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Orientador : Claudio Luiz Messias Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia Resumo: O presente trabalho foi conduzido com a finalidade de se estudar através do índice enzimático, a obtenção de diferentes mutantes de M. anisopliae para não produção de exoenzimas amilase, lipase e protease e revertentes, utilizando luz ultravioleta. Também procurou-se caracterizar os mutantes e revertentes exoenzimáticos, através de eletroforese para os padrões de a-esterase e aspectos citológicos como comprimento de conídios e número de núcleos por conídio. Por fim, determinou-se a virulência dos mutantes e revertentes à ninfas de 3º estadio de Rhodnius prolixus. Para isso, empregaram-se as linhagens E9 e V14 de K.anisopliae var. anisopliae.. A mutante amilase- e lipase-apresentaram índices enzimáticos iguais a um, o que não ocorreram com os mutantes protease-. Todos os revertentes apresentaram fenótipo exoenzimáticos semelhante aos tipos selvagens. Não houve alteração na germinação, comprimento de conídios e número de núcleos por conídio dos mutantes e revertentes. O padrão eletroforético de a ¿esterase mostrou-se diferente somente nos mutantes lipase-, entretanto não houve alteração para os revertentes correspondentes lipase+. A virulência dos mutantes amilase- e lipase- diminuiu significativamente, enquanto os mutantes protease-, não mostraram redução significativa. Os revertentes restabeleceram a virulência em níveis semelhantes aos tipos selvagens Abstract: The present work was conducted in order to study by means of enzimatyc index the obtainment of mutants of Metarhizium anisopliae var. anisoplae strains E9 e V14 wich lost or had some reduction in their capability to produce extracellular enzymes namely amylases, lipases and proteases as well their capability to produce extracellular enzymes namely amylases, lipases and proteases as well their reversion induced by ultraviolet light. The mutants and revertants were characterized electrophoretically for a -esterase pattern and cytologically for conidia size as well as number of nuclei. The virulence of mutants and revertant strains were evaluated in bioassays against third instar nymphae of Rhodnius prolixus. The mutant strains for amylase and lipase showed phenotypically similar to their parental strains, and it was not observed variation in length, germination and number of nuclei per conidia for both mutants and their revertants. The electrophoretic pattern for a ¿esterases was similar for most of the studied strains except for the mutant showing deficiency for lipolytic activity. The virulence of amylolytic and lipolytic mutants were reduced when compared to their parental strain, while the proteolytic mutants did not show any significant reduction. The virulence was restored for all revertant strains Doutorado Doutor em Ciências

Yeasts are potential plant-growth-promoting microbes; however, this resource is underexploited, mainly in the semiarid regions worldwide. In the present study, we isolated potentially endophytic yeasts from roots of fieldgrown maize and characterized them at molecular, biochemical, and associative levels. Thirteen yeasts were retrieved, and the ITS1-5.8 S-ITS2 region sequences identified them within the Meyerozyma genus. The phylogenetic analyses showed that 12 out of 13 strains were closely related to M. guilliermondii CBS 2030T and ESA 35 to M. caribbica CBS 9966T. All yeasts synthesized indolic compounds and were favorable for siderophore production, and eleven proteolytic and seven amylolytic Mayerozyma spp. were identified. The principal component analysis positively correlated the in vitro characteristics and the maize growth promotion, highlighting six promising strains. Our results indicated that the maize-associated yeasts from the genus Meyerozyma are potential tools for inoculant production for plant growth promotion. Made available in DSpace on 2022-09-06T10:19:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Maize-associated-Meyerozyma-from-the-Brazilian-semiarid-region-2022.pdf: 941274 bytes, checksum: d4dc999975c8fb02aea5f96491fe4268 (MD5) Previous issue date: 2022

Submitted by MARCOS VINICIUS MANSANO SARTO (marcos__sarto@hotmail.com) on 2018-05-15T14:16:33Z No. of bitstreams: 1 corrigida Biblioteca_Tese Marcos 13.pdf: 1446458 bytes, checksum: cff9f01fbb1b8cf0ba17b24419908f06 (MD5) Approved for entry into archive by Maria Lucia Martins Frederico null (mlucia@fca.unesp.br) on 2018-05-15T17:39:34Z (GMT) No. of bitstreams: 1 sarto_mvm_dr_botfca_par.pdf: 934507 bytes, checksum: 71a9ac5b8e2eb04aa48c431bb9a06856 (MD5) Made available in DSpace on 2018-05-15T17:39:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 sarto_mvm_dr_botfca_par.pdf: 934507 bytes, checksum: 71a9ac5b8e2eb04aa48c431bb9a06856 (MD5) Previous issue date: 2018-03-06 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) Os objetivos deste trabalho foram investigar a contribuição do sistema radicular de eucalipto e U. brizantha, no sequestro de carbono, e as propriedades microbiológicas do solo em sistema integrado de produção agropecuária. O sistema era composto por 2 eucaliptos, E. grancam e E. urograndis, integrados com a forrageira [Urochloa brizantha (Hochst. ex A. Rich.) R. Webster ‘Marandu’] em região tropical. A inserção do eucalipto em área de pastagem reduz a produtividade de forragem até pelo menos 2 m de distância do eucalipto. A produtividade de forragem integrada aumenta ao longo do transecto de 1,7 Mg ha-1 a 0 m para 4,45 Mg ha-1 aos 6 m do eucalipto. A densidade de comprimento radicular é modificada mais na superfície do solo principalmente até 0,4 m, sendo que a inserção do eucalipto em área de pastagem reduz a densidade de comprimento, densidade e diâmetro radicular. As quantidades de raízes de eucalipto (C3) são mais abundantes próximo das árvores, e são reduzidas com a distância do eucalipto até 1 m de profundidade. A quantidade total de raízes no solo é menor com a inserção do componente florestal em área de pastagem bem manejadas, de 11,6 Mg ha-1 em sistema integrado de produção para 18,4 Mg ha-1 na pastagem a pleno sol, correspondendo a redução de 36 % na quantidade de raízes no solo até 1 m de profundidade. Os estoques de C variaram de 62–65 Mg ha-1 no sistema integrado de produção, não diferindo entre os eucaliptos, e nem quanto às distâncias do eucalipto, o sistema integrado de produção manteve os estoques de C próximo da condição inicial (66 Mg ha-1). Os estoques de C foram maiores na pastagem que no sistema integrado de produção agropecuária apenas na camada de 0-0,20 m de profundidade. A análise isotópica do solo não revelou mudança nos valores δ13C em função da inserção do eucalipto (C3) no SIPA até 1 m. No sistema integrado há estratificação da umidade do solo, com menor umidade do solo próximo ao eucalipto. Apesar do aumento atividade enzimática no solo em sistema integrado, a inserção de eucaliptos na área de pastagem não afetou as propriedades microbianas do solo. The objective of this work was to investigate the contributions of the eucalyptus and U. brizantha root system, carbon sequestration, and microbiological soil properties in an integrated crop-livestock system (ICLS). The system was composed of two eucalyptus, E. grancam and E. urograndis, integrated with a forage [Urochloa brizantha (Hochst. Ex A. Rich.) R. Webster 'Marandu'] in a tropical region. The insertion of eucalyptus in a pasture area reduces forage production up to 2 m away from the eucalyptus. An integrated forage yield increased along the transect from 1.7 Mg ha-1 to 0 m to 4.45 Mg ha-1 to 6 m of eucalyptus. The root length density was modified more in the soil surface, up to 0.4 m, than deep in the soil and the insertion of the eucalyptus in the pasture area reduced the density of length, overall density, and root diameter of the eucalyptus. The amounts of eucalyptus (C3) roots are more abundant near the trees and most of these are within a depth of 1 m. The total amount of non-soil roots is lower with an insertion of the forest component in a well-managed pasture area, from 11.6 Mg ha-1 in an integrated production system to 18.4 Mg ha-1 in the pasture in full sun, corresponding to a 36% reduction in the amount of roots in the soil up to 1 m in depth. C stocks ranged from 62-65 Mg ha-1 without an integrated production system, not differing between eucalyptus, nor even at the distances of eucalyptus, and the integrated production system maintained C stocks close to the initial condition (66 Mg ha-1). C stocks were higher in the production of an integrated agricultural production system only in the layer 0-0.20 m deep. The soil isotopic analysis showed no change in δ13C values as a function of the insertion of eucalyptus (C3) in ICLS up to 1 m. In the integrated system there is stratification of the soil unit, with lower soil moisture near the eucalyptus. Despite increasing enzymatic activity, there is no soil in an integrated system, an insertion of eucalyptus in the area of unaffected passage as microbial property of the soil. FAPESP: 14/10656-3 FAPESP: 16/14323-4.

Los efluentes de la industria frigorífica se caracterizan por presentar altas concentraciones de proteínas, grasas y polisacáridos. La degradación de estos compuestos a sus constituyentes monoméricos es realizada por la acción de enzimas extracelulares, producidas y secretadas por bacterias hidrolíticas (BH). En consecuencia, la actividad de estos microorganismos favorece el aumento de las tasas de degradación de la fracción orgánica presente en este tipo de residuos. En el presente estudio, un total de 15 bacterias productoras de enzimas extracelulares fueron aisladas y seleccionadas al presentar un índice de actividad enzimática ? 2,0. De estos 15 aislados, 7 presentaron actividad proteolítica (46,6%), 3 amilolítica (20%), 3 celulolítica (20%) y 2 lipolítica (13,4%). Adicionalmente, fue evidenciado efecto antagónico entre algunos de los aislados seleccionados, indicando su posible desventaja competitiva en condiciones naturales. Se concluye que las BH obtenidas evidencian un potencial promisorio para la optimización de sistemas de tratamiento de aguas residuales procedentes de la industria frigorífica.

Un total de 26 cepas de bacterias marinas con actividad proteolítica fueron aisladas de agua de mar contaminadas con efluentes pesqueros; las mismas que se evaluaron en base al crecimiento y formación de halos de actividad en Agar Marino suplementados con caseína al 1%, pH 8,0 e incubados a 25 ºC por 72 h. Cinco cepas, seleccionadas por presentar los mejores halos de actividad fueron evaluadas a su vez por su crecimiento y producción de proteasas a diferentes concentraciones de NaCl, rangos de temperatura y pH; siendo consideradas finalmente como bacterias halotolerantes, psicrotróficas y alcalófilas moderadas. Estas cepas también fueron evaluadas por su actividad proteolítica específica sobre la caseína, siendo la cepa CM48 (Pseudomonas sp.) la que presentó la mejor actividad específica (17,38 U/mg) a las 72 horas, y seguidas por las cepas CM45 (Alcaligenes sp.) (12,09 U/mg) y tres cepas de Aeromonas sp. (CM43, CM44 y CM46) con valores de 12,02; 10,07 y 10,10 U/mg respectivamente. A total of 26 strains of marine bacteria with proteolytic activity was isolated from sea water contaminated with fishing effluents; they were evaluated in basis of their growth and formation of activity halos in Marine Agar supplemented with casein to 1%, pH 8,0 and incubated to 25 ºC per 72 hours. Selected five strains were evaluated on the basis of displaying the best halos of activity as well by their growth and production of proteases at different concentrations of NaCl, temperature ranges and pH; being finally considered as moderate halotolerants bacteria, psicrotrophics and alkalophile. These strains also were evaluated by their specific proteolytic activity on the casein, being strain CM48 (Pseudomonas sp.) the one that presented the best specific activity (17,38 U/mg) at 72 hours, and followed by strain CM45 (Alcaligenes sp.) (12,09 U/mg) and three strains of Aeromonas sp. (CM43, CM44 and CM46) with values of 12,02; 10,07 and 10,10 U/mg respectively.

Beauveria bassiana is an entomopathogenic fungus used in the biological control of insect pests in agriculture. The production costs of its conidia, on a large scale, in the standard substrate (rice) currently used, affects the production process. Finding alternatives as a way of minimizing process costs has led to the need to investigate the efficiency of alternative substrates that, in addition to important nutritional properties, have high availability and low cost. Entomopathogenic fungi produce enzymes that are involved in the process of pathogenicity and virulence. However, when stimulated by specific substrates they can produce enzymes of biotechnological interest. Thus, the objective of this work was to analyze the potential of different substrates (algaroba fiber, malt residues, acerola seeds and fibers, and sugarcane bagasse) for conidiogenesis and enzymatic production (solid state fermentation) from of B. bassiana. The experiments for the production and viability of the conidia were carried out in triplicate, in erlernmeyer (250 mL) containing 30 g of each substrate, 0.3 μL of the conidial suspension (1 x 106 conidia/mL), humidity of 70 ± 10 % and Temperature (T = 29 ± 1 ° C). After 10 days of incubation, the rice substrates (standard medium) (2.00 × 106 conidia/g substrate), malt A (1.22 × 106 conidia/g), malt B (1.75 × 106 conidia/g), and algaroba fiber (2.36 x 106 conidia/g) provided higher conidia production. The viability of the conidia produced in these same substrates did not differ statistically among them, with a germination percentage of 99.96; 90.04; 93.17 and 98.21 %, respectively. The pathogenicity of the B. bassiana conidia produced on the different substrates was evaluated in the coconut termite. The mortality rate of infected termites did not differ statistically, surpassing 80 % mortality, except for the control group. The enzymatic activity (cellulolytic and amylolytic) was determined by the DNS method (dinitrosalicylic acid). The substrates used in the solid state fermentation, malt A (1.178 ± 0.002 U/mL), malt B (2.392 ± 0.013 U/mL), algaroba fiber (0.596 ± 0.007 U/mL) and acerola seed (0.964 ± 0.09 U/mL) showed amylolytic activity. From this analysis, different temperatures (30°, 40º, 50º, 60º, 65º, and 70º C) were evaluated to identify the optimum temperature of the amylolytic enzymes produced in this process. It was observed that the greatest activities found were in extreme temperatures, in the range of 60º to 70º C, suggesting that these enzymes are thermophilic. Sugarcane bagasse presented higher cellulolytic activity (15.29 ± 0.07 U/mL) for CMcase and (2.58 ± 0.9 U/mL U/mL) for FPase due to the characteristic of its cellulosic matrix, which differs from the other substrates. Proteolytic activity was quantified using azocasein. The algaroba had the highest activity (0.514 ± 0.009 U / mL). The alternative substrates used for growth and sporulation of B. bassiana can provide a reduction of approximately 50 % in the cost of producing conidia of entomopathogenic fungi used in the biological control of several insect pests. In addition, they are presented as a viable alternative for the production of microbial enzymes with wide application in several biotechnological processes. Beauveria bassiana é um fungo entomopatogênico usado no controle biológico de insetos-praga na agropecuária. Os custos de produção de seus conídios, em larga escala, no substrato padrão (arroz) utilizado atualmente onera o processo de produção. Encontrar alternativas como forma de minimizar os custos do processo, levou a necessidade de averiguar a eficiência de substratos alternativos que, além de propriedades nutricionais importantes, possuem grande disponibilidade e baixo custo. Os fungos entomopatogênicos produzem enzimas que estão envolvidas no processo de patogenicidade e virulência. Porém, ao serem estimulados por substratos específicos podem produzir enzimas de interesse biotecnológico. Dessa forma, o objetivo deste trabalho foi analisar o potencial de diferentes substratos (fibra da algaroba, resíduos de malte, sementes e fibras de acerola e bagaço da cana-de-açúcar) para conidiogênese e produção enzimática (fermentação em estado sólido) a partir de B. bassiana. Os experimentos para produção e viabilidade dos conídios foram realizados em triplicata, em erlernmeyer (250 mL) contendo 30 g de cada substrato, 0,3 μL da suspensão de conídios (1 x 106 conídios/mL), umidade de 70 ± 10% e temperatura (T = 29 ± 1° C). Após 10 dias de incubação, os substratos arroz (meio padrão) (2,00 x 106 conídios/g de substrato), malte A (1,22 x 106 conídios/g), malte B (1,75 x 106 conídios/g) e fibra de algaroba (2,36 x 106 conídios/g), proporcionaram maior produção de conídios. A viabilidade dos conídios produzidos nesses mesmos substratos não diferiu estatisticamente entre si, com porcentagem de germinação de 99,96; 90,04; 93,17 e 98,21 %, respectivamente. A patogenicidade dos conídios de B. bassiana produzidos nos diferentes substratos foi avaliada no cupim do coqueiro. A taxa de mortalidade dos cupins infectados não diferiu estatisticamente superando 80 % de mortalidade com exceção do grupo controle. A atividade enzimática (celulolítica, amilolítica) foi determinada pelo método DNS (ácido dinitrosalicílico). Os substratos utilizados na fermentação em estado sólido, malte A (1,178 ± 0,002 U/mL), malte B (2,392 ± 0,013 U/mL), fibra algaroba (0,596 ± 0,007 U/mL) e semente de acerola (0,964 ± 0,09 U/mL) apresentaram atividade amilolítica. A partir dessa análise, diferentes temperaturas foram avaliadas (30°, 40º, 50º, 60º, 65º e 70º C) para identificar a temperatura ótima das enzimas amilolíticas produzidas nesse processo. Observou-se que as maiores atividades encontradas foram em temperaturas extremas, na faixa de 60º a 70ºC, sugerindo que essas enzimas são termofílicas. O bagaço de cana de açúcar apresentou maior atividade celulolítica (15,29 ± 0,07 U/mL) para CMcase e (2,58 ± 0,9 U/mL) para FPase devido à característica de sua matriz celulósica, que difere dos demais substratos. A atividade proteolítica foi quantificada utilizando a azocaseína. A algaroba apresentou a maior atividade (0,514 ± 0,009 U/mL). Os substratos alternativos utilizados para crescimento e esporulação de B. bassiana podem fornecer uma redução de aproximadamente 50 % nos custos de produção de conídios de fungos entomopatogênicos utilizados no controle biológico de vários insetos-praga. Além disso, apresentam-se como alternativa viável para a produção de enzimas microbianas com aplicação ampla em diversos processos biotecnológicos.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz Objetivos: Este estudo teve como objetivos: (i) avaliar a caraterização de estirpes Candida, isoladas na cavidade oral de participantes diabéticos e não diabéticos com próteses removíveis. (ii) estudar a caraterização patogénica associada aos isolados encontrados de Candida sp. através da expressão de enzimas hidrolíticas como as proteinases e as fosfolipases, comparar essa caraterização nos dois grupos de participantes diabéticos e não diabéticos. Materiais e Métodos: Foram observados, na Clínica Universitária Egas Moniz, 70 participantes, de ambos os sexos, portadores de próteses removíveis. Destes, 36 eram diabéticos tipo 2 e 34 não diabéticos. A recolha das amostras foi realizada na área subjacente à prótese removível da cavidade oral dos pacientes através de uma zaragatoa estéril. Estas recolhas foram tratadas posteriormente no laboratório do ISCSEM, de modo, a obter os objetivos acima indicados. Os resultados obtidos foram analisados em SPSS. Resultados: Das 70 amostras observadas foi possível identificar 2 estirpes Candida sp., especificamente, em que, C. albicans, foi a espécie mais prevalente nos dois grupos de estudo, diabético (30%) e não diabético (34,29%). Enquanto que C. tropicalis foi detetada numa menor percentagem, tanto no grupo diabético (5,71%) como no não diabético (7,14%). Foi possível verificar a patogenicidade nas espécies isoladas, através da expressão de enzimas extracelulares como fator de virulência. Estas enzimas foram expressas em maior percentagem no grupo diabético. C. albicans para além de ter sido a espécie prevalente também revelou ser a espécie com maior capacidade patogénica (72,22%). Conclusão: Os resultados permitiram concluir que existe uma relação entre a perda dentária e a doença DM em idades mais avançadas, em que, poderão ser considerados fatores de predisposição à colonização por Candida sp. na cavidade oral. C. albicans, foi a espécie mais prevalente em ambos os grupos e apresentou a maior capacidade de expressar proteinases e fosfolipases. No entanto, não foram encontradas diferenças estatisticamente significativas (P>0.05) entre o grupo diabético e o grupo controlo em relação à colonização por Candida sp. e os seus respetivos fatores de virulência.

Aeromonas spp. são bactérias Gram-negativas relacionadas, principalmente, a ecossistemas aquáticos. Estas bactérias são consideradas patógenos oportunistas de diversos animais, inclusive o homem. Algumas espécies gênero Aeromonas secretam uma ampla variedade de enzimas extracelulares, dentre elas β-lactamases, lípases, amilases, proteases, e nucleases entre outras. As nucleases podem desempenhar múltiplos papéis relacionados ao metabolismo, à proteção contra a entrada de material genético exógeno e, em alguns casos, como fator de virulência. Neste contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar as diferenças nas atividades de DNases extracelulares e o perfil eletroforético entre espécies e isolados do gênero Aeromonas; a clonagem e expressão heteróloga, caracterização frente a fatores físicos/químicos que afetam a atividade enzimática e análise de bioinformática das DNases Dns e Aha3441, bem como a avaliação da expressão dos gene nuc, dns e aha3441 de Aeromonas hydrophila IBAer119. Os resultados mostraram uma ampla variação intra e interespecífica na atividade de DNases extracelulares, sem diferença significativa entre isolados clínicos e ambientais. Zimogramas dos isolados de Aeromonas spp., empregando DNA como substrato, possibilitaram a identificação de diferentes perfis de atividade DNásica. Um total de seis bandas de massa molecular aparente variando entre 22 e 119 KDa foram identificadas. As bandas de 22 e 85 KDa foram as mais frequentes entre os isolados de Aeromonas spp. analisados. As DNases secretadas por A. hydrophila IBAer119 são afetadas pela ação de proteases produzidas pelo próprio isolado. A avaliação da expressão dos genes dns, aha3441 e nuc de A. hydrophila IBAer119 permitiu observar maiores taxas transcricionais para os genes dns e aha3441, as quais, coincidem com o pico de atividade DNásica extracelular. As DNases extracelulares identificadas no isolado de A. hydrophila IBAer119 não desempenham preferencialmente, um papel nutricional, sugerindo que sua função pode estar relacionada à proteção contra entrada de DNA exógeno ou à virulência. As enzimas Dns e Aha3441 provenientes de A. hydrophila IBAer119 foram clonadas e expressas de forma heteróloga em Escherichia coli DH5α. Ambas DNases utilizam Mg como co-fator e são inibidas por EDTA e SDS. A avaliação permitiu observar que Dns e Aha3441 apresentam pHs de ação entre 7,0 e 9,0 e temperaturas de atividade entre 37°C e 60°C, para Dns, e temperaturas de atividade entre 37°C e 50°C, para Aha3441. Ambas DNases apresentam elevada estabilidade térmica quando mantidas a 40°C por até 50 minutos. Tanto Dns quanto Aha3441 apresentaram capacidade de degradar RNA e DNA sendo assim caracterizadas como nucleases açúcar não especificas. A análise da sequência proteica permitiu identificar a presença de um peptídeo sinal de 20aa para a enzima Dns e 23aa para a enzima Aha3441, indicando que estas enzima são secretadas por sistema secII. Além disso, a avaliação de bioinformática permitiu identificar que Dns apresenta um domínio correspondente à superfamília da Endonuclease I e apresenta elevado grau de similaridade com DNases de outros gêneros bacterianos. Já a DNase Aha3441 apresenta domínios correspondentes à superfamília EEP e a subfamília OB folds, similares aos observados em outra DNase de Aeromonas spp. denominada Nuc. O modelo tridimensional de Dns permitiu observar a presença de um sítio catalítico com topologia ββα-metal, típico de outras endonucleases. Já o modelo tridimensional de Aha3441 permitiu observar uma elevada similaridade conformacional com a cadeia D da DNase pancreática bovina (BP DNase I). Além disso, os sítios de ligação a metais, sítios de ligação a fosfato e sítio catalítico apresentam elevado grau de conservação quando comparados com homólogos encontrados em outras bactérias e mesmo em relação à BP DNase I, indicando que Aha3441 compartilha o mesmo mecanismo de ação. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior, CAPES. Aeromonas spp. are Gram-negative bacteria generally associated to aquatic ecosystems. These bacterial are considered opportunistic pathogens of various animals, including man. Some species of this genus can secrete a wide variety of extracellular enzymes, such as, β-lactamases, lipases, amylases, proteases, nucleases, among others. Nucleases can play multiple roles related to metabolism, protection against exogenous genetic material and, in some cases, virulence factor. In this context, the aim of this study was to evaluate the differences in extracellular DNases activities and electrophoretic profiles between species and isolates of Aeromonas spp., cloning and heterologous expression of nucleases, effect of physical/chemical factors on the enzyme activity, evaluation of nuc, dns and aha3441 expression, and bioinformatics analysis of DNases Dns and Aha3441. The results showed a wide variation in intra- and interspecific DNases extracellular activity, without significant difference between clinical and environmental isolates. DNase zymograms of Aeromonas spp. isolates, using DNA as a substrate, allowed the identification of different DNase activity profiles. A total of six bands of apparent molecular mass ranging between 22 and 119 KDa were identified. Bands of 22 and 85 KDa were the most frequent among Aeromonas spp. isolates analyzed. The Dnases secreted by Aeromonas hydrophila IBAer119 are affected by the action of proteases produced by the isolate itself. The evaluation of dns, aha3441 and nuc gene expression of A. hydrophila IBAer119 allowed observing high transcription rates for dns and aha3441 genes, which coincide with the peak of extracellular DNase activity. Extracellular DNases identified in isolated A. hydrophila IBAer119 do not play preferably a nutritional role, indicating that its function can be related to protection against exogenous DNA or virulence. The enzymes Dns and Aha3441 from A. hydrophila IBAer119 were cloned and heterologously expressed in Escherichia coli DH5α. Both DNases uses Mg as a cofactor and are inhibited by EDTA and SDS. Experimental data indicates that Dns and Aha3441 have maximal activity at pHs between 7.0 and 9.0, and temperatures between 37°C and 60°C, for Dns, and between 37°C and 50°C, for Aha3441. Both enzymes exhibited high thermal stability when kept at 40°C for 50 minutes. Dns and Aha3441 showed ability to degrade RNA and DNA characterizing them as sugar non-specific nucleases. The sequence analysis of the protein identified the presence of a signal peptide with 20aa, for Dns enzyme, and 23aa, for Aha3441 enzyme, indicating that these enzymes are secreted by secII system. Moreover, the bioinformatics evaluation of the Dns allowed identifying an Endonuclease I superfamily domain, and with high similarity with DNases of the others bacterial genera. DNase Aha3441 has an EEP superfamily domain and OB subfamily folds, similar to those observed in another Aeromonas DNase called Nuc. The threedimensional model of Dns indicates the presence a catalytic site with ββα-metal topology, typical of other endonucleases. The three-dimensional model of Aha3441 showed high conformational similarity with the D chain of the BP DNase I (bovine pancreatic DNase). In addition, the metal binding, the phosphate binding, and the catalytic sites of Aha3441 showed high degree of conservation when compared with homologs of other bacteria, and even BP DNase I, indicating that Aha3441 shares the same mechanism of action.

The dynamics of mesophilic and thermophilic bacterial population was studied in the bulk soil and rhizosphere of the grass Aristida adscensionis L. in a caatinga of the semi-arid Brazilian Northeast. Mesophilic heterotrophic bacteria, sporeforming bacteria and actinomycetes were significantly more abundant than thermophiles, and their counts were 10(6) - 10(7) CFU g-1 dry soil, showing weak fluctuations over the one-year study period. Thermophiles were below 10(6) CFU g-1 dry soil and, in general, demonstrated stronger fluctuations over the studied period. Among them, thermophilic actinomycetes showed the greatest decline during the dry season. No significant differences in microbial number were observed between bulk and rhizosphere soil. Mesophilic bacteria were represented mainly by Gram positive, filamentous organisms (actinomycetes) and by Gram positive, endospore-forming, rod-shaped organisms. All isolates of thermophilic bacteria were Gram positive, endospore-forming rods. Most of mesophilic isolates produced amylases and proteases, and 38% of isolates produced all studied extracellular enzymes: amylases, proteases, cellulases and chitinases. Among thermophilic bacteria, all isolates showed proteolytic activity and 77% produced amylases, but no one produced cellulases or chitinases.A dinâmica das populações bacterianas meso e termofílicas foi estudada no solo sem raízes e rizosférico associado à gramínea Aristida adscensionis L. na caatinga da zona semi árida do nordeste brasileiro. As bactérias totais heterotróficas, as bactérias esporuladoras e actinomicetos mesofílicos foram significativamente mais abundantes que os termofílicos, suas contagens variando na ordem de 10(6) - 10(7) UFC g-1 de solo seco, apresentando flutuações discretas ao longo de um período de um ano. Microrganismos termófilos foram encontrados numa ordem de 10(6) UFC g-1 de solo seco e demonstraram, em geral, flutuações mais evidentes durante o mesmo período de estudo. Entre os termófilos, os actinomicetos apresentaram um maior declínio durante a estação seca. Nenhuma diferença significativa no número de microrganismos foi observada entre o solo rizosférico e o solo não rizosférico. As bactérias mesofílicas mais observadas foram as filamentosas Gram positivas (actinomicetos) e os bastonetes esporulantes Gram positivos. Todos os isolados termofílicos foram bactérias esporuladoras Gram positivas em forma de bacilo. A maioria dos isolados mesofílicos produziu amilases e proteases, enquanto que 38% das linhagens produziram todas as enzimas extracelulares estudadas: amilases, proteases, celulases e quitinases. Entre as bactérias termofílicas, todos os isolados apresentaram atividade proteolítica e 77% produziram amilases, mas nenhum produziu quitinases ou celulases.

Dissertação para obtenção do grau de Mestre no Instituto Superior de Ciências da Saúde Egas Moniz Objetivos: Avaliar a prevalência do género Candida sp. na cavidade oral de indivíduos diabéticos e não diabéticos, ambos não portadores de prótese dentária; avaliar os fatores de virulência de Candida sp. associados às espécies isoladas e ao grupo portador e relacionar os valores de HbA1c com a colonização por Candida sp.. Material e Métodos: A amostra incluiu 117 indivíduos de ambos os géneros. A recolha das amostras foi efetuada na Clínica Dentária Universitária do ISCSEM e no laboratório de análises clínicas Lumilabo. Após leitura e assinatura do consentimento informado, foi recolhida uma amostra da mucosa oral com auxilio de uma zaragatoa estéril com meio de transporte. No laboratório de Microbiologia do ISCSEM, as amostras foram inoculadas em meios específicos e identificadas, para que se realizassem os testes fenotípicos. Para tratamento estatístico foi usado o programa IBM SPSS. Resultados: Dos indivíduos incluídos na amostra, 56,4% eram diabéticos, e 43,6% pertenciam ao grupo controlo. Foi possível verificar a presença de Candida sp. em 43,9% no grupo de estudo e 17,6% no grupo controlo. Candida albicans (C. albicans) foi a espécie mais prevalente. Quanto à capacidade de expressar: (i) proteinases, verificou-se que das 38 estirpes isoladas, 36,8% expressaram estas enzimas e 29% correspondiam a estirpes isoladas da cavidade oral de diabéticos; (ii) fosfolipases, verificou-se que 68,4% produziram estas enzimas e 50% foram isoladas de diabéticos. Quanto à HbA1c ≥ 6,5% vs colonização por Candida sp.: 67,9% apresentavam HbA1c ≥ 6,5% e estavam colonizados e 72,4% tinham HbA1c ≥ 6,5 mas não estavam colonizados por estes fungos leveduriformes. Conclusão: Ser diabético é um fator importante para a colonização por Candida sp. na cavidade oral. C. albicans foi a espécie mais prevalente e a que apresentou maior capacidade de expressar proteinases e fosfolipases. A HbA1c descontrolada não apresentou significado estatístico para colonização por Candida sp.

The present study was done in order to identify the fungus invading some of the supralittoral ponds used for shrimp aquaculture in the CIBNOR facilities in La Paz, Baja California Sur (BCS), México during the summer season. From the walls and bottoms of the ponds, two strains of Geotrichum spp. were isolated and morphologically identified. Fungal adhesion towards hemocytes and primary cultures of various white shrimp (Litopeneaus vannamei) tissues (gill, tegument, and gut) was analyzed to determine infectivity. Extracellular protease, lipase, and amylase activity were evaluated as virulence factors. Survival of shrimp post-larvae (PL8) exposed to fungal culture supernatant or to their filaments was also investigated. The results showed that shrimp tegument cells and hemocytes were very susceptible to Geotrichum spp. invasion, and that this fungus provokes great mortality of post-larvae. Hence, Geotrichum spp. could be considered an opportunistic pathogen that might represent a serious health risk to shrimp in culture. El presente trabajo se realizó con el fin de identificar hongos que invaden algunos de los estanques supralitorales utilizados para el cultivo del camarón en la instalación del CIBNOR, en La Paz, BCS, México durante la temporada de verano. De las paredes y el fondo de los estanques se aislaron e identificaron morfológicamente dos cepas de Geotrichum spp. Se analizó la adhesividad de hongos hacia cultivos primarios de diversos tejidos (hemocitos, branquias, tegumento, e intestino) de camarón blanco (Litopeneaus vannamei) para determinar la infectividad. La actividad de lipasas, amilasas, y proteasa extracelular, fueron evaluadas como factores de virulencia. También se evaluó la supervivencia de post-larvas (PL8) de camarones expuestos a los sobrenadantes del cultivo o filamentos de hongos. Los resultados muestran que las células de tegumento y hemocitos de camarón son susceptibles a la invasión por Geotrichum spp. y que este hongo provoca gran mortalidad de post-larvas de camarón. Por lo tanto, Geotrichum spp. puede ser considerado un patógeno oportunista que podría representar un riesgo grave para la salud de los camarones en cultivo.

The present study was done in order to identify the fungus invading some of the supralittoral ponds used for shrimp aquaculture in the CIBNOR facilities in La Paz, Baja California Sur (BCS), México during the summer season. From the walls and bottoms of the ponds, two strains of Geotrichum spp. were isolated and morphologically identified. Fungal adhesion towards hemocytes and primary cultures of various white shrimp (Litopeneaus vannamei) tissues (gill, tegument, and gut) was analyzed to determine infectivity. Extracellular protease, lipase, and amylase activity were evaluated as virulence factors. Survival of shrimp postlarvae (PL8) exposed to fungal culture supernatant or to their filaments was also investigated. The results showed that shrimp tegument cells and hemocytes were very susceptible to Geotrichum spp. invasion, and that this fungus provokes great mortality of post-larvae. Hence, Geotrichum spp. could be considered an opportunistic pathogen that might represent a serious health risk to shrimp in culture.

With the purpose to evaluate Candida albicans virulence in vivo, two strains selected were based on their phospholipase and proteinase activity, and used in a model of experimental infection. One strain, isolated from vaginal secretion, was stocked at the URM Culture Collection for 43 years and presented high phospholipase (Pz=0.217) and proteinase (1.386 U.mL-1) activity. The other strain was a fresh strain isolated from oropharyngeal secretion of an AIDS patient, and presented low phospholipase (Pz=0.482) and proteinase (0.780 U.mL-1) activity. The strains were inoculated via intraperitoneum in immunosuppressed and non-immunosuppressed mice (Mus musculus) and the infection was evaluated over a period of 21 days. Liver, spleen, lungs and kidneys were aseptically removed and the blood of the animals was collected every 72 h. The number of colony forming units (c.f.u) isolated from each organ was counted and a histopathologic examination was performed. The freshly isolated strain was more virulent than the stocked strain, as shown by the number of positive cultures and severity of the lesions observed at the histopathologic examination. A correlation between the in vitro enzymatic activity and the in vivo virulence was not observed.Com o objetivo de avaliar a virulência de Candida albicans in vivo, foram selecionadas duas cepas de acordo com a atividade enzimática de fosfolipase e protease, para utilização em modelo de infecção experimental. Utilizou-se um isolado de secreção vaginal, estocado na Micoteca URM por 43 anos com alta atividade de fosfolipase (Pz=0.217) e de protease (1.386 U.mL-1), e outro recém-isolado de secreção orofaríngea de paciente com AIDS, o qual apresentou baixa atividade de fosfolipase (Pz=0.482) e de protease (0.780 U.mL-1). As amostras foram inoculadas por via intra-peritoneal em camundongos (Mus musculus) na presença e ausência de imunossupressão e a infecção foi avaliada durante 21 dias. A cada 72 h foram assepticamente removidos o fígado, baço, pulmões e rins e coletado o sangue desses animais. Foi quantificado o número de unidades formadoras de colônias (u.f.c.) recuperadas de cada órgão e realizada avaliação histopatológica dos mesmos. A cepa recém-isolada mostrou-se mais virulenta in vivo, quanto ao número de culturas positivas e à severidade das lesões observadas ao exame histopatológico. Não foi observada correlação entre a atividade enzimática in vitro e a virulência in vivo.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Agrárias, Programa de Pós-Graduação em Recursos Genéticos Vegetais, Florianópolis, 2015. A macieira é uma espécie frutícola de clima temperado de maior importância comercial, tanto no contexto internacional, quanto no nacional. No sul do Brasil e Uruguai, a cultura é severamente afetada por doenças típicas de clima tropical, entre elas merece destaque a mancha foliar de Glomerella (MFG) e a podridão amarga (PA), ambas causadas por espécies do gênero Colletotrichum. A MFG e a PA podem ocorrer simultaneamente nos pomares, porém possuem muitas diferenças no que se refere à capacidade de infecção. Dessa forma, o principal objetivo deste trabalho foi identificar e caracterizar isolados de Colletotrichum que afetam as folhas e os frutos de macieira no sul do Brasil e Uruguai e investigar os principais mecanismos bioquímicos envolvidos no processo de infecção em folhas. No estudo de diversidade, o sequenciamento de três regiões gênicas (ITS, GAPDH e TUB2) permitiu a identificação de três espécies causadoras de PA e MFG no Brasil, Colletotrichum fructicola, Colletotrichum karstii e Colletotrichum nymphaeae; e três espécies causadoras de PA no Uruguai, Colletotrichum fructicola, Colletotrichum theobromicola e Colletotrichum melonis. Além disso, a análise filogenética e multivariada agrupou os isolados em três diferentes complexos de espécies, Colletotrichum gloeosporioides, Colletotrichum boninense e Colletotrichum acutatum. No teste de patogenicidade em frutos, todos os isolados brasileiros provenientes de PA causaram podridão em frutos com ferimentos, mas apenas 5 em frutos sem ferimentos. No entanto, todos os isolados uruguaios causaram podridão em frutos com e sem ferimentos. Em folhas, todos os isolados brasileiros de MFG e 11 de PA foram capazes de causar mancha foliar, enquanto que somente um isolado uruguaio de PA possuiu essa capacidade. Na produção de enzimas extracelulares, o isolado de PA apresentou os maiores níveis de laccase e pectina liase em meio líquido comparado ao isolado de MFG. Em folhas de macieira, o isolado de MFG apresentou apressórios predominantemente sésseis, enquanto que os de PA foram pedicelados. O isolado de PA exibiu mais conídios com múltiplos apressórios melanizadosprovavelmente como um sinal das múltiplas tentativas de infecção. O acúmulo de H2O2 foi raramente observado nos sítios de infecção, e o escurecimento em algumas células epidérmicas não foi associado à reação de hipersensibilidade. Folhas inoculadas com o isolado de MFG aumentaram a perda de eletrólitos 48 h após a inoculação (HAI), o reflete a transição do fungo da fase biotrófica para a necrotrófica. Em relação à atividade das enzimas envolvidas com o estresse oxidativo, os dois isolados testados aumentaram a atividade das enzimas guaiacol peroxidase, catalase e glutationa redutase, porém de forma diferenciada ao longo do tempo. A atividade da ascorbato peroxidase apresentou um aumento 6 HAI com o isolado de MFG, enquanto que a atividade da superóxido dismutase não foi afetada. Plantas inoculadas com o isolado de MFG tiveram um menor acúmulo de H2O2 48 HAI, o que pode indicar a eficiência das enzimas antioxidantes na eliminação de espécies reativas de oxigênio e em evitar a morte celular. Os isolados de MFG parecem ter um mecanismo para suprimir as respostas de defesa da planta. Abstract : Apple is one of the most important fruit of temperate climate in the international and national context. In Southern Brazil and Uruguay, it is severely affected by tropical climate diseases, such as, glomerella leaf spot (GLS) and apple bitter rot (ABR), both caused by Colletotrichum spp. GLS and ABR can occur simultaneously in orchards, but have clear differences in tissue specialization. Thus, the main objective of this work was to identify and characterize Colletotrichum isolates that affects leaves and fruits in Southern Brazil and Uruguay and investigate biochemical mechanisms involved during the leaf infection process. In diversity studies, sequencing of three gene regions (ITS, GAPDH and TUB2) allowed the identification of three species causing ABR and GLS in Brazil, i.e., Colletotrichum fructicola, Colletotrichum karstii, and Colletotrichum nymphaeae; and three species causing ABR in Uruguay, i.e., Colletotrichum fructicola, Colletotrichum theobromicola, and Colletotrichum melonis. Furthermore, phylogenetic and multivariate analysis clustered the isolates into three different species complexes, C. gloeosporioides, C. boninense and C. acutatum. In pathogenicity test, Brazilian isolates caused ABR in wounded fruits, but only five in non-wounded ones. Uruguayan isolates produced symptoms in fruits with or without previous wounding. All Brazilian isolates from GLS and eleven from ABR were able to cause GLS symptoms, while a sole Uruguayan ABR-isolate caused leaf spot symptom. In culture, ABR-isolate exhibited higher levels of laccase and pectin lyase, but not polygalacturonase. On leaves, GLS-isolate formed appressoria mostly sessile, while ABR-isolate pedicellate. ABR-isolate germlings formed multiple melanized appressoria probably as a sign of unsuccessful infection attempts. H2O2 accumulation was rarely visualized at infection sites and was not associated with hypersensitive response. GLS-isolate markedly increased the electrolyte leakage at 48 hours after infection (HAI) reflecting its transition from the biotrophic into the necrotrophic phase. Both isolates influenced differently oxidative stress enzymes,increasing the activities of guaiacol peroxidase, catalase and glutathione reductase at different times, except for superoxide dismutase that remained unaltered. Ascorbate peroxidase activity was only affected with GLS-isolate at 6 HAI. GLS-isolate reduced H2O2 accumulation in leaves at 48 HAI, suggesting that antioxidative enzymes act more efficiently in scavenging reactive oxygen species and avoiding cell death. GLS-isolate seems, therefore, to have a mechanism to suppress plant defence responses.

The verrucose caused by Cladosporium herbarum reduces production and quality of Passion fruit (Passiflora edulis Sims.), a largely consumed tropical fruit. This work aimed to investigate the antagonism of Trichoderma species (T. polysporum, T. koningii, T. viride and T. harzianum) against Cladosporium herbarum, and to study the production of extracellular hydrolytic enzymes by the pathogen and the antagonists. The results showed considerable antagonistic potential for the biocontrol of C. herbarum isolates by all Trichoderma species, except T. koningii. The most distinguished effect was observed for T. polysporum. In relation to the pattern of esterase obtained by electrophoresis in poliacrylamyde gel, the major activity presented by the isolates was observed after five days of incubation. The C. herbarum isolates produced extracellular enzymes, lipase, pectinase, cellulase, and protease, all possibly related to the infection process. Amylase excretion, not known to be associated with phytopathogens, was detected in Trichoderma species, but not in C. herbarum. In addition to amylase, all Trichoderma species tested produced also extracellular cellulase and pectinase, except T. koningii in relation to the latter enzyme. The demonstration of various esterase isoenzymes in zymograms of the Trichoderma species and C. herbarum isolates was markedly improved by washing the mycelia with detergents or EDTA. This fact suggested that a major fraction of extracelular enzymes may remain attached to outside fungal cell wall after being excreted.O maracujá (Passiflora edulis Sims.), um fruto tropical amplamente consumido, tem sua produção e a qualidade dos seus frutos reduzidos pela verrugose causada por Cladosporium herbarum. Este trabalho objetivou investigar o antagonismo de espécies de Trichoderma (T. polysporum, T.koningii, T. viride e T. harzianum) contra C. herbarum, e estudar a produção de enzimas hidrolíticas extracelulares pelo fitopatógeno e antagonistas. Os resultados mostraram considerável potencial antagônico para o biocontrole dos isolados de C. herbarum por todas as espécies de Trichoderma, exceto T. koningii. O efeito mais promissor foi observado para T. polysporum. Em relação ao padrão de esterase obtido por eletroforese em gel de poliacrilamida, a maior atividade apresentada pelos isolados foi observada cinco dias após a incubação. Os isolados de C. herbarum produziram enzimas extracelulares, lipase, pectinase, cellulase e protease, todas possivelmente relacionadas ao processo de infecção do hospedeiro. A excreção de amilase que parece não estar associada com fitopatógenos foi detectada nas espécies de Trichoderma, mas não em C. herbarum. Além disso, todas as espécies de Trichoderma testadas produziram também celulase e pectinase, exceto T. koningii com relação a esta última enzima. A demonstração de várias isoesterases no zimograma das espécies de Trichoderma e isolados de C. herbarum, foi notavelmente melhorada através da lavagem do micélio com detergentes ou EDTA. Este fato sugere que uma grande fração de enzimas extracelulares pode permanecer presa externamente na parede celular fúngica após excreção.

Dermatophytes, capable to use keratin of the host for nutrition, belong to one of the major groups of pathogenic fungi. Since dermatophytes are a closely related group they share various common features, and the morphology of isolates of a given species can be atypical, making species identification and differentiation even more difficult. Many methods have been explored in attempts to distinguish dermatophytes, but the combined use of different approaches for the investigation of the intraspecific and interspecific variability of Trichophyton continues to be scarce. Some studies have shown that amplified fragments of the small ribosomal DNA subunit 18S contains variable regions which can be used to discriminate between medically relevant yeast species, indicating that these regions could also be used for differentiation between dermatophytes. In our study, sequence analysis of the 18S-rDNA gene was combined with morphological and biochemical criteria in order to detect genetic differences between seven Trichophyton isolates and estimate their phylogenetic relationships. The results show that the isolates investigated belong to the Trichophyton group, which potentially contains the Trichophyton rubrum cluster. Os dermatófitos formam um dos principais grupos de fungos patogênicos, caracterizados pela utilização da queratina do hospedeiro para sua nutrição. Por se constituírem um grupo de fungos intimamente relacionados, compartilham uma série de características comuns. Além disto, a morfologia de isolados de determinadas espécies pode ser atípica, tornando a identificação das espécies ainda mais difícil. Muitos métodos vêm sendo explorados na tentativa de distinguir dermatófitos, porém a associação de diferentes abordagens para a investigação da variabilidade intra e interespecífica de Trichophyton permanece escassa. Alguns trabalhos têm demonstrado que apesar de conservados, os fragmentos amplificados da seqüência correspondente à subunidade ribossomal menor 18S, contêm regiões conhecidas por sua variabilidade e capacidade de distinção entre espécies de levedura de importância médica, indicando que esta região também pode ser útil na diferenciação dos dermatófitos. Nesse estudo, a análise da seqüência do DNA ribossomal 18S foi combinada com critérios morfológicos e bioquímicos com o objetivo de se detectar possíveis diferenças genéticas entre sete isolados e estimar suas relações filogenéticas. Os resultados mostram que os isolados investigados pertencem ao grupo Trichophyton, o qual pode potencialmente conter o cluster Trichophyton rubrum.

Con el fin de seleccionar las bacterias marinas con la capacidad de producir enzimas extracelulares ( CEE ) , se analizaron muestras de Argopecten purpuratus y Crassostrea gigas en el cultivo , así como de otros invertebrados interticlal y bentónicos. La selección de cepas de la CEE de productores se llevó a cabo en Agar Marino ( MA ) con la adición del sustrato relevante ( almidón , caseína , Tween - 80 , lecitina , ADN y gelatina ) . La CEE evaluación cepas productoras se llevó a cabo en 102 aislamientos . Los resultados muestran que las bacterias asociadas TOA . purpuratusand C. gigashave las mejores actividades multienzimáticos ; Sin embargo , Semimytilus algosus, Tetrapigus niger y Thais chocolata también son fuentes importantes de productores de bacterias de la CEE. La actividad multienzimático cualitativa en MA ( zonas claras u opacas alrededor de las colonias en mm de diámetro ) varió de 6 a > 16 mm . La frecuencia de la producción multienzimático fue caseinase 62,74 % , entre esterasa 57,84 % , 52,94 % de la amilasa , la gelatinasa 38,23 % , 33,3 % DNAsa , agarasa 5,43 % y 90,0 % lecitinasa . Los resultados sugieren la posibilidad de usar cepas nativas para fines biotecnológicos

Os sapais são ecossistemas dinâmicos e contribuem para a defesa da linha costeira e conservação da biodiversidade. As plantas libertam exsudados na rizosfera que influenciam fortemente as comunidades de microrganismos e consequentemente a libertação de enzimas extracelulares. Estas enzimas estão envolvidas na decomposição de resíduos orgânicos e no ciclo de nutriente do solo sendo um indicador da atividade microbiana, nomeadamente da sua composição e abundância. Este estudo teve como principal objetivo a análise da atividade enzimática no rizosedimento de duas espécies de sapal, S. maritima e S. versicolor no estuário do Tejo durante 4 períodos temporais: Novembro 2012, Fevereiro 2013, Maio 2013 e Fevereiro 2014. Os resultados mostraram diferenças na atividade das enzimas fenol oxidase, β-glucosidase, fosfatase alcalina, quitobiase, sulfatase, desidrogenase (p-value < 0,05) entre espécies e entre períodos de amostragem. O pH, salinidade, matéria orgânica e humidade influenciam a atividade enzimática e os exsudados influenciam a atividade enzimática, tendo-se verificado uma separação das duas espécies; ABSTRACT: “Temporal variation of enzymatic activity associated with the microorganisms living in the Spartina maritima and Spartina versicolor rizosediment” Saltmarshes are dynamic ecosystems and contribute to defence of the coastline and biodiversity conservation. Plants release exudates that have a strong influence on the microorganisms communities present on the rhizosphere and consequently in the release of extracellular enzymes. This enzymes are involved in organic residues decomposition and nutrient cycle of the soil, being a good indicator of microbial activity, composition and abundance. The main goal of this study was the analysis of enzymatic activity of the rizosediment of two saltmarsh plant species, S. maritima and S. versicolor on Tagus estuary in four temporal periods: November 2012, February 2013, May 2013 and February 2014. The results show significant differences in phenol oxidase, β-glucosidase, acid phosphatase, alkaline phosphatase, quitobiase, sulfatase, dehydrogenase, protease and urease enzymatic activity (p-value < 0.05) between species and between sampling periods. The environmental factors such pH, salinity, organic matter and humidity also influence the enzymatic activity and exudates leading to separation by specie.

O presente trabalho teve por objetivos coletar, isolar, identificar e comparar fungos endofíticos associados às plantas de cafeeiro cultivadas sob diferentes manejos; avaliar o potencial biotecnológico e enzimático dos fungos selecionados e correlacionar este potencial enzimático com a capacidade de remediação destes fungos sobre o corante têxtil Brilhante Azul de Remazol (RBBR) e efluentes gerados por indústrias têxteis. Foram coletadas folhas de plantas de cafeeiros mantidos sob manejos orgânico e convencional. Foram identificadas 39 morfoespécies de fungos endofíticos dentre os isolados provenientes do sistema orgânico e 27 morfoespécies oriundas do sistema convencional. Sete isolados degradaram o corante RBBR disposto em meio de cultura sólido e os quatro que apresentaram melhor descoloração detectada visualmente [CO. 5, CO. 10 (Colletotrichum sp.), CO.11a e CC. 22 (Aspergilllus niger)] e o fungo padrão Lentinula edodes (INCQS 40220) foram analisados quanto à capacidade de produção de enzimas ligninolíticas e capacidade de descoloração em efluente sintético com e sem acréscimo de madeira. Todos os fungos analisados foram capazes de secretar Lacase e/ou Manganês peroxidase e de promover a descoloração do corante RBBR. Os fungos CO.5 e CO.10 apresentaram resultados promissores em efluente sintético, promoveram descoloração e secretaram enzimas do sistema ligninolítico. No entanto, A. niger (CC.22) foi mais eficiente, removendo 94,67% da cor em apenas 48 horas e foi selecionado para a análise de biodegradação do efluente têxtil. Nas análises em efluente têxtil A. niger (CC.22) foi capaz de produzir enzimas e remover até 72,22% de cor também em 48 horas de incubação, reforçando a hipótese de que este fungo basiomiceto apresenta potencial para ser avaliado em sistemas de remediação de poluentes, como os efluentes texteis. This study aimed to collect, isolate, identify and compare endophytic fungi associated with coffee plants grown under different managements; evaluate the enzymatic and biotechnological potential of selected fungi and correlate with the potential remediation ability of these fungi for textile dye Remazol Brilliant Blue (RBBR) and effluents generated by textile industries. We collected leaves of coffee plants kept under organic and conventional management systems. We identified 39 endophytic fungi morphospecies of isolates from organic system and 27 morphospecies from the conventional system. Seven isolates degraded dye RBBR arranged in solid medium and the four that showed better decolorization visually detected [CO. 5, CO. 10 (Colletotrichum sp.), CO.11a and CC.22 (Aspergilllus niger)] and standard fungus Lentinula edodes (INCQS 40 220) were analyzed for their capacity to produce ligninolytic enzymes and decolorization capacity in synthetic wastewater with and without addition of wood. All fungi studied secreted laccase and/or manganese peroxidase.It also promoted decolorization of the dye RBBR. Fungi CO.5 and CO.10 promoted discoloration and secreted enzymes ligninolytic, showing promising results in synthetic effluent. However, A. niger (CC.22) was more efficient, removing 94.67% of the color in only 48 hours and was selected for biodegradation analysis of textile effluent. In the analyzes in textile effluent A. niger (CC.22) was capable to produce enzymes and remove up to 72.22% color also at 48 hours of incubation, reinforcing the hypothesis that this basidiomycete fungus has potential to be measured in systems for pollutants remediation, such as textile effluents. Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Dissertação para obtenção do Grau de Mestre em Biotecnologia dos Recursos Marinhos apresentada à ESTM - Escola Superior de Turismo e Tecnologia do Mar do Instituto Politécnico de Leiria. As enzimas são as mais notáveis e altamente especializadas proteínas, apresentando na maioria das vezes eficiência catalítica superior à de catalisadores sintéticos, sendo a sua produção industrial, assegurada, maioritariamente, por algumas espécies de microrganismos. Os microrganismos provenientes de ambientes extremos desenvolvem mecanismos de adaptação, que lhes permite sobreviver em condições físico-químicas extremas, ou cenários contaminados. Podendo, portanto produzir enzimas ativos e/ou estáveis com elevado potencial biotecnológico e industrial. Apesar da recente proibição da sua utilização em tintas anti incrustantes, o tributilestanho (TBT) é um contaminante comum em sistemas aquáticos, sendo considerado uma das substâncias mais tóxicas já introduzidas no ambiente marinho. Neste sentido, microrganismos resistentes a TBT (capazes de crescer a 3mM de TBT) recolhidos de sete portos portugueses, foram isolados, caracterizados por rep-PCR e identificados por MALDI-TOF-MS. A atividade proteolítica e lipolítica extracelular destes isolados foram avaliadas. Os extratos lipolíticos foram submetidos a ensaios de otimização das condições de atividade pela metodologia de superfície de resposta e os extratos proteolíticos foram caracterizados por zimografia. A percentagem de isolados resistentes a TBT variou entre 0.08% (porto de Setúbal) e 7.67% (porto de Peniche). Por rep-PCR distinguiu-se 111 isolados diferentes, dos quais 14 produziram enzimas extracelulares. A maior parte dos extratos proteolíticos apresentaram atividade caseínolítica e gelatinolítica. Dos extratos lipolíticos testados, F3 e L2 demostraram ter atividade (8U/mL e 4 U/mL, respetivamente) a 30ºC e a pH 9, sendo lipases alcalinas. Os isolados produtores de enzimas extracelulares foram identificados como pertencendo aos géneros Serratia, Pseudomonas e Citrobacter. O nosso estudo comprovou que os isolados resistentes a TBT são capazes de produzir enzimas extracelulares com um grande potencial biotecnológico. As bactérias da Figueira e Leixões (F3 e L2) apresentaram atividade lipolítica alcalina, demostrando potencial aplicação na indústria de detergentes.

"El amaranto (Amaranthus hypochondriacus L.) es tolerante a las condiciones de semiaridez y se adapta a los suelos arenosos de la región central del Valle de México. A pesar de su importancia agronómica, poco se conoce sobre las interacciones suelo-planta- microbiota en esta especie vegetal. El objetivo del presente trabajo fue estudiar los cambios fenotípicos de la comunidad bacteriana en función de los caracteres fisiológicos y bioquímicos, y su contribución al enriquecimiento nutricional, en la rizocoraza de amaranto cultivado en un suelo arenoso del Valle de México. Se tomaron muestras de suelo de rizocoraza en cuatro épocas del cultivo (siembra, floración, cosecha y postcosecha); se purificaron y caracterizaron 38 aislados bacterianos considerando 8 pruebas fisiológicas y 34 bioquímicas. Los resultados revelaron un elevado potencial heterótrofo de la comunidad bacteriana. Un análisis de conglomerados y de distancia euclidiana de Ward, considerando las pruebas fisiológicas y bioquímicas aplicadas, separó los aislados en tres fenones, un par y un aislado solo; con base en dichos análisis y su comparación con las descripciones del Manual de Bergey, los aislados bacterianos podr ían pertenecer a las familias Bacillaceae, Enterobacter iaceae, Pseudomonadaceae y Streptomycetaceae. En relación a su capacidad degradativa, los aislados bacterianos procedentes de cosecha y postcosecha mostraron una mayor producción de enzimas extracelulares DNAsas, quitinasas, fosfatasas y esculinasas. Finalmente, se resaltó el potencial biotecnológico agrícola de los aislados bacterianos procedentes de la rizocoraza de amaranto."

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:46Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2012-12-14Bitstream added on 2014-06-13T19:25:23Z : No. of bitstreams: 1 doria_kmabs_dr_botfca.pdf: 1440184 bytes, checksum: df65e19a8245aa12b6f0eb1ae9944257 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Dentro do setor florestal há diferentes culturas implantadas de forma comercial no Brasil, dentre elas destacam-se o eucalipto, o pinus e a seringueira. A produção nacional de borracha seca (oriunda da seringueira) cresceu mais de oito vezes nos últimos 18 anos, e chegou a 130 mil toneladas em 2010. A produção interna está concentrada em São Paulo (57,8%), Bahia (14,05%) e Mato Grosso (11,53%). Como em outras culturas de plantio, a heveicultura enfrenta inúmeros problemas com doenças, entre elas as doenças das folhas, tronco e painel. No presente trabalho, o objeto principal foi o estudo da fusariose, cujos sintomas se iniciam a partir de trincas na casca, a partir do porta-enxerto, e segue em direção ao painel, causando o secamento ao redor desta lesão. Com o passar do tempo esta lesão cresce em tamanho e a casca acaba se desprendendo, tornando a árvore imprópria para a sangria. Os objetivos específicos foram à caracterização dos isolados obtidos e o conhecimento das diversidades genética e patogênica de isolados oriundos das principais regiões produtoras de látex no Brasil, utilizando para isso: a) caracterização morfológica e cultural; b) estudo de agressividade dos isolados; c) teste de resistência clonal; d) efeito de fungicidas no controle in vitro; e) caracterização genética, através de sequenciamento de regiões gênicas com valor taxonômico, como a região ITS e f) produção in vitro de enzimas extracelulares. Nas coletas de isolados e levantamento de dados de campo, verificou-se alguns talhões com 49,20% de incidência de seca patológica, com árvores atacadas em agregados ou reboleiras e o patógeno se distribuindo mais no sentido da linha de plantio, o agente foi caracterizado a nível de gênero como Fusarium spp. que é um fungo mitospórico, da classe forma Hyphomycetes, que produz conídios... In the Brazilian forestry sector there are different cultures, such as eucalyptus, pine and rubber, grown as a business. Domestic production of dry rubber (derived from the rubber tree) rose more than eight times in 18 years, and reached 130 thousand tons in 2010. Domestic production is concentrated in São Paulo (57.8%), Bahia (14.05%) and Mato Grosso (11.53%). As in other plantation crops, heveiculture faces numerous problems such as diseases, including diseases of the leaves, trunk and panel. In the present work, the main goal was the study of Fusarium, whose symptoms begin in the cracks in the bark, from the rootstock, and goes towards the panel, causing the bark around the injury to dry up. Over time the lesion grows in size and the bark ends up shedding, making the tree unsuitable for bleeding. Specific goals were characterizing the obtained isolates and cognition of the genetic and pathogenic diversity of isolates from the major latex producing regions in Brazil, using for this: a) morphological and cultural characterization b) study of the aggressiveness of isolates c) test of clonal resistance d) effect of fungicides on in vitro control e) genetic characterization by sequencing genic regions with a taxonomic value, such as the ITS region and f) in vitro production of extracellular enzymes. In the collections of isolates and survey field data, there were some plots with 49.20% of pathological incidence of drought, with trees... (Complete abstract click electronic access below)

A strong socio-economic development pressure in South Chile will more and more cause an impact to the present lakes and rivers. Nevertheless, our knowledge concerning the ecological structure and the microbial self-purification capabilities of these lacustrine water bodies is scant but essential for a future sustainable development of land and water use. We studied Lake Laja, a lake already heavily impacted by water diversions for hydropower generation and irrigation. Typical for the Andean region Lake Laja is an oligotrophic water body, limited by nitrogen nutrients. Only very low chlorophyll a and particulate organic carbon (POC) concentrations and a small abundance and biomass of bacteria (mainly ultramicrobacteria) and heterotrophic flagellates were encountered. Weak trophic interrelations were derived from a high bacteria-to-heterotrophic flagellate ratio. For the ten investigated extracellular enzymes (alkaline phosphatase, leucine, arginine-, glycine and tyrosine-aminopeptidase, α-, β-D-glucosidase, α-, β-D-galactosidase, N-acetyl-β-D-glucosaminidase), with the exception of α-D-glucosidase, a broad range of organic matter degradation activities was proven. Probably, due to the N-limitation, organic nitrogen hydrolysing extracellular enzymes reached activities on average of 45 % compared to other studies in oligotrophic waters. The possible effect of N-limitation on extracellular enzyme activities was more pronounced by cell specific extracellular enzymatic activity rates, which exceeded those of other oligotrophic water bodies on average by factor 2. The overall activities of all microbial extracellular enzymes studied proved to be dominated by the dissolved free external enzymes (up to 98 %) over the ectoenzymes which are associated with particulate organic matter (bacterial cell walls, particles, and aggregates). It is concluded that future socio-economic changes, dealing with watershed human intervention (accelerating inorganic and organic loads) as well as global change (temperature and precipitation changes) could lead to significant changes in the ecology of Lake Laja. La gran presión generada por el desarrollo socioeconómico del sur de Chile, está causando cada vez más un mayor impacto en los lagos y ríos allí presentes. Sin embargo, el conocimiento de la estructura ecológica y la capacidad microbiana de autodepuración de los cuerpos de agua lacustres es escasa, pero esencial para un futuro uso sostenible de los recursos agua y suelo. Se estudió el lago Laja, por ser un cuerpo de agua muy afectado por la extracción de agua para la generación de energía hidroeléctrica y el riego. Como es característico de la región andina, el lago Laja es oligotrófico limitado por nutrientes nitrogenados. Se encontraron bajas concentraciones de clorofila a y carbono orgánico particulado (POC), así como bajas abundancias y biomasa de bacterias (principalmente ultramicrobacteria) y de flagelados heterotróficos. Interrelaciones tróficas débiles se determinaron de la relación bacterias y flagelados heterotróficos. Para las diez enzimas extracelulares estudiadas (fosfatasa, leucina-, arginina-, glicina- y tirosina-aminopeptidasa, a-, b-D-glucosidasa, a-, b-D-galactosidasa, N-acetyl-b-D-glucosaminidasa), con la excepción de α-β-glucosidase, se analizó un amplio rango de actividad de degradación sobre la materia orgánica. Probablemente, debido a la limitación de nitrógeno, el N-orgánico hidrolizado por enzimas extracelulares alcanzó una actividad promedio de 45 %, comparada con otros estudios en aguas oligotróficas. El posible efecto de la limitación de N en la actividad enzimática extracelular, fue más pronunciado en las tasas de la actividad enzimática extracelular específicas, las cuales excedieron en un factor promedio de dos a las de otros cuerpos de aguas oligotróficos. En general, la actividad de todas las enzimas extracelulares microbianas estudiadas resultaron estar dominadas por enzimas externas disueltas libres (hasta el 98 %), más que por ectoenzimas asociadas a partículas de materia orgánica (paredes celulares de bacterias, partículas y agregados). De esta manera es posible concluir que los futuros cambios socioeconómicos, reflejados en el incremento de cargas orgánicas e inorgánicas, así como el efecto del cambio global (cambios en temperaturas y precipitaciones), podrían provocar cambios significativos en la ecología del lago Laja.

Enzymatic activity is an important property for soil quality evaluation. Two sequences of experiments were carried out in order to evaluate the enzymatic activity in a soil (Rhodic Eutrudox) amended with cattle manure, earthworm casts, or sewage sludges from the municipalities of Barueri and Franca. The activity of commercial enzymes was measured by microcalorimetry in the same soil samples after sterilization. In the first experiment, the enzyme activities of cellulase, protease, and urease were determined in the soil samples during a three month period. In the second sequence of experiments, the thermal effect of the commercial enzymes cellulase, protease, and urease on sterilized soil samples under the same tretaments was monitored for a period of 46 days. The experimental design was randomized and arranged as factorial scheme in five treatments x seven samplings with five replications. The treatment effects were statistically evaluated by one-way analysis of variance. Tukey´s test was used to compare means at p < 0.05. The presence of different sources of organic residues increased the enzymatic activity in the sampling period. Cattle manure induced the highest enzymatic activity, followed by municipal sewage sludge, whereas earthworm casts induced the lowest activity, but differed from control treatment. The thermal effect on the enzyme activity of commercial cellulase, protease, and urease showed a variety of time peaks. These values probably oscillated due to soil physical-chemical factors affecting the enzyme activity on the residues. A atividade enzimática é uma propriedade importante para avaliação da qualidade do solo. Duas sequências de experimentos foram realizadas com o objetivo de avaliar a atividade enzimática em amostras de solo (Latossolo Vermelho eutroférrico típico), tratadas com esterco bovino, húmus de minhoca ou lodos de esgoto dos municípios de Barueri e Franca. A atividade de enzimas comerciais nas mesmas amostras de solo, após serem esterilizadas, foi medida por microcalorimetria. No primeiro experimento, a atividade das enzimas celulase, protease e urease foi determinada em amostras de solo durante um período de três meses. Na segunda sequência de experimentos, o efeito térmico das enzimas comerciais celulase, protease e urease em amostras de solo, esterilizadas sob os mesmos tratamentos, foi monitorado por um período de 46 dias. O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, em esquema fatorial cinco tratamentos x sete amostragens, com cinco repetições. O efeito dos tratamentos foi avaliado estatisticamente pela análise de variância. O teste de Tukey foi usado para comparar médias a p < 0,05. A presença de diferentes fontes de materiais orgânicos aumentou a atividade enzimática durante o período de amostragem. O esterco bovino propiciou os maiores valores, seguido pelos lodos de esgoto. O húmus de minhoca ocasionou os valores mais baixos, mas que diferiram significativamente do tratamento controle. O efeito térmico para a atividade das enzimas comerciais celulase, protease e urease mostrou uma variedade de picos ao longo do tempo. Esses valores oscilaram provavelmente devido aos fatores físico-químicos do solo, alterando a atividade enzimática nos resíduos.

"En este trabajo se estudió la producción de fenol oxidasa de tres cepas de Scytalidium thermophilum y se caracterizó la enzima de la cepa más productora. Se evaluó la producción de enzima en tres diferentes medios de cultivo: almidón (SM), papa dextrosa y levadura (PDY) e infusión de pasto (GI) a diferentes temperaturas (42, 45 y 48 °C) y diferentes valores de pH (6, 7 y 8). La actividad enzimática más alta (0.115 U/ml) fue observada con la cepa ECS-0602 en infusión de pasto Pangola a pH 8 y 45 °C. Subsecuentemente, se llevó a cabo la purificación de la enzima por cromatografía de intercambio iónico y la enzima parcialmente purificada fue caracterizada. La enzima mostró un peso molecular de 87 kDa en gel 10% SDS-PAGE y mostró la actividad más alta a pH 7 y 55 °C. La máxima velocidad -1 -1 (V ) fue de 80.72 umoles min mg de proteína y la constante de afinidad catalítica (K ) fue max M de 302.79 mM, ambas determinadas sobre catecol como sustrato. La enzima purificada mostró también actividad catalasa de pH 5.5 a 8 y a temperatura ambiente, con una máxima -1 actividad catalasa de 10 640 Umg de proteína a pH 6. La enzima es una hemoproteína glicosilada que contiene 0.7 moles de Fe por mol de proteína."

Em vista do crescimento de infecções fúngicas oportunisticas causadas por Fusarium spp. e da resistência do fungo aos antifúngicos frequentemente utilizados, o estudo visa avaliar o perfil de sensibilidade das associações entre terbinafina, itraconazol, cetoconazol e anfotericina B frente a 20 isolados clínicos e ambientais de Fusarium solani, e verificar fatores associados a virulência como pesquisa de melanina na parede celular e a produção das enzimas extracelulares proteinase, fosfolipase, lipase e DNAse. Anfotericina B associada à itraconazol demonstrou efeito sinérgico em 15% dos isolados, sendo 33% de origem ambiental e 65% de origem clínica. Efeitos sinérgicos foram obtidos contra 10% dos isolados na associação entre anfotericina B e cetoconazol e contra 5% na associação entre anfotericina B e terbinafina. Nossos resultados revelaram efeitos aditivos e indiferentes contra as cepas testadas nas associações entre terbinafina e derivados azólicos. Não foi detectada presença de melanina na parede de F. solani. As culturas de F. solani clínicas e ambientais apresentaram atividade enzimática de proteinase positiva após coloração com ácido acético e negro de amido, com formação de halos ao redor da colônia na proporção de 30% e 45% respectivamente. Atividades enzimáticas de lipase, fosfolipase e DNAse não foram detectadas, contudo, não é possível afirmar que F. solani não produza essas enzimas, considerando que as mesmas podem ser mantidas intracelularmente e não liberadas para o meio. Despite of the increase of opportunistic fungal infections caused by Fusarium spp. and their resistance to antifungal drugs, the aims of this study were to evaluate susceptibility profiles of 20 clinical and environmental isolates of Fusarium solani against the associations among terbinafine, itraconazole, ketoconazole and amphotericin B, and to verify the presence of associated virulence factors as melanin and extracellular enzymes (proteinase, phospholipase, lipase and DNAse). Amphotericin B combined with itraconazole showed synergism against 15% of the isolates, 33% of these was from the environment and 65% from clinical cases. Synergistic effect was observed against 10% of strains tested by association between amphotericin B and ketoconazole and against 5% in association between anphotericin B and terbinafine. The associations between terbinafine and azole derivatives showed additive effect and no difference against the samples. Presence of melanin in the F. solani cell wall was not observed. Both, clinical and environmental isolates expressed enzymatic activity of proteinase in 30% and 45% of cases. Enzymatic activity of lipase, phospholipase and DNAse were not detected; however, it was not possible to state that F. solani do not produce these enzymes, as they could manteined intracellularly and would not released to the environment. TEDE BV UNIFESP: Teses e dissