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Zusammenfassung W��hrend seines Aufenthalts 1803 in Mexiko machte von Humboldt die Bekanntschaft von Dupaix, einem spanischen Soldaten luxemburgischer Herkunft und Liebhaber pr��kolumbischer Altert��mer. Die Entdeckung verschiedener Manuskripte Dupaix��� sowie die Untersuchung diverser Archive und pers��nlicher Aufzeichnungen des Freiherrn und von Dokumenten unterschiedlicher Institutionen beiderseits des Atlantiks erlauben es, den au��ergew��hnlichen Weg eines ber��hmten mexikanischen Objekts, der Chalchiuhtlicue, nachzuvollziehen, die der preu��ische Forschungsreisende 1810 als ���aztekische Priesterin��� in seinem Buch Vues des cordill��res ��� beschrieben hatte. Der vorliegende Beitrag versucht, die verschiedenen Besitzer und die Umst��nde nachzuzeichnen, welche die Wanderung dieser emblematischen pr��hispanischen Statuette von Mexiko-Stadt nach London fast ein halbes Jahrhundert lang begleitet haben. Abstract In 1803, during his sojourn in Mexico, von Humboldt made the acquaintance of Dupaix, a Spanish soldier of Luxemburgish origin with a keen interest in pre-Columbian art. The discovery of several manuscripts belonging to Dupaix, together with a study of various archives and personal notes left by Humboldt, not to mention the documents held in different institutions on both sides of the Atlantic, have made it possible to recreate the remarkable itinerary of a famous Mexica work of art, that of Chalchiuhtlicue. In his ground-breaking work Vues des cordill��res ��� published in 1810, the Prussian explorer had referred to her as an ���Aztec Priestess���. In this article we attempt to trace the various successive owners of this emblematic pre-Hispanic statuette and the circumstances surrounding the period of almost 50 years it spent wandering between Mexico and London. Resumen El descubrimiento de diferentes manuscritos de Dupaix, militar espa��ol de origen luxemburgu��s afi cionado a las antig��edades precolombinas que se entrevist�� en 1803 con von Humboldt con motivo de su estancia en M��xico, unido al examen de diversos archivos y notas personales del bar��n, as�� como de documentos conservados en diversas instituciones de uno y otro lado del Atl��ntico, permite seguir el recorrido singular de una c��lebre antig��edad mexicana, a saber la Chalchiuhtlicue, que el explorador prusiano identifi c�� en 1810 como una ���sacerdotisa azteca��� en su obra Vues des cordill��res ��� La presente contribuci��n intenta rastrear a los sucesivos diferentes propietarios y las circunstancias que han acompa��ado durante m��s de medio siglo a la peregrinaci��n de esta emblem��tica estatuilla prehisp��nica de M��xico a Londres., HiN - Alexander von Humboldt im Netz. Internationale Zeitschrift f��r Humboldt-Studien, Bd. 22 Nr. 43 (2021)

NTRK gene fusions are sporadic genetic alterations that can occur across tumor entities. Whereas they are quite rare in most solid tumors they are present at much higher frequencies in certain rare tumors such as infantile fibrosarcoma, congenital mesoblastic nephroma, secretory breast, or salivary gland carcinoma. NTRK gene fusions or TRK fusion proteins are considered strong oncogenic drivers. If NTRK gene fusions are detected, TRK inhibitors such as entrectinib and larotrectinib can be used regardless of the tumor entity. So far only larotrectinib is approved in the European Union. Both drugs have been shown to be effective and well tolerated in phase I and phase II studies. The low prevalence of TRK fusion-positive cancers poses challenges for diagnostic and clinical work-flows. On one hand, patients with NTRK gene fusions should be identified; on the other hand, epidemiological, histological, and resource-related aspects have to be taken into account. Based on these premises, we suggest a diagnostic algorithm for TRK fusion cancers and present current data on TRK inhibitors.NTRK-Genfusionen sind seltene genetische Alterationen, die tumorentitätenübergreifend vorkommen können. Während sie in den meisten soliden Tumoren nur sehr niederfrequent vorkommen, lassen sie sich in bestimmten Tumoren wie dem infantilen Fibrosarkom, dem kongenitalen mesoblastischen Nephrom und dem sekretorischen Mamma- oder Speicheldrüsenkarzinom jedoch häufig nachweisen. NTRK-Genfusionen bzw. TRK-Fusionsproteine gelten als starke onkogene Treiber. Bei Nachweis von NTRK-Genfusionen können TRK-Inhibitoren unabhängig von der Tumorentität eingesetzt werden. Vertreter sind Entrectinib und Larotrectinib. Bislang ist nur Larotrectinib in der Europäischen Union zugelassen. Für beide wurden Wirksamkeit und Verträglichkeit in Phase-I- und Phase-II-Studien gezeigt. Die Seltenheit der TRK-Fusionstumoren stellt diagnostische und klinische Prozesse vor große Herausforderungen: Einerseits sollen alle Patienten mit TRK-Fusionstumoren identifiziert werden, andererseits sind epidemiologische und histologische Aspekte sowie Ressourcen zu berücksichtigen. Basierend auf diesen Punkten möchten wir einen Diagnosealgorithmus für TRK-Fusionstumoren vorschlagen, außerdem stellen wir aktuelle Daten zu den TRK-Inhibitoren vor.

While ionizing radiation (IR) is a powerful tool in medical diagnostics, nuclear medicine, and radiology, it also is a serious threat to the integrity of genetic material. Mutagenic effects of IR to the human genome have long been the subject of research, yet still comparatively little is known about the genome-wide effects of IR exposure on the DNA-sequence level. In this study, we employed high throughput sequencing technologies to investigate IR-induced DNA alterations in human gingiva fibroblasts (HGF) that were acutely exposed to 0.5, 2, and 10 Gy of 240 kV X-radiation followed by repair times of 16 h or 7 days before whole-genome sequencing (WGS). Our analysis of the obtained WGS datasets revealed patterns of IR-induced variant (SNV and InDel) accumulation across the genome, within chromosomes as well as around the borders of topologically associating domains (TADs). Chromosome 19 consistently accumulated the highest SNVs and InDels events. Translocations showed variable patterns but with recurrent chromosomes of origin (e.g., Chr7 and Chr16). IR-induced InDels showed a relative increase in number relative to SNVs and a characteristic signature with respect to the frequency of triplet deletions in areas without repetitive or microhomology features. Overall experimental conditions and datasets the majority of SNVs per genome had no or little predicted functional impact with a maximum of 62, showing damaging potential. A dose-dependent effect of IR was surprisingly not apparent. We also observed a significant reduction in transition/transversion (Ti/Tv) ratios for IR-dependent SNVs, which could point to a contribution of the mismatch repair (MMR) system that strongly favors the repair of transitions over transversions, to the IR-induced DNA-damage response in human cells. Taken together, our results show the presence of distinguishable characteristic patterns of IR-induced DNA-alterations on a genome-wide level and implicate DNA-repair mechanisms in the formation of these signatures., publishedVersion

Diese Arbeit beschäftigt sich mit dem peroxisomalen Matrixproteinimport, sowie der peroxisomalen Qualitätskontrolle. Neben der Charakterisierung eines peroxisomalen Importkanals für Proteine mit peroxisomaler Signalsequenz Typ 2 in der Hefe \(\textit {S. cerevisiae}\) wurde ebenfalls ein putativer Proteinkanal in menschlichen Peroxisomen charakterisiert. Zusätzlich wurde eine neue Interaktionsstelle der Porenkomponenten PEX5 und PEX14 funktionell charakterisiert, deren Verlust zu einem partiellem PTS1-Importdefekt führt und eine Destabilisierung von PEX5 zu Folge trägt. Es wird vermutet, dass die neue Bindestelle einen Einfluss auf die Interaktion von PEX5 mit dem Export‐Komplex besitzt. Zusätzlich konnte erstmalig ein Interaktionspartner der AAA\(_+\)‐ATPase ATAD1 an der peroxisomalen Membran beschrieben werden, dabei handelt es sich um PEX5. Es wurden Hinweise gefunden, dass ATAD1 PEX5 aus der Membran entfernt, welches anschließend proteasomal abgebaut wird.

