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BACKGROUND. Glioblastoma (GBM) is a fast-growing and aggressive brain tumor. GBM is the most frequent malignant primary brain tumour and it can result in death in three-six months, if untreated. The current standard of care (SOC) therapy consists in maximal safe surgical resection followed by radiation therapy and adjuvant temozolomide (Stupp protocol), with a median overall survival (OS) of 8-10 months. However, more than half of GBM patients die within one year from the diagnosis, and only 5% survive more than 5 years despite aggressive therapies. Research has now shifted additional attention to methods of modulating the innate immune system for the treatment of GBM. Moreover, radiotherapy, that plays a key role in GBM treatment, has the potential to convert immunologically ‘cold’ tumors into ‘hot’ tumors by a combination of distinct mechanisms. Overall, literature data indicate that local radiation produces systemic, immune-mediated anti¬tumour and, potentially, antimetastatic effects. Additionally, the combination of local radiotherapy and immune-modulation can augment local tumour control and cause distant (abscopal) antitumour effects through increased tumour-antigen release and antigen-presenting cell (APC) cross-presentation, improved dendritic-cell (DC) function, and enhanced T cell priming. In order to sort out the immunomodulatory effects of radiotherapy for brain glioma we conducted this project, also in association with immunetherapy. The radiological response has been evaluated as well. METHODS. Radiotherapy treatment in combination with dendritic cell immunotherapy was evaluated. GL261-glioma bearing immune-competent mice were treated by means of RT (3 fractions, 1 fr/day) as exclusive and concomitant immunotherapy (dendritic cells). Two clinical trials were studied as well. The population was GBM patients treated by means of standard therapy plus DC-vaccine therapy. Response assessment of GBM after radio-chemotherapy and during immunotherapy by delayed contrast trams (treatment response assessment maps) was evaluated as well. RESULTS. Survival, CD8+ T, NK cells were significantly and slightly significant different: control vs RT vs RT-IT. We found that activated microglia persists in both tumor and contralateral brain of irradiated mice. Moreover, RT promoted antitumoral M1 polarization and RT contributed to a massive recruitment of Th1 CD4+ T cells; RT and DC combination contributes to a robust infiltrate of CD8+ T cells. CONCLUSION. Our results confirm that RT can modulate the TME creating a specific chemokine gradient involved in T cell homing. RT in combination with IT can induce an anti-tumour systemic long-lasting effector CD8+ T cell response as well as a local infiltration of NK cells and CD8+ T cells. The combinatorial approach seems to be a promising therapy for GBM patients. It might be evaluated trough other clinical trials in order to confirm the preliminary results. BACKGROUND. Glioblastoma (GBM) is a fast-growing and aggressive brain tumor. GBM is the most frequent malignant primary brain tumour and it can result in death in three-six months, if untreated. The current standard of care (SOC) therapy consists in maximal safe surgical resection followed by radiation therapy and adjuvant temozolomide (Stupp protocol), with a median overall survival (OS) of 8-10 months. However, more than half of GBM patients die within one year from the diagnosis, and only 5% survive more than 5 years despite aggressive therapies. Research has now shifted additional attention to methods of modulating the innate immune system for the treatment of GBM. Moreover, radiotherapy, that plays a key role in GBM treatment, has the potential to convert immunologically ‘cold’ tumors into ‘hot’ tumors by a combination of distinct mechanisms. Overall, literature data indicate that local radiation produces systemic, immune-mediated anti¬tumour and, potentially, antimetastatic effects. Additionally, the combination of local radiotherapy and immune-modulation can augment local tumour control and cause distant (abscopal) antitumour effects through increased tumour-antigen release and antigen-presenting cell (APC) cross-presentation, improved dendritic-cell (DC) function, and enhanced T cell priming. In order to sort out the immunomodulatory effects of radiotherapy for brain glioma we conducted this project, also in association with immunetherapy. The radiological response has been evaluated as well. METHODS. Radiotherapy treatment in combination with dendritic cell immunotherapy was evaluated. GL261-glioma bearing immune-competent mice were treated by means of RT (3 fractions, 1 fr/day) as exclusive and concomitant immunotherapy (dendritic cells). Two clinical trials were studied as well. The population was GBM patients treated by means of standard therapy plus DC-vaccine therapy. Response assessment of GBM after radio-chemotherapy and during immunotherapy by delayed contrast trams (treatment response assessment maps) was evaluated as well. RESULTS. Survival, CD8+ T, NK cells were significantly and slightly significant different: control vs RT vs RT-IT. We found that activated microglia persists in both tumor and contralateral brain of irradiated mice. Moreover, RT promoted antitumoral M1 polarization and RT contributed to a massive recruitment of Th1 CD4+ T cells; RT and DC combination contributes to a robust infiltrate of CD8+ T cells. CONCLUSION. Our results confirm that RT can modulate the TME creating a specific chemokine gradient involved in T cell homing. RT in combination with IT can induce an anti-tumour systemic long-lasting effector CD8+ T cell response as well as a local infiltration of NK cells and CD8+ T cells. The combinatorial approach seems to be a promising therapy for GBM patients. It might be evaluated trough other clinical trials in order to confirm the preliminary results.

