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Incidence Rate (IR) of Dengue fever in east and southwest Sumba district in 2015 amounted to 10.7‰ and 12.95‰ respectively. The phenomenon which is often found during this time is the transovarial transmission of the dengue virus in Ae. aegypti mosquitoes. The purpose of this research was to determine the presence of viral infections in Ae. aegypti mosquitoes through transovarial. It was a descriptive study with a cross-sectional design. The sample was an adult Ae. aegypti mosquito that is 8 to 10 days old. Dengue virus in mosquito body was checked by using immunocytochemical method Streptavidin Biotin Peroxidase Complex (ISBPC) at headsquash preparation. The resultshowed that the transovarial infection presence in male and female Ae. aegypti in East and Southwest Sumba District with Transovarial Infection Rate (TIR) in females and males ranging from 41.67%-41.92 and 25.00 – 50.00% respectively. The female and males mosquitoes TIR in East Sumba district were ranging from 20.00%-40.00% and 35.00%-40.00% respectively. East and Southwest Sumba districts are a high potential area for the transmission of dengue hemorrhagic fever with the presence of dengue virus in Ae. aegypti. Abstrak Incidence Rate (IR) Demam Berdarah Dengue di Kabupaten Sumba Barat Daya dan Kabupaten Sumba Timur pada tahun 2015 masing-masing sebesar 10,7‰ dan 12,95‰. Fenomena yang sering ditemukan selama ini adalah transmisi trans-ovari virus dengue pada nyamuk Ae. aegypti. Tujuan penelitian adalah untuk mengetahui adanya infeksi virus dengue pada nyamuk Ae. aegypti melalui trans-ovari. Penelitian ini merupakan studi deskriptif dengan desain potong lintang. Sampelnya adalah nyamuk Ae. aegypti dewasa yang telah berumur delapan sampai 10 hari. Pemeriksaan virus Dengue dalam tubuh nyamuk menggunakan metode Imunositokimia Streptavidin Biotin Peroxidase Complex (ISBPC) pada sediaan headsquash. Hasil penelitian infeksi virus dengue pada Ae. aegypti betina maupun jantan di Kabupaten Sumba Barat Daya menunjukkan adanya infeksi virus dengue melalui trans-ovari dengan Transovarial Infection Rate pada nyamuk betina berkisar antara 41,67% - 41,92, dan pada nyamuk jantan 25,00 – 50,00%. Transovarial Infection Rate di Kabupaten Sumba Timur pada nyamuk betina yang berkisar antara 20,00% - 40,00% dan pada nyamuk jantan 35,00% - 40,00%. Kesimpulannya Kabupaten Sumba Barat Daya dan kabupaten Sumba Timur merupakan daerah yang berpotensi untuk terjadinya penularan DBD dengan ditemukannya infeksi virus dengue pada nyamuk Ae. aegypti betina maupun jantan.

Objective: Evaluate the messenger RNAs (mRNA) PIWI proteins expression during infection with VDEN 4 in human hepatocyte cells. Materials and Methods: VDEN4 strain H778494 (JQ513335) was used, which was stored in Aedes albopictus cell culture (Clone C6 / 36) at the Arbovirology and Hemorrhagic Fevers section of the Evandro Chagas Institute. The techniques of cell cultures, stock (C6/36), inoculation, extraction, viral load quantification, RTqPCR and statistical analyzes were performed at the Viral Biogenesis Laboratory. Results: According to the results obtained, two cells (HepG2 and Huh7.5) demonstrated a higher level of viral replication at 72 hours post infection (hpi). The PIWI 2 target alter its mRNA expression during VDEN4 infection. The PIWI 4 target expression, was observed an altered expression in the infected cells. Thus, it was found that they are in different poles, while the viral load in the first three days showed high expression. The expression of mRNA was low in relation to the normal rate given by the uninfected cells. Conclusion: In our findings, it was observed that PIWI2 and 4 proteins have an inverse relationship to the viral infection process by VDEN4, when there is an increase in viral replication, these two proteins end up having a significant reduction in their expression. Probably, this reduction of expression is involved with the biogenesis process of apoptosis-regulating microRNAs. Objetivo: Evaluar la expresión de los ARN mensajeros (ARNm) de las proteínas PIWI durante la infección por VDEN 4 en células de hepatocitos humanos. Materiales y Métodos: Se utilizó la cepa VDEN4 H778494 (JQ513335), la cual se almacenó en cultivo celular de Aedes albopictus (Clon C6 / 36) en la colección de la sección de Arbovirología y Fiebres Hemorrágicas del Instituto Evandro Chagas. Las técnicas de cultivo celular, stock (C6/36), inoculación, extracción, cuantificación de carga viral, RTqPCR y análisis estadísticos se realizaron en el Laboratorio de Biogénesis Viral de la misma sección. Resultados: De acuerdo con los resultados obtenidos, se observó que dos células (HepG2 and Huh7.5), demostraron un mayor nivel de replicación viral a las 72 horas post infección (hpi). Se ha demostrado que la diana PIWI 2 altera su expresión de RNAm durante la infección por VDEN4. En la expresión de la diana PIWI 4, se observó una expresión alterada en las células infectadas. Así, se encontró que se encuentran en polos diferentes, mientras que el título viral en los primeros tres días mostró alta expresión, la expresión de RNAm fue baja en relación a la tasa normal dada por la muestra no infectada. Conclusión: en nuestros hallazgos se observó que las proteínas PIWI2 y 4 tienen una relación inversa con el proceso de infección viral por VDEN4, es decir, cuando hay un aumento en la replicación viral, estas proteínas terminan teniendo una reducción significativa en su expresión. . Estos datos terminan por llevarnos a considerar que esta reducción de expresión está involucrada en el proceso de biogénesis de los microRNA reguladores de la apoptosis. Objetivo: Avaliar a expressão dos RNAs mensageiros (mRNA) das proteínas PIWI durante a infecção por VDEN 4 em células de hepatócitos humano. Materiais e Métodos: Foi utilizada a cepa H778494 (JQ513335) do VDEN4 que se encontrava estocada em cultura de células Aedes albopictus (Clone C6/36) no acervo da seção de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas. As técnicas de cultivos celulares (C6/36, HepG2 e Huh7.5), estoque (C6/36), inoculação, extração, quantificação de carga viral, RTqPCR e análises estatísticas foram todas realizadas no Laboratório de Biogênese Viral da mesma seção. Resultados: De acordo com os resultados obtidos observou-se que duas células HepG2 e Huh7.5) demonstraram um maior nível de replicação viral a 72 horas pós infecção (hpi). O alvo PIWI 2 demonstrou que altera sua expressão de mRNA durante a infecção por VDEN4. Na expressão do alvo PIWI 4 foi observado uma expressão alterada nas células infectadas. Assim, verificou-se que os mesmos se encontram em polos diferentes, enquanto o titulo viral nos três primeiros dias apresentaram alta expressão, a expressão de mRNA foi baixa em relação a taxa normal dada pela amostra não infectada. Conclusão: Em nossos achados observou-se que as proteínas PIWI2 e 4 possuem uma relação inversa ao processo de infecção viral por VDEN4, isto é, quando ocorre um aumento da replicação viral essas duas proteínas acabam por ter uma redução significante de sua expressão. Estes dados acabam por nos levar a considerar que esta redução da expressão está envolvida com o processo de biogênese de microRNAs reguladores de apoptose.

As arboviroses causadas pelo vírus Dengue (DENV) e Zika (ZIKV), são atualmente consideradas doenças que representam um potencial desafio para a saúde pública, resultando em intensas e limitantes manifestações clínicas, podendo culminar em microcefalia (ZIKV) e óbito. Ainda não existem vacinas na rede pública ou qualquer outra droga preventiva, o diagnóstico é impreciso devido as reações cruzadas entre os anticorpos de DENV, ZIKV e de outros flavivírus. Diante desse contexto, objetivamos desenvolver e também testar novas moléculas baseadas em pequenos peptídeos (fagos) ligantes ao vírus ZIKV e DENV-2 utilizando a metodologia Phage-Dispay. Assim, o objetivo do presente estudo foi selecionar, caracterizar e validar ligantes de ZIKV e DENV-2, bem como testar fagos miméticos a um inibidor de fosfolipase A2 avaliando a capacidade dessas moléculas em inibir e também diferenciar ZIKV e DENV. O imunoensaio ELISA, ensaio de inibição da entrada de ZIKV e DENV-2 in vitro por citometria de fluxo utilizando células Vero e anticorpo 4G2 e análises in sílico foram utilizados para a validação dos fagos selecionados. Também foi realizado ELISA utilizando amostras de pacientes infectados com DENV e ZIKV. Notavelmente, os fagos testados foram capaz de diferenciar DENV de ZIKV e de indivíduos saudáveis. A acurácia no diagnóstico foi determinada pela curva ROC. O fago D4, selecionado para ZIKV, foi capaz de inibir a entrada de ZIKV e DENV-2. O fago F12, também selecionado para ZIKV, não foi capaz de inibir a entrada de ZIKV, entretanto foi capaz de discriminar pacientes de DENV de pacientes de ZIKV e indivíduos saudáveis (p