Der ADP/ATP Carrier/AAC ist das häufigste Protein der mitochondrialen Innenmembran. Er wird von einem Gen im Zellkern kodiert u. von zytosolischen Ribosomen synthetisiert. In dieser Arbeit wurde der AAC auf seinem Weg vom Zytosol in das Innere der Mitochondrien festgehalten, um den Transports durch den TOM-Komplex näher zu untersuchen. Als Modellprotein wurde der AAC von Neurospora crassa verwendet. Für die in vitro Importexperimente wurde radioaktiv markierter AAC in Retikulozytenlysat, mit Hilfe von \(^{35}\)S-Methionin synthetisiert u. anschließend in isolierte Mitochondrien der Hefe Saccharomyces cerevisiae importiert. Der Import konnte durch eine Vorinkubation der Mitochondrien in Gegenwart von N-Ethylmaleimid (NEM) gehemmt werden. NEM reagiert mit den SH-Gruppen der Cysteine im Tom70-Importrezeptor bzw. Tom40-Importpore. Die Funktion des Tom70 wird durch die Vorbehandlung mit NEM nicht beeinträchtigt. Beim Tom40 bewirkt NEM eine Blockierung der Importpore entlang der \(\beta\)-Faltblattstränge.

In classical models of tumorigenesis, the accumulation of tumor promoting chromosomal aberrations is described as a gradual process. Next-generation sequencing-based methods have recently revealed complex patterns of chromosomal aberrations, which are beyond explanation by these classical models of karyotypic evolution of tumor genomes. Thus, the term chromothripsis has been introduced to describe a phenomenon, where temporarily and spatially confined genomic instability results in dramatic chromosomal rearrangements limited to segments of one or a few chromosomes. Simultaneously arising and misrepaired DNA double-strand breaks are also the cause of another phenomenon called chromoplexy, which is characterized by the presence of chained translocations and interlinking deletion bridges involving several chromosomes. In this study, we demonstrate the genome-wide identification of chromosomal translocations based on the analysis of translocation-associated changes in spatial proximities of chromosome territories on the example of the cutaneous T-cell lymphoma cell line Se-Ax. We have used alterations of intra- and interchromosomal interaction probabilities as detected by genome-wide chromosome conformation capture (Hi-C) to infer the presence of translocations and to fine-map their breakpoints. The outcome of this analysis was subsequently compared to datasets on DNA copy number alterations and gene expression. The presence of chained translocations within the Se-Ax genome, partly connected by intervening deletion bridges, indicates a role of chromoplexy in the etiology of this cutaneous T-cell lymphoma. Notably, translocation breakpoints were significantly overrepresented in genes, which highlight gene-associated biological processes like transcription or other gene characteristics as a possible cause of the observed complex rearrangements. Given the relevance of chromosomal aberrations for basic and translational research, genome-wide high-resolution analysis of structural chromosomal aberrations will gain increasing importance.