Nello studio clinico DENDR1, attivo presso la Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta, 24 pazienti affetti da glioblastoma primario sono stati sottoposti a sette vaccinazioni con cellule dendritiche (DC) in combinazione al chemioterapico temozolomide (TMZ) come adiuvante. 9 pazienti hanno beneficiato del trattamento e l’aumento della sopravvivenza è correlato ad una persistente risposta mediata da cellule natural killer, ma non da linfociti CD8. Nello specifico, il trattamento con TMZ ha avuto un impatto negativo sull’attivazione di una risposta mediata da linfociti CD8 compromettendo la formazione di una memoria immunologica, un requisito fondamentale per una risposta immunitaria anti-tumorale prolungata nel tempo. La resistenza alla TMZ è risultata essere legata all’espressione di ABCC3, una proteina coinvolta nella resistenza ai farmaci, nelle cellule natural killer ma non nei linfociti CD8. Nello studio clinico DENDR2, 12 pazienti con GBM recidivo sono stati trattati con cinque vaccinazioni con cellule dendritiche in combinazione con TMZ. In questi pazienti non abbiamo trovato un’attivazione significativa dei una risposta immunitaria anti-tumorale o un beneficio in termini di sopravvivenza. Dati recenti indicano che l’iniezione intradermica dell’anatossina tetanica/difterica nel sito di somministrazione delle cellule dendritiche determina l’insorgenza di un processo infiammatorio con aumento di fattori, quali la CCL3 che sembra favorisce la migrazione delle DC ai linfonodi e di conseguenza l’efficacia della vaccinazione. Questo tipo trattamento che viene definito preconditioning. In uno studio pilota chiamato variant –(V) DENDR2, che include otto pazienti con GBM recidivo, le DC sono state somministrate a livello intradermico nella stessa area dopo 24 ore è stata iniettata la tossina tetanica al fine di predisporre un ambiente favorevole alla loro attivazione e migrazione. I pazienti arruolati in questo studio non hanno ricevuto TMZ come trattamento adiuvante. 5 pazienti, che hanno raggiunto una sopravvivenza di 9 mesi e sono stati pertanto definiti lungo-sopravviventi, hanno mostrato una forte attivazione di linfociti CD8 con formazione di memoria. Inoltre abbiamo osservato a un aumento di linfociti CD4 attivati dalla tossina tetanica parallelamente a un’attivazione di linfociti CD4 più propriamente associati all’azione delle DCs. Inoltre, il sito di vaccinazione è risultato essere molto infiltrato dal linfociti CD4 esprimenti CCL3, a supporto di una possibile maggior migrazione di cellule dendritiche ai linfonodi. Complessivamente questi dati indicano che il protocollo di somministrazione della TMZ dovrebbe essere rivalutato in modo da potenziare la risposta immunitaria con il contributo dei linfociti CD8. Inoltre, il preconditiong del sito di vaccinazione e l’assenza di TMZ permetterebbero l’attivazione di linfociti CD8 e la formazione di una memoria immunologica, supportata da un aumento di linfociti CD4 che sostengono la persistenza di una risposta anti-tumorale durante il trattamento. In the DENDR1 clinical study, active at Fondazione IRCCS Istituto Neurologico Carlo Besta, 24 patients with first diagnosis of glioblastoma (GBM) were treated with seven vaccinations with dendritic cell (DC) combined to temozolomide (TMZ) as an adjuvant. 9 patients took advantage of this approach and the gain in survival was associated with a specific and long-lasting NK cell, and not CD8+ T cell, response. Specifically, TMZ administration limited the T cell response impairing on CD8+ T cell activation and memory formation, that is a critical requirement for a long-lasting anti-tumor immune-response. Resistance to TMZ was associated with the expression of the multidrug resistance protein ABCC3 in NK but not CD8+ T cells. In the DENDR2 clinical study, 12 patients with recurrent GBM were treated with five DC vaccinations combined with a dose-dense TMZ. These patients did not experience any significant immune response activation and survival advantage. Recent data suggested that pre-conditioning the vaccine site with the recall antigen tetanus/diphtheria toxoid induces a local inflammation with the involvement of CCL3, which improves lymph nodes homing of DC and consequently, the efficacy of DC vaccination. In a pilot study named variant (V)-DENDR2, including 8 patients with recurrent GBM, the vaccine site was pre-conditioned with tetanus toxoid (TT) 24 hours before each DC vaccination. TMZ was avoided. 5 patients, who reached OS9 and were indicated as long-term survivors, showed a strong CD8+ T cell activation and effector to memory transition. Moreover, a vaccine-specific CD4+ T cell activation was detected, accompanied by a TT- specific CD4+ memory T cell response. Moreover, the injection site was strongly infiltrated by CD4+ T cells expressing the chemokine CCL3, supporting a potential increase of DC - homing. Taken together these results suggest that the schedule of TMZ administration should be carefully reconsidered in order to improve and complete the immune response with the contribution of CD8+ T cells. Furthermore, pre-conditioning of the vaccine site and TMZ absence allowed CD8+ T cell activation and memory formation, supported by an increased frequency of CD4+ T helper cells sustaining the persistence of the anti-tumor response during the treatment.