Zika and Dengue viruses have spread, due to globalisation, to all continents which lie at least in part in the subtropic and tropic climatic zones. This spread of these viruses is a reason of an increasing number of severe diseases caused by them. New drugs, which would be effective against these infections, could be an answer to this challenge. Various viral proteins, among them also viral helicase, which is the topic of this bachelor thesis, can be a suitable drug target. The task was to prepare expression constructs for production of recombinant helicases of Zika and Dengue viruses via the suitable bacterial strain Escherichia coli. Several constructs derived from plasmid pET-16b were prepared with inserted helicase of Zika and Dengue viruses. One of them was used for the preparation of recombinant purified helicase of Zika virus, that will be used for further research. [IN CZECH] Keywords: Flavivirus, Zika virus, Dengue virus, helicase, expression, purification, enzyme activity [IN CZECH]

Objective: A study with a theoretical-experimental approach applied to the gene expression of DENV DNA forms in mammalian cells, compared to the presence of fragments originating from viral RNA described in the literature in arthropod cells, experimentally infected by DENV. Methodology: This is a bilateral study, of a theoretical-experimental nature, with a primary intervention basis, carried out in vitro, under a comparative technical approach. Laboratory techniques for gene expression by conventional PCR, verification procedures for analysis and literature data records were obtained and processed at the Viral Biogenesis Laboratory, linked to the Arbovirology and Hemorrhagic Fevers Sector of the Evandro Chagas Institute. Results: Experimental analysis indicated the presence of DENV-4 DNA forms in cells persistently infected by inoculation at 72 hpi. As a comparative function, C6/36 cells presented viral DNA sequences incorporated in regions of LTR retrotransposons, thus allowing to suggest that most integration events are mediated by reverse transcriptases derived from retrotransposons. Conclusion: Given the results demonstrated, it becomes evident the need for studies that characterize the ability of viral RNA to be converted into DNA forms, as well as the influence of this characteristic on the permanence of these fragments after infection, to which proteins these genes belongs, how these genes modify and interact in viral replication and the relationship of pathogenicity and tropism associated with post-mutation protein molecular plasticity, during viral replication. Objetivo: Estudio con enfoque teórico-experimental aplicado a la expresión génica de formas de DNA de DENV en células de mamífero, comparado con la presencia de fragmentos provenientes de RNA viral descritos en la literatura en células de artrópodos, infectados experimentalmente por DENV. Metodología: Se trata de un estudio bilateral, de carácter teórico-experimental, con base de intervención primaria, realizado in vitro, bajo un enfoque técnico comparado. En el Laboratorio de Biogénesis Viral, vinculado al Sector de Arbovirología y Fiebres Hemorrágicas del Instituto Evandro Chagas, se obtuvieron y procesaron técnicas de laboratorio de expresión génica por PCR convencional, procedimientos de verificación para análisis y registros de datos bibliográficos. Resultados: El análisis experimental indicó la presencia de formas de DNA de DENV-4 en células infectadas persistentemente por inoculación a 72 hpi. Como función comparativa, las células C6 / 36 presentaron secuencias de DNA viral incorporadas en regiones de retrotransposones LTR, lo que permite sugerir que la mayoría de los eventos de integración están mediados por transcriptasas inversas derivadas de retrotransposones. Conclusión: Dados los resultados demostrados, se evidencia la necesidad de estudios que caractericen la capacidad del RNA viral para convertirse en formas de DNA, así como la influencia de esta característica en la permanencia de estos fragmentos después de la infección, a qué proteínas estos genes pertenece, cómo estos genes modifican e interactúan en la replicación viral y la relación de patogenicidad y tropismo asociados con la plasticidad molecular de la proteína posmutación, durante la replicación viral. Objetivo: Estudo com abordagem teórico-experimental aplicada à expressão gênica de formas de DNA do DENV em células de mamíferos, comparada à presença de fragmentos oriundos de RNA viral descritos na literatura em células de artrópodes, experimentalmente infectadas pelo DENV. Metodologia: Trata-se de um estudo bilateral, de natureza teórico-experimental, com base na intervenção primária, realizado in vitro, sob uma abordagem técnica comparativa. Técnicas laboratoriais de expressão gênica por PCR convencional, procedimentos de verificação para análise e registros de dados da literatura foram obtidos e processados ​​no Laboratório de Biogênese Viral, vinculado ao Setor de Arbovirologia e Febres Hemorrágicas do Instituto Evandro Chagas. Resultados: A análise experimental indicou a presença de formas de DNA de DENV-4 em células infectadas persistentemente por inoculação a 72 hpi. Como função comparativa, as células C6 / 36 apresentaram sequências de DNA viral incorporadas em regiões de retrotransposons LTR, permitindo sugerir que a maioria dos eventos de integração são mediados por transcriptases reversas derivadas de retrotransposons. Conclusão: Diante dos resultados demonstrados, fica evidente a necessidade de estudos que caracterizem a capacidade do RNA viral de ser convertido em formas de DNA, bem como a influência dessa característica na permanência desses fragmentos após a infecção, para quais proteínas esses genes pertence, como esses genes modificam e interagem na replicação viral e a relação da patogenicidade e tropismo associada à plasticidade molecular da proteína pós-mutação, durante a replicação viral.

Resumen Introducción: El dengue perinatal es una patología de la que poco se sabe, los reportes disponibles describen riesgo de resultados perinatales adversos. Objetivo: Reportar un caso de dengue perinatal, como diagnóstico diferencial de sepsis neonatal, que debe tenerse en cuenta en zonas endémicas. Caso clínico: Recién nacido de una mujer de 23 años quien a las 36 semanas de gestación presentó cuadro de dengue con antígeno Non-Structural Protein 1 (NS1) positivo y anticuerpos anti-dengue negativos. Al sexto día de enfermedad dio a luz a un recién nacido sano, quien, al segundo día de vida, presentó fiebre sin otros hallazgos patológicos al examen físico, asociado a trombocitopenia severa (17.900 plaquetas/uL) y aumento de la proteína C reactiva, antígeno viral NS1 positivo e in-munoglobulina G (IgG) anti dengue positiva. Fue manejado con antibióticoterpia con ampicilina y gentamicina por protocolo de la institución para sepsis neonatal probable. El neonato mostró me joría clínica, con estabilidad hemodinámica y aumento significativo de plaquetas, siendo dado de alta. Conclusiones: El dengue en el embarazo trae consigo el riesgo de resultados perinatales adver sos, particularmente bajo peso al nacer y parto pre-término. Los hijos de madres diagnosticadas con dengue al final del embarazo deberían ser observados estrechamente con realización de hemograma seriado en los primeros días de vida, debido al riesgo de transmisión vertical.

