cascade – offre un cadre mathématique simple pour comprendre la dynamique temporelle des cascades d’activation, et le délai et changement dans la forme de la réponse qui peuvent être observés entre l’entrée et la sortie.

National audience; Les produits terminaux de glycations s’accumulent avec l’âge mais peuvent aussi provoquer un vieillissement accéléré, sous l’effet de facteurs externes (ex. « malbouffe », pollution, alcool, tabac, UV). Dans ce contexte, nous émettons l’hypothèse qu’un des liens moléculaires, entre exposition aux pesticides et risque de développer la maladie de Parkinson, implique la régulation de la glycation via son système de défense porté par la protéine Park 7. Le projet ToxPARK a pour but de caractériser la régulation de l’activité de Park 7 par les pesticides, dont ceux de la famille des carbamates et du paraquat, dans une démarche moléculaire et cellulaire.

Ce travail propose une approche pragmatique de l’avant-garde comme ethos de collectifs culturels. Elle est fondée sur la théorie du signalement de handicap tel que le décrit l’ethologiste et biologiste Amotz Zehavi. On montre comment des collectifs d’avant-garde signalent qu’ils peuvent porter divers fardeaux, agir de façon altruiste et se sacrifier, afin d’être couronné du titre d’avant-gardistes, puis on examine ces notions à travers le mouvement contemporain de l’écriture dite collaborative.

The plasma membrane of most eukaryotic cells possess specialized invaginated lipid nanodomains called caveolae. Like clathrin coated pits, caveolae possess a characteristic coat composed of a suite of essential proteins including caveolins and cavins [Parton and Simons 2007, Parton and del Pozo 2013, Lamaze et al. 2017]. In addition to being implicated in important cellular functions such as transcytosis, lipid homeostasis, endocytosis and signaling, caveolae have been recently shown to demonstrate a protective role in maintaining the integrity of the plasma membrane under conditions of mechanical stress [Sinha et al. 2011]. The caveolar pits act as ‘membrane reservoirs’ that can flatten out by disassembling their coat and thereby buffer the membrane tension variations resulting from mechanical stress. Following caveolae flattening, caveolins and the caveolar coat proteins are released and this event has been hypothesized to be involved in downstream signal transduction [Nassoy and Lamaze 2012]. The goal of my thesis work was to unravel the precise control of signaling by caveolae mechanics. Here we tried to dissect mechanotransduction through caveolae by elucidating the molecular events underlying the control of JAK-STAT signaling through disassembly of caveolae. Using state-of-the-art super resolution imaging combined with machine-learning network analysis, we show that in response to mechanical stress, caveolae disassemble into so-called smaller scaffolds (also known as non-caveolar caveolin-1 (Cav1) which display increased mobility at the plasma membrane. In addition, we found that Cav-1 negatively regulates JAK1 kinase dependent STAT3 phosphorylation. Furthermore, we revealed the interaction between Cav1 and JAK1 which increases upon an increase in mechanical stress and is mediated by the caveolin scaffolding domain (CSD). Taken together, our results demonstrate that caveolae can act as mechano-signaling organelles with an ability to remotely control downstream signal transduction from the plasma membrane., La membrane plasmique de la plupart des cellules eucaryotes possède des nanodomaines lipidiques invaginés spécialisés appelés cavéoles. Comme les puits recouverts de clathrine, les cavéoles possèdent un manteau caractéristique composé de protéines essentielles comprenant les cavéolines et les cavines [Parton et Simons 2007, Parton et del Pozo 2013, Lamaze et.al 2017]. En plus d'être impliquées dans des fonctions cellulaires importantes telles que la transcytose, l'homéostasie lipidique, l'endocytose et la signalisation, le rôle protecteur des cavéoles dans le maintien de l'intégrité de la membrane plasmique dans des conditions de stress mécanique a récemment été démontré [Sinha et al. 2011]. Les cavéoles agissent comme des « réservoirs membranaires » qui peuvent s'aplatir en démantelant leur manteau protéique et ainsi amortir les variations de tension membranaire résultant des contraintes mécaniques. Après l'aplatissement des cavéoles, cavéolines et leurs protéines d'enveloppe sont libérées et cet événement a été supposé être impliqué dans la transduction du signal en aval [Nassoy et Lamaze 2012]. Le but de mon travail de thèse était de décrypter le contrôle précis de la signalisation par la mécanique des cavéoles. Nous avons donc essayé de disséquer la mécanotransduction cavéolaire en élucidant les événements moléculaires sous-jacents au contrôle de la signalisation JAK-STAT par le désassemblage des cavéoles. En combinant l’imagerie à super résolution à l’analyse de réseaux par apprentissage automatique (machine learning), nous montrons qu'en réponse à un stress mécanique, les cavéoles se fragmentent en assemblages plus petits (également appelés cavéoline-1 (Cav1) non cavéolaires) qui présentent une augmentation de leur mobilité au niveau de la membrane plasmique. En outre, nous avons constaté que Cav-1 régule négativement la phosphorylation de STAT3 dépendante de la kinase JAK1. De plus, nous avons observé l'interaction entre Cav1 et JAK1 qui augmente lors d'un stress mécanique plus important et qui est médiée par le domaine d'échafaudage de la cavéoline (CSD). L’ensemble de nos résultats démontrent que les cavéoles peuvent agir comme des organites de mécano-signalisation avec la capacité de contrôler à distance la transduction du signal en aval de la membrane plasmique.