Der Sec61-Translokon-Pathway ist für die meisten Proteine der erste Schritt des intrazellulären Proteintransports. Mit Hilfe von Signalsequenzen der Proteine und des Sec61-Komplexes der ER-Membran werden sekretorische Proteine über die ER-Membran transloziert und integrale Membranproteine in diese integriert. Die kontrollierte Beeinflussung der Translokation von Proteinen am Sec61-Komplex hat ein hohes pharmakologisches Potential, das zur Zeit noch nicht genutzt wird. Inhibitoren des Sec61-Komplexes könnten z.B. zu neuen Zytostatika entwickelt werden. Um dieses Ziel in erreichbare Nähe zu rücken, muss die Funktionsweise des Sec61-Komplexes und insbesondere der Öffnungsmechanismus des proteinleitenden Kanals durch die Signalsequenzen der Proteine weiter aufgeklärt werden. Auch für diesen Zweck wären Inhibitoren des Sec61-Komplexes gute Werkzeuge. Ein Beispiel für einen solchen Inhibitor stellt das Zyklodepsipeptid Cotransin (CT) dar. Bisher wurde beschrieben, dass CT und einige andere Zyklodepsipeptide wahrscheinlich direkt an den Sec61-Komplex binden, dort aber nur die Biosynthese einer kleinen Anzahl von Proteinen blockieren. Für diese Selektivität sind die Signalsequenzen der sensitiven Proteine verantwortlich. Die Zahl der Proteine, deren Biosynthese tatsächlich CT-sensitiv ist, war ebenso unklar wie die Eigenschaften der Signalsequenzen, die diese Sensitivität vermitteln. Im Vorfeld dieser Arbeit wurde die tatsächliche Selektivität von CT mit Hilfe einer Proteomics-Analyse untersucht und festgestellt, dass bei einer sättigenden CT-Konzentration von 30 μM die Biosynthese fast aller sekretorischer Proteine CT-sensitiv war. Die Biosynthese der Mehrzahl der integralen Membranproteine war dagegen CT-resistent. Die Substanz ist damit weitaus weniger selektiv als bisher angenommen. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde eine breit angelegte, bioinformatische Analyse der Signalsequenzen der CT-sensitiven Proteine durchgeführt, die in dieser Proteomics-Studie identifiziert wurden. Ziel war es, ein mögliches Konsensusmotiv in den Signalsequenzen (Signalankersequenzen oder Signalpeptide) zu identifizieren, das die CT-Sensitivität vermittelt, und dieses dann experimentell zu charakterisieren. In allen CT-sensitiven Signalankersequenzen konnte auf Ebene der α-helikalen Sekundärstruktur ein entsprechendes Konsensusmotiv gefunden werden. Das Konsensusmotiv bildet auf der Helixoberfläche zwei Vertiefungen durch kleine Aminosäurereste aus (Gly, Ala, Ser, Thr, Cys), die durch größere, raumfüllende Aminosäurereste voneinander getrennt sind. Flankierend zu dieser Gruppe von Aminosäuren finden sich große geladene, polare oder aromatischen Aminosäurereste. In der Folge wurde mit Hilfe von gerichteten Mutagenesen experimentell bestätigt, dass dieses Motiv die CT-Sensitivität einer Signalankersequenz vermitteln kann. Im Gegensatz zu den CT-sensitiven Signalankersequenzen, bilden die meisten CT-sensitiven Signalpeptide dieses Motiv nicht aus und es bleibt unklar, worauf deren CT-Sensitivität beruht. In den seltenen Fällen, in denen das Motiv in einem Signalpeptid vorhanden ist, scheint es auch hier die CTSensitivität zu vermitteln. Dies konnte ebenfalls durch gerichtete Mutagenesen experimentell gezeigt werden. Die oben beschriebenen Zyklodepsipeptide weisen einen Signalsequenz-selektiven Wirkungsmechanismus am Sec61-Komplex auf und sind daher, auch aufgrund ihrer peptidischen Struktur, für die Wirkstoffentwicklung wenig geeignet. Im zweiten Teil dieser Arbeit wurde ein zellbasierter Hochdurchsatz-Screen entwickelt und etabliert, mit dem Ziel, neue Inhibitoren für den Sec61-Komplex zu identifizieren, die den proteinleitenden Kanal auch unabhängig von Signalsequenzen blockieren. Bei diesem sequenziellen Screening-Verfahren mit 37312 Substanzen wurden im Primärscreen zunächst alle Verbindungen aus der Bibliothek identifiziert, die einen Einfluss auf Transkription, Translation und den Sec61-Translokon-Pathway haben. Im Sekundärscreen wurden dann die Substanzen identifiziert, die eine Selektivität für den Sec61-Translocon-Pathway aufweisen sollten. Nach Bestimmung der IC50-Werte und Berücksichtigung der Parameter der Medizinalchemie wurden fünf Substanzen für die weitere Analyse ausgewählt. Die Selektivität der Substanzen wurde mit Hilfe eines zellulären Biosyntheseassays mit verschiedenen Membranproteinen bestimmt. Die Aktivität gegen den Sec61-Translokon-Pathway konnte mit einem zellfreien Transkriptions-/ Translations-/ Translokationsassay bewiesen werden. Dabei zeigte sich, dass zwei Substanzen (FMP-214534 und FMP-401319) den Sec61-Translokon-Pathway unabhängig von Signalsequenzen mit einer IC50 im niedrigen mikromolaren Bereich (zelluläres Assay) blockieren. Für die Substanz FMP-401319 wurde eine Vielzahl kommerziell erhältlicher Analoga analysiert und eine Substanz mit leicht verbesserten Eigenschaften gefunden. Mit dieser Substanz (FMP-401319-3) wurde abschließend mit Hilfe des zellfreien Transkriptions-/ Translations-/ Translokationsassays und Proteaseprotektion bestimmt, auf welcher Stufe des Sec61-Translokon-Pathways die Verbindung angreift. Es konnte gezeigt werden, dass die Substanz die cotranslationale Translokation eines Proteins auf der Ebene des Sec61-Komplexes blockiert, und zwar nachdem das Ribosom an den Sec61-Komplex gebunden hat, aber bevor die naszierende Proteinkette das ER-Lumen erreicht und das Signalpeptid abgespalten werden kann. Zukünftige Studien müssen zeigen, wo genau die Substanz FM-401319-3 bindet und den Sec61-Komplex beeinflusst., For most proteins, the Sec61 translocon pathway represents the first step in intracellular protein transport. With the help of signal sequences of the proteins and the Sec61 complex of the ER membrane, secretory proteins are translocated across the ER membrane and integral membrane proteins are integrated into the lipid bilayer. Thus, controlling protein translocation at the Sec61 complex has a high pharmacological potential, which is currently not used. Inhibitors of the Sec61 complex could therefore serve, for example, as new cytostatic drugs. Sec61 inhibitors further represent appropriate tools to study the function of the Sec61 complex and in particular the opening mechanism of the protein-conducting channel by the signal sequences of the proteins which, in turn, must be further elucidated in order to optimize these drugs. An example of such an inhibitor is the cyclodepsipeptide cotransin (CT). To date, it was described that CT and some other cyclodepsipeptides are likely to bind directly to the Sec61 complex. However, these compounds were shown to only block the biosynthesis of a small number of proteins. For this selectivity, the signal sequences of the sensitive proteins are crucial. Nevertheless, neither the actual number of CT-sensitive proteins was clearly be determined nor was known what distinguishes CT-sensitive and non-sensitive signal sequences. Prior to this work, the actual selectivity of CT was studied by a proteomics analysis and it was found that at a saturating CT concentration (30 μM), the biosynthesis of almost all secretory proteins was CT-sensitive. The biosynthesis of the majority of integral membrane proteins, however, was CT-resistant. These results showed that CT was far less selective than previously thought. In the first part of this work, an extensive bioinformatic analysis of the signal sequences of the CT-sensitive proteins, previously identified in the proteomics study, was performed. The aim was to identify a possible consensus motif in the signal sequences (signal anchor sequences or signal peptides), which mediates CT sensitivity and to characterize it experimentally. In all CT-sensitive signal anchor sequences, a corresponding consensus motif could be identified at the level of the α-helical secondary structure of these sequences. The consensus motif leads to the formation of two cavities at the helix surface by the presence of small amino acid residues (Gly, Ala, Ser, Thr, Cys) which are separated by larger, space-filling amino acid residues. The cavities are flanked on both sides by large charged, polar or aromatic amino acid residues. Subsequently, it was confirmed experimentally by directed mutagenesis experiments that this motif can mediate the CT sensitivity of a signal anchor sequence. In contrast to the CTsensitive signal anchor sequences, most CT-sensitive signal peptides do not form this motif and it remains unclear what determines their CT sensitivity. However, in the rare cases where the motif is present in a signal peptide, it also appears to mediate CT sensitivity. This could also be confirmed experimentally by directed mutagenesis. The cyclodepsipeptides described above have a signal sequence-selective mechanism of action at the Sec61 complex and are therefore not suitable for drug development, also because of their peptidic structure. In the second part of this work, a cell-based high-throughput screen was developed and established with the aim to identify new inhibitors for the Sec61 complex, which block the protein-conducting channel independently of signal sequences. In the primary screen of this sequential screening assay (37,312 compounds in total), all substances from the library that have an influence on transcription, translation and the Sec61 translocon pathway were identified. In the secondary screen, the substances which should inhibit the Sec61 translocon pathway alone were then selected. After determining the IC50 values, and considering the parameters of medicinal chemistry, five substances were selected for further analysis. The selectivity of the substances was determined by use of a cellular biosynthesis assay with various membrane proteins. The activity against the Sec61 translocon pathway was analyzed using a cell-free transcription/ translation/ translocation assay. It was found that two substances, namely FMP-214534 and FMP-401319, block the Sec61 translocon pathway independent of signal sequences with low micromolar IC50 values (cellular assay). For the substance FMP-401319, a variety of commercially available analogs were analyzed and a compound with slightly improved properties, namely FMP-401319-3, was found. Using this substance, in the cell-free transcription/ translation/ translocation assay and protease protection experiments, it was finally determined at which stage of the Sec61 translocon pathway the compound acts. It could be shown that FMP-401319-3 actually blocks the cotranslational translocation of a protein at the level of the Sec61 complex. This occurs after the ribosome has bound to the Sec61 complex, but before the nascent protein chain has reached the ER lumen for signal peptide cleavage. Future studies will have to show where exactly the substance FM-401319-3 binds and exerts its functions at the Sec61 complex.

Das Diphtherie-Toxin tötet Zellen indem nach Rezeptor-vermittelter Endozytose des Toxins seine Enzymdomäne DTA aus frühen Endosomen in das Zytosol transloziert und dort die Proteinbiosynthese inhibiert. Bei dieser Translokation scheinen zell-eigene Faktoren unterstützend involviert zu sein. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung von Peptidyl-Prolyl-cis/trans-Isomerasen (Cyclophiline und FK-Bindeproteine) bei der Aufnahme von nativem DT in humane Zellen untersucht. Pharmakologische Substanzen (CsA, FK506, VK112), welche die Isomerase-Aktivität der Cyps sowie FKBPs inhibieren, schützten HeLa-Zellen vor Vergiftung und verzögerten den pH-abhängigen Transmembran-Transport von DTA. Zusammenfassend sind diese Zell-Faktoren also an der Toxinaufnahme des DT in humane Zellen beteiligt, wodurch neue Therapiemöglichkeiten entwickelt werden könnten.