90 p., El virus Dengue, transmitido por insectos del género Aedes sp, causa la mayor arbovirosis del planeta. Norte de Santander, considerado zona endémica, ocupa el quinto puesto a nivel Nacional reportando 6.034 casos. La mayoría de las infecciones son asintomáticas facilitando su no percepción, actualmente no se cuenta con información sobre prevalencia de Dengue en la comunidad UDES, requiriéndose del conocimiento del estado de éste evento infeccioso en nuestra comunidad en fortalecimiento de la vigilancia epidemiológica; por lo cual el presente trabajo propuso determinar la asociación de la respuesta humoral IgG a Flavivirus Dengue en relación con variables sexo, edad y área de formación, en estudiantes de primer semestre de la Universidad de Santander, Cúcuta, Colombia durante los años 2018 y 2019, mediante un estudio de campo longitudinal con nivel correlacional, partiendo de una población de 86 estudiantes de primer semestre de la Universidad de Santander (UDES) Campus Cúcuta, seleccionados aleatoriamente (consintiendo participar de manera voluntaria) con un rango de edades de 15-30 años. El estudio se realizó en dos fases, fase I (análisis al momento de la vinculación al estudio) y fase II (análisis 1 año después de la vinculación al estudio). En la fase I se determinó seroprevalencia al agente infeccioso y en la fase II el cambio del estado serológico (seroconversión) de los individuos inicialmente seronegativos. Como resultado, en la fase I se obtuvo la seroprevalencia frente al virus Dengue, la cual fue 75,6%, resaltando que la seropositividad fue mayor en la Facultad de Ciencias de la Salud obteniendo el 78,0%. En la segunda fase se evidenció la seroconversión en el 50,0% de la población evaluada, resaltando que el 35,7% pertenecía a programas académicos de la Facultad de Ciencias de la Salud., Dengue virus, transmitted by insects of the genus Aedes sp, causes the largest arbovirosis on the planet. Norte de Santander, considered an endemic zone, occupies fifth place at the national level, reporting 6,034 cases. The majority of infections are asymptomatic, facilitating their non-perception, currently there is no information on the prevalence of Dengue in the UDES community, requiring knowledge of the status of this infectious event in our community in strengthening epidemiological surveillance; Therefore, the present work proposed to determine the association of the IgG humoral response to Flavivirus Dengue in relation to variables sex, age and training area, in first semester students of the University of Santander, Cúcuta, Colombia during the years 2018 and 2019 , through a longitudinal field study with a correlational level, based on a population of 86 first-semester students of the University of Santander (UDES) Campus Cúcuta, randomly selected (consenting to participate voluntarily) with an age range of 15-30 years. The study was carried out in two phases, phase I (analysis at the time of linking to the study) and phase II (analysis 1 year after linking to the study). In phase I, seroprevalence to the infectious agent was determined and in phase II the change in the serological status (seroconversion) of the initially seronegative individuals. As a result, seroprevalence against Dengue virus was obtained in phase I, which was 75.6%, highlighting that seropositivity was higher in the Faculty of Health Sciences obtaining 78.0%. In the second phase, seroconversion was evident in 50.0% of the population evaluated, highlighting that 35.7% belonged to academic programs of the Faculty of Health Sciences., Pregrado, Bacteriólogo(a) y Laboratorista Clínico, Pag. INTRODUCCION 17 1. PROBLEMA 19 1.1 PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 19 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA 22 1.3 OBJETIVO 22 1.3.1 Objetivo General 22 1.3.2 Objetivos Específicos 22 1.4 JUSTIFICACIÓN 23 2.0 MARCO REFERENCIAL 25 2.1 ANTECEDENTES 25 2.2 MARCO TEORICO 30 2.3 MARCO CONCEPTUAL 33 2.7 OPERACIONALIZACION DE LAS VARIABLES 41 3.0 MARCO METODOLÓGICO 43 3.1 TIPO DE INVESTIGACIÓN 43 3.1.1 Nivel de investigación 43 3.1.2 Diseño de la investigación 43 3.2 MATERIALES MÉTODOS 43 3.3 POBLACIÓN Y MUESTRA 44 3.3.1 Población 44 3.3.2 Muestra 44 3.4 VALIDEZ Y CONFIABILIDAD 44 3.5 TÉCNICAS E INSTRUMENTOS DE RECOLECCIÓN DE DATOS 45 3.6 TÉCNICAS DE PROCESAMIENTO Y ANÁLISIS DE DATOS 45 4. ANÁLISIS E INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS 46 4.1 RESULTADOS 46 4.1.1 DATOS GENERALES FASE I 46 4.1.2 Identificación del área de formación de la población objeto de estudio mediante el instrumento de recolección de datos. 48 4.1.3 Determinación de la seroprevalencia de respuesta IgG frente a virus Dengue en estudiantes de primer semestre de la Universidad de Santander. 50 4.1.4 DATOS GENERALES FASE II 54 4.1.5 Determinación de la seroconversión de respuesta IgG frente a virus Dengue en estudiantes de primer semestre de la Universidad de Santander, campus Cúcuta, un año después de su ingreso a la Universidad, mediante ensayo inmunoenzimático. 57 4.2 DISCUSIÓN 60 5. CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES 63 5.1 CONCLUSIONES 63 5.2 RECOMENDACIONES 64 LISTA DE TABLAS Tabla 1. Edad, Sexo y estrato socioeconómico de los estudiantes evaluados. 46 Tabla 2. Distribución según programa académico 49 Tabla 3. Seroprevalencia IgG Anti - NS1. 51 Tabla 4. Seroprevalencia IgG Anti - proteína E. 51 Tabla 5. Correlación según variables de interés (Fase I). 53 Tabla 6. Edad, Sexo y estrato socioeconómico de los estudiantes evaluados. 55 Tabla 7. Seroconversión según la Facultad perteneciente 57 Tabla 8. Correlación según variables de interés (Fase II). 59 LISTA DE ILUSTRACIONES Ilustración 1. Coordenadas geográficas Universidad de Santander 40 Ilustración 2. Entrada Principal Universidad de Santander 40 Ilustración 3. Toma de muestra. 88 Ilustración 4. Firma de la encuesta y consentimiento informado. 88 Ilustración 5.Recom Line Tropical Fever IgG 88 Ilustración 6. Procesamiento técnica LIA 88 Ilustración 7. Resultados de la Técnica (Fase II). 88 LISTA DE GRÁFICAS GRÁFICA 1. Presencia de signos y síntomas 47 GRÁFICA 2. Diagnóstico, conocimiento del vector y evidencia de la presencia de este en el lugar de residencia 48 GRÁFICA 3. Distribución según facultad. 50 GRÁFICA 4. Seropositividad en Primera toma de muestra. 52 GRÁFICA 5. Diagnóstico, evidencia de la presencia del vector en el lugar de residencia y la Universidad. 56 GRÁFICA 6. Distribución según facultad, segunda muestra. 57 ANEXOS ANEXO 1. PROCEDIMIENTO Y PROTOCOLO PARA TOMA DE MUESTRAS SANGUÍNEAS. 73 ANEXO 2. DETERMINACIÓN CUALITATIVA DE ANTICUERPOS IgM E IgG PARA VIRUS DENGUE. 78 ANEXO 3. ENCUESTA FASE I 85 ANEXO 4. ENCUESTA FASE II 87 ANEXO 5. EVIDENCIAS FOTOGRAFICAS 88, Ej. 1

RESUMEN La quinasa dependiente de ciclina 5 (CDK5) regula diversas funciones en neuronas, células endoteliales y epiteliales, entre ellas la dinámica del citoesqueleto. Así mismo, se ha reportado que componentes del citoesqueleto, tales como, filamentos de actina y microtúbulos juegan un rol importante durante la infección por el virus dengue (DENV). El objetivo del presente trabajo fue evaluar por dos métodos, inhibición química y silenciamiento génico, la participación de CDK5 durante la infección por DENV-2. La actividad antiviral de roscovitina fue evaluada usando ensayos de Unidades Formadoras de Placa (PFU). La eficiencia de transfección y el silenciamiento de CDK5, empleando miARNs artificiales, se determinó por citometría de flujo. El efecto sobre la proteína de envoltura viral y elementos del citoesqueleto se evidenció mediante microscopia avanzada de fluorescencia y análisis de imágenes. Roscovitina mostró actividad antiviral en etapas pre y post-infectivas en una forma dependiente de la dosis. El tratamiento con roscovitina y miRCDK5 mostró ser efectivo reduciendo la cantidad de CDK5 en células no infectadas. En células infectadas y transfectadas con miRCDK5, así como tratadas con el inhibidor, se observó una reducción significativa de la proteína de envoltura viral; sin embargo, no se encontró reducción significativa de CDK5. Además, el tratamiento con roscovitina indujo cambios celulares morfológicos evidentes en células infectadas. Los resultados indican la potencial participación de CDK5 durante la infección por DENV-2, posiblemente mediando la traducción proteica o la replicación del genoma viral a través de la regulación de la dinámica del citoesqueleto. Se requieren datos adicionales para esclarecer la mecanística del fenómeno usando métodos alternativos. ABSTRACT Cyclin-Dependent Kinase 5 (CDK5) regulates several functions in neurons, endothelial, and epithelial cells, including the cytoskeleton dynamics. Likewise, it has been reported that some cytoskeleton elements, such as actin filaments and microtubules, play an essential role during Dengue virus (DENV) infection. This work aimed to evaluate the role of CDK5 during DENV-2 infection by two methods, chemical inhibition, and gene silencing. The antiviral activity of roscovitine was evaluated using Plaque Forming Units (PFU) assay. The transfection efficiency and knockdown of CDK5, using artificial miRNAs, was carried out by flow cytometry. The effect on the viral envelope protein and cytoskeleton elements was evidenced by advanced fluorescence microscopy and image analysis. Roscovitine showed antiviral activity in pre and post-infection stages in a dose-dependent manner. Treatment with roscovitine and miRCDK5 decrease the amount of CDK5 in uninfected cells. In cells infected and transfected with miRCDK5, as well as treated with the inhibitor, a significant reduction of the viral envelope protein was observed; however, no significant reduction of CDK5 was found. Also, evident morphological cellular changes were observed during the treatment with roscovitine in infected cells. The results indicate the potential participation of CDK5 during DENV-2 infection, possibly mediating protein translation or replication of the viral genome through the cytoskeletal dynamics regulation. Additional data are required to clarify the mechanistic of these phenomena using alternative methods.

Embora uma vacina contra a dengue tenha se tornado disponível recentemente e o teste de sua eficácia, e respectiva cobertura, esteja sendo realizado em vários lugares, o controle de vetores continua sendo o único método efetivo para prevenir a transmissão do vírus da dengue (DENV). A vigilância entomológica é fator chave para alertar as autoridades sobre possíveis surtos; até agora a infecção natural por DENV em populações de mosquitos tem sido pouco utilizada como sistema de alerta precoce. O objetivo deste estudo foi pesquisar os vírus Dengue em adultos e imaturos (larvas) de Aedes aegypti e Aedes albopictus em áreas urbanas no estado do Rio Grande do Norte, Brasil. Formas de insetos imaturos (larvas ) foram coletadas de abril de 2011 a março de 2012, enquanto a coleta de adultos foi realizada ao longo de três anos, no período de maio de 2011 a abril de 2014. Os RNAs virais das amostras foram extraídos e o foi realizado o teste Nested Reverse Transcriptase PCR, para detecção e tipagem dos DENV. Dos 1.333 insetos imaturos coletados durante o período do estudo, 1.186 (89%) foram A. aegypti e 147 (11%) A. albopictus. O DENV-4 foi identificado em pools de larvas de A. aegypti. A taxa de infecção por DENV em imaturos de A. aegypti foi expressa como MIR = 3,37. O DENV não foi detectado em imaturos de A. albopictus. Um total de 1.360 fêmeas adultas do gênero Aedes foram capturadas entre maio de 2011 e abril de 2014. Desse total, 1.293 eram A. aegypti (95%) e 67 A. albopictus (5%). Dos 130 pools estudados, 27 (20,7%) foram positivos para DENV. O DENV-1 foi identificado em 2/27 (7,4%) pools; 1 de A. albopictus e 1 de A. aegypti. O DENV-2 foi identificado em apenas 1/27 (3,7%) dos pools de A. aegypti. O DENV-4 foi o mais prevalente, identificado em 24/27 (88,8%) dos pools positivos, sendo 19 de A. aegypti e 5 de A. albopictus. A taxa mínima de infecção para adultos do gênero Aedes foi de 19,8, considerando tanto A. aegypti quanto A. albopictus.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz A infeção por vírus dengue consiste numa arbovirose categorizada como uma das principais responsáveis pela morbilidade e mortalidade constatadas nas regiões tropicais e subtropicais, especialmente nos países pertencentes à Ásia e à América Central e do Sul. A disseminação dos vetores e do vírus tem acrescido nos últimos anos devido a várias condições como alterações climáticas, aumento de viagens para países endémicos e urbanização. Várias medidas têm sido efetuadas no âmbito da mitigação de ambos os fatores, como a implementação de técnicas de controlo químico e biológico para os mosquitos e recentemente a vacinação contra o vírus, existente em vários países endémicos. Contudo, devido ao uso excessivo de métodos químicos nos mosquitos e à inexistência de agentes antivirais, tem-se pesquisado e desenvolvido estratégias alternativas, nomeadamente a utilização de plantas medicinais. A fitoterapia constitui uma área que combina conhecimento tradicional com métodos de pesquisa e desenvolvimento fitoquímico, com o intuito da criação de novas abordagens terapêuticas e profiláticas. Plantas medicinais como Cissampelos pareira Linn compreende atividades farmacológicas muito distintas, desde ação analgésica e antipirética até antivírica. O progresso científico alcançado nesta área pode criar uma cura para esta patologia.