Tam Metin / Full Text Karayolu ağlarında büyük öneme sahip olan kavşaklar, çeşitli özelliklerine göre kategorilere ayrılır. Hemzemin kavşak tiplerinden biri olan dönel kavşaklar yirminci yüzyılın başından itibaren kullanılmaktadır. Modern dönel kavşaklar, ada etrafında dönen araca yol ver kuralı ve yüksek güvenliğe sahip geometrisi ile yaklaşım kollarından katılan araçların düşük ve sabit hızla hareketini sağlar. Bu nedenle modern dönel kavşaklar, son yıllarda özellikle kentsel kavşaklarda tercih edilmektedir. Ancak bu kavşak tipi, yaklaşım kollarındaki dengesiz akımlara karşı hassas olduğundan, bu şartlar altında kavşağa katılmak isteyen araçlar arasında gerekli olan boşluğu sağlayamaz ve kavşak kollarında gecikmeler ve kuyruklanmalar oluşur. Meydana gelen aşırı gecikme ve kuyruklanma sorunlarının azaltılması amacıyla kısmi denetimli sinyalize dönel kavşaklar bir çözüm seçeneği olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bu makalede, kısmi denetimli sinyalize dönel kavşakların kavşak performansı üzerindeki etkisi mevcut literatür ışığında incelenmiştir. Bu çalışmada dönel kavşakların performanslarını değerlendirmek için temel parametre olarak gecikme kullanılmış, ayrıca çevresel ve ekonomik etkilere de değinilmiştir. İncelenen çalışmalarda, kısmi denetimli sinyalize dönel kavşakların çeşitli akım talepleri altında başarılı sonuçlar verdiği görülmüştür.Bu sebeple kısmi denetimli sinyalize dönel kavşakların ülkemizde bulunan dönel kavşakların geometrileri ve yerel sürücü davranışları gibi değişkenler de göz önünde bulundurulması kaydıyla bir seçenek olarak değerlendirilmesi gerektiğinden bahsedilmiştir. ntersections have significant effect in highway networks and are categorized according to their various characteristics. Roundabouts, one of the types of at-grade intersections, have been using since the beginning of the twentieth century. Modern roundabouts are common in recent years, especially in urban intersections, thanks to the give way rule to circulating vehicles around the island and its geometry that provides high safety by ensuring low and constant speed movement of the vehicles joining from the approaches. However, this type of intersection is sensitive to unbalanced flow patterns in the approaches, it cannot provide the necessary gap to the vehicles that want to join the intersection under these conditions hence delays and queues occur in the intersection legs. In order to reduce emerged excessive delay and queuing problems, roundabout metering has started to be used as a solution option. In this article, the effect of roundabout metering on intersection performance is examined in the light of the available literature. In this study, delay was used as the primary parameter to evaluate the performance of roundabouts, also environmental and economic impacts were mentioned. In the investigated studies, it was seen that roundabout metering shows successful results under several flow patterns. Thus, it was mentioned that roundabout metering should be considered as an option by taking factors into account such as the geometry of the roundabouts in Turkey and local driver behaviors.

International audience; Recent geographical scholarship has shown that the persecution and extermination of European Jews during the Holocaust was associated with profound spatial transformations at every scale, from the body to the continent. Yet, the embodied spatial experience of Jews throughout persecution and the way it affected their subjectivity, particularly as they kept living and surviving in the ordinary city, has been understudied. In this paper, we draw on the diaries of six Parisian Jews written during the Holocaust to explore the process of subject formation, or subjectivation, as antisemitic measures transform their daily life and experience of public space in the city. We focus in particular on two techniques of control that sought to produce particular kinds of subjects by working on the relationship between bodies and their surrounding milieus: signage and body writing. Relying on understandings of subjectivation as contested, contingent, and multiple we show that, first, ‘ideal’ subject formation relied on techniques involving both bodily inscription and differentiation as well as the resignification of urban space; and second, that such efforts were resisted and taken up only partially by both Jewish and non-Jewish Parisians, resulting in incomplete and contested attempts at subjection.; Des études de géographie récentes ont montré que la persécution et l’extermination des Juifs européens pendant la Shoah étaient liées à de profondes transformations spatiales à toutes les échelles, du corps au continent. Toutefois, l’expérience spatiale et corporelle des Juifs à travers la persécution et la manière dont elle a influencé leur subjectivité, en particulier pendant qu’ils continuaient à vivre et survivre dans la ville ordinaire, a été insuffisamment étudiée. Dans cet article, nous nous appuyons sur les journaux de six Juifs parisiens écrits pendant la Shoah, pour explorer le processus de constitution du sujet, ou subjectivation, alors que les mesures antisémites transforment leur quotidien et leur expérience de l’espace public dans la ville. Nous nous concentrons en particulier sur deux techniques de contrôle conçues pour générer des catégories des sujets particulières en exploitant la relation entre les corps et les milieux dans lesquels ils se trouvent: la signalisation et l’inscription corporelle. En nous basant sur des conceptions de la subjectivation comme contestée, contingente et multiple, nous démontrons que, premièrement, la constitution du sujet “idéal” se fonde sur des techniques comprenant à la fois l’inscription et les différentiations corporelles ainsi que la resignification de l’espace urbain, et que, deuxièmement, ces efforts ont rencontré des résistances et n’ont été que partiellement adoptés par les Parisiens, Juifs autant que non-Juifs, avec pour résultat des tentatives incomplètes et contestées de subjection.