La famiglia del fattore nucleare delle cellule T attivate (NFAT) comprende cinque proteine con attività trascrizionale che possono essere suddivise in due gruppi sulla base dei loro domini funzionali; il gruppo comprendente NFAT5, la cui regolazione avviene sulla base di cambiamenti osmotici, e il gruppo comprendente la famiglia di NFATc, regolata dall’azione della calcineurina. Sebbene le diverse funzioni della famiglia NFATc siano state scoperte essere associate ai meccanismi di sviluppo, attivazione e tolleranza dei linfociti, in particolare delle cellule T, numerosi studi hanno evidenziato nuovi ruoli per quanto riguarda le cellule del sistema immunitario innato, come le cellule dendritiche convenzionali (DC) e i macrofagi. Inoltre, è stato proposto che i membri della famiglia NFATc, una volta attivi nelle cellule dell’immunità innata, potrebbero essere anche coinvolti nella collaborazione tra immunità innata e adattativa. Le DC sono cellule presentanti l’antigene e sono potenti attivatori della risposta delle cellule T. A tal proposito, è stato dimostrato che uno dei motivi per cui le DC presentano un’alta efficienza nell’attivare le cellule T è la loro capacità di produrre di interleuchina-2 (IL-2) in seguito ad esposizione con stimoli infiammatori (Granucci et al., 2001). Ulteriori studi hanno anche provato che sia l’aumentata espressione di CD25, sia la produzione di IL-2 da parte delle DC a livello della sinapsi immunologica sono eventi fondamentali per l’attivazione delle cellule T (Wuest et al., 2011). Dato che sia la produzione di CD25 che di IL-2 sono entrambe controllate dalla traslocazione di NFATc, è possibile che l’attivazione della via di segnalazione di NFAT nelle DC possa avere un ruolo fondamentale nell’attivazione delle cellule T alloreattive durante il rigetto acuto dei trapianti. A tale proposito, l’inibizione selettiva e specifica della via di segnalazione di NFAT nelle DC potrebbe essere fondamentale al fine di inibire l’attivazione delle cellule T alloreattive e per indurre un meccanismo di tolleranza ai trapianti. Abbiamo quindi utilizzato un modello sperimentale di rigetto acuto di trapianto allo scopo di testare il ruolo della via di segnalazione di NFAT nell’attivazione delle cellule T. Per questo scopo abbiamo generato un nuovo inibitore di NFATc specifico per le cellule dell’immunità innata e lo abbiamo utilizzato per testare il coinvolgimento di NFATc durante il rigetto acuto dei trapianti.

