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As Doenças Falciformes (DF) são hemoglobinopatias hereditárias que ocasionam dor aguda e danos progressivos em múltiplos órgãos e tecidos do corpo devido à expressão da Hemoglobina S (HbS). A HbS no estado desoxigenado acarreta deformação das hemácias, levando à rigidez da membrana celular. Isto ocasiona complicações como inflamação crônica, bloqueio dos vasos sanguíneos e hemólise intravascular. Atualmente, os tratamentos convencionais envolvem transfusões sanguíneas e o uso de fármacos, como a hidroxiuréia, para induzir a produção de Hemoglobina Fetal (HbF). Uma possibilidade de cura é o transplante de Células-Tronco Hematopoiéticas (CTH), no entanto, essas abordagens apresentam muitas limitações e efeitos colaterais. Este projeto propõe o desenvolvimento de uma terapia gênica com vetores epissomais, incorporando elementos de replicação autônoma do tipo Região de Ancoramento de Matrix, do inglês Scaffold/Matrix Attachment Region (S/MAR), com elementos para o silenciamento gênico do gene BCL11A, um repressor da expressão de γ-globina (formadora da HbF), além da inserção e expressão de uma β-globina modificada (β-SA3), que impede a polimerização da HbS. Essa estratégia visa superar desafios associados aos vetores epissomais convencionais e vetores virais, proporcionando estabilidade e persistência prolongada do material genético de forma segura nas células-alvo, buscando o desenvolvimento de uma terapia eficaz. Para isso, plasmídeos contendo S/MAR estão sendo sintetizados de modo a silenciar o BCL11A, expressar β-SA3 e combinar estas duas estratégias, para posterior transdução via eletroporação em células K562 e células-tronco hematopoiéticas. Estas células serão diferenciadas em eritrócitos e terão amostras coletadas ao longo do processo para análises de proliferação, morfologia, viabilidade, imunofenotipagem, níveis de HbF, além de expressão gênica (qPCR) e proteica (western blot) de reguladores da hematopoiese. Até o momento, um grupo controle, composto por K562 não transduzidas, foram testadas para padronização dos experimentos e métodos de diferenciação. Essas células passaram por diferentes técnicas de avaliação morfológica pelo método cytospin e tiveram seus padrões de proliferação, apoptose, enucleação, diferenciação e expressão de HbF mensurados via citometria de fluxo. Também foram testadas quanto a expressão de diferentes marcadores celulares como o CD105; CD235a; CD71; CD233; CD44; CD49d; CD43; CD146 e CD123. Os resultados morfológicos e de citometria de fluxo mostraram que o processo de diferenciação se iniciou, porém estão sendo testadas padronizações nos métodos de cultivo e de eletroporação, para a etapa de transdução com as construções de edição e adição gênica. Após as análises, espera-se definir um protocolo de modificação celular ex vivo com as construções de maior modulação de HbF e β-SA3 para testes in vivo. Apoio Financeiro: FUNDHERP, CTC/FAPESP (2013/08135-2), INCTC/CNPq (465539/2014-9), CAPES (88887.899641/2023-00).

