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The satellite cells are long regarded as heterogeneous cell population, which is intimately linked to the processes of muscular recovery. The heterogeneous cell population may be classified by specific markers. In spite of the significant amount of variation amongst the satellite cell populations, it seems that their activity is tightly bound to the paired box 7 transcription factor expression, which is, therefore, used as a canonical marker for these cells. Muscular dystrophic diseases, such as Duchenne muscular dystrophy, elicit severe tissue injuries leading those patients to display a very specific pattern of muscular recovery abnormalities. There have been works on the application of precursors cells as a therapeutic alternative for Duchenne muscular dystrophy and initial attempts have proven the cells inefficient; however later endeavours have proposed solutions for the experiments improving significantly the results. The presence of a range of satellite cells populations indicates the existence of specific cells with enhanced capability of muscular recovery in afflicted muscles.

Stem cells, both embryonic and adult, due to the potential for application in tissue regeneration have been the target of interest to the world scientific community. In fact, stem cells can be considered revolutionary in the field of medicine, especially in the treatment of a wide range of human diseases. However, caution is needed in the clinical application of such cells and this is an issue that demands more studies. This paper will discuss some controversial issues of importance for achieving cell therapy safety and success. Particularly, the following aspects of stem cell biology will be presented: methods for stem cells culture, teratogenic or tumorigenic potential, cellular dose, proliferation, senescence, karyotyping, and immunosuppressive activity.

O sistema de sinalização de canabinoides endógeno (eCBS) é composto por moléculas endocanabinóides que interagem com os receptores CB1 e CB2 acoplados à proteína G, estando presente em diversos tecidos e tipos celulares, entre eles em células do sistema nervoso central (SNC), sistema imune e células-tronco mesenquimais (MSC). A presença desses receptores, em específico, tanto em células do sistema imune como em células-tronco pode ser indício do caminho de sinalização celular pelo qual os dois sistemas se comunicam. Ultimamente houve crescimento de tratamentos de diversas doenças relacionadas ao SNC utilizando derivados de canábis, como o canabidiol, demonstrando resultados positivos. No entanto, não sabemos os reflexos dos tratamentos que envolvem o eCBS em outros tipos celulares. Existe assim a necessidade do entendimento dessa comunicação, bem como dos efeitos sistêmicos e prováveis efeitos colaterais relacionados à estimulação desses receptores, uma vez que o estímulo dos mesmos pode influenciar a ativação e resposta de células-tronco de polpa dentária humana (DPSC). Tais conhecimentos formam ainda a base para uma melhor compreensão do efeito medicinal da canábis, contribuindo no esclarecimento de sua ação por exemplo em doenças neurodegenerativas e no desenvolvimento de novos medicamentos. O presente trabalho objetivou então avaliar os efeitos de agentes estimulatórios e inibitórios dos receptores canabinóides sobre a resposta imunológica e proliferativa das DPSC. Para tal, DPSC humanas foram isoladas da polpa dentária e caracterizadas para confirmação de sua identidade como células-tronco (CT). As DPSC foram então cultivadas na presença ou ausência de um agonista (anandamida) e de antagonistas (AM251 e SR144528) dos receptores CB1 e CB2 do eCBS, sob estímulo ou não de TNF-α. Para análise da imunomodulação, moléculas de superfície ligadas à imunossupressão (HLA-DR, PD-L1, PD-L2) foram mensuradas por citometria de fluxo. Paralelamente, a expressão de mRNA relacionado às moléculas do eCBS foi verificada por Real time RT-PCR, bem como a expressão para as citocinas TGF-β e IL-6. Ainda, a taxa de proliferação das DPSCs em estudo também foi avaliada. A caracterização das células isoladas confirmou sua identidade como CT. A citometria para os marcadores HLA-DR, PD-L1 e PD-L2 indicou que as DPSCs expressam esses marcadores em sua superfície celular e que sua expressão responde diferencialmente ao estímulo do eCBS, bem como à presença de TNF-α, o que comprova o papel desse sistema na influência do perfil imunomodulador atribuído às DPSCs. A análise da expressão gênica para os componentes do eCBS forneceu uma compreensão