National audience; Le développement d’une méthode d’imagerie innovante a permis de montrer que la membrane qui entoure les cellules végétales est composée d’une multitude de petits territoires présentant des états physiques variés. L’organisation globale et locale de cette membrane est modifiée de façon très rapide lorsque la cellule détecte des microorganismes, établissant un lien fonctionnel entre cette organisation et la mise en place de mécanismes de défense. 13 10 ans de recherche SPE Les plantes sont confrontées en permanence à des attaques de champignons, bactéries ou autres parasites, et développent des réponses adaptatives qui conditionnent leur survie. Certaines molécules produites par des microorganismes, appelées éliciteurs, sont reconnues par la plante qui mobilise alors ses systèmes de défense inductibles et organise sa résistance. La membrane des cellules végétales est une mosaïque hétérogène de territoires de très petite taille. Certains d’entre eux, enrichis en constituants protéiques et lipidiques particuliers, apparaissent comme plus rigides et ordonnés car ils sont le siège d’interactions fortes entre les différentes molécules, notamment les lipides, qui les constituent. Dans les minutes qui suivent le traitement par un éliciteur de réactions de défense, la cryptogéine, une petite protéine sécrétée par un oomycète, la membrane des cellules de tabac subit deux modifications : elle voit sa fluidité latérale et la proportion des petits domaines ordonnés augmenter. Le traitement par un éliciteur bactérien, la flagelline, provoque uniquement ce second mécanisme. La cryptogéine est, contrairement à la flagelline, un éliciteur nécrosant, provoquant une mort cellulaire locale visant à contenir la progression du microorganisme. Ainsi, l’augmentation de la proportion de domaines ordonnés pourrait être un phénomène générique associé au déclenchement de la signalisation de défense, quand l’augmentation de fluidité latérale serait un effet spécifique à la cryptogéine. Ces travaux ont révélé la première description de l’organisation de la membrane végétale, et son implication dans les réponses de défense. Ils ont ouvert la voie à la caractérisation de la dynamique et de certains nouveaux acteurs de cette cascade cellulaire.

JAK2 V617F mutation is frequently identified in myeloproliferative neoplasms (MPN). Additional somatic variants are supposed to contribute to bone marrow fibrosis or acute myeloid leukemia evolution. One of these mutations affects SRSF2, a gene encoding a component of the splicing machinery. To investigate how Jak2 V617F and Srsf2 P95H mutations interact in the hematopoietic tissue, we generated conditional knock-in mice in which the two mutations were expressed upon the control of Scl gene. Our study shows that Srsf2 P95H mutation initially exhibits limited effect on Jak2 V617F polycythemia and thrombocytosis but induces a delay in myelofibrosis development and protect hematopoietic stem cell from exhaustion observed after serial transplantation in Jak2 V617F single mutant cells. We focused on megakaryocyte (MK), implied in fibrosis development and found that Srsf2P95H partially reversed MKabnormalities induced by Jak2 V617F (cell size, normalized ploidy and expression of c-Mpl). Analysis of c-Mpl/Jak2 signaling with mass cytometry revealed a slight reduced proportion of MK expressing high levels of P-Stat5 in case of Srsf2 P95H co-occurrence with Jak2 V617F while treatment with high dose of the thrombopoietin-mimetic romiplostim in mice transplanted with wild-type or Srsf2 P95H bone marrow cells confirms the negative impact of Srsf2 P95H on fibrosis development. Gene expression analysis on sorted MK confirms down-regulation of Jak/Stat signaling pathway induced by Srsf2 P95H and reveals that Srsf2 P95H mutation more frequently induces exon 14 skipping of Jak2 mRNA. These result was confirmed in granulocytes samples from patients with JAK2 V617F MPN with associated SRSF2 P95H mutation., La mutation JAK2 V617F est fréquemment observée en cas de néoplasme myéloprolifératif (NMP). D’autres mutations somatiques peuvent être associées et sont corrélées au stade myélofibrotique ou à une évolution en leucémie aigüe. L’une de ces mutations touche le gène SRSF2, codant pour une protéine du complexe d’épissage. Pour étudier l’interaction entre les mutations Jak2 V617F et Srsf2 P95H dans le tissu hématopoïétique, nous avons généré un modèle murin knock-in conditionnel des deux mutations s’exprimant sous le contrôle du gène Scl. Notre étude montre que Srsf2 P95H limite peu le développement de la polyglobulie et de la thrombocytose induites par Jak2 V617F mais freine l’évolution vers une fibrose médullaire et protège les cellules souches hématopoïétiques de l’épuisement en transplantations sériées. L’étude des mégacaryocytes (MK), impliqués dans le processus fibrotique, montre que Srsf2 P95H induit une quasi-normalisation des anomalies induites par Jak2 V617F (taille, ploïdisation, expression de c-Mpl). L’analyse de la signalisation c-Mpl/Jak2 par cytométrie de masse révèle une discrète diminution de la proportion de MK exprimant de haut niveau de P-Stat5 en cas de mutation Srsf2 P95H associée à Jak2 V617F tandis que l’injection d’un agoniste de la thrombopoïetine à fortes doses confirme l’impact négatif de Srsf2 P95H sur le développement de la fibrose. L’étude de l’expression génique de MK triés confirme l’altération de la voie Jak/Stat induite par Srsf2 P95H et révèle que Srsf2 P95H induit plus fréquemment une perte de l’exon 14 (incluant la mutation V617F) de l’ARNm de Jak2. Ce résultat est confirmé sur des échantillons de granulocytes de patients atteints de NMP JAK2 V617F avec mutation SRSF2 P95H associée.