Resumen Introducción: El dengue perinatal es una patología de la que poco se sabe, los reportes disponibles describen riesgo de resultados perinatales adversos. Objetivo: Reportar un caso de dengue perinatal, como diagnóstico diferencial de sepsis neonatal, que debe tenerse en cuenta en zonas endémicas. Caso clínico: Recién nacido de una mujer de 23 años quien a las 36 semanas de gestación presentó cuadro de dengue con antígeno Non-Structural Protein 1 (NS1) positivo y anticuerpos anti-dengue negativos. Al sexto día de enfermedad dio a luz a un recién nacido sano, quien, al segundo día de vida, presentó fiebre sin otros hallazgos patológicos al examen físico, asociado a trombocitopenia severa (17.900 plaquetas/uL) y aumento de la proteína C reactiva, antígeno viral NS1 positivo e in-munoglobulina G (IgG) anti dengue positiva. Fue manejado con antibióticoterpia con ampicilina y gentamicina por protocolo de la institución para sepsis neonatal probable. El neonato mostró me joría clínica, con estabilidad hemodinámica y aumento significativo de plaquetas, siendo dado de alta. Conclusiones: El dengue en el embarazo trae consigo el riesgo de resultados perinatales adver sos, particularmente bajo peso al nacer y parto pre-término. Los hijos de madres diagnosticadas con dengue al final del embarazo deberían ser observados estrechamente con realización de hemograma seriado en los primeros días de vida, debido al riesgo de transmisión vertical. Abstract Introduction: Few reports are available about perinatal dengue, with controversial results in regards the risk of perinatal outcome. Objective: To report a case of perinatal dengue as a differential diagno sis with neonatal sepsis, which must be considered in endemic areas. Clinical case: Male newborn of a 23 year-old female, who presented a Non-Structural Protein 1 (NS1) antigen positive to dengue at 36 weeks of gestation and negative anti-dengue antibodies. At day six of the illness a healthy newborn was born. On the second day of life the neonate presented fever with no other pathological findings on the physical exam, associated with severe thrombocytopenia (17,900 platelets/uL), increased C-reactive protein, a positive NS1 antigen, and positive anti-dengue immunoglobulin G (IgG). He was treated with ampicillin and gentamicin according the Institution protocol of neonatal sepsis. The newborn showed clinical improvement, with hemodynamic stability and significant increase of platelets, receiving the medical discharge. Conclusions: Dengue in pregnancy produces the risk of adverse perinatal outcomes, particularly low birth weight and preterm delivery. Children of mothers diagnosed with dengue at the end of pregnancy should be observed closely with serial hemograms during child's first days of life, due to the high risk of vertical transmission.

El dengue, causada por el virus dengue (DENV), es una de las enfermedades más importantes no sólo por los altos índices de morbilidad/mortalidad, sino también por su gran impacto económico y social en los países de las regiones tropicales/subtropicales. La infección por el DENV cursa por un variado rango de manifestaciones clínicas que van desde una infección asintomática o con síntomas leves, hasta el dengue grave que puede ser fatal. En la actualidad, no se dispone de un tratamiento etiológico y tampoco de una vacuna eficaz mundialmente distribuida, contra los 4 serotipos del DENV. A pesar de los grandes esfuerzos orientados a entender el mecanismo asociado con la patogénesis de la enfermedad, aún no se ha logrado esclarecer de forma definitiva las causas que conllevan a las formas graves de enfermedad. Algunas hipótesis buscan dar una explicación biológica y fisiológica a las manifestaciones clínicas que se presentan durante la infección. Dado que una de ellas sugiere que luego del contacto con las células dendríticas el DENV altera su funcionalidad, la presente revisión tiene como objetivo describir los hallazgos más relevantes referentes a la importancia de dichas células en el marco de la infección por el DENV y progresión de la enfermedad. Dengue fever, caused by dengue virus (DENV) infection, is one of the most important diseases in the world, not only due to the high morbidity/mortality rates it causes, but also because of its great economic and social impact in tropical/subtropical countries. DENV infection has a wide range of clinical manifestations ranging from asymptomatic infection or infection with mild symptoms to severe dengue that can lead to death. At present, no etiological treatment or effective globally distributed vaccine against the four DENV serotypes exists. Despite great efforts made to understand the mechanism associated with DENV disease pathogenesis the causes leading to severe dengue presentation have not been clarified. Some hypotheses seek to give a biological and physiological explanation to the clinical manifestations that appear during the infection. Based on the evidence that after contact with dendritic cells DENV alters the functionality of these cells, this review aims to describe the most relevant findings regarding the importance of dendritic cells in the context of DENV infection and progression of the illness.

El dengue, causada por el virus dengue (DENV), es una de las enfermedades más importantes no sólo por los altos índices de morbilidad/mortalidad, sino también por su gran impacto económico y social en los países de las regiones tropicales/subtropicales. La infección por el DENV cursa por un variado rango de manifestaciones clínicas que van desde una infección asintomática o con síntomas leves, hasta el dengue grave que puede ser fatal. En la actualidad, no se dispone de un tratamiento etiológico y tampoco de una vacuna eficaz mundialmente distribuida, contra los 4 serotipos del DENV. A pesar de los grandes esfuerzos orientados a entender el mecanismo asociado con la patogénesis de la enfermedad, aún no se ha logrado esclarecer de forma definitiva las causas que conllevan a las formas graves de enfermedad. Algunas hipótesis buscan dar una explicación biológica y fisiológica a las manifestaciones clínicas que se presentan durante la infección. Dado que una de ellas sugiere que luego del contacto con las células dendríticas el DENV altera su funcionalidad, la presente revisión tiene como objetivo describir los hallazgos más relevantes referentes a la importancia de dichas células en el marco de la infección por el DENV y progresión de la enfermedad.