Die Frage nach der Existenz alternativer Importwege in Peroxisomen der Hefe \(\textit {Saccharomyces cerevisiae}\) wurde in zwei unterschiedlichen Projekten bearbeitet. Im ersten Projekt wurde demonstriert, dass der Transport des peroxisomalen Enzyms Gpd1p (Glycerin-3-phosphat Dehydrogenase) spezifisch von dem Korezeptorprotein Pex21p über den PTS2-Importweg vermittelt wird. Die Analyse von Gpd1p-Komplexen führte weiterhin zur Identifikation des Gpd1p-Interaktionspartners Pnc1p (Nikotinamidase), welcher trotz eines fehlenden Importsignals in Peroxisomen lokalisiert ist. Untersuchungen des Pnc1p-Transports ergaben einen peroxisomalen Import von Pnc1p durch die Bildung eines Komplexes mit dem Enzym Gpd1p. Im zweiten Teil der Arbeit konnte das putative Rezeptorprotein Ymp8p (YMR018w) erstmals immunologisch unter spezifischen Umweltbedingungen nachgewiesen sowie Lokalisation und Topologie aufgeklärt werden. Die Funktionalität als Importrezeptor wurde an Hand spezifischer Kargoproteine demonstriert.

submitted by Anika Schorpp Universität Linz, Masterarbeit, 2017

Sec61p is the channel-forming subunit of the heterotrimeric Sec61 complex that mediates co-translational protein import into the endoplasmic reticulum (ER). In yeast, proteins can also be post-translationally translocated by the hetero-heptameric Sec complex, composed of the Sec61 and Sec63 complexes. Sec61 is also a candidate for the dislocation channel for misfolded proteins from the ER to the cytosol during ER-associated degradation (ERAD). The structure of Sec61p is highly conserved, but the roles of its N-terminal acetylation and N-terminal amphipathic helix were unknown so far. To investigate the function of the Sec61p N-terminus, I deleted its amphipathic helix, or both the helix and N-acetylation site, and characterized these two mutants together with a sec61 mutant carrying a mutation of the N-terminal acetylation site previously shown to result in temperature-sensitivity and an ERAD defect. Mutation of the N-acetylation site on its own had no effect on protein import into the ER in intact cells. Yeast expressing sec61 without the N-terminal helix displayed severe growth and post-translational ER import defects. Nevertheless, the formation of Sec complexes was not affected. Instead, removal of the N-terminal helix compromised the integrity of heterotrimeric Sec61 complexes. My data show that the Sec61p N-terminal helix is required for post-translational protein import into the ER and Sec61 complex stability, whereas Sec61p N-terminal acetylation plays a role in ERAD. Der heterotrimere Sec61-Proteinkomplex vermittelt die Translokation sekretorischer Proteine ins Endoplasmatische Reticulum (ER) und ist ein putativer Transportkanal fehlgefalteter Proteine aus dem ER ins Cytosol während der ER-assoziierten Proteindegradation (ERAD). Die Untereinheit Sec61p bildet den Kanal und vermittelt den cotranslationalen Proteinimport in das ER. Proteine können in Hefen auch posttranslational durch den heteroheptameren Sec-Komplex, bestehend aus dem Sec61- und dem Sec63‑Komplex, transloziert werden. Die Sec61p-Struktur ist hochkonserviert, aber die Funktion der N-Acetylierung und der N-terminalen amphipatischen Helix waren bisher nicht bekannt. Daher deletierte ich die Helix mit und ohne die Acetylierungsstelle und charakterisierte beide Mutanten zusammen mit einer kürzlich entdeckten sec61 Mutante, die in der N-terminalen Acetylierungsstelle mutiert ist, temperatursensitiv ist und ERAD-Defekte aufweist. Die Mutation der Acetylierungsstelle hatte keinen Effekt auf den Proteinimport ins ER intakter Zellen. Hefen, die sec61 ohne die N-terminale Helix exprimieren, zeigen einen starken Wachstums- und posttranslationalen ER-Importdefekt. Die Ausbildung des Sec-Komplexes war nicht betroffen, obwohl die Integrität des heterotrimeren Sec61-Komplexes beeinflusst war. Meine Daten belegen, dass die N-terminale Helix für den posttranslationalen Import ins ER und die Sec61-Komplexstabilität notwendig ist, wohingegen die N-Acetylierung eine Rolle in der ERAD spielt.

Author Klemens Winkler Zusammenfassung in deutscher Sprache Arbeit gesperrt bis Universität Linz, Univ., Dissertation, 2016 OeBB

submitted by Andreas Karner Universität Linz, Univ., Dissertation, 2016

Eine der beeindruckendsten Umwelten, die von Bakterien besiedelt werden ist die extreme Kälte. Nur wenig ist bekannt über die Anpassung von kältesensitiven, zellbiologischen Prozessen. In dieser Arbeit, präsentiere ich eine genomweite Analyse von psychrophilen, mesophilen und thermophilen Bakterien zur Identifikation struktureller Änderungen von klassischen Signalpeptiden, Tat-Signalpeptiden, Lipoproteinsignalpeptiden und Transmembrandomänen zur Anpassung an die Kälte. Der größte Unterschied ist, dass psychrophile Signalpeptide und Transmembrandomänen höhere Anteile an Ile beinhalten verglichen mit mesophilen. Sec61p ist ein mehrfach transmembranes Protein, dass einen Kanal in der Membran des endoplasmatischen Retikulums (ER) bildet. Es ist die Pore, die für den Import löslicher Vorläuferproteine und für die Insertion von Transmembrandomänen verantwortlich ist. Außerdem ist Sec61p von S. cerevisiae ein Kandidat für den Exportkanal in einem Prozess, der als ERAD bezeichnet wird. In dieser Arbeit untersuchte ich den N-Terminus und etablierte die sec61S2Y-Mutante, die defekt für die N-Acetylierung, posttranslationale Translokation und ERAD ist. Ich untersuchte die Mutante sec61Y345H in Hefe, deren Homolog in Mäusen Diabetes auslöst und identifizierte in einem neuen Screen eine vitale sec61-Mutante ohne Loop 7. Eine vollständige Deletion von Loop 7 führt zu starken Defekten im posttranslationalen Proteinimport von löslichen Proteinen ins ER und in ERAD von löslichen Substraten. One of the most impressive environments bacteria settled in is the extreme cold. Little is known about adaptation of cold-sensitive cell biological processes. In this thesis, I present a genome-wide analysis of several psychrophilic, mesophilic and thermophilic bacteria to identify structural changes in classic signal peptides, Tat signal peptides, lipoprotein signal peptides and transmembrane domains to the cold. The most striking difference was that psychrophile signal peptides and transmembrane domains contained higher percentages of Ile compared to mesophiles. Sec61p is a multiple transmembrane protein that forms a channel in the membrane of the endoplasmic reticulum (ER). The pore is responsible for the import of soluble precursor proteins and for the insertion of membrane proteins. Furthermore, Sec61p of S. cerevisiae is a candidate for the export channel in a process named ERAD. In this thesis, I examined the role of the N-terminus and established the sec61S2Y mutant, defective for N-acetylation, posttranslational translocation and ERAD. I analyzed the sec61Y345H mutant, whose homolog in Mice causes diabetes and I identified a vital sec61 mutant lacking loop 7 in a new screen. A complete deletion of Loop 7 results in strong defects for its posttranslational protein import of soluble proteins in the ER and in the ERAD of soluble substrates.