O desenvolvimento de terapias alogênicas (off-the-shelf) utilizando o Receptor Quimérico de Antígeno (CAR) visa reduzir limitações das terapias autólogas, como a necessidade de compatibilidade HLA e aumento do tempo de espera do paciente em razão do tempo de manufatura. Nesse contexto, as células NK podem ser utilizadas como uma fonte alogênica, visto que não dependem de compatibilidade HLA, possuem alta capacidade citotóxica exercendo atividade antitumoral por meio de seus mecanismos fisiológicos e produzem menos efeitos colaterais. As células NK podem ser utilizadas como um produto de uso clínico imediato para atender maior demanda de pacientes. Apesar do grande sucesso das imunoterapias utilizando CAR, o tratamento de tumores sólidos ainda é um grande desafio. O microambiente tumoral contém barreiras físicas e metabólicas que dificultam a entrada e sobrevivência das células do sistema imune, uma das razões é a presença de células imunossupressoras, como as células T reguladoras (Treg). Estas células possuem o receptor GITR e a interação com seu ligante GITRL pode inibir a ação supressora das Treg e fornecer um sinal co-estimulatório para células T e NK. Assim, o presente estudo visa avaliar um CAR anti o antígeno GD2, o qual tem sido amplamente estudado devido à sua alta expressão em tumores sólidos como neuroblastoma e melanoma. No entanto, os ensaios clínicos apresentam resultados insatisfatórios, devido a falta de persistência e potência das células T e um microambiente tumoral imunossupressor. Partimos da hipótese de que a combinação de um CAR anti GD2 com a expressão de GITRL pode aumentar o potencial citotóxico em tumores sólidos e inibir Treg. As células NK-CAR foram geradas, caracterizadas e os ensaios de citotoxicidade in vitro por meio de co-cultivo com as células GD2+ foram realizados pelos métodos de citometria de fluxo e bioluminescência. Ambas as NK-CAR obtiveram pureza de 96% sem perda de expressão com o tempo. A cinética de crescimento mostrou que ambas as células CAR obtiveram resultados superiores em relação à NK-92, que obteve fator de expansão de 225 vezes, enquanto as CARs de 600 (antiGD2) e 800 (antiGD2-GITRL). O ensaio de citotoxicidade com a linhagem de neuroblastoma SH-SY5Y (GD2+) foi realizado durante 12 e 24 horas e analisadas por citometria de fluxo. Tanto na proporção 1:1 quanto 3:1 (alvo:efetora) as células CAR tiveram maior citotoxicidade em relação ao controle (30%‒40%) mesmo com a presença de mais células alvo do que efetoras. Pelo método de bioluminescência foi utilizada a linhagem de melanoma SK-MEL28-S6 (GD2+). Neste ensaio, observou-se que as células NK-92 não apresentaram capacidade citotóxica. Por outro lado, as células CAR-antiGD2 manifestaram níveis de citotoxicidade de 15% (após 24 horas) e 60% (após 48 horas), enquanto as células CAR-antiGD2-GITRL exibiram taxas de citotoxicidade de 40% (após 24 horas) e 80% (após 48 horas). Os resultados obtidos até o momento mostraram que após a expansão as células NK-CAR alcançaram melhores parâmetros cinéticos mantendo elevado grau de pureza. Além disso, as células NK-CAR antiGD2 demonstraram habilidade em induzir citotoxicidade em duas linhagens tumorais distintas GD2+. As próximas etapas do presente estudo têm como objetivo avaliar a citotoxicidade das células NK-CAR em linhagens provenientes de glioblastoma multiforme e avaliar o efeito da molécula GITRL no bloqueio de células Treg.

Aims: CAR-T cell therapy has proven its importance in cancer treatment and currently there are five approved products on the market. However, these products are based on viral vectors, which presents a risk of insertional mutagenesis, it can also be immunogenic and its manufacture is extremely expensive. The development of a nonviral vector, suitable for an efficient and stable transfection of NK and T cells is the goal of this study. Methods: In this study we use a special episomal vector (extrachromosomal vectors) with i) scaffold/matrix attachment region (S/MAR) motifs that can actively mediate the episomal maintenance, ii) a plasmid replication enhancer, the replication-Initiation Region (IR) from the β-globin locus (pEP-IR) and iii) a CAR anti CD19 (pEP-IR-CAR). We electroporated activated and non-activated T cells and NK cells with different plasmid concentrations. We evaluated transfection efficiency and viability. Results and discussion: Our findings showed that unstimulated T cells are transfected more efficiently than activated T cells. Transfection of unstimulated T cells with 20 ug of supercoiled pEP-IR-GFP plasmid reached 22 to 63% of GFP and viability around 54% depending on the culture condition used after electroporation (FBS% and IL2). We then accessed the efficacy of pEP-IR-CAR and CAR expression, confirmed in 3,2% of the cells with 89% of viability. Cells expressing CAR on their surface were marked with anti-CAR antibody Biotin-SP-conjugated and selected by anti-Biotin microbeads, achieving an enrichment of 54,9% CAR+ cells. Conclusions: Our results showed that we established an optimized protocol resulting in an acceptable transfection efficiency and the transfected cells can be selected. So, the next step is to perform in vitro cytotoxicity and in vivo assays with the episomal CAR+ cells. Funding: Financially supported by FAPESP 2020/09206-4, FAPESP 2019/25309-0, CTC Center for Cell-based Therapy (FAPESP 2013/08135-2), and National Institute of Science and Technology in Stem Cell and Cell Therapy (CNPq 573754-2008-0 and FAPESP 2008/578773).