A dengue é uma arbovirose que afeta o homem, gerando uma problemática na saúde pública do mundo, especialmente em países tropicais os quais apresentam condições que favorecem a disseminação do mosquito Aedes aegypti. Atualmente, dentre as várias estratégias para controle da doença, ainda não se tem uma vacina eficaz ou um antiviral capaz de combater essa infecção. Assim, o objetivo do presente estudo foi avaliar a atividade antiviral de extratos obtidos da folha e frutos da planta Morinda citrifolia L. em cultura de células Vero infectadas com vírus dengue-2 (DENV-2). Inicialmente foram obtidos os extratos brutos (hidroetanólico) e as respectivas frações: hexano, clorofórmio e acetato de etila, analisados por cromatografia. O teste de citotoxicidade do extrato bruto, resíduo aquoso e frações foram realizados em cultura de células Vero pelo método MTT, nas concentrações de 1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,2 μg/mL. O ensaio antiviral foi conduzido através das seguintes estratégias: células infectadas com DENV-2 (controle positivo); células mantidas com meio de cultura (controle negativo); células infectadas com DENV-2 e tratadas com o extrato ou frações. Após cinco dias de infecção a viabilidade celular foi avaliada pelo método de MTT e o sobrenadante da cultura foi utilizado para quantificação viral por unidade formadora de placa (PFU). Os resultados demonstraram que a análise cromatográfica dos extratos e frações revelou bandas distintas e sugestivas de saponinas, terpenos e flavonoides. Tais extratos e frações não foram tóxicos para as culturas de células, com exceção do tratamento das células com a fração clorofórmio obtido da folha e as frações hexano e acetato de etila do fruto verde, levando a uma viabilidade próxima de 65%. No ensaio antiviral o controle positivo apresentou viabilidade celular em torno de 60% após cinco dias de infecção. No tratamento com os compostos obtidos da folha observou-se que ao adicionar a fração de acetato de etila às células infectadas, estas mantiveram uma viabilidade celular próximo a 100% na concentração de 1000μg/mL e a 85% nas concentrações de 500 e 250μg/mL. O tratamento com a fração hexano apresentou uma viabilidade superior ao controle positivo em todas as concentrações. No entanto, na fração clorofórmio, a viabilidade manteve-se elevada apenas nas concentrações de 500 e 250μg/mL. O extrato bruto e a fração residual aquosa não demonstraram atividade antiviral. As células tratadas com o extrato e as diferentes frações obtidas dos frutos maduro e verde, apresentaram de um modo geral uma viabilidade celular próxima de 100% nas concentrações de 500 e 1000 μg/mL no fruto maduro e apenas 1000 μg/mL no fruto verde, com exceção das células que foram tratadas com a fração clorofórmio, na qual não foi possível observar nenhuma diferença significativa quando comparado ao controle positivo. Na quantificação viral observou-se que as células tratadas com as frações hexano e clorofórmio obtidos da folha e também os extratos brutos obtidos dos frutos maduro e verde tiveram ação antiviral, resultando na diminuição total da carga viral. Finalmente, a partir desse estudo podemos identificar uma possível atividade antiviral dos compostos obtidos de Morinda citrifolia contra o vírus dengue. Dengue is an arbovirosis which affects mankind, causing problems in the public health worldwide, especially in tropical countries which present conditions that favor the spread of the mosquito Aedes aegypti. Currently, among the various strategies to control the disease, there is no effective vaccine or antiviral capable of combating this infection. Thus, the aim of the present study was to evaluate the antiviral activity of leaf and fruit extracts of the plant Morinda citrifolia L. in Vero cells culture infected with dengue-2 virus (DENV-2). Initially, the crude extracts (hydroethanolic) and their fractions were obtained: hexane, chloroform and ethyl acetate, followed by chromatographic analysis. The cytotoxicity test of the crude extract, the aqueous residue and its fractions were performed in culture of Vero cells by the MTT method, at concentrations of 1000; 500; 250; 125; 62.5; 31.2 μg/mL. The antiviral assay results were conducted through the following strategies: cells infected with DENV-2 (positive control); cells maintained with culture medium (negative control); cells infected with DENV-2 and treated with the extract or fractions. After five days of infection, cell viability was evaluated by the MTT method and culture supernatant was used for viral quantification by plaque forming unit (PFU) assay. The results showed that the chromatographic analysis of extracts and fractions present distinct bands, which could be suggestive of saponins, terpenes and flavonoids. Such extracts and fractions were not toxic to cell cultures, except for the cells treated with the chloroform fraction obtained from leaf, hexane and ethyl acetate fractions of the green fruit, leading to a near 65% viability. In the antiviral assay the positive control had 60% of cell viability after five days of infection. Among the leaf extract treatments, it was observed that infected cells treated with ethyl acetate fraction, maintained their cell viability around 100% in the concentration of 1000μg/mL and up to 85% in the concentrations of 500 and 250μg/mL. The hexane fraction treatment showed higher viability in comparison to the positive control at all concentrations. However, in the chloroform fraction, viability remained high only at concentrations of 500 and 250 μg/mL. Crude extract and residual aqueous fraction did not show any antiviral activity. Cells treated with the extract and different fractions obtained from the mature and green fruits, presented an overall cell viability close to 100% in 500 and 1000 μg/mL in the mature fruit and only 1000 μg/mL in the green fruit. However, for the cells treated with the chloroform fraction, it was not possible to observe any significant difference when compared to the positive control. In the viral quantification it was observed that cells treated with hexane and chloroform fractions obtained from leaf, as well as crude extracts obtained from mature and green fruits had antiviral effect, resulting in a total viral load decrease. Finally, identified from this study, a possible antiviral activity of the compounds obtained from Morinda citrifolia against dengue virus.

Oligonucleotídeos são pequenas moléculas de ácidos nucleicos com grande potencial biotecnológico para aplicação em diversas áreas da biologia e da medicina. Entre suas principais aplicações está a identificação genética de patógenos por meio da técnica de PCR e a produção de aptâmeros com efeito bioativo ou farmacológico. Nesse contexto, a produção e o desenho de oligonucleotídeos são pontos críticos para sua aplicação. A técnica mais utilizada para a produção de oligonucleotídeos de DNA é a síntese química. Apesar de sua eficácia, esta técnica não pode ser realizada in house, tornando o usuário totalmente dependente de um fornecedor. Este trabalho teve como objetivo desenhar novos oligonucleotídeos com potencial para diferentes aplicações, desenvolver um método para produzi-los, e validar a sua aplicação em um protocolo para detecção de Flavivírus por meio da técnica de reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). Na primeira etapa do trabalho, um conjunto de primers universais para identificação de Flavivírus foi desenvolvido. Para isso, 1442 genomas completos de diferentes representantes do gênero Flavivirus foram alinhados para seleção de regiões conservadas (CRs). Foram selecionadas 26 CRs, as quais permitiram o desenho de 76 primers universais. Entre eles, foi escolhido o par de primers com a melhor condição de degeneração e temperatura de anelamento para validação do protocolo de RT-PCR in vitro, o qual tem o potencial de amplificar um fragmento da proteína NS5 de 800-806 pb de tamanho. O fragmento gerado é suficientemente variável para discriminar potencialmente qualquer espécie do gênero Flavivirus por sequenciamento. Uma vez determinado o fragmento que seria amplificado para detecção universal de Flavivírus, procedeu-se uma nova etapa para desenho de primers específicos. Desta vez, o produto de amplificação gerado pelos primers universais foi definido como alvo, no intuito de produzir cinco novos primers específicos para identificação do vírus Zika e dos quatro sorotipos do vírus Dengue. Dessa forma, foi desenvolvido um sistema de semi-nested RT-PCR no qual, em um primeiro passo, é detectada a presença de qualquer espécie do gênero Flavivirus e, em um segundo passo, pela adição de um conjunto de primers específicos, é permitida à amplificação de fragmentos de tamanhos diferentes para discriminação do vírus Zika e dos quatro sorotipos de dengue em gel de agarose. Na segunda etapa do trabalho, foi desenvolvido um método enzimático para produção de oligonucleotídeos de DNA. O método proposto é baseado na rolling circle amplification (RCA) e envolve quatro etapas enzimáticas: (1) fosforilação da extremidade 5’ da sequência alvo, (2) circularização da sequência alvo, (3) polimerização de uma nova fita simples de DNA contendo os oligonucleotídeos de interesse e, por fim, (4) um ensaio de restrição para liberar os oligonucleotídeos. Todas as etapas foram realizadas em um único tubo, adicionando as enzimas com suas respectivas soluções-tampão. Os oligonucleotídeos gerados foram separados utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida 8% (PAGE) e visualizados por coloração em prata. Potencialmente, qualquer oligonucleotídeo que não tenha bases degeneradas pode ser produzido pelo método enzimático proposto em um único tubo de reação. Para ilustrar, foi apresentada a produção de três variações do aptâmero 31-TBA, um oligonucleotídeo de cadeia simples que tem ação anticoagulante. Oligonucleotides are small molecules of nucleic acids with great biotechnological potential for application in several areas of biology and medicine. The pathogen identification by PCR and the production of aptamers with bioactive or pharmacological effect can be cited among its main applications. In this context, the production and design of oligonucleotides are critical points for their application. The most widely used technique for the production of DNA oligonucleotides is chemical synthesis. Despite its effectiveness, this technique cannot be performed in house, making the user totally dependent on a supplier. This work aimed to design new oligonucleotides with potential for different applications, to develop a method for produce them, and to validate their application in a new protocol for the Flavivirus detection using reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR). In the first stage of the work, a set of universal primers for Flavivirus identification was developed. For this, 1442 complete genomes of different representatives of the genus Flavivirus were aligned for selection of conserved regions (CRs). Twenty-six CRs were selected, allowing the design of 76 universal primers. Among them, it was chosen the primer pairs with the better characteristics related todegeneration and annealing temperature. These primers were used for the standardization of the in vitro RT-PCR protocol, which potentially amplifies an fragment of 800-806 bp in size from the coding region of NS5 protein. This fragment has sufficient variability to discriminate any species of the genus Flavivirus by sequencing. Once the flavivirus detection system was complete, a new step was taken for the design of specific primers. For this, the amplicon generated by the universal primers was defined as a target, in order to produce five new primers for specific identification of Zika virus and the four serotypes of the Dengue virus. Thus, a semi-nested RT-PCR system was developed. In the first step, some species of the genus Flavivirus are detected and in the second step, with the addition of a set of specific primers, are generated fragments of different sizes for discrimination between Zika virus and four dengue virus serotypes by agarose electrophoresis. In the second stage of the work, an enzymatic method for the production of DNA oligonucleotides was developed. The proposed method is based on rolling circle amplification (RCA) and involves four enzymatic steps: (1) phosphorylation of the 5 'end of the target sequence, (2) circularization of the target sequence, (3) polymerization of a new single strand of DNA containing the oligonucleotides of interest and, finally, (4) a restriction assay to release the oligonucleotides. All steps were performed in a single tube, adding the enzymes with their respective buffer solutions. The oligonucleotides produced were resolved using 8% polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and visualized by silver staining. Potentially, any oligonucleotide that has no degenerate bases can be produced by the proposed enzymatic method in a single tube. To illustrate, the production of three variations of aptamer 31-TBA, a single chain oligonucleotide having anticoagulant action, was presented.