La relazione di causalità tra carcinoma squamoso della cervice uterina (SCC) e infezione da Virus del Papilloma umano (HPV) mucosali ad alto rischio è ampiamente riconosciuta, mentre in letteratura sono presenti dati contrastanti sulla possibile associazione tra alcuni genotipi di HPV cutanei e lo sviluppo di tumori cutanei di tipo non-melanoma (NMSC). Il progetto di ricerca della tesi è incentrato sullo studio delle capacità trasformanti di HPV, analizzate in un sistema cellulare funzionale ad evidenziare i differenti meccanismi in grado di indurre la tumorigenesi dipendente da genotipi diversi di HPV. Sono stati utilizzati cheratinociti umani trasformati dalle proteine E6 ed E7 di HPV mucosale ad alto rischio di tipo 16 (K16) e cheratinociti umani immortalizzati dalle proteine E6 ed E7 di HPV cutaneo di tipo 38 (K38). L’attività trasformante di E6 ed E7 di entrambi i genotipi di HPV coinvolge principalmente l’inibizione dei soppressori tumorali p53 e pRb con alcune differenze sostanziali che riguardano soprattutto la proteina E6. Infatti, mentre le proteine E7 di HPV16 e HPV38 inibiscono l’attività del soppressore tumorale pRb con un simile meccanismo di azione, l’effetto di E6 dei due diversi genotipi su p53 è molto differente. L’oncoproteina E6 di HPV16 lega p53 promuovendone la degradazione; invece E6 di HPV38, agendo insieme a E7 con meccanismi ancora poco noti, modifica l’attività transattivante di p53 favorendo l’accumulo del suo inibitore ΔNp73 e la conseguente down-regolazione dell’attivazione trascrizionale dei geni target di p53 coinvolti nell’inibizione della proliferazione cellulare. È stato inoltre descritto che la proteina oncogena E7 di HPV16 attiva il fattore di trascrizione κB (NF-κB), implicato nell’attivazione di una serie di geni necessari per la sopravvivenza della cellula. Recenti evidenze, inoltre, indicano che E6 ed E7 agiscono anche su ulteriori meccanismi cellulari regolatori dell’espressione genica quali i microRNA (miRNA). Il coinvolgimento di quest’ultimo meccanismo di regolazione dell’espressione genica nella tumorigenesi associata a HPV è stato valutato utilizzando un approccio di tipo “high throughput” attraverso l’analisi del miRNoma espresso dalle K16 e K38 comparate ai cheratinociti di controllo. Sono stati così identificati miRNA deregolati sia nelle K16 che nelle K38. Saggi specifici eseguiti tramite Real-Time RT-PCR hanno permesso di confermare la deregolazione di un gruppo significativo di miRNA in entrambi i tipi di cheratinociti. Poiché studi precedenti effettuati nel laboratorio hanno dimostrato che l’Interferone (IFN) di tipo I inibisce la proliferazione di linee cellulari di SCC HPV-positive e dei cheratinociti K16 e K38 (Chiantore et al., 2012, Vannucchi et al., 2000, Vannucchi et al., 2005), è stato valutato l’effetto del trattamento di IFN sull’espressione dei miRNA nei cheratinociti E6/E7-trasdotti. L’IFN-β sembra essere in grado di riportare l’espressione di alcuni miRNA deregolati ad un livello simile a quello dei cheratinociti di controllo. L’analisi dei target dei miRNA identificati, tuttora in corso, permetterà di approfondire i meccanismi coinvolti nella deregolazione della proliferazione indotta dalle oncoproteine di HPV e nell’azione antitumorale svolta dall’IFN. 3 E’ stata anche valutata la risposta antitumorale dell’ospite alle cellule HPV-trasformate esaminando la possibilità di indurre in vitro la risposta di linfociti T citotossici (CTL) E6/E7 specifici attraverso l’uso di cellule presentanti l’antigene (APC), quali le cellule dendritiche (DC) o le cellule di Langerhans (LC), differenziate in vitro da monociti umani trattati con GM-CSF+IL-4 o GM-CSF+IL-4+TGF-β, rispettivamente. Le APC sono state poi pulsate con cheratinociti E6/E7-trasdotti necrotici e/o apoptotici. È stato definito il protocollo di priming in vitro valutando la citotossicità dei CTL specifici per E6 ed E7 e MHC-I ristretti, sulla base della diversa capacità d’internalizzazione, del grado di maturazione e del microambiente extracellulare delle APC pulsate. I saggi di citotossicità hanno mostrato che la percentuale maggiore di killing specifico è stata ottenuta stimolando i CTL con LC incubate con frammenti cellulari necrotici ed in presenza di siero umano, indicando che una corretta maturazione delle APC risulta essere importante per l’induzione della risposta immunitaria cellulare. Inoltre, poiché è stato riportato che miRNA specifici sono coinvolti nei pathways di maturazione delle APC (Turner et al., 2011, Jurkin et al., 2010), sono stati analizzati i livelli di espressione di alcuni miRNA selezionati nelle DC e LC utilizzate nello studio. Particolare attenzione è stata focalizzata sui miR-146a e miR-21 attivati dal pathway NF-κB e sul miR-98 associato alla regolazione del differenziamento cellulare e della risposta infiammatoria. I diversi livelli di espressione dei miRNA sono stati valutati nelle APC incubate con frammenti necrotici ottenuti da cellule K16 e K38 e in quelle stimolate con lipopolisaccaride batterico (LPS), rispetto alle APC immature. I dati ottenuti hanno mostrato un’over-espressione del miR-146a in tutte le combinazioni di stimolazione per le LC, mentre il miR-98 è risultato over-espresso solo nelle LC stimolate con K38 necrotiche. La ricerca dei target è stata al momento focalizzata sul miR-98, i cui target validati sono HMGA2 (high mobility group AT- hook 2) e HNRNPP2 (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein 2) mentre tra i target putativi è presente il recettore 1 per il transforming growth factor-beta (TGF-βR1) la cui funzione potrebbe essere correlata alla maturazione delle LC. I risultati ottenuti mostrano differenze nei pattern di espressione dei miRNA nei cheratinociti immortalizzati dalle proteine E6 ed E7 di HPV di tipo mucosale e cutaneo e indicano che l’IFN-β può esercitare la sua azione antiproliferativa in cellule tumorali HPV-trasformate, anche attraverso meccanismi di regolazione dell’espressione genica da miRNA. Inoltre si individuano le LC come le APC più appropriate nel produrre CTL E6/E7 specifici con un maggiore tasso di killing e indicano che la maturazione delle LC sia dipendente dai differenti cheratinociti E6/E7-trasdotti, quindi dalla capacità oncogena delle proteine dello specifico genotipo di HPV.