detalhada do funcionamento do sistema em DPSCs em termos de sua autorregulação, e em termos de sua resposta à presença de TNF-α. Isso permitiu confirmar que o eCBS é um sistema presente e funcionalmente ativo em DPSCs, envolvido diretamente com a imunomodulação. A análise da expressão gênica para as citocinas TGF-β e IL-6 mostrou que as DPSCs expressam os genes para estas citocinas mesmo quando cultivadas sem estímulo específico. Mostrou também que essa expressão é profundamente alterada como resposta aos estímulos do eCBS e ao estímulo por TNF-α, indicando mais uma vez o papel desse sistema na coordenação da resposta celular de DPSCs, em especial relativa à imunomodulação. A análise da taxa de proliferação das DPSCs frente aos estímulos do eCBS e ao estímulo por TNF-α mostrou que o eCBS não é capaz de afetar significativamente a proliferação das DPSCs, mas o TNF-α sim. A análise conjunta desses dados indica que o eCBS presente nas DPSCs não só responde ao estímulo imunológico, como também altera moléculas chave da resposta imune, fornecendo os estímulos necessários para que as DPSCs atuem na coordenação do ambiente inflamatório. The endogenous cannabinoid signaling system (eCBS) is composed of endocannabinoid molecules that interact with G-protein coupled receptors CB1 and CB2, and it is present in many tissues and cell types, including central nervous system (CNS) cells, the immune system cells and mesenchymal stem cells (MSC). The presence of such receptors in both immune and stem cells may be indicative of the cellular signaling pathway through which the two systems communicate. Lately there has been shown a growth in treatments of various CNS-related diseases using cannabis derivatives such as cannabidiol, showing positive results. However, we still do not know the consequences of treatments involving eCBS in other cell types.Thus, there is a need to understand such communication, as well as the systemic and related side effects upon receptors stimulation, since it may influence the activation and response of human dental pulp stem cells (DPSC). Such knowledge also form the basis for a better understanding of cannabis medicinal effects, contributing to clarify its action for example in neurodegenerative diseases and also i the development of new medicines. Thus, the present study aims at evaluating the effects of cannabinoid receptor stimulatory and inhibitory agents uppon DPSC immune and proliferative responses. So, human DPSC were isolated from dental pulp and characterized to confirm their identity as stem cells. DPSC were then cultured in the presence or absence of an agonist (anandamide) and antagonists (AM251 and SR144528) for eCBS receptors, whether or not stimulated by TNF-α. For immunomodulation analysis, immunosuppressionrelated surface molecules (HLA-DR, PD-L1, PD-L2) were measured by flow cytometry. eCBS components mRNA expression was verified by Real time RTPCR as well as the expression for TGF-β and IL-6 cytokines. The proliferation rate of DPSCs under study was also evaluated. The characterization of the isolated cells confirmed their identity as stem cells. Cytometry for HLA-DR, PDL1 and PD-L2 markers indicated that DPSCs express these markers on their cell surface and that their expression responds differentially to eCBS stimulus as well as to the presence of TNF-α, which proves the role of such system in influencing the DPSCs immunomodulatory profile. Gene expression analysis for eCBS-related enzymes and receptors provided a deep and detailed understanding of the system's functioning in DPSCs, both in terms of its selfregulation and its response to the presence of TNF-α. Such results confirmed that eCBS is a present and functionally active system in DPSCs, directly involved with immunomodulation. Gene expression analysis for TGF-β and IL-6 cytokines showed that DPSCs express genes for these cytokines even when cultured without specific stimulation. It also showed that this expression is profoundly altered as a response to eCBS stimuli and TNF-α stimulation, again indicating the role of this system in coordinating the cellular response of DPSCs, especially concerning immunomodulation. Analysis of DPSC proliferation rate under eCBS and TNF-α stimulation showed that eCBS is not able to significantly affect DPSC proliferation, but TNF-α does. The combined analysis of these data indicates that eCBS present in DPSCs not only responds to immune stimulation, but also alters key immune response molecules, providing the necessary stimuli for DPSCs to act in the coordination of such environment.