89 p. Cd, Los Virus Dengue (DENV), el Virus del Chikungunya (CHIKV) y el Virus Zika (ZIKV) son trasmitidos por el mismo vector, lo que resulta en la co-circulación de estos tres virus en las mismas regiones geográficas, aumentando la posibilidad de coinfecciones. El objetivo de este estudio fue identificar las cepas circulantes y calcular la prevalencia de co-infecciones en el municipio Villa del Rosario (Norte de Santander). Para lograr esto, con previo aval de bioética y consentimiento informado, se recolectaron muestras de suero de pacientes que presentaban fiebre menor de 7 días y con diagnóstico clínico compatible con alguna de estas tres enfermedades virales. Se extrajo el ARN de los sueros, posteriormente se realizó la retrotranscripción (RT) para obtener el cDNA, el cual fue utilizado como plantilla para la identificación de DENV y CHIKV (por PCR convencional) y ZIKV (por Real Time PCR). Las muestras positivas para DENV fueron serotipificadas y algunas muestras positivas para DENV y CHIKV fueron secuenciadas. Los resultados demostraron que 82 pacientes fueron positivos para uno o más virus: 33 (21.02%) para DENV, 47 (29.94%) para CHIKV y 29 (18.47%) para ZIKV. Adicionalmente, se encontró co-infección entre ellos: la prevalencia de co-infección DENV/CHIKV, DENV/ZIKV y CHIKV/ZIKV fue del 7.64%, 6.37% y 5.10%, con tasas de ataque de 14.90, 12.42 y 9.93 casos por cada 100.000 habitantes, respectivamente. Por otro lado, se encontraron tres pacientes co-infectados con los tres virus (prevalencia del 1.91%) con una tasa de ataque de 4.96 casos por 100.000 habitantes. Este estudio demuestra la simultánea co-circulación de DENV, CHIKV y ZIKV y sus co-infecciones en la región nororiente de Colombia., Dengue virus (DENV), Chikungunya virus (CHIKV) and Zika virus (ZIKV) are transmitted by the same vector, resulting in the co-circulation of these three viruses in the same geographic regions, increasing the possibility of co-infections. The objective of this study was to identify circulating strains and estimate the prevalence of co-infections in the municipality of Villa del Rosario (Norte de Santander). To achieve this, prior endorsement of bioethics and informed consent, serum samples from patients with fever less than 7 days and with clinical diagnosis compatible with any of these three viral diseases were collected. RNA was extracted from sera subsequently reverse transcription (RT) was performed to obtain cDNA, which was used as a template for identifying DENV and CHIKV (conventional PCR) and ZIKV (real-time PCR). DENV-positive samples were serotyped, and some of those positive for DENV and CHIKV were sequenced. The results showed that eighty-two patients were positive for one or more viruses: 33 (21.02%) for DENV, 47 (29.94%) for CHIKV and 29 (18.47%) for ZIKV. In addition, co-infection among them was found: the prevalence of DENV/CHIKV, DENV/ZIKV, and CHIKV/ZIKV co-infection was 7.64%, 6.37%, and 5.10%, with attack rates of 14.90, 12.42, and 9.93 cases per 100,000 inhabitants, respectively. Furthermore, three patients were found to be co-infected with all three viruses (prevalence of 1.91%), with an attack rate of 4.96 cases per 100,000 inhabitants. Our results demonstrate the simultaneous cocirculation of DENV, CHIKV, ZIKV and their co-infections in the northeastern region of Colombia., Maestría, Magister en Investigación en enfermedades Infecciosas, TABLA DE CONTENIDO 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................. 1 1.1 DENGUE ............................................................................................... …… 1 1.1.2 Agente etiologico, DENV..........................................................................2 1.1.2 Ciclo de replicación viral .......................................................................... 4 1.1.3 Patogénesis ................................................................................................ 5 1.1.4 Manifestaciones clínicas del Dengue ........................................................ 6 1.2. FIEBRE DEL CHIKUNGUNYA ................................................................... 7 1.2.1 Agente etiologico, CHIKV.........................................................................8 1.2.2 Ciclo de replicación viral........................................................................... 9 1.2.3 Patogénesis..................................................................................................9 1.2.4 Manifestaciones clinicas de la fiebre del Chikungunya........................ ...10 1.3. FIEBRE ZIKA .............................................................................................. 10 1.3.1. Agente etiologico, ZIKV ........................................................................ 12 1.3.2. Ciclo de replicación viral ....................................................................... 13 1.3.3 Patogénesis .............................................................................................. 13 1.3.4 Manifestaciones clínicas de la fiebre del Zika ........................................ 13 1.4. CO-INFECCIONES ...................................................................................... 14 2. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA Y JUSTIFICACION………………...16 3. OBJETIVOS ........................................................................................................ 18 3.1 Objetivo general ......................................................................................... 18 3.2 Objetivos especificos ................................................................................. 18 4. MATERIALES Y MÉTODOS ............................................................................ 19 4.1. MATÉRIALES ............................................................................................. 19 4.1.1 Kit de extracción de ARN. ...................................................................... 19 4.1.2. Kit de sintesis de cDNA ......................................................................... 19 4.1.3. Master Mix ............................................................................................. 20 4.1.4.Taqman .................................................................................................... 20 4.1.5 Otros materiales ..................................................................................... 20 4.1.6. Equipos ................................................................................................... 21 4.2. MÉTODOS ................................................................................................... 22 4.2.1 Recolección de muestras ......................................................................... 22 4.2.1.1 Diseño del estudio ................................................................................ 22 4.2.1.2 Población y tamaño de la muestra ........................................................ 23 4.2.1.3 Criterios de inclusión ........................................................................... 23 4.2.1.4 Confidencialidad .................................................................................. 23 4.2.1.5 Toma de muestras sanguineas .............................................................. 24 4.2.2 Aislamiento de ARN de las muestras de suero ....................................... 24 4.2.3 Sintesis de cDNA .................................................................................... 25 4.2.4 Identificación molecular DENV ............................................................. 25 4.2.4.1 Serotipificación DENV ........................................................................ 25 4.2.5 Identificación molecular CHIKV ............................................................ 26 4.2.6 Identificación molecular ZIKV ............................................................... 27 4.2.7 Secuenciación .......................................................................................... 27 4.2.8 Construcción de arboles filogenéticos .................................................... 27 3.2.9 Análisis de datos ..................................................................................... 28 5. RESULTADOS .................................................................................................... 29 5.1 DESCRIPCIÓN GENERAL DE LA COHORTE ......................................... 29 5.2 DISTRIBUCIÓN TEMPORAL DE LA INFECCIÓN POR DENV, CHIKV y ZIKV ...............................27 5.3 CO-CIRCULACIÓN DE DENV, CHIKV Y ZIKV ...................................... 31 5.3.1 DENV ...................................................................................................... 31 5.3.2 CHIKV .................................................................................................... 32 5.3.3 ZIKV ....................................................................................................... 33 5.4 GENOTIPIFICACIÓN DE VIRUS CO-CIRCULANTES ............................ 34 5.4 CO-INFECCIONES ....................................................................................... 38 6. DISCUSIÓN ........................................................................................................ 41 7. CONCLUSIONES ............................................................................................... 45 8. RECOMENDACIONES………………………………………………………... 46 9.REFERENCIAS .................................................................................................... 47 ANEXOS ................................................................................................................. 54, Ej. 1