Purpose: The aim of this study was to compare [ 18 F]FDG and [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 PET/CT image findings in patients with multiple myeloma (MM)., Methods: Twenty consecutive patients with symptomatic biopsy-proven MM were submitted to whole body [ 18 F]FDG and [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 PET/CT with a time interval of 1-8 days between procedures. All lesions were counted and had their maximum SUV (SUVmax) measured. Intra-class correlation (ICC) was used to assess the agreement between [ 18 F]FDG and [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 PET/CT findings., Results: A total of 266 lesions were detected in 19/20 patients. [ 18 F]FDG detected 223/266 (84%) lesions in 17 patients and [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 190/266 (71%) lesions in 19 patients. Both procedures did not identify any active lesion in 1 patient. Forty-three (16%) lesions were detected only by [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 and 76 (29%) only by [ 18 F]FDG. Both tracers identified 147 (55%) lesions. Intralesional mismatch of FDG-PSMA uptake was identified in 25 of these 147 lesions, found in 8 different patients. Different lesions with uptake of only [ 18 F]FDG or [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 in the same patient were found in 4 patients. The highest SUVmax of [ 18 F]FDG and [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 had a median (min-max) SUVmax of 6.5 (2.0-37.8) and 5.5 (1.7-51.3), respectively. [ 18 F]FDG and [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 respectively identified 18 and 19 soft tissue lesions. False-positive [ 18 F]FDG findings had minimal or no uptake of [ 68 Ga]Ga-PSMA-11. Good reliability (ICC ≥ 0.75) was found for number of lesions, number of soft tissue lesions and highest SUVmax in each patient., Conclusion: [ 18 F]FDG or [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 alone can detect most MM lesions. Almost half of the lesions take up only one of the tracers, reflecting increased glycolysis or angiogenesis in specific lesions, and suggesting their possible complementary role in MM. The marked [ 68 Ga]Ga-PSMA-11 uptake in some cases raises the possibility of a theranostic approach in selected patients., (© 2023. The Author(s), under exclusive licence to Springer-Verlag GmbH Germany, part of Springer Nature.)

The present study investigated the effects of a 6-week swimming training on blood pressure, nitric oxide (NO) levels and oxidative stress parameters such as protein and lipid oxidation, antioxidant enzyme activity and endogenous non-enzymatic antioxidant content in kidney and circulating fluids, as well as on serum biochemical parameters (cholesterol, triglycerides, urea and creatinine) from Nω-nitro-L-arginine methyl ester hydrochloride (L-NAME)-induced hypertension treated rats. Animals were divided into four groups (n = 10): Control, Exercise, L-NAME and Exercise L-NAME. Results showed that exercise prevented a decrease in NO levels in hypertensive rats (P < 0·05). An increase in protein and lipid oxidation observed in the L-NAME-treated group was reverted by physical training in serum from the Exercise L-NAME group (P < 0·05). A decrease in the catalase (CAT) and superoxide dismutase (SOD) activities in the L-NAME group was observed when compared with normotensive groups (P < 0·05). In kidney, exercise significantly augmented the CAT and SOD activities in the Exercise L-NAME group when compared with the L-NAME group (P < 0·05). There was a decrease in the non-protein thiols (NPSH) levels in the L-NAME-treated group when compared with the normotensive groups (P < 0·05). In the Exercise L-NAME group, there was an increase in NPSH levels when compared with the L-NAME group (P < 0·05). The elevation in serum cholesterol, triglycerides, urea and creatinine levels observed in the L-NAME group were reverted to levels close to normal by exercise in the Exercise L-NAME group (P < 0·05). Exercise training had hypotensive effect, reducing blood pressure in the Exercise L-NAME group (P < 0·05). These findings suggest that physical training could have a protector effect against oxidative damage and renal injury caused by hypertension., (Copyright © 2012 John Wiley & Sons, Ltd.)