Background Pin1 has previously been described to regulate cells that participate in both innate and adaptive immunity. Thus far, however, no role for Pin1 has been described in modulating conventional dendritic cells, innate antigen presenting cells that potently activate naïve T cells, thereby bridging innate and adaptive immune responses. Methodology/Principal Findings When challenged with LPS, Pin1-null mice failed to accumulate spleen conventional dendritic cells (cDC). Analysis of steady-state spleen DC populations revealed that Pin1-null mice had fewer CD8+ cDC. This defect was recapitulated by culturing Pin1-null bone marrow with the DC-instructive cytokine Flt3 Ligand. Additionally, injection of Flt3 Ligand for 9 days failed to induce robust expansion of CD8+ cDC in Pin1-null mice. Upon infection with Listeria monocytogenes, Pin1-null mice were defective in stimulating proliferation of adoptively transferred WT CD8+ T cells, suggesting that decreases in Pin1 null CD8+ cDC may affect T cell responses to infection in vivo. Finally, upon analyzing expression of proteins involved in DC development, elevated expression of PU.1 was detected in Pin1-null cells, which resulted from an increase in PU.1 protein half-life. Conclusions/Significance We have identified a novel role for Pin1 as a modulator of CD8+ cDC development. Consistent with reduced numbers of CD8+ cDC in Pin1-null mice, we find that the absence of Pin1 impairs CD8+ T cell proliferation in response to infection with Listeria monocytogenes. These data suggest that, via regulation of CD8+ cDC production, Pin1 may serve as an important modulator of adaptive immunity.

La Sclerosi Multipla (SM) è una malattia autoimmune/infiammatoria del Sistema Nervoso Centrale (SNC), in cui sono coinvolte sia cellule del sistema immunitario che cellule residenti del SNC. L'encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) rappresenta un modello animale di SM e può essere indotta in ceppi di roditori suscettibili tramite immunizzazione con autoantigeni di mielina. Nel corso di EAE, linfociti T autoaggressivi migrano nel SNC, dove danno luogo a danno tissutale. Aumentati livelli di glutammato, il principale neurotrasmettitore del SNC, contribuiscono alla degenerazione degli oligodendrociti responsabile della demielinizzazione e del danno assonale. Il glutammato agisce su due classi di recettori: i recettori ionotropici (iGlu) e i recettori metabotropici (mGlu). I recettori iGlu mediano la normale neurotrasmissione glutamatergica, mentre i recettori mGlu svolgono un ruolo modulatorio regolando il rilascio presinaptico di glutammato. I recettori mGlu sono espressi sia dai neuroni che dalle cellule gliali. In particolare, i recettori mGlu localizzati su astrociti e microglia residenti nel SNC, svolgono un ruolo importante nel controllo dei processi neurodegenerativi. Durante i processi neuroinfiammatori, astrociti e microglia vanno incontro ad attivazione e produzione di fattori solubili in grado di esercitare sia effetti neuroprotettivi che effetti neurotossici, quali fattori neurotrofici, citochine e chemiochine. Citochine e chemiochine prodotte dalle cellule gliali residenti giocano un ruolo primario nella neuroinfiammazione e forniscono quindi dei potenziali bersagli per interventi farmacologici. Quindi una via alternativa per modulare i processi neurodegenerativi/neuroinfiammatori potrebbe consistere nell'identificazione di recettori di membrana in grado di controllare la produzione di mediatori solubili dell'infiammazione. I recettori mGlu racchiudono queste potenzialità perché essi controllano i livelli sinaptici di glutammato e inducono la sintesi di fattori neurotrofici, che nella SM potrebbero esercitare effetti protettivi sui neuroni e sugli oligodendrociti degeneranti. Nei processi neuroinfiammatori, oltre alle cellule residenti nel SNC, un ruolo centrale è giocato da cellule dendritiche (DC) infiltrate, le più potenti cellule presentanti antigene, capaci di attivare i linfociti T helper (Th) naive che nell'autoimmunità diventano capaci di presentare antigeni self contribuendo all'induzione della malattia e al danno cellulare. La DC stessa gioca anche un ruolo critico nell'induzione e nel mantenimento di tolleranza verso antigeni self. In particolare, le DC plasmacitoidi (pDC) sono in grado di dirigere verso l'immunità o la tolleranza, a seconda dei segnali ricevuti. Non solo le pDC sono dotate di proprietà tollerogeniche, ma anche sottopopolazioni specializzate di linfociti T possono svolgere un ruolo primario di immunoregolazione. Tra queste, le cellule Treg distribuite ampiamente in tutto l'organismo, secernono mediatori antinfiammatori e down-regolano risposte effettrici di cellule Th. Quantunque non siano attualmente disponibili informazioni sull'espressione di recettori