Cell migration is at the heart of many physio pathological processes. It is governed by a complex cellular machinery based on the combined action of adhesive receptors and tyrosine kinase receptors controlling cytoskeletal dynamics and essential to the migration process. However, the functional and physical interrelationships between these underlying signaling pathways remain poorly understood to date, which limits the discovery of new therapies, particularly those for metastatic disease.My project was first focused on migration signaling by trying to understand the indirect functional link between the mono-ubiquitination of ICAP-1, but also AKAP9 and PKA, two putative regulators of the mechano-dependent migration rate. In the current state of our knowledge, this part proved to be very unsuccessful, which underlined the need to develop a more integrative approach to signaling networks in order to understand their complexity. Indeed, this approach allows to better rationalize experimental hypotheses by integrating all the knowledge in the field, and, in fact, to better understand the complexity of cross signaling at the heart of the physio pathological process of cell migration. This strategy was applied in a collaboration that identified a TGFβ3-ERRa signaling involved in the modulation of the immune system of the bone metastatic niche of breast cancer, which allowed us to validate the approach.In the second part of my thesis, this approach allowed the identification of a new signaling axis between PKA and an oncogene, AXL a receptor tyrosine kinase at the heart of migration in triple negative breast cancer, suggesting the importance of PKA in this pathology. Finally, by extending the signaling network biology approach, the development of a new drug identification methodology has allowed the identification of potential repositioning of indications having an effect on the migration and cell cycle of a mesenchymal triple negative breast cancer cell model. The established methodology could be used in the preliminary toxicological evaluation of chemical compounds by defining the mechanisms of action that link them with the pathophysiology of migration, including metastatic processes.; La migration cellulaire est au cœur de nombreux processus physiopathologiques. Elle est régie par une machinerie cellulaire complexe reposant sur l’action combinée des récepteurs adhésifs et des récepteurs tyrosine kinase contrôlant la dynamique du cytosquelette, et essentielle au processus de migration. Cependant les interrelations fonctionnelles et physiques entre ces voies de signalisation sous-jacentes demeurent méconnues à ce jour ce qui limite la découverte de nouvelles thérapies, notamment celles anti- métastatiques.Mon travail de thèse s’est d’abord focalisé sur la signalisation de la migration en essayant d’appréhender le lien fonctionnel indirect entre la mono-ubiquitination d’ICAP-1, mais aussi AKAP9 et PKA, deux régulateurs putatifs de la vitesse de migration mécano-dépendante. En l’état actuel de nos connaissances, cette partie s’est avéré très peu fructueuse, ce qui a souligné la nécessité de développer une approche plus intégrative des réseaux de signalisation pour en appréhender leur complexité. Cette approche permet en effet de mieux rationnaliser les hypothèses expérimentales en intégrant l’ensemble des connaissances du domaine, et, de fait, de mieux appréhender la complexité des signalisations croisées au cœur du processus physiopathologiques de la migration cellulaire. Cette stratégie a été appliquée dans le cadre d’une collaboration qui a permis d’identifier une signalisation TGFβ3-ERRa au cœur de la modulation du système immunitaire de la niche métastatique osseuse du cancer du sein, ce qui nous a permis de valider l’approche.Dans la seconde partie de ma thèse, cette approche a permis d’identifier un nouvel axe de signalisation entre PKA et un oncogène, AXL un récepteur tyrosine kinase au cœur de la migration dans le cancer du sein triple négatif, suggérant ainsi l’importance de PKA dans cette pathologie. Enfin, en étendant l’approche de biologie des réseaux de signalisation, le développement d’une nouvelle méthodologie d'identification de drogues a permis d’identifier de potentiels repositionnements d’indication ayant un effet sur la migration et le cycle cellulaire d’un modèle cellulaire de cancer du sein triple négatif, de type mésenchymateux. La méthodologie mise en place pourrait être utilisée dans l’évaluation préliminaire toxicologique de composés chimiques en définissant les mécanismes d’action qui les relient avec la physio-pathologie de la migration, dont les processus métastatiques.