El virus dengue (DENV) es un grave problema para la salud pública por su reemergencia en las últimas décadas, ya que en la actualidad casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de infección. A pesar de la creciente incidencia de DENV en el mundo, y en América en particular, al presente no hay quimioterapia específica para el tratamiento de la enfermedad. Las etapas iniciales que conducen a la entrada del virus a la célula son una alternativa atractiva como estrategia antiviral para bloquear el comienzo de la infección. Sin embargo, se ha demostrado que la entrada de DENV es un proceso muy complejo que depende de distintos factores virales y celulares, que a su vez afectan la susceptibilidad antiviral frente a agentes que interfieren con la interacción inicial virus-célula. El presente trabajo de tesis se propuso estudiar la entrada del virus dengue 3 (DENV-3) a células de mamífero y sus posibles implicancias en la terapia antiviral, analizando la acción inhibitoria de carragenanos. Mediante la utilización de inhibidores farmacológicos y moleculares de las diferentes vías endocíticas celulares se demostró que la entrada infecciosa de DENV-3 cepa H87 a células Vero y A549 ocurre por una vía endocítica no clásica, independiente de clatrina, dependiente de pH ácido y dinamina, con una participación parcial de caveolas. Asimismo, se demostró por primera vez en estos sistemas celulares la coexistencia de vías infectivas y no infectivas para la entrada de DENV, situación que podría disminuir la eficiencia de la infección. El tráfico intracelular luego de la entrada de DENV-3 presentó características propias de los virus de penetración tardía hasta completar el proceso de fusión y desnudamiento viral. La evaluación de la dependencia con clatrina para la entrada de DENV-3 a otras líneas celulares humanas, tales como células HepG2, U937 y K562, mostró una respuesta variable según la línea celular. También los resultados fueron variables en la infección a células U937 en presencia o ausencia de anticuerpos contra DENV. Respecto de la actividad antiviral, los carragenanos λ e ι fueron potentes inhibidores de DENV-3, con valores de índice de selectividad (relación citotoxicidad / actividad antiviral) mayores a 1000, excepto en la infección mediada por anticuerpos. El blanco de ambos compuestos fue la entrada del virus a la célula, interfiriendo con la adsorción viral y la internalización de la nucleocápside a partir de los endosomas. La caracterización de la vía de entrada de DENV-3 y de la actividad antiviral de compuestos que bloquean eventos tempranos en la multiplicación del virus aporta conocimientos para dilucidar los mecanismos que regulan la infección viral así como optimizar el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales que sean protectoras ante los cuatro serotipos de DENV, de modo de evitar la progresión a las formas severas y letales de la enfermedad. The reemergence of dengue virus (DENV) in the last decades is a serious threat for public health, since at present almost half the world population is at risk of infection. Instead of the increasing DENV incidence worldwide, and particularly in America, there is no specific chemotherapy for treatment of the disease. The initial stages leading to virus entry into the host cell represent an attractive antiviral strategy for chemotherapy to suppress the beginning of infection. However, DENV entry appears to be a very complex process regulated by several celland virus-dependent factors that may also affect antiviral susceptibility to agents blocking the initial virus-cell interaction. The aim of the present study was to study the entry of dengue 3 (DENV-3) into mammalian cells and the possible relationship with antiviral susceptibility, analyzing the inhibitory action of carrageenans. By using chemical and molecular inhibitors of different endocytic pathways, it was demonstrated that the infectious entry of DENV-3 strain H87 into Vero and A549 cells occurs by a non-classical clathrin-independent endocytosis pathway, which depends on the acid endosomal pH and dynamin, and is partially-mediated by caveolae. Results show for the first time in these cell systems the simultaneous coexistence of infective and non-infective routes for DENV entry into the cell, a phenomenon that may reduce the efficiency of infection. The intracellular trafficking of DENV-3 after uptake was typical of a late-penetrating virus to achieve fusion and viral uncoating. The influence of the clathrin pathway in DENV-3 infective entry in other mammalian cell lines of human origin, such as HepG2, U937 and K562 cells, was also evaluated demonstrating that variable entry pathways are employed depending on the host cell. Furthermore, the entry into U937 cells also when infection occurred in the presence of non neutralizing antibodies. Next, the antiviral susceptibility of DENV-3 to entry inhibitors was evaluated. Both λ and ι carrageenans were potent inhibitors of DENV-3, with selective index values (ratio cytotoxicity / antiviral activity) higher than 1000. However, no inhibition was detected in antibody-mediated infection. The target of these compounds was virus entry by dual blockade of virus adsorption and internalization of the nucleocapsid from the endosomes. The characterization of the entry pathway of DENV-3 and the antiviral activity of compounds that block early events in virus multiplication cycle provides information to elucidate the mechanisms responsible of virus infection as well as to optimize the design of new antiviral therapies protective against the four DENV serotypes, in order to prevent progression to severe and lethal forms of disease. Fil: Piccini, Luana Erica. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales; Argentina.

Los cultivos celulares de mosquitos son frecuentemente utilizados para el aislamiento, identificación y caracterización de arbovirus. Para el estudio de los virus dengue (VDEN) y virus de fiebre amarilla (VFA) se emplean, principalmente, la línea celular C6/36 de Aedes albopictus y la línea celular AP61, obtenida de Aedes pseudoscutellaris. La línea celular de A. aegypti AEGY28, previamente obtenida a partir de tejidos embrionarios del vector, se utilizó en el presente trabajo para evaluar la susceptibilidad a la infección por VDEN y VFA. Para ello, los cultivos celulares se ensayaron a diferente multiplicidad de infección con los aislados clínicos de virus dengue tipo 2 (COL789, MOI: 1 y 5) y VFA (V341, MOI 0,02). Posteriormente se realizó la detección de antígenos virales por la técnica de inmunocitoquímica y su cuantificación por la técnica de CellELISA fluorométrica. Se usaron como controles positivos de infección, tanto células C6/36 como células VERO. Inesperadamente, no se observó inmunoreactividad en las células de A. aegypti infectadas con ambos tipos de virus en ninguno de los MOI o tiempos estudiados. Tampoco se evidenció antígeno por la técnica fluorométrica ni fue posible detectar RNA viral por RTPCR a partir de células infectadas. Por lo tanto, se puede concluir que la línea celular de A. aegypti no es susceptible a la infección por VDEN ni por VFA. Ello podría estar relacionado con características propias de la membrana celular o de la maquinaria enzimática necesaria para la replicación viral Mosquito cell derived cultures are useful tools for arbovirus isolation, identification or characterization. For studying dengue (DENV) and yellow fever viruses (YFV) Aedes albopictus C6/36 or Aedes pseudoscutellaris AP61 cell lines, are normally used. The Aedes aegypti AEGY28 cell line was obtained from embryonic tissues and characterized previously by one of us. In order to evaluate its susceptibility to two Flavivirus, AEGY28 cells were inoculated with different multiplicity of infection (MOI) with type 2 DENV (COL789, MOI: 1 and 5) and YFV clinical isolates (V341, MOI 0,02) then processed at different times post infection (p.i.). Immunostaining and fluorometric cellELISA were carried out to identify and quantify viral antigens. C6/36 and Vero cells were used as positive controls. Unexpectedly, immunoreactivity was not found in inoculated AEGY28 cells, even in higher MOI or late times p.i., therefore antigen quantification using fluorometric cellELISA were not plausible. Reverse transcriptase PCR with specific primers did not detect viral RNA in AEGY28 inoculated cells. We can conclude that Aedes aegypti AEGY28 cell line is not susceptible to dengue and yellow fever Flavivirus, a finding possibly related with the lacking of specific molecules at the plasma membrane or absence of cell machinery necessary for viral replication

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Fil: Carro, Ana C. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas; Argentina. Fil: Carro, Ana C. Universidad de Buenos Aires. Facultad de Ciencias Exactas y Naturales. Departamento de Química Biológica; Argentina At present, a high proportion of world population is at risk of infection with dengue virus (DENV), a pathogen causing either a mild febrile illness or more severe forms of disease, with 2.5 % mortality. Although DENV represents a serious health problem worldwide, no specific chemotherapy or vaccine is currently available. Virus entry is an attractive antiviral strategy to block initiation of infection. For DENV, the mode of entry into the host cell has been studied only in fibroblastic or epithelial cell lines, derived from mammals or mosquitoes, with controversial results. In the present study, the entry of DENV into human myeloid cell lines, a model more representative of the natural infection, was analyzed as well as the relationship between mode of entry and antiviral susceptibility to sulfated polysaccharides. By using biochemical inhibitors of endocytic routes, infectivity titrations by plaque formation, viral RNA determinations by quantitative RT/PCR, fluorescence and electron microscopy, a clathrin, and dynamin, mediated endocytosis was demonstrated for entry of both serotypes DENV 2 strain NGC and DENV 1 strain Hawaii into human myelomonocytic U937 and erithroleukaemic K562 cell lines. When both cells were infected with DENV 2 in the presence of nonneutralizing anti DENV antibodies, conditions which allow an enhancement of infection in vitro and lead to severe forms of disease in vivo, the route of entry was clathrin mediated or not, according to the receptor FcR involved in the infective process. Furthermore, the antiviral activity in both cell systems of carrageenan, a sulfated polysaccharide known to inhibit DENV 2 adsorption and uncoating in Vero cells, was also evaluated. A relationship between antiviral susceptibility to carrageenan and the type of receptor employed for antibody-mediated entry was observed. Finally, studies about the cholesterol dependence for DENV infection have shown that the envelope cholesterol is a critical factor in the fusion process for DENV entry whereas cell membrane cholesterol is not involved. The characterization of the mode of entry in myeloid cells and the role of viral cholesterol contributes to the knowledge of factors involved in DENV infection and the design and usage of new and more effective antiviral therapies. Actualmente, casi la mitad de la población mundial se encuentra en riesgo de contraer virusdengue (DENV), agente patógeno que puede causar una infección aguda febril autolimitada o progresara formas más severas de enfermedad, con una tasa de mortalidad de 2,5 %. A pesar de representar ungrave problema para la salud pública, no existen vacunas ni quimioterapias disponibles para DENV. Laentrada del virus a la célula huésped es una interesante estrategia antiviral ya que permite bloquear elcomienzo de la infección viral. En el caso de DENV, sólo se ha estudiado hasta el presente el modo deentrada en líneas celulares epiteliales o fibroblásticas de mamíferos y de mosquito, con resultadoscontroversiales. El presente trabajo de tesis se enfocó en el estudio del mecanismo de entrada de estepatógeno a células mieloides humanas, más representativas de la infección natural, y la implicancia quepudiese tener en la quimioterapia antiviral. Mediante la utilización de inhibidores químicos de lasdistintas vías endocíticas, medida de infectividad por formación de placas, determinaciones de RNAviral por RT PCR en tiempo real y técnicas de microscopía de fluorescencia y electrónica, se demostróque los dos serotipos DENV 1 cepa Hawaii y DENV 2 cepa NGC utilizan una vía clásica de endocitosisdependiente de clatrina y dinamina para entrar en células humanas U937, de origen monocítico, yK562, de origen ertitroleucémico. En la infección de ambas células en presencia de anticuerpos noneutralizantes anti DENV, condiciones en que hay incremento de la infección in Vitro y puedenexplicarse las formas más severas de la enfermedad in vivo, se observó que DENV 2 utiliza diferentesvías de entrada, mediadas o no por clatrina, según el receptor Fc R involucrado en el proceso. Tambiénse evaluó en los mismos sistemas la actividad antiviral del carragenano , polisacárido sulfatado queinhibe la adsorción e internalización de DENV 2 en células Vero, encontrándose también una relaciónentre la susceptibilidad antiviral y el tipo de receptor empleado para la entrada mediada poranticuerpos. Finalmente, se realizó un estudio de la dependencia de colesterol para la infección conDENV, concluyendo que el contenido adecuado de colesterol en la envoltura viral, no así en lamembrana celular, sería determinante para lograr la fusión de ambas membranas y alcanzar unainfección productiva. La caracterización de la vía de entrada en células mieloides y el rol del colesterolviral aporta nueva información para comprender los factores involucrados en la infección de DENV yfavorecer el diseño y utilización de nuevas terapias antivirales más efectivas.