mGlu sulle DC, è stato dimostrato che queste cellule possono liberare alti livelli di glutammato per mezzo di un antiporto cistina/glutammato. I nostri dati indicano che le DC murine ed in particolare le pDC esprimono alti livelli di recettori mGlu4 e che l'espressione mGlu può essere selettivamente modulata in risposta a segnali stimolatori o tollerogenici. L'induzione della tolleranza verso antigeni “self” è uno dei principali obiettivi nell’ immunoterapia per la sclerosi multipla (SM). Recenti evidenze indicano che la produzione periferica di cellule T regolatorie, (Tregs) anti-infiammatorie CD4+ Foxp3+, e di cellule CD4 T helper (Th17) che producono IL17 hanno un ruolo antagonista nella patogenesi della SM. In questo lavoro è stato dimostrato che la somministrazione ripetuta del modulatore allosterico positivo per il recettore mGlu4, PHCCC, è in grado di sopprimere lo sviluppo dell’ encefalomielite autoimmune sperimentale (EAE) in topi immunizzati con l'antigene della mielina, MOG. Anche se nessuna induzione di apoptosi di cellule T CD4 + è stata osservata nella milza di topi trattati con PHCCC, abbiamo trovato che il trattamento PHCCC è in grado di modulare l'equilibrio immunitario attraverso la promozione di una grande espansione delle cellule Treg CD4+/Foxp3+ e la produzione di TGF-, inibendo la polarizzazione verso il fenotipo Th17 e abrogado la proliferazione delle popolazioni di cellule presentanti l’antigene DC. Studi in vitro su co-culture di cellule DC-T hanno messo in evidenza la capacità del PHCCC sopprimere la proliferazione delle cellule T reattive contro il MOG, in tramite la produzione di citochine pro-infiammatorie, e una maggiore proliferazione delle cellule T CD4+ CD25+. Questi dati mostrano un nuovo meccanismo in cui l'attivazione dei recettori mGlu4 risulta in grado di modulare il sistema immunitario e di avere un ruolo protettivo nelle malattie autoimmuni, come l’ EAE/MS. Multiple Sclerosis (MS) is an autoimmune/inflammatory disease of the Central Nervous System (CNS), in which both cells of the immune system and resident cells of CNS are directly implicated. Experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) is a widely accepted animal model of MS that can be induced in susceptible rodent strains by active immunization with myelin self antigens. During EAE, auto-aggressive myelin-reactive T lymphocytes migrate in the CNS, where they recognize their cognate target antigen and initiate an inflammatory cascade leading to tissue damage. In MS increased levels of glutamate, the major excitatory neurotransmitter of the CNS, contribute to oligodendrocyte degeneration leading to demyelination and axonal damage. Glutamate acts on ionotropic (iGlu) and metabotropic (mGlu) receptors. IGlu receptors mediate glutamatergic neurotransmission, whereas mGlu receptors exert a modulatory role by regulating presynaptic glutamate release. mGlu receptors are expressed both on neurons and glial cells. In particular, mGlu receptors localized on CNS resident astrocytes and microglia play a fundamental role in the control of neurodegeneration. During neuroinflammation, astrocytes and microglia undergo activation and produce soluble factors, which exert both neuroprotective and neurotoxic effects, such as neurotrophic factors, cytokines and chemokines. Cytokines and chemokines produced by resident glial cells, play a major role in neuroinflammation and therefore they may provide potential sites for pharmacological intervention. Therefore an alternative way to modulate the neurodegenerative/neuroinflammatory process could be the identification of membrane receptors able both to confer neuroprotection and to control the production of soluble inflammatory mediators. MGlu receptors cater this potential because they control synaptic glutamate levels and induce the synthesis of neurotrophic factors, which in MS could exert protective effects on degenerating neurons and oligodendrocytes. In neuroinflammation, other than CNS resident cells, a central role is played by infiltrating dendritic cells (DCs), the most potent antigen presenting cells capable of presenting the antigen to and activating naïve T helper (Th)lymphocytes, leading in autoimmunity to organ destruction and induction of the disease. DCs play also a critical role in the induction and maintenance of tolerance towards self antigens. In particular, plasmacytoid DCs (pDCs), a recently described DC population in both humans and mice, display a highly plastic functionalphenotype capable to direct immunity or tolerance, depending on the signals received. It is now clear that not only pDCs are endowed with tolerogenic activities, but also specialized subpopulation of T lymphocytes can play a major role in controlling immune responses. Among these, Treg are distributed throughout the