Cell migration is at the heart of many physio pathological processes. It is governed by a complex cellular machinery based on the combined action of adhesive receptors and tyrosine kinase receptors controlling cytoskeletal dynamics and essential to the migration process. However, the functional and physical interrelationships between these underlying signaling pathways remain poorly understood to date, which limits the discovery of new therapies, particularly those for metastatic disease.My project was first focused on migration signaling by trying to understand the indirect functional link between the mono-ubiquitination of ICAP-1, but also AKAP9 and PKA, two putative regulators of the mechano-dependent migration rate. In the current state of our knowledge, this part proved to be very unsuccessful, which underlined the need to develop a more integrative approach to signaling networks in order to understand their complexity. Indeed, this approach allows to better rationalize experimental hypotheses by integrating all the knowledge in the field, and, in fact, to better understand the complexity of cross signaling at the heart of the physio pathological process of cell migration. This strategy was applied in a collaboration that identified a TGFβ3-ERRa signaling involved in the modulation of the immune system of the bone metastatic niche of breast cancer, which allowed us to validate the approach.In the second part of my thesis, this approach allowed the identification of a new signaling axis between PKA and an oncogene, AXL a receptor tyrosine kinase at the heart of migration in triple negative breast cancer, suggesting the importance of PKA in this pathology. Finally, by extending the signaling network biology approach, the development of a new drug identification methodology has allowed the identification of potential repositioning of indications having an effect on the migration and cell cycle of a mesenchymal triple negative breast cancer cell model. The established methodology could be used in the preliminary toxicological evaluation of chemical compounds by defining the mechanisms of action that link them with the pathophysiology of migration, including metastatic processes., La migration cellulaire est au cœur de nombreux processus physiopathologiques. Elle est régie par une machinerie cellulaire complexe reposant sur l’action combinée des récepteurs adhésifs et des récepteurs tyrosine kinase contrôlant la dynamique du cytosquelette, et essentielle au processus de migration. Cependant les interrelations fonctionnelles et physiques entre ces voies de signalisation sous-jacentes demeurent méconnues à ce jour ce qui limite la découverte de nouvelles thérapies, notamment celles anti- métastatiques.Mon travail de thèse s’est d’abord focalisé sur la signalisation de la migration en essayant d’appréhender le lien fonctionnel indirect entre la mono-ubiquitination d’ICAP-1, mais aussi AKAP9 et PKA, deux régulateurs putatifs de la vitesse de migration mécano-dépendante. En l’état actuel de nos connaissances, cette partie s’est avéré très peu fructueuse, ce qui a souligné la nécessité de développer une approche plus intégrative des réseaux de signalisation pour en appréhender leur complexité. Cette approche permet en effet de mieux rationnaliser les hypothèses expérimentales en intégrant l’ensemble des connaissances du domaine, et, de fait, de mieux appréhender la complexité des signalisations croisées au cœur du processus physiopathologiques de la migration cellulaire. Cette stratégie a été appliquée dans le cadre d’une collaboration qui a permis d’identifier une signalisation TGFβ3-ERRa au cœur de la modulation du système immunitaire de la niche métastatique osseuse du cancer du sein, ce qui nous a permis de valider l’approche.Dans la seconde partie de ma thèse, cette approche a permis d’identifier un nouvel axe de signalisation entre PKA et un oncogène, AXL un récepteur tyrosine kinase au cœur de la migration dans le cancer du sein triple négatif, suggérant ainsi l’importance de PKA dans cette pathologie. Enfin, en étendant l’approche de biologie des réseaux de signalisation, le développement d’une nouvelle méthodologie d'identification de drogues a permis d’identifier de potentiels repositionnements d’indication ayant un effet sur la migration et le cycle cellulaire d’un modèle cellulaire de cancer du sein triple négatif, de type mésenchymateux. La méthodologie mise en place pourrait être utilisée dans l’évaluation préliminaire toxicologique de composés chimiques en définissant les mécanismes d’action qui les relient avec la physio-pathologie de la migration, dont les processus métastatiques.

ITCH est une ligase de l’ubiquitine impliquée dans différents processus cellulaires. Elle contient une région riche en prolines (PRR, proline rich region) qui lui permet de lier le domaine SH3 (Src homology 3) d’Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Plusieurs de ces protéines sont impliquées dans l’endocytose clathrine-dépendante de récepteurs tel le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR, epidermal growth factor receptor). Après activation, l’EGFR est internalisé dans des vésicules enrobées de Clathrine et un complexe protéique formé par CBL, CIN85 et Endophiline participe à cet évènement. ITCH lie l’ubiquitine à CBL et à Endophiline pour vraisemblablement modifier leurs fonctions, ce qui suggère un lien direct entre cette ligase et l’endocytose de l’EGFR. Afin de déterminer le rôle d’ITCH dans ce processus, plusieurs expériences furent réalisées. Premièrement, la modalité de liaison entre la ligase ITCH et les protéines à domaine SH3 a été étudiée en détails. Une série de mutations dans la région PRR d’ITCH nous a aidé à identifier trois résidus arginines (R252, R255, R258) nécessaires pour son interaction avec Endophiline et d’autres protéines à domaine SH3. Deuxièmement, des lignées cellulaires HeLa et Cos7 furent modifiées génétiquement par CRISPR pour empêcher l’expression d’ITCH. Ces