O glutamato, aminoácido não-essencial, é um neurotransmissor excitatório do sistema nervoso central (SNC), sendo liberado durante o impulso nervoso. Em situações de patologia cerebral, o acúmulo de glutamato ocorre no espaço extracelular, causando dano neuronal e, eventualmente, apoptose. Muitos trabalhos relataram que a citotoxicidade do glutamato está associada a várias doenças neurológicas. Neste contexto, o acetato, um ácido graxo de cadeia curta, pode beneficiar o SNC de forma energética e estrutural. A acetil-coenzima A, forma metabolicamente ativa de acetato, é utilizada como substrato em vias bioquímicas envolvidas no metabolismo de carboidratos, lipídios e proteínas, além de aumentar a acetilação das histonas, alterando a expressão de genes inflamatórios. A linhagem celular de neuroblastoma humano SH-SY5Y é comumente usada em estudos relacionados a doenças neurodegenerativas, com uma capacidade de expansão em larga escala antes da diferenciação, enquanto que a linhagem de células-tronco de polpa de dente de leite decíduo esfoliado (SHED) é comumente utilizada em modelos de estudo do comportamento celular. O objetivo desta pesquisa foi avaliar os efeitos do acetato mediante a citotoxicidade causada pelo glutamato em células SH-SY5Y e SHED. Células SH-SY5Y e SHED foram cultivadas, respectivamente, em meio DMEM/F12 suplementado com 10% (v/v) de soro fetal bovino (SFB) e 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, e meio alfa-MEM, suplementado com 10% (v/v) de SFB, 1% (v/v), 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, 0,01 mM de aminoácidos não essenciais e 2 mM L-glutamina. A viabilidade celular em diferentes concentrações de acetato (5 a 75 mM) e glutamato (25 a 150mM) foi medida pelo ensaio MTT. A diferenciação foi realizada em SH-SY5Y pela suplementação do meio com 10 μM de ácido retinóico (AR) e redução de SFB para 1% (v/v) durante 4, 7 e 10 dias em cultura, e em SHED pela substituição do meio de cultivo por DMEM Low-Glicose, suplementado com 10% (v/v) de SFB, 1% (v/v) de penicilina-estreptomicina, 10-7 M de dexametasona, 50 μM de 2-fosfato ácido ascórbico e 2 mM de β-glicerolfosfato, a fim de verificar como essas células respondem à mistura de acetato/glutamato. A análise estatística foi realizada teste ANOVA de uma ou duas vias, bem como pelo teste de Kruskal-Wallis, quando apropriado, com p < 0,05 considerado estatisticamente significativo. Após 7 dias de incubação, as concentrações de 5 e 25 mM de acetato apresentaram menor influência sobre a viabilidade de células SH-SY5Y e SHED, enquanto que o IC50% de glutamato ficou em torno de 75mM e 50mM para estas linhagens, respectivamente. Ao submeter as células ao tratamento combinado de acetato e glutamato, observou-se que o acetato não exerceu citoproteção mediante exposição celular ao glutamato. Após análise qualitativa da diferenciação osteogênica em SHEDs, foi observado maior mineralização nas células tratadas com AR e acetato, em comparação com as células controle. Estudos subsequentes, que permitam identificar como tais células respondem ao acetato em nível molecular, considerando a expressão de ciclinas, compactação da cromatina e a presença de marcadores bioquímicos característicos durante a diferenciação de cada linhagem, por exemplo, poderão fornecer um entendimento