body to regulate excessive inflammatory responses and eventual recognition of self antigens by effector Th cells. Although no information is currently available for the expression of mGlu receptors in DCs, it has been clearly demonstrated that these cells can release high levels of glutamate through a cystine/glutamate antiporter. Interestingly, our data indicate that mouse DCs, and in particular pDCs, do express high levels of mGlu4 and that the expression of mGlu receptors can be selectively modulated in response to either stimulatory or tolerogenic signals. The induction of tolerance to self-proteins continues to be a goal of multiple sclerosis (MS) immunotherapy. Recent evidence indicates that peripherally generated anti-inflammatory CD4+Foxp3+ regulatory T cells (Tregs) and IL17-producing CD4+ T helper cells (Th17) play antagonistic roles in the pathogenesis of MS. We found that repeated administration of the selective mGlu4 receptor enhancer, PHCCC, prevented the development of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) in mice immunized with the myelin antigen, MOG. Although no induction of apoptosis was seen in CD4+ T cells in the spleens of PHCCC-treated mice, we found that PHCCC treatment modulated the immune balance by promoting a large expansion of CD4+/Foxp3+ Treg cells, producing TGF-, inhibiting Th17 polarization and abrogating the proliferation of antigen-presentingDC populations. Tissue DC-T-cell co-culture assays demonstrated that PHCCC in vitro downregulated MOG-specific T cell proliferation, largely attenuated the T-cell mediated production of pro-inflammatory cytokines, and increased proliferation of CD4+CD25+ T cells. Tese data unravel a novel mechanism whereby activation of mGlu4 receptors modulate the immune system and is protective against autoimmune disorder, including EAE/MS. Dottorato di ricerca in Scienze per la salute (XXIII ciclo)

CD133 is a hallmark of primitive myeloid progenitors. We have addressed whether human cord blood cells selected for CD133 can generate dendritic cells, and Langerhans cells in particular, in conditions that promote that generation from CD34+ progenitors. Transforming growth factor-β1 (TGF-β1) and anti–TGF-β1 antibody, respectively, were added in some experiments. With TGF-β, monocytoid cells were recognized after 7 days. Immunophenotypically immature dendritic cells were present at day 14. After 4 more days, the cells expressed CD54, CD80, CD83, and CD86 and were potent stimulators in mixed lymphocyte reaction; part of the cells expressed CD1a and langerin, but not Birbeck granules. Without TGF-β, only a small fraction of cells acquired a dendritic shape and expressed the maturation-related antigens, and lymphocytes were poorly stimulated. With anti–TGF-β, the cell growth was greatly hampered, CD54 and langerin were never expressed, and lymphocytes were stimulated weakly. In conclusion, CD133+ progenitors can give rise in vitro, through definite steps, to mature, immunostimulatory dendritic cells with molecular features of Langerhans cells, although without Birbeck granules. Addition of TGF-β1 helps to stimulate cell growth and promotes the acquisition of mature immunophenotypical and functional features. Neither langerin nor Birbeck granules proved indispensable for lymphocyte stimulation.

Spontaneous Ca(2+) oscillations have been observed in a number of excitable and non-excitable cells, but in most cases their biological role remains elusive. In the present study we demonstrate that spontaneous Ca(2+) oscillations occur in immature human monocyte-derived dendritic cells but not in dendritic cells stimulated to undergo maturation with lipopolysaccharide or other toll like-receptor agonists. We investigated the mechanism and role of spontaneous Ca(2+) oscillations in immature dendritic cells and found that they are mediated by the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor as they were blocked by pretreatment of cells with the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor antagonist Xestospongin C and 2-aminoethoxydiphenylborate. A component of the Ca(2+) signal is also due to influx from the extracellular environment and may be involved in maintaining the level of the intracellular Ca(2+) stores. As to their biological role, our results indicate that they are intimately linked to the "immature" phenotype and are associated with the translocation of the transcription factor NFAT into the nucleus. In fact, once the Ca(2+) oscillations are blocked with 2-aminoethoxydiphenylborate or by treating the cells with lipopolysaccharide, NFAT remains cytoplasmic. The results presented in this report provide novel insights into the physiology of monocyte-derived dendritic cells and into the mechanisms involved in maintaining the cells in the immature stage.

Microbial products, including lipopolysaccharide (LPS), an agonist of Toll-like receptor 4 (TLR4), regulate the lifespan of dendritic cells (DCs) by largely undefined mechanisms. Here, we identify a role for calcium-calmodulin–dependent kinase IV (CaMKIV) in this survival program. The pharmacologic inhibition of CaMKs as well as ectopic expression of kinase-inactive CaMKIV decrease the viability of monocyte-derived DCs exposed to bacterial LPS. The defect in TLR4 signaling includes a failure to accumulate the phosphorylated form of the cAMP response element-binding protein (pCREB), Bcl-2, and Bcl-xL. CaMKIV null mice have a decreased number of DCs in lymphoid tissues and fail to accumulate mature DCs in spleen on in vivo exposure to LPS. Although isolated Camk4−/− DCs are able to acquire the phenotype typical of mature cells and release normal amounts of cytokines in response to LPS, they fail to accumulate pCREB, Bcl-2, and Bcl-xL and therefore do not survive. The transgenic expression of Bcl-2 in CaMKIV null mice results in full recovery of DC survival in response to LPS. These results reveal a novel link between TLR4 and a calcium-dependent signaling cascade comprising CaMKIV-CREB-Bcl-2 that is essential for DC survival.

Several glycoconjugates are involved in the immune response. Sialic acid is frequently the glycan terminal sugar and it may modulate immune interactions. Dendritic cells (DCs) are antigen-presenting cells with high endocytic capacity and a central role in immune regulation. On this basis, DCs derived from monocytes (mo-DC) are utilised in immunotherapy, though many features are ignored and their use is still limited. We analyzed the surface sialylated glycans expressed during human mo-DC generation. This was monitored by lectin binding and analysis of sialyltransferases (ST) at the mRNA level and by specific enzymatic assays. We showed that alpha 2-3-sialylated O-glycans and alpha 2-6- and alpha 2-3-sialylated N-glycans are present in monocytes and their expression increases during mo-DC differentiation. Three main ST genes are committed with this rearrangement: ST6Gal1 is specifically involved in the augmented alpha 2-6-sialylated N-glycans; ST3Gal1 contributes for the alpha2-3-sialylation of O-glycans, particularly T antigens; and ST3Gal4 may contribute for the increased alpha2-3-sialylated N-glycans. Upon mo-DC maturation, ST6Gal1 and ST3Gal4 are downregulated and ST3Gal1 is altered in a stimulus-dependent manner. We also observed that removing surface sialic acid of immature mo-DC by neuraminidase significantly decreased its endocytic capacity, while it increased in monocytes. Our results indicate the STs expression modulates the increased expression of surface sialylated structures during mo-DC generation, which is probably related with changes in cell mechanisms. The ST downregulation after mo-DC maturation probably results in a decreased sialylation or sialylated glycoconjugates involved in the endocytosis, contributing to the downregulation of one or more antigen-uptake mechanisms specific of mo-DC.

All immunosuppressive treatments, either pharmacological or physical, have the potential to impair the skin immune system network of cells and cytokines, thus leading to an increased incidence of skin cancer. Since skin cancer in transplant recipients may show uncommon clinical features and have an unusually aggressive course, transplant patients should be strictly followed up by experienced dermatologists in order to diagnose and treat properly any skin cancer in an early phase. Importantly, due to the fact that sun exposure increases immunosuppression in the skin, patients should be clearly informed about the additional risk of sun exposure and the preventive measures to be taken.

SUMMARY We have investigated the occurrence, immunohistochemical profile, ultrastructural features and relationships to lymphocytes of the non-lymphoid accessory cells in the dermal infiltrate of five patients affected by B celt lymphoma with secondary involvement of the skin. Typical nonlymphoid accessory cells were found in all cases. Most of these cells had ultrastructural features which resembled those of the poorly differentiated dendritic reticulum cells described in follicular lymphomas of the lymph nodes. The immunohistochemical findings of DRC-1 +, C3b r+ dendritic cells often arranged in follicular-like structures with neoplastic B cells and only few, scattered OKM1+, OKM5+ mononuclear phagocytes support the hypothesis that the vast majority of the non-lymphoid cells observed in our cases were poorly differentiated dendritic reliculum cells. These results and previously published reports indicate that the organization of the dermal infiltrate of B cell lymphomas tends to reproduce the typical arrangement of the B zone of the lymphoid tissue, although with a lesser degree of differentiation, similar to that observed in lymph node follicular lymphomas.