Das Multiple Myelom ist eine häufige, inkurable Plasmazellneoplasie, deren klinischer Verlauf sehr heterogen ist. Die Pathogenese ist noch zu weiten Teilen unklar und vor allem vor dem Hintergrund der sehr unterschiedlichen Überlebenszeiten stellt sich die Frage, ob noch genauere prognostische Aussagen möglich sind. Daher war das Ziel unserer Arbeit die weitere Untersuchung von Subgruppen, die Beleuchtung der Pathogenese sowie die Untersuchung der Rolle der Genexpression als Prognosemarker. Wir führten eine real-time PCR von 30 Kandidatengenen durch, ausgesucht nach ihrer Lage an kritischen genomischen Regionen oder ihrer Rolle als Zellzyklus- oder Apoptoseregulator. Unser Kollektiv bestand aus 110 unvorbehandelten Patienten mit neu diagnostiziertem Multiplen Myelom. Es konnten signifikante Genexpressionsunterschiede zwischen den Subgruppen identifiziert werden (z.B. Expression von Kandidatengenen involviert in Translokationen (CCND1 bei t11;14; FGFR3 und MMSET bei t4;14)). Dies gibt Hinweise auf spezifische pathogenetische Abläufe in den einzelnen Subgruppen. Darüber hinaus konnten wir anhand der Genexpressions-Clusteranalyse Hinweise auf neue biologische Subgruppen finden, die mit den bisher bekannten nicht übereinstimmen. Die Genexpressionsanalyse beim Multiplen Myelom könnte als unabhängiger prognostischer Parameter die prognostische Aussagekraft weiter optimieren; als besonders vielversprechend zeigten sich ATM und MUM-1.

The acute promyelocytic leukaemia (APL) accounts for 10% of the adult AML patients. APL patients carry chromosomal translocations involving the rarα gene on chromosome 17. The most frequent translocations lead to the expression of the fusion proteins PML/RARα (98%; t(15;17)) and PLZF/RARα (1%; t(11;17)) (X-RARα). The APL is characterised by a differentiation block at the promyelocytic stage and leads to an increased amount of myeloid blasts in the bone marrow and in the peripheral blood. Both X-RARα fusion proteins build high molecular weight (HMW) complexes, which are essential to excert the leukaemic potential. The purpose of this work was to validate and analyse binding partners of the PLZF/RARα fusion protein for their leukaemic potential. IT-based pathway analyses of 20 putative PLZF/RARα binding partners revealed the central proteins actin, c-Fos and Erk1/2. VASP, TFII-I and PI4KIIα were selected for further studies, due to their direct influence on the proteins mentioned above. The interaction studies validated the binding of PLZF/RARα with all three proteins: VASP, TFII-I and PI4KIIα. The binding occurs in all cases mainly through the RARα portion. The PLZF/RARα expression causes the dephosphorylation of the actin-associated phosphoprotein VASP, which leads to its cellular delocalisation. The hypophosphorylation of VASP is probably connected with the proteasomal degradation of the kinases PKA and/or PKG. Treatment with the standard APL therapeutic all-trans retinoic acid (ATRA) reestablished VASP phosphorylation in PLZF/RARα -expressing cells. The leukaemic fusion protein co-localised with the transcription factor TFII-I in the nucleus. Furthermore, the expression of both X-RARα fusion proteins causes the deregulation of TFII-I target genes. TFII-I is at least sequestered by PML/RARα, since ATRA treatment reverts in nearly all cases the aberrant expression of the TFII-I target genes. Additionally, the important TFII-I target gene c-fos, which is an protooncogene and part of the AP-1 transcription factor family was overexpressed in the presence of the X-RARα proteins. Moreover, PLZF/RARα caused the translocation of the lipid kinase PI4KIIα to the nucleus, leading to their co-localisation. It was shown before that PI4KIIα overexpression leads to an increased synthesis of PI(4)P and the subsequent induction of Erk1/2, while the expression of PLZF/RARα inhibits PI4KIIα activity. Further analyses showed that the sequestration of the kinase resulted in the inactivation of Erk1/2. ATRA treatment induced Erk1/2 activation in control and PML/RARα -expressing cells, but not in the ATRA-resistent PLZF/RARα -expressing cells. Differentiation experiments in murine haematopoietic progenitor cells showed that PI4KIIα expression is essential for the myeloid differentiation. However, the overexpression of PI4KIIα in PLZF/RARα -expressing cells alone could not overcome the differentiation block. In summary, the PLZF/RARα fusion protein disturbs the normal activity and functionality of its interaction partners, which contributes to the development of APL. New APL marker proteins and pathways were identified and validated. These marker proteins represent putative therapeutic targets. Further examinations could lead to an improved treatment of patients with the PLZF/RARα-associated APL.

Studien implizieren, dass Cx36 ein mutmaßlicher Partner für mehrere Proteine, einschließlich \(\alpha\)-CaMKII ist. Im ersten Teil, um die physische Interaktion zwischen Cx36 und \(\alpha\)-CaMKII auszuwerten, Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer (FRET)-Protokoll wurde in N2A Zellen, die mit verschiedenen Cx36 transfiziert wurden, und \(\alpha\)-CaMKII Konstrukte angewendet. Experimente für FRET Einschätzung nach Foto Inaktivierung von Cx36-EYFP wurden mit einem 514 nm Laser in Ca\(^{2+}\)/Ionomycin behandelt und Ca\(^{2+}\)/Ionomycin unbehandelten Zellen durchgeführt. Der zweite Teil des Projekts zielte darauf ab, ob die Bindung von \(\alpha\)-CaMKII zu Cx36 zu klären ist. Gegenstand der Tätigkeits-abhängigen Mechanismen wie Translokation nach Stimulation. Im dritten Teil wurde Cx36-EYFP-WT Expression und mögliche Translokation von \(\alpha\)-CaMKII-ECFP-WT in Neuronen untersucht. Gap junctions are the structural equivalents of electrical synapses in the central nervous system (CNS), which can be formed by one or more types of connexin (Cx) proteins. Recent studies imply that Cx36 is a putative partner for several binding proteins, including \(\alpha\)-CaMKII. In the first part, to evaluate the physical interaction between Cx36 and \(\alpha\)-CaMKII, fluorescence resonance energy transfer (FRET) protocol was applied in N2A cells, which were transfected with different Cx36, and \(\alpha\)-CaMKII constructs. Experiments for FRET assessment were performed after photo-inactivation of Cx36-EYFP with a 514 nm laser in Ca\(^{2+}\)/ionomycin treated and Ca\(^{2+}\)/ionomycin untreated cells. The second part of the project, aimed to clarify whether binding of \(\alpha\)-CaMKII to Cx36 is subject of activity-dependent mechanisms such as translocation after stimulation. In the third part, Cx36-EYFP-WT expression and possible translocation of \(\alpha\)-CaMKII-ECFP-WT was studied in neurons.

Der Proteinimport in Peroxisomen unterscheidet sich von bekannten Translokons, indem gefaltete und sogar oligomere Proteine über die peroxisomale Membran transportiert werden. Im Mittelpunkt dieser Arbeit sollte die Identifizierung und Charakterisierung eines Pex5p-unabhängigen Kanals stehen. Der isolierte Pex18p-Komplex aus einem Pex5p-defizienten \(\textit {S. cerevisiae}\) Stamm enthält zwei Subkomplexe mit unterschiedlicher Zusammensetzung. Die identifizierten Pex18p-Subkomplexe wurden mittels \(\textit {planarer Bilayertechnik}\) auf Porenaktivität hin untersucht. Die Messungen ergaben eine Porenaktivität für den größeren Subkomplex mit Pex18p und Pex14p als Hauptbestandteile. Die unterschiedlichen Charakteristika der Pore durch Modifikation des Kargoproteins Fox3p zeigen, dass es sich um eine für PTS2-Proteine spezifische Pore handelt. Damit konnte eine weitere Pore identifiziert werden, die spezifisch für PTS2-Proteine ist und sich in ihren Eigenschaften von der PTS1-Pore unterscheidet.