mais completo de como esse composto atua na dinâmica metabólica e bioenergética celular. Glutamate, a non-essential amino acid, is an excitatory neurotransmitter of the central nervous system (CNS), being released during the nerve impulse. In situations of cerebral pathology, the accumulation of glutamate occurs in the extracellular space, causing neuronal damage and, eventually, apoptosis. Many studies have reported that glutamate cytotoxicity is associated with various neurological diseases. In this context, acetate, a short chain fatty acid, can benefit the CNS energetically and structurally. Acetyl-coenzyme A, a metabolically active form of acetate, is used as a substrate in biochemical pathways involved in the metabolism of carbohydrates, lipids and proteins, in addition to increasing the acetylation of histones, altering the expression of inflammatory genes. The SH-SY5Y human neuroblastoma cell line is commonly used in studies related to neurodegenerative diseases, with a large scale expansion capacity prior to differentiation, whereas the stem cell line of exfoliated deciduous teeth (SHED) is commonly used in models of cellular behavior. The objective of this research was evaluate the effects of acetate by glutamate-induced cytotoxicity on SH-SY5Y and SHED cells. SH-SY5Y and SHED cells were cultured respectively in DMEM / F12 medium supplemented with 10% (v/v) fetal bovine serum (FBS) and 1% (v/v) penicillin-streptomycin, and alpha-MEM medium, supplemented with 10% (v/v) FBS, 1% (v/v), 1% (v/v) penicillin-streptomycin, 0.01 mM non-essential amino acids and 2 mM L-glutamine. Cell viability at different concentrations of acetate (5 to 75 mM) and glutamate (25 to 150 mM) was measured by the MTT assay. Differentiation was performed on SH-SY5Y by supplementing the medium with 10 μM retinoic acid (RA) and reducing FBS to 1% (v/v) for 4, 7 and 10 days in culture, and in SHED by replacing the culture medium with DMEM Low-Glucose, supplemented with 10% (v/v) FBS, 1% (v/v) penicillin-streptomycin, 10-7 M dexamethasone, 50 μM ascorbic acid 2-phosphate and 2 mM β- Glycerol phosphate in order to verify how these cells respond to the acetate/glutamate mixture. Statistical analysis was performed one-way or two-way ANOVA, as well as Kruskal-Wallis test, when appropriate, with p < 0.05 considered statistically significant. After 7 days of incubation, concentrations of 5 and 25 mM acetate had less influence on the viability of SH-SY5Y and SHED cells, whereas the IC50% of glutamate was around 75mM and 50mM for these lines, respectively. By subjecting the cells to the combined treatment of acetate and glutamate, it was observed that acetate did not exert cytoprotection through cellular exposure to glutamate. After qualitative analysis of the osteogenic differentiation in SHEDs, greater mineralization was observed in the cells treated with RA and acetate, in comparison with the control cells. Subsequent studies to identify how these cells respond to acetate at the molecular level, considering the expression of cyclins, chromatin compaction, and the presence of characteristic biochemical markers during differentiation of each lineage, for example, may provide a more complete understanding of how this component acts on the metabolic dynamics and cellular bioenergetics.