lignées cellulaires knockout furent caractérisées et utilisées dans un essai d’endocytose de l’EGFR, puis examinées par spectrométrie de masse. L’internalisation d’EGFR fut suivie en microscopie confocale à l’aide d’un ligand EGF fluorescent -/- dans les deux types de cellules ITCH . En absence d’ITCH, nous observons une diminution significative du niveau d’EGF internalisé par rapport aux cellules parentales. La surexpression d’ITCH dans les cellules ITCH-/- rétablit l’internalisation normale de l’EGF, confirmant l’implication d’ITCH dans le processus, mais la surexpression des formes mutantes de ITCH incapable de lier Endophiline ou catalytiquement inactive ne rétablit pas l’internalisation de l’EGF. Ces résultats nous permettent de conclure que l’interaction ITCH-Endophiline et la fonction catalytique de ITCH sont nécessaires pour l’endocytose de l’EGFR. Ensemble, ces deux fonctions de ITCH régulent le trafic endocytique de l’EGFR. De plus, les cellules ITCH-/- montrent un délai de dégradation de l’EGFR phosphorylé ainsi qu’une prolongation du temps d’activation de la kinase MAPK (mitogen-activated protein kinase). Finalement, pour explorer l’influence de l’absence d’ITCH sur ses substrats et partenaires moléculaires nous avons effectué une comparaison protéomique des partenaires d’interaction et des protéines ubiquitylées à partir des lysats cellulaires ITCH-/- et WT. Les résultats ont montré que le manque d’expression de la ligase ITCH altère la présence peptidique des protéines liées à la signalisation de l’EGFR, à la voie protéolytique dépendante de l'ubiquitine et à l’adhésion cellulaire. Cette étude révèle pour une première fois que la protéine ITCH est requise pour l’endocytose dépendante de la Clathrine de l’EGFR., ITCH is a ubiquitin ligase involved in various cellular processes including endocytosis. It contains a proline rich region (PRR) which allows it to bind the SH3 domain of endophilin and other SH3 domain-containing proteins involved in Clathrin-mediated endocytosis (CME). CME is an important regulatory mechanism for growth factor receptor activity. The epidermal growth factor receptor (EGFR) is actively internalized in Clathrin-coated vesicles after activation. This endocytosis is facilitated by a protein complex formed by CBL, CIN85 and Endophilin. ITCH is known to ubiquitinate both CBL and endophilin, providing a potential functional link between the ligase and receptor internalization. In order to determine the role of ITCH in this process, several experiments were performed. First, the mapping of molecular binding sites between the ligase ITCH and SH3 domain proteins has been studied in detail. A series of mutations in the PRR region of ITCH helped us identify three arginine residues (R252, R255, R258) as necessary for its interaction with endophilin and all the tested SH3-domain containing proteins. Secondly, HeLa and Cos7 cell lines were genetically modified by CRISPR to prevent ITCH expression. These knockout cell lines were characterized for use in an EGFR endocytosis assay and for mass spectrometry analysis. EGFR internalization was monitored by confocal microscopy using fluorescent EGF ligand in both ITCH-/- cell types. In the absence of ITCH, a significant decrease in the level of internalized EGF compared to parental cells is visible. Overexpression of WT ITCH in the knockout cells restores normal internalization of EGF, confirming the involvement of ITCH in the process. Overexpression of Endophilin-binding defective or catalytically inactive ITCH does not restore the internalization of EGF in ITCH-/- cells. These results show that the ITCH- Endophilin interaction as well as the catalytic function of ITCH are necessary for the endocytosis of EGFR. In addition, ITCH-/- cells show a delay in the degradation of phosphorylated EGFR accompanied with an extended period of mitogen-activated protein kinase (MAPK) activation. In a last set of experiments, we explored the influence of the absence of ITCH on its substrates and molecular partners. We performed a proteomic comparison of ITCH-binding partners and potential substrates using the ITCH-/- and WT cell lysates. The results showed that the lack of ITCH expression alters the peptide count of proteins mainly related to EGFR signaling, theubiquitin-dependent proteolytic pathway and cell adhesion. This study shows for the first time that the protein ITCH is required for the clathrin-dependent endocytosis of EGFR.

Strigolactones (SL) make up a novel class of phytohormones that are found across the whole land plant lineage. In vascular plants, the main hormonal role of SL is the repression of shoot axillary branching. However, SL are also a major symbiotic signal, granting the plant increased access to the nutrients and water contained in the rhizosphere. These two functions of SL led to the hypothesis that these molecules have been instrumental at the time of land colonization by plants, approximately 450 million years ago. Studying SL biosynthesis and signaling in the bryophyte Physcomitrium patens (P. patens, a non-vascular plant), and comparing these processes with the available knowledge in vascular plants, enables to investigate the evolution of SL cellular pathways in land plants. As a matter of facts, SL biosynthesis and signaling pathways are quite extensively described in vascular plants. Notably, SL signaling starts in the cytosol where the SL molecule binds to the D14 receptor. D14 cleaves the SL and stays covalently linked to a part of the SL. Under this conformation, D14 can then interact with two partners in the nucleus: the MAX2 F-box protein and SMXL proteins. SMXL proteins act as repressors of the SL response, as their interaction with D14 and MAX2 will trigger their ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Most SL biosynthesis and signaling genes have homologs in P. patens genome, sometimes in different numbers. Nevertheless, only reverse genetics approaches can clearly establish these homologs