In der Arbeit wurde die Rolle der intrazellulär lokalisierten löslichen Adenylylcyclase (LAC) bei der Apoptose-Regulation untersucht. Dazu wurden (1) Behandlung mit einem spezifischen Hemmstoff, (2) LAC-Knockdown, sowie (3) LAC-Überexpression verwendet. Die Ergebnisse zeigen eine pro-apoptotische Rolle der LAC in zwei \(\textit in-vitro\) Modellen: (i) simulierte Ischämie/Reperfusion von adulten Kardiomyozyten, und (ii) Behandlung von vaskulären Glattmuskelzellen (VGMZ) mit Oxysterol. In beiden Modellen besteht der Hauptmechanismus der Apoptose aus mitochondrialer Translokation von LAC, gefolgt von PKA-abhängigen Phosphorylierung (Thr (167)) und Translokation des pro-apoptotischen Bax-Proteins zu den Mitochondrien. Des Weiteren spielt eher zytosolische als mitochondriale LAC eine pro-apoptotische Rolle in VGMZ. Zusammenfassend zeigt die Arbeit die Schlüsselrolle der zytosolischen LAC bei der Kontrolle der mitochondrialen Apoptose in Kardiomyozyten und in VGMZ.

Der Proteinimport in Peroxisomen unterscheidet sich von bekannten Translokons, indem gefaltete und sogar oligomere Proteine über die peroxisomale Membran transportiert werden. Im Mittelpunkt dieser Arbeit sollte die Identifizierung und Charakterisierung eines Pex5p-unabhängigen Kanals stehen. Der isolierte Pex18p-Komplex aus einem Pex5p-defizienten S. cerevisiae Stamm enthält zwei Subkomplexe mit unterschiedlicher Zusammensetzung. Die identifizierten Pex18p- Subkomplexe wurden mittels planarer Bilayertechnik auf Porenaktivität hin untersucht. Die Messungen ergaben eine Porenaktivität für den größeren Subkomplex mit Pex18p und Pex14p als Hauptbestandteile. Die unterschiedlichen Charakteristika der Pore durch Modifikation des Kargoproteins Fox3p zeigen, dass es sich um eine für PTS2-Proteine spezifische Pore handelt. Damit konnte eine weitere Pore identifiziert werden, die spezifisch für PTS2-Proteine ist und sich in ihren Eigenschaften von der PTS1-Pore unterscheidet.

Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Positionsklonierung krankheitsverursachender Gene unter Verwendung Phänotyp-assoziierter balancierter Translokationen, für die Identifizierung und nähere Charakterisierung von bisher unbekannten genetischen Ursachen. Die Grundlage hierfür stellten 4 Translokationspatienten dar, die sich bei ungeklärter genetischer Ursache mit den unterschiedlichen Krankheitsbildern Noonan-Like, Cri-du-Chat-Like, Adipositas kombiniert mit hypogonadotropem Hypogonadismus und DiGeorge-Like präsentierten. Ausgehend von der grundsätzlichen These eines monogenen, über die Translokationsbruchpunkte direkt durch Ruptur eines Gens oder indirekt über Positionseffekt vermittelten Defekts, erfolgte die Charakterisierung der Translokationsbruchpunkte. Diese umfasste deren Feinkartierung mittels FISH und Mini-FISH-Analysen, sowie eine sich anschließende basengenaue Bruchpunktbestimmung über Sequenzierung von Bruchpunkt-überspannenden Fragmenten. Die Kausalität der im Bereich der Bruchpunkte ermittelten Kandidatengene für den entsprechenden Phänotyp, auf Grund von Defizienz, wurde an Hand von Expressionsanalysen untersucht und gegebenenfalls durch weiterführende funktionelle Analysen bestätigt. Der Möglichkeit zusätzlich auftretender, kryptischer und für den Phänotyp relevanter Aberrationen wurde mittels molekularer Karyotypisierung nachgegangen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte somit für drei Translokationspatienten die dem jeweiligen Krankheitsbild zu Grunde liegende Genetik geklärt werden. Insgesamt deckten die erhaltenen Ergebnisse das mögliche Spektrum der genetischen Konsequenzen balancierter Translokationen ab und dienten speziell im Fall des Noonan-Syndrome-Like-Patienten der Positionsklonierung des krankheitsverursachenden Gens MYST4. Dessen Haploinsuffizienz konnte über funktionelle Charakterisierung als bis dahin unbekannte genetische Ursache für Erkrankungen im Noonan-Syndrom-Spektrum nachgewiesen werden. The aim of the present thesis was positional cloning of disease associated genes by using potentially phenotype associated balanced translocations for identification and further characterization of hitherto unknown genetic causes. Therefore four distinct translocation patients were investigated who presented themselves with diverse phenotypes comprising Noonan-like, Cri-du-Chat-like, obesity combined with hypogonadotropic hypogonadism and DiGeorge-like phenotypes of unknown genetic origin. Assuming a monogenic defect caused by direct disruption of a gene by the chromosomal translocation or an indirect posititional effect on a gene proximal to one of the breakpoints, the characterization of the translocation breakpoints was performed. This comprised a fine mapping by FISH and Mini-FISH-analyses and subsequent breakpoint sequencing based on breakpoint-spanning PCR products. Potential candidate genes found on or near the breakpoints and their putative causality for the phenotype through deficiency was investigated by expression analysis and verified by further functional studies. The possibility of additionally occurring cryptic aberrations with relevance for the phenotype was investigated by molecular karyotyping. In summary, within this thesis it was possible to clarify the genetic cause for the aberrant phenotype of three translocation harboring patients. The results thereby comprised the broad spectrum of genetic consequences seen for balanced translocations and served in the case of the Noonan-like patient for the positional cloning of a novel disease causing gene: MYST4. By functional characterization MYST4 haploinsufficiency was proven to be a novel cause for the Noonan-syndrome-like spectrum.

Sugar beet (Beta vulgaris L. ssp. vulgaris) is a host of the beet cyst nematode (BCN) Heterodera schachtii Schmidt, which causes high yield losses. Resistance had been identified in the wild relative Patellifolia procumbens and was integrated into the sugar beet genome by a translocation to the end of chromosome 9. Two nematode resistant (TR520 and TR363) and two susceptible (TR659 and TR320), sugar beet translocation lines which share partly homologous sequences from P. procumbens chromosome 1, were the focus of my research. I hypothesized that a second gene for nematode resistance (Hs1-2) is located on a region shared by both resistance carrying translocations. The aim of this work was the identification of the Hs1-2 gene. The work includes a functional analysis of a candidate sequence for the Hs1-2 gene (ORF 702) which encodes a galactosyltransferase family protein and which had been identified in a previous work. Moreover, new gene candidates have been identified and characterized after whole genome shotgun (WGS) sequencing using the Illumina HiSeq platform of the translocation lines TR520 and TR363. Die Zuckerrübe (Beta vulgaris L.) ist ein Wirt des Rübenzystennematoden Heterodera schachtii Schmidt, welcher für hohe Ertragsverluste verantwortlich ist. Resistenz gegen H. schachtii konnte in der Wildart Patellifolia procumbens festgestellt und durch Translokation an das Ende von Chromosom 9 der Zuckerrübe übertragen werden. Bislang sind zwei nematodenresistente (TR520 und TR363) und zwei anfällige Translokationslinien (TR320 und TR659) bekannt, die teilweise homolog zueinander sind. Die Position eines zweiten Nematodenresistenzgens (Hs1-2) wird in einer gemeinsamen Region der beiden resistenten Linien vermutet. Als Ergebnis einer früheren Arbeit war in Bezug auf diese Hypothese der offene Leserahmen (open reading frame, ORF) 702 als Kandidatensequenz vorgeschlagen worden. Das Ziel meiner Arbeit war die Klonierung des Hs1-2 Gens. Zunächst wurde hierzu eine funktionelle Analyse des ORF 702 durchgeführt und weitere translokationsspezifische Sequenzen und Genkandidaten mittels whole-genome-shotgun (WGS) Sequenzierung mit der Illumina HiSeq-Platform der Translokationslinien TR520 und TR363 identifiziert.