Lesões na musculatura esquelética podem ocorrer devido desordens genéticas ou trauma. Em lesões menos extensas nas quais vasos sanguíneos ou tecido conectivo não são atingidos o músculo consegue se regenerar sem intervenção médica. Contudo, lesões envolvendo porções maiores do tecido a regeneração não consegue ser completa sem intervenção. Desse modo, a engenharia tecidual aparece como uma alternativa para a regeneração completa do tecido. Dentre os biomateriais empregados na regeneração muscular, as matrizes extracelulares descelularizadas figuram como as classes de biomateriais mais empregadas. Contudo até o presente momento não foi desenvolvido uma metodologia de descelularização de tecido esquelético que preserve a arquitetura do tecido e sua composição química com uma taxa adequada de remoção de células. Desta forma, o presente trabalho almeja produzir um biomaterial composto da matriz extracelular de músculo esquelético de rato Wistar descelularizada. Para tanto, músculo esquelético de ratos Wistar machos foram extraídos e submetidos a lavagens sucessivas com soro fisiológico estéril. Posteriormente, os músculos foram congelados e fatiados, sendo então novamente lavado com soro fisiológico e submetido a irradiação com luz UV por 20 min em cada face do material. Após a irradiação, O tecido foi então digerido em uma solução de tripsina 0,05% contendo 0,2% de EDTA pH 7,6 por 2h a 37°C. Em seguida o tecido sofreu banhos, sob refrigeração, em solução de SDS 1% (p/v) por 4 a 5 dias com trocas diárias da solução. Finalmente o material foi submetido a um banho em água destilada por dois dias finalizando assim a descelularização. Após o procedimento foi obtido um biomaterial com aparência translucida e com uma concentração de DNA de 0,005 ± 0,002 ng de DNA por mg enquanto o controle não descelularizado apresentou uma concentração de 0,800 ± 0,107 ng de DNA por mg de tecido. Além disso, a análise em microscopia de fluorescência comprovou a inexistência de estruturas nucleares e a preservação da arquitetura do tecido após a descelularização. A presente metodologia representa um avanço nos protocolos de descelularização, pois foi obtido um nível de descelularização 10 vezes menor que o preconizado na literatura como ideal além permitir um patamar bem superior de descelularização mantendo a estrutura tridimensional do tecido em comparação a trabalhos similares. Injuries in skeletal muscle can occur genetic disorders or trauma. In less extensive injuries in which blood vessels or connective tissue are not affected muscle can regenerate without medical intervention. However, injuries involving major portions of the tissue regeneration can be complete without intervention. Thus, tissue engineering is an alternative to the complete tissue regeneration. Among the biomaterials used in muscle regeneration, the decellularized extracellular matrices appear as the most used biomaterials classes. However until now it has not developed a methodology of skeletal tissue decellularization that preserves the tissue architecture and chemical composition with an appropriate rate of removal of cells. Thus, the present study aims to produce a biomaterial composed of the extracellular matrix decellularized skeletal muscle of Wistar rats. To this end, the skeletal muscle of male Wistar rats were extracted and subjected to repeated washings with sterile saline. Subsequently, the muscles were frozen and sliced, and then washed again with saline and subjected to irradiation with UV light for 20 min on each face of the material. After irradiation, the tissue was then digested in a 0.05% trypsin solution containing 0.2% EDTA pH 7.6 for 2h at 37 ° C. Then the tissue baths experienced under refrigeration, in 1% SDS solution (w / v) for 4 to 5 days with daily exchanges of solution. Finally the material was subjected to a bath in distilled water for two days thus finishing the decellularization. After the procedure was obtained a biomaterial with a translucent appearance and a DNA concentration of 0.005 ± 0.002 ng per mg of DNA while the control had not decellularized a concentration of 0.800 ± 0.107 ng DNA per mg of tissue. Furthermore, fluorescence microscopy analysis confirmed the absence of nuclear facilities and the maintenance of tissue architecture after decellularization. This methodology represents an advance in decellularization protocols because it was obtained a level of decellularization 10 times lower than that recommended in the literature as ideal addition allow much higher level of decellularization keeping the three-dimensional structure of the tissue compared to similar works

CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior O coração é um órgão vital, que bombeia o sangue permitindo a sua circulação pelo corpo. A valva aórtica, e as suas estruturas de apoio ventriculares, formam a peça central do coração. Todas as câmaras do coração estão relacionadas diretamente à valva e seus folhetos são incorporados diretamente no esqueleto cardíaco. Falhas dos folhetos aórticos são as mais comuns entre as doenças relacionadas às valvas do coração, tendo como consequência o impacto negativo na vida do paciente, bem como nas despesas dos sistemas de saúde em todo o mundo. O desenvolvimento de materiais capazes de substituir com eficácia o tecido danificado da valva aórtica é de grande interesse na medicina regenerativa e engenharia de tecidos. As valvas mecânicas e biológicas têm sido amplamente estudadas, mas várias questões relacionadas com a integração ao hospedeiro ainda não foram resolvidas. Promissores protocolos para descelularização de tecidos de valva cardíaca têm sido investigados como uma alternativa para a preparação do material de substituição e para ser empregado como um substrato para a recelularização da matriz. No entanto, alguns protocolos de descelularização utilizados hoje em dia têm algumas limitações, uma vez que ainda não existe um método que permita a descelularização e ao mesmo tempo mantenha a estrutura da matriz extracelular para a posterior recelularização, evitando a rejeição após a implantação e futura substituição da prótese. Assim, o presente trabalho visa a obtenção de uma matriz biológica que satisfaça esses requisitos, por meio da descelularização dos folhetos aórticos de suínos e sua recelularização com células-tronco da polpa dentária humana. Foram testados três protocolos de descelularização, sendo que os protocolos que utilizaram tripsina foram reprodutíveis e forneceram matrizes com menor quantidade de DNA, quando comparados com o protocolo que utilizou apenas detergente e não foi reprodutível. As células-tronco podem ser isoladas de dentes decíduos (SHEDs) humanos e pesquisas apontam sua importância na medicina regenerativa visando à reconstrução de folhetos aórticos. Nesse trabalho, as SHEDs foram obtidas e caracterizadas fenotipicamente, sendo positivas para marcadores mesenquimais e embrionários e negativas para marcadores hematopoiéticos, além de apresentarem, in vitro, potencial de diferenciação osteogênica. Tais células foram então cultivadas em placas de petri com as matrizes descelularizadas, porém não houve sucesso na recelularização. Para tentar contornar esse problema, foi construído um biorreator a fim de aumentar a eficiência da recelularização do tecido, no entanto os resultados estão sendo testados. Vários pontos ainda devem ser abordados a fim de superar os obstáculos da técnica de descelularização do tecido para obter sucesso na recelularização. Heart is a vital organ that pumps blood allowing its circulation through the body. The aortic valve and their ventricular support structures form the centerpiece of the heart. All chambers of the heart are directly related to the valve, and its leaflets are directly incorporated into the heart skeleton. Amongst heart valves diseases, failures in the aortic leaflets are the most common ones, leading to negative impacts on patients’ life, as well as increases on the costs for health systems worldwide. For regenerative medicine and tissue engineering, the development of materials capable of effectively replace damaged aortic valve tissue is of great interest. The mechanical and biological valves have been widely studied, but several issues related to integration to the host have not yet been resolved. Promising decellularization protocols for tissue heart valve have been investigated as an alternative for the preparation of replacement material and to serve as a substrate for matrix repopulation. However, some of the decellularization protocols used today have some limitations, since until now there is still no method which can achieve a complete decellularization while maintaining the structure of extracellular matrix for later repopulation, avoiding rejection after implantation and future replacement of the prosthesis. Thus, the present work aims at obtaining a biological matrix that satisfies such requirements through the decellularization of pigs aortic leaflets and its repopulation with stem cells isolated from human dental pulp. So far, we tested three decellularization protocols. The protocols using trypsin were shown reproducible and yielded a smaller amount of DNA, when compared to the protocol where only detergent was employed, which was also not reproducible. About the stem cells, they can be isolated from human deciduous teeth (SHEDs), with studies indicating its importance in regenerative medicine aimed at the reconstruction of aortic leaflets. In this work, SHEDs were obtained and phenotypically characterized, being positive for mesenchymal and embryonic markers and negative for hematopoietic markers, in addition to presenting in vitro osteogenic differentiation potential. The SHEDs were then cultured in Petri plates with the decellularized matrices, however there was no success in the matrix repopulation. In an attempt to overcome such problem, a bioreactor was built in order to increase the tissue repopulation efficiency, however the results are being tested. Several points still need to be addressed in order to overcome the obstacles of tissue decellularization technique and then achieve a successful recellularization.