function. Previous characterization of P. patens SL deficient mutant Ppccd8 revealed that SL biosynthesis is broadly conserved between mosses and vascular plants. Furthermore, SL play a similar role in the regulation of plant architecture in P. patens as demonstrated in vascular plants. On the other hand, results presented herein show that SL signaling is only partly conserved between P. patens and vascular plants, supporting the prior observation that the sole MAX2 homolog in P. patens is not needed for SL response. Indeed, only 2 out of the 13 P. patens D14 homologs (PpKAI2L genes) are involved in SL perception according to the characterization of Ppkai2l CRISPR knock-out mutants and to biochemistry analyses. Moreover, instead of D14, PpKAI2L proteins are closer to the KAI2 protein, which is not involved in SL perception in vascular plants. In addition, the phenotype of CRISPR knock-out mutants for the PpSMXL genes, together with genetic linkage analysis of PpSMXL with PpMAX2 and PpCCD8, show that none of the 4 PpSMXL proteins play a major role in SL response. However, the two PpSMXL homologs that are closer to the ancestral land plants SMXL seem to be important regulators of growth, which as per recent phylogenetic studies could be the ancestral role of the SMXL family. This effect on growth would actually be the main response to the ancestral KL (KAI2-ligand) signal, an endogenous signal different from SL. Transduction of the KL signal would hence be conserved across land plants and would be achieved in P. patens via some PpKAI2L proteins, together with the PpMAX2 and at least two PpSMXL proteins. To date, the identity of the KL molecule(s) remains under debate. As SL signaling is not conserved in P. patens, it appears that the known SL signaling pathway results from a vascular plants specific innovation. Likewise, SL response in P. patens would be the product of a convergent evolution. Therefore, the question as to how P. patens transduces the SL signal, downstream of perception by specific PpKAI2L proteins, remains open.; Les strigolactones (SL) sont une nouvelle classe de phytohormones, retrouvées chez toutes les plantes terrestres. Chez les plantes vasculaires, les SL ont un rôle hormonal prédominant dans la régulation de l’architecture aérienne, mais aussi une fonction de signal symbiotique, favorisant ainsi la captation d’eau et de nutriments du sol par les plantes. Ces deux fonctions ont conduit à l’hypothèse selon laquelle les SL ont pu être essentielles dans les processus de colonisation du milieu terrestre par les plantes il y a 450 millions d’années. L’étude de la biosynthèse et de la signalisation des SL chez la bryophyte Physcomitrium patens (P. patens, non-vasculaire), par comparaison avec ce qui est connu chez les plantes vasculaires, permet de questionner l’évolution des voies cellulaires associées aux SL chez les plantes terrestres. Chez les plantes vasculaires, les voies de biosynthèse et de perception des SL sont assez bien décrites. La voie de signalisation des SL commence par la perception de la molécule par le récepteur D14 dans le cytosol, qui la clive et reste associé à une partie de la SL. Ce complexe interagit dans le noyau avec deux partenaires : la protéine à boîte F MAX2, capable de recruter un complexe d’ubiquitination, et certaines protéines SMXL. Ces protéines agissent comme des répresseurs de la réponse aux SL et vont être ubiquitinées sous l’action du complexe recruté par MAX2, puis rapidement dégradées par le protéasome. Chez P. patens, la plupart des gènes de biosynthèse et de signalisation des SL sont retrouvés, parfois en nombres différents comparés aux plantes vasculaires. Seules des approches de génétique inverse permettent de définir précisément leur fonction. La précédente caractérisation du mutant de biosynthèse Ppccd8 chez P. patens a montré que les SL sont synthétisées via une voie similaire à celle des plantes vasculaires. En outre, la fonction des SL dans la régulation de l’architecture est conservée chez P. patens. Au contraire, en accord avec la découverte précédente que l’unique homologue de MAX2 chez P. patens n’est pas impliqué dans la signalisation des SL, les résultats ici présentés indiquent que la signalisation des SL n’est que partiellement conservée entre P. patens et les plantes vasculaires. En effet, seuls 2 homologues PpKAI2L de D14, sur les 13 possédés par P. patens, sont impliqués dans la perception des SL, d’après l’étude de mutants perte-de-fonction et les analyses de biochimie. Par ailleurs, les protéines PpKAI2L sont phylogénétiquement plus proches d’une autre protéine appelée KAI2 que de D14. Or KAI2 ne perçoit pas les SL chez les plantes vasculaires. De plus, la caractérisation des mutants perte-de-fonction Ppsmxl, obtenus par l’utilisation de la technologie CRISPR, et les analyses de liaison génétique avec PpMAX2 et PpCCD8 montrent que les quatre protéines PpSMXL ne jouent pas un rôle majeur dans la réponse aux SL. Cependant, les protéines PpSMXL les plus proches phylogénétiquement des SMXL ancestrales apparaissent comme des régulateurs importants de la croissance, ce qui pourrait constituer le rôle ancestral des protéines SMXL, en accord avec des études phylogénétiques récentes. Cette régulation de la croissance constituerait la réponse à un autre signal endogène, plus ancestral que les SL, le KL (ligand de KAI2). La transduction du signal KL serait conservée au moins chez les plantes terrestres et impliquerait chez P. patens certaines protéines PpKAI2L et les protéines PpMAX2 et PpSMXL. L’identité moléculaire du KL n’a pas encore été élucidée. N’étant pas conservée chez P. patens, la signalisation des SL résulte possiblement d’une innovation spécifique de la lignée des plantes vasculaires. Ainsi, la voie de réponse aux SL présente chez la mousse résulterait d’une évolution convergente vers la perception des SL. Il reste donc à élucider comment le signal SL est transduit chez P. patens, en aval de sa perception par certaines protéines PpKAI2L.

Strigolactones (SL) make up a novel class of phytohormones that are found across the whole land plant lineage. In vascular plants, the main hormonal role of SL is the repression of shoot axillary branching. However, SL are also a major symbiotic signal, granting the plant increased access to the nutrients and water contained in the rhizosphere. These two functions of SL led to the hypothesis that these molecules have been instrumental at the time of land colonization by plants, approximately 450 million years ago. Studying SL biosynthesis and signaling in the bryophyte Physcomitrium patens (P. patens, a non-vascular plant), and comparing these processes with the available knowledge in vascular plants, enables to investigate the evolution of SL cellular pathways in land plants. As a matter of facts, SL biosynthesis and signaling pathways are quite extensively described in vascular plants. Notably, SL signaling starts in the cytosol where the SL molecule binds to the D14 receptor. D14 cleaves the SL and stays covalently linked to a part of the SL. Under this conformation, D14 can then interact with two partners in the nucleus: the MAX2 F-box protein and SMXL proteins. SMXL proteins act as repressors of the SL response, as their interaction with D14 and MAX2 will trigger their ubiquitination and subsequent proteasomal degradation. Most SL biosynthesis and signaling genes have homologs in P. patens genome, sometimes in different numbers. Nevertheless, only reverse genetics approaches can clearly establish these homologs function. Previous characterization of P. patens SL deficient mutant Ppccd8 revealed that SL biosynthesis is broadly conserved between mosses and vascular plants. Furthermore, SL play a similar role in the regulation of plant architecture in P. patens as demonstrated in vascular plants. On the other hand, results presented herein show that SL signaling is only partly conserved between P. patens and vascular plants, supporting the prior observation that the sole MAX2 homolog in P. patens is not needed for SL response. Indeed, only 2 out of the 13 P. patens D14 homologs (PpKAI2L genes) are involved in SL perception according to the characterization of Ppkai2l CRISPR knock-out mutants and to biochemistry analyses. Moreover, instead of D14, PpKAI2L proteins are closer to the KAI2 protein, which is not involved in SL perception in vascular plants. In addition, the phenotype of CRISPR knock-out mutants for the PpSMXL genes, together with genetic linkage analysis of PpSMXL with PpMAX2 and PpCCD8, show that none of the 4 PpSMXL proteins play a major role in SL response. However, the two PpSMXL homologs that are closer to the ancestral land plants SMXL seem to be important regulators of growth, which as per recent phylogenetic studies could be the ancestral role of the SMXL family. This effect on growth would actually be the main response to the ancestral KL (KAI2-ligand) signal, an endogenous signal different from SL. Transduction of the KL signal would hence be conserved across land plants and would be achieved in P. patens via some PpKAI2L proteins, together with the PpMAX2 and at least two PpSMXL proteins. To date, the identity of the KL molecule(s) remains under debate. As SL signaling is not conserved in P. patens, it appears that the known SL signaling pathway results from a vascular plants specific innovation. Likewise, SL response in P. patens would be the product of a convergent evolution. Therefore, the question as to how P. patens transduces the SL signal, downstream of perception by specific PpKAI2L proteins, remains open.; Les strigolactones (SL) sont une nouvelle classe de phytohormones, retrouvées chez toutes les plantes terrestres. Chez les plantes vasculaires, les SL ont un rôle hormonal prédominant dans la régulation de l’architecture aérienne, mais aussi une fonction de signal symbiotique, favorisant ainsi la captation d’eau et de nutriments du sol par les plantes. Ces deux fonctions ont conduit à l’hypothèse selon laquelle les SL ont pu être essentielles dans les processus de colonisation du milieu terrestre par les plantes il y a 450 millions d’années. L’étude de la biosynthèse et de la signalisation des SL chez la bryophyte Physcomitrium patens (P. patens, non-vasculaire), par comparaison avec ce qui est connu chez les plantes vasculaires, permet de questionner l’évolution des voies cellulaires associées aux SL chez les plantes terrestres. Chez les plantes vasculaires, les voies de biosynthèse et de perception des SL sont assez bien décrites. La voie de signalisation des SL commence par la perception de la molécule par le récepteur D14 dans le cytosol, qui la clive et reste associé à une partie de la SL. Ce complexe interagit dans le noyau avec deux partenaires : la protéine à boîte F MAX2, capable de recruter un complexe d’ubiquitination, et certaines protéines SMXL. Ces protéines agissent comme des répresseurs de la réponse aux SL et vont être ubiquitinées sous l’action du complexe recruté par MAX2, puis rapidement dégradées par le protéasome. Chez P. patens, la plupart des gènes de biosynthèse et de signalisation des SL sont retrouvés, parfois en nombres différents comparés aux plantes vasculaires. Seules des approches de génétique inverse permettent de définir précisément leur fonction. La précédente caractérisation du mutant de biosynthèse Ppccd8 chez P. patens a montré que les SL sont synthétisées via une voie similaire à celle des plantes vasculaires. En outre, la fonction des SL dans la régulation de l’architecture est conservée chez P. patens. Au contraire, en accord avec la découverte précédente que l’unique homologue de MAX2 chez P. patens n’est pas impliqué dans la signalisation des SL, les résultats ici présentés indiquent que la signalisation des SL n’est que partiellement conservée entre P. patens et les plantes vasculaires. En effet, seuls 2 homologues PpKAI2L de D14, sur les 13 possédés par P. patens, sont impliqués dans la perception des SL, d’après l’étude de mutants perte-de-fonction et les analyses de biochimie. Par ailleurs, les protéines PpKAI2L sont phylogénétiquement plus proches d’une autre protéine appelée KAI2 que de D14. Or KAI2 ne perçoit pas les SL chez les plantes vasculaires. De plus, la caractérisation des mutants perte-de-fonction Ppsmxl, obtenus par l’utilisation de la technologie CRISPR, et les analyses de liaison génétique avec PpMAX2 et PpCCD8 montrent que les quatre protéines PpSMXL ne jouent pas un rôle majeur dans la réponse aux SL. Cependant, les protéines PpSMXL les plus proches phylogénétiquement des SMXL ancestrales apparaissent comme des régulateurs importants de la croissance, ce qui pourrait constituer le rôle ancestral des protéines SMXL, en accord avec des études phylogénétiques récentes. Cette régulation de la croissance constituerait la réponse à un autre signal endogène, plus ancestral que les SL, le KL (ligand de KAI2). La transduction du signal KL serait conservée au moins chez les plantes terrestres et impliquerait chez P. patens certaines protéines PpKAI2L et les protéines PpMAX2 et PpSMXL. L’identité moléculaire du KL n’a pas encore été élucidée. N’étant pas conservée chez P. patens, la signalisation des SL résulte possiblement d’une innovation spécifique de la lignée des plantes vasculaires. Ainsi, la voie de réponse aux SL présente chez la mousse résulterait d’une évolution convergente vers la perception des SL. Il reste donc à élucider comment le signal SL est transduit chez P. patens, en aval de sa perception par certaines protéines PpKAI2L.