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq A dengue é uma doença infecciosa aguda, geralmente transmitida por mosquitos Aedes aegypti. O agente etiológico pertence à família Flaviviridae, gênero Flavivirus e compreende quatro sorotipos antigenicamente relacionados, porém distintos: DENV-1, 2, 3 e 4. No Brasil, a doença representa um problema de saúde pública nacional. O objetivo do presente estudo foi descrever os aspectos epidemiológicos da dengue no Estado do Rio Grande do Norte, no período de 2013 a 2014. Um total de 483 amostras de sangue ou soro, no período de Janeiro de 2013 a Dezembro de 2014, foi estudado pela metodologia de RT-PCR para a detecção e tipagem viral. A infecção foi confirmada em 36,44% (176/483) dos casos estudados. Este estudo detectou a circulação de três sorotipos do vírus da dengue no Rio Grande do Norte, DENV-1, 2 e 4. O sorotipo predominante em 2013-2014 foi o DENV-4, representando 83,51% (81/97) e 68,35% (54/79) dos casos positivos, respectivamente. Em relação à distribuição espacial, a maioria dos casos ocorreu em Natal e Caicó, com 9,28% (9/97) e 18,99% (15/79), respectivamente. Os meses com maior circulação viral no RN foram Março, em 2013 e Maio, em 2014. O sexo feminino foi o mais acometido, representando 69,07% (67/97) em 2013 e 54,43% (43/79) em 2014. A faixa etária mais acometida foi a de 21-30 anos (2013) e a de 11-20 anos (2014), com 25,77% (25/97) e 20,25% (16/79) dos casos positivos, respectivamente. A análise filogenética indicou que o genótipo V (DENV-1) e o genótipo II (DENV-4) circularam no Estado. Nossos resultados fornecem informações sobre a dinâmica dos DENV no Rio Grande do Norte, importantes para o desenvolvimento de estratégias de controle da doença. Dengue is an acute infectious disease, usually transmitted by Aedes aegypti mosquitoes. The etiologic agents belong to the family Flaviviridae, genus Flavivirus, and occur as four antigenically related but distinct serotypes designated DENV-1, 2, 3, and 4. In Brazil, the disease represents a national public health problem. The purpose of the present study was to describe epidemiological aspects of dengue in the State of Rio Grande do Norte, from 2013 to 2014. A total of 483 blood or serum samples, collected from January 2013 to December 2014, were studied by RT-PCR for viral detection and typing. The infection was confirmed in 36.44% (176/483) of the cases studied. This study detected the circulation of three serotypes of dengue virus in Rio Grande do Norte, DENV-1, 2, and 4. The predominant serotype in 2013-2014 was the DENV-4, representing 83.51% (81/97) and 68.35% (54/79) of the positive cases, respectively. Regarding the spatial distribution, most of the cases occurred in Natal and Caicó, with 9.28% (9/97) and 18.99% (15/79), respectively. The months with the biggest viral circulation in RN were March 2013 and May 2014. The female gender was the most affected, representing 69.07% (67/97) in 2013 and 54.43% (43/79) in 2014. The most affected age groups were 21-30 years (2013) and 11-20 years (2014) with 25.77% (25/97) and 20.25% (16/79) positive cases, respectively. Phylogenetic analysis indicated that genotype V (DENV-1) and genotype II (DENV-4) circulated in the State. Our results provide information about the dynamics of DENV in the Rio Grande do Norte, important for the development of disease control strategies.

INTRODUCÃO: A dengue é uma arbovirose que vem causando sérios problemas de saúde pública, em regiões tropicais e subtropicais do planeta. MÉTODOS: Neste estudo, foram investigadas amostras de sangue de crianças, através da RT-PCR, com o intuito de se identificar sorotipos do vírus dengue nessa população infantil, em Manaus/AM, durante o ano de 2008. RESULTADOS: O DENV-3 foi o único sorotipo viral identificado. CONCLUSÕES: No presente estudo, 83% das crianças analisadas apresentaram resultado negativo para dengue através do RT-PCR sugerindo a ocorrência de outras doenças febris que necessitam ser esclarecidas.

Dengue infections represent one of the most prevalent arthropod-borne diseases worldwide, causing a wide spectrum of clinical outcomes. Engineered infectious clone is an important tool to study Dengue virus (DENV) biology. Functional full-length cDNA clones have been constructed for many positive-strand RNA viruses and have provided valuable tools for studying the molecular mechanisms involved in viral genome replication, virion assembly, virus pathogenesis and vaccine development. We report herein the successful development of an infectious clone from a primary Brazilian isolate of dengue virus 3 (DENV3) of the genotype III. Using a two-plasmid strategy, DENV3 genome was divided in two parts and cloned separately into a yeast-bacteria shuttle vector. All plasmids were assembled in yeast by homologous recombination technique and a full-length template for transcription was obtained by in vitro ligation of the two parts of the genome. Transcript-derived DENV3 is infectious upon transfection into BHK-21 cells and in vitro characterization confirmed its identity. Growth kinetics of transcript-derived DENV3 was indistinguishable from wild type DENV3. This system is a powerful tool that will help shed light on molecular features of DENV biology, as the relationship of specific mutations and DENV pathogenesis. As infecções causadas por dengue representam uma das mais prevalentes doenças transmitidas por artrópodes mundialmente, causando um amplo espectro de manifestações clínicas. A tecnologia de clones infecciosos é uma importante ferramenta para o entendimento da biologia do vírus da dengue (DENV). Clones de cDNA infeccioso têm sido construídos para muitos vírus de RNA com cadeia positiva e são ferramentas valiosas para o estudo dos mecanismos moleculares envolvidos na replicação do genoma viral, montagem da partícula viral, patogênese viral, e desenvolvimento de vacinas. No presente trabalho, nós descrevemos o desenvolvimento de um clone infeccioso baseado num isolado primário brasileiro do vírus Dengue sorotipo 3 (DENV3), genótipo III. Usando uma estratégia de dois plasmídeos, o genoma viral foi dividido em duas partes e os fragmentos gerados foram clonados separadamente num vetor shuttle levedura-bactéria. Os plasmídeos foram construídos pela técnica de recombinação homóloga em levedura e a transcrição do genoma completo foi realizada a partir ligação in vitro das duas partes do genoma. O transcrito de DENV3 se mostrou infeccioso quando transfectado em células BHK-21 e a identidade do clone infeccioso foi confirmada por caracterização in vitro. A cinética de crescimento do DENV3 gerado neste sistema foi indistinguível do vírus parental. Este sistema representa uma poderosa ferramenta que ajudará na elucidação de aspectos moleculares da biologia do DENV bem como no estudo de mutações associadas com patogênese do DENV.

No existen modelos animales apropiados para el estudio de la fisiopatología y las manifestaciones clínicas de la enfermedad causada por la infección con virus dengue, por lo que para ello se requiere desarrollar modelos experimentales. El propósito del presente trabajo fue establecer un modelo de infección in vitro con virus dengue serotipo-2 (DENV-2). Para esto se obtuvieron células mononucleares de sangre periférica (CMSP) usando un gradiente de Ficoll, y se las cultivó e infectó con DENV-2 a una baja multiplicidad de infección. La subpoblación celular que se infectó y produjo citocinas se identificó empleando un análisis multiparamétrico por citometría de flujo. Como resultado, las CMSP fueron permisivas a la infección, que se detectó a las 24 horas de inoculado el virus. Además, en este mismo tiempo, los monocitos CD14+, pero no los linfocitos CD3+ o CD19+, fueron la subpoblación celular preferencialmente infectada y responsable de la producción de TNF-α e IL-6. En conclusión, se estableció un modelo de infección in vitro usando CMSP no fraccionadas, en el que se identificó a los monocitos CD14+ como la principal célula blanco de la infección con DENV-2 y productora de citocinas proinflamatorias. To date, there are no appropriate animal models for the study of the pathophysiology and clinical manifestations of the disease caused by dengue virus infection; therefore, experimental models are required for that purpose. The objective of the present work was to establish a model of in vitro infection with DENV-2. To this end, human peripheral blood mononuclear cells (PBMC) were obtained using a Ficoll gradient, and infected with DENV-2 using a low multiplicity of infection. The cell populations infected and responsible for the production of cytokines were identified using a multiparametric analysis by flow cytometry. As a result, PBMC were permissive to infection that was detected 24 hours after virus inoculation. Additionally, at this same time, CD14+ cells, but not CD3+ or CD19+ cells, were preferentially infected and responsible for the production of TNF-α and IL-6. In conclusion, we established a model of in vitro infection using unfractionated PBMC, in which CD14+ cells were identified as the primary target cells for infection with DENV-2, and the production of proinflammatory cytokines.