Biological processes are complex study objects due to their dynamic nature and structural diversity of living organisms. To study dynamic processes statistically, numerous experiments with multiple observations have to be performed, and data have to be analyzed and evaluated. Owing to great technological advances, gigabytes of data are being acquired both in research and industry. Slow and subjective manual analyses are not sufficient anymore, and automated evaluation methods are required. The distribution of biomolecules provides valuable information on a current biological state. The distribution of biomolecules depends on and is influenced by functions of biomolecules, and may thus be used to detect abnormalities. The relatively young research field extit{toponomics} describes the laws of spatial arrangement of molecules. Several evaluation methods have previously been developed, automatized and standardized. However, no standard evaluation methods have been reported to quantitatively analyze such an important biological process like translocation of biomolecules. Translocation processes are vital for living organisms. For instance, substance inclusion into a cell or exclusion from it represent a translocation. Furthermore, signaling biomolecules translocate from the cytoplasm across the nuclear membrane into the nucleus to influence gene and protein expression. Investigating translocation processes may help to understand complex biological functions. It may also be used to analyze signaling events, or may even be employed for diagnostics and therapy monitoring. Manual and case-specific methods for quantitative translocation analysis are known, but fail to be generally applicable. Therefore, I have developed a novel generic automated approach. The method is based on microscopy images of biological samples. I have defined a generic method to quantitatively express distribution of biomolecules in numeric descriptors. Herewith, changes in distribution may be analyzed using different biological samples. Thus, the samples analyzed do not necessarily have to belong to a time series. Furthermore, not only cell cultures, but also tissue samples can be used for the analysis. Evaluations of cell cultures are simpler due to homogeneity and spatial separation of individual objects. However, structural polarity of the cells can be seen only in tissues. I have developed two workflows based on numeric descriptors for the distribution of bio-ewline molecules. The first workflow uses structure detection in images to localize the objects for evaluation. The second workflow avoids this complex operation by a structure-independent information extraction strategy. Both workflows are generic and may be applied to quantify a wide range of translocation processes.

In der Arbeit wurde die Rolle der intrazellulär lokalisierten löslichen Adenylylcyclase (LAC) bei der Apoptose- Regulation untersucht. Dazu wurden (1) Behandlung mit einem spezifischen Hemmstoff, (2) LAC-Knockdown, sowie (3) LAC- Überexpression verwendet. Die Ergebnisse zeigen eine pro-apoptotische Rolle der LAC in zwei in-vitro Modellen: (i) simulierte Ischämie/Reperfusion von adulten Kardiomyozyten, und (ii) Behandlung von vaskulären Glattmuskelzellen (VGMZ) mit Oxysterol. In beiden Modellen besteht der Hauptmechanismus der Apoptose aus mitochondrialer Translokation von LAC, gefolgt von PKA-abhängigen Phosphorylierung (Thr (167)) und Translokation des pro-apoptotischen Bax-Proteins zu den Mitochondrien. Des Weiteren spielt ehe zytosolische als mitochondriale LAC eine pro-apoptotische Rolle in VGMZ. Zusammenfassend zeigt die Arbeit die Schlüsselrolle der zytosolischen LAC bei der Kontrolle der mitochondrialen Apoptose in Kardiomyozyten und in VGMZ.

The ability to produce toxins is spread among a huge variety of bacterial strains. A very prominent class of bacterial protein toxins is the family of binary AB toxins sharing a common mode of intoxication. A pore forming component B binds and translocates an enzymatic component A into the cytosol of target cells exhibiting a fatal mode of action. These components are supposed to be not toxic themselves but both required for cell toxicity. Anthrax toxin produced by the Gram-positive bacteria Bacillus anthracis is the best studied binary toxin especially since its use as a biological weapon in the context of the attacks of 9/11 in 2001. In contrast to other binary toxins, Anthrax toxin possesses two different enzymatic components, edema factor (EF), a calcium- and calmodulin-dependent adenylat-cyclase and lethal factor (LF), a zinc-dependent metalloprotease. Protective antigen (PA) is the pore-forming component responsible for binding and translocation. Clostridium botulinum possesses in addition to the well known botulinum toxin (Botox) a variety of other toxins, such as the binary C2 toxin. C2 toxin is composed of the binding and translocation moiety C2II and the enzymatic moiety C2I acting as an actin-ADP-ribosyltransferase. In this study, the mode of translocation and the binding kinetics to the enzymatic component were studied in a biophysical experimental setup. In chapter 2, the binding of the N-terminal fractions EFN and LFN to the PA channel are analyzed in artificial bilayer membranes revealing lower binding affinity compared to full-length EF and LF. Other biophysical properties like voltage-dependency and ionic-strength dependency are not influenced. The results suggest that additional forces are involved in the binding process, than those concerning the N-terminus exclusively, as it was supposed previously. As the treatment of an Anthrax infection with antibiotics is often medicated very late due to the lack of early symptoms, tools to prevent intoxication are required. 4-aminoquinolones like chloroquine are known to block the PA channel, thereby inhibiting intoxication but they also lead to severe side-effects. In chapter 3 new promising agents are described that bind to PA in artificial bilayer systems, elucidating common motives and features which are necessary for binding to PA in general. The possible interaction of Anthrax and C2 toxin is investigated by measuring the binding of one enzymatic component to the respective other toxin’s pore (chapter 4). Interestingly, in vitro experiments using the black lipid bilayer assay show that PA is able to bind to C2I resulting in half saturation constants in the nanomolar range. Furthermore, in vivo this combination of toxin components exhibits cell toxicity in human cell lines. This is first-time evidence that a heterologous toxin combination is functional in in vitro and in vivo systems. In contrast, C2II is able to bind to EF as well as to LF in vitro, whereas in in vivo studies almost no toxic effect is detected. In the case of PA, an N-terminal His6-tag attached to the enzymatic subunit increased the binding affinity (chapter 5). A His6-tag attached to not related proteins also led to high binding affinities, providing the possibility to establish PA as a general cargo protein. In chapter 6 a set of different molecules and proteins is summarized, which are either related or not related to binary toxins, PA is able to bind. In first line, the presence of positive charges is found to be responsible for binding to PA which is in accordance to the fact that PA is highly cation selective. Furthermore, we present evidence that different cationic electrolytes serve as a binding partner to the PA channel. In the last decade another toxin has aroused public attention as it was found to be responsible for a rising number of nosocomial infections: Clostridium difficile CDT toxin. The mode of action of the enzymatic subunit CDTa is similar to C2I of C2 toxin, acting as an ADP-ribosylating toxin. The channel forming and binding properties of CDT toxin are studied in artificial bilayer membranes (chapter 7). We found that two different types of channels are formed by the B component CDTb. The first channel is similar to that of iota toxin’s Ib of Clostridium perfringens with comparable single channel conductance, selectivity and binding properties to the enzymatic subunit CDTa. The formation of this type of channel is cholesterol-dependent, whereas in the absence of cholesterol another kind of channel is observed. This channel has a single channel conductance which is rather high compared to all other binary toxin channels known so far, it is anion selective and does not show any binding affinity to the enzymatic component CDTa. The results reveal completely new insights in channel formation properties and the flexibility of a pore-forming component. Additionally, these findings suggest further possibilities of toxicity of the pore forming component itself which is not known for any other binary toxin yet. Therefore, the pathogenic role of this feature has to be studied in detail., Die Fähigkeit, Toxine zu produzieren, ist unter verschiedensten Bakterienstämmen sehr verbreitet. Zu diesen Toxinen zählt auch die Familie der binären AB-Toxine, die hauptsächlich von Bakterien der Gattung Bacillus und Clostridium gebildet werden. Charakteristisch für diese bakteriellen Proteintoxine ist der Wirkungsmechanismus der Zellintoxikation. Eine porenformende Untereinheit B bindet eine enzymatische Untereinheit A und transportiert diese in das Zytosol von Zielzellen, die dort tödliche Wirkung entfalten. Es wird angenommen, dass die einzelnen Komponenten an sich nicht toxisch sind, sondern nur in Kombination Zellvergiftung auslösen. Anthrax-Toxin, das von dem Gram-positiven Bakterium Bacillus anthracis produziert wird, ist das bekannteste und am besten untersuchte binäre Toxin, besonders seit es im Jahr 2001 als Biowaffe eingesetzt wurde. Im Gegensatz zu anderen binären Toxinen besitzt das Anthrax-Toxin zwei enzymatische Komponenten: Edema Factor (EF), eine kalzium- und calmodulinabhängige Adenylatzyklase, und Lethal Factor (LF), eine zinkabhängige Metalloprotease. Protective Antigen (PA) ist die porenformende Komponente, die für die Binding und die Translokation der enzymatischen Untereinheiten verantwortlich ist. Clostridium botulinum produziert neben dem bekannten Botulinumtoxin (Botox) eine Reihe weiterer Toxine, unter anderem das binäre C2 Toxin. Dieses besteht aus der Binde- und Translokationskomponente C2II und der enzymatischen Komponente C2I, die als ADP-Ribosyltransferase fungiert. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit werden der Translokationsmechanismus und die kinetischen Bindeeigenschaften dieser Toxine biophysikalisch untersucht. In Kapitel 2 wird die Bindung der N-terminalen Fragmente EFN und LFN an den PA-Kanal in künstlichen Lipidmembranen analysiert. Obwohl die Spannungs- und Ionenstärkeabhängigkeit unverändert sind, weisen die verkürzten Proteine deutlich geringe Bindeaffinitäten zu PA im Vergleich zu den vollständigen Proteinen auf. Die Ergebnisse zeigen, dass, anders als bisher angenommen, weitere Kräfte als die zwischen dem N-Terminus und dem PA-Kanal eine Rolle für die Bindung der enzymatischen Komponente spielen. Da bei einer Anthraxinfektion häufig keine frühen Symptome sichtbar sind, erfolgt die Behandlung mit Antibiotika in der Regel relativ spät. Daher werden neue Wirkstoffe benötigt, um einer Intoxikation vorzubeugen. Es ist bekannt, dass 4-Aminoquinolone, wie zum Beispiel Chloroquin, in der Lage sind, die PA-Pore zu blockieren und somit eine Zellvergiftung zu verhindern, allerdings haben diese Wirkstoffe starke Nebenwirkungen. In Kapitel 3 werden neue, vielversprechende Wirkstoffe beschrieben, die an PA binden können und Aufklärung darüber geben, welche Eigenschaften für die Bindung an PA im Allgemeinen verantwortlich sind. Des Weiteren wird untersucht, ob eine Kreuzreaktion zwischen den Komponenten des Anthrax- und C2-Toxins möglich ist (Kapitel 4). Dazu wird die Bindung einer enzymatischen Komponente an die Pore des entsprechenden anderen Toxins gemessen. Interessanterweise ergeben in vitro Experimente an künstlichen Lipidmembranen, dass PA an C2I bindet und in vivo Vergiftungen an humanen Zelllinien auslöst. Damit wird zum ersten Mal gezeigt, dass eine heterologe Toxinkombination sowohl in vitro als auch in vivo funktionell ist. C2II hingegen ist zwar in der Lage, EF und LF zu binden, die Transportrate in Zielzellen ist jedoch sehr gering. Im Fall von PA bewirkt ein N-terminaler His6-tag, der an die enzymtischen Einheiten gekoppelt ist, eine Erhöhung der Bindeaffinität, beschrieben in Kapitel 5. Dies ist sowohl für nah verwandte Proteine der Fall als auch für Proteine, die nicht im Zusammenhang mit binären Toxinen stehen. Somit eröffnet sich die Möglichkeit, PA als universelles Transportprotein zu nutzen. In Kapitel 6 werden verschiedene Moleküle und Proteine beschrieben, die in der Lage sind, an PA zu binden. Vor allem positive Ladungen scheinen für die Bindung an PA-Kanäle verantwortlich zu sein, was mit der Tatsache, dass PA stark kationenselektiv ist, im Einklang steht. Des Weiteren wird zum ersten Mal beschrieben, dass verschiedene Kationen selbst als Bindepartner fungieren können. Seit einigen Jahren ist ein weiteres Toxin in den Fokus der Öffentlichkeit gerückt, da es zunehmend für nosokomiale Infektionen verantwortlich gemacht wird: CDT-Toxin von Clostridium difficile. Wie das C2-Toxin besitzt CDT-Toxin ADP-Ribosyltransferaseaktivität, was zu irreversiblen Schäden des Aktin- Zytoskeletts und somit zum Zelltod führt. Die biophysikalischen Eigenschaften, betreffend Porenbildung und Bindeaffinität des CDT-Toxins werden in Kapitel 7 beschrieben. Wir zeigen, dass die B Komponente CDTb fähig ist, zwei unterschiedliche Kanäle zu bilden. Einer dieser Kanäle ist dem des Iota-Toxins von Clostridium perfringens ähnlich, die Einzelkanalleitfähigkeit, Selektivität und Bindeeigenschaften sind vergleichbar. Die Bildung dieses Kanals ist abhängig von Cholesterin, wohingegen in Abwesenheit von Cholesterin überwiegend ein anderer Kanal geformt wird. Dieser zeigt eine für einen binären Toxinkanal ungewöhnlich hohe Einzelkanalleitfähigkeit, der Kanal ist anionselektiv und weist keinerlei Bindeaffinität zu der enzymatischen Komponente CDTa auf. Die Ergebnisse offenbaren neue Einblicke in die Formierung von Toxinkanälen und deuten darauf hin, dass dieses Toxin durch die Flexibilität der Kanalbildung möglicherweise zusätzliche Fähigkeiten besitzt, Zellintoxikation auszulösen. Dennoch ist die physiologische und pathogene Rolle dieser Eigenschaft noch weitestgehend ungeklärt und bedarf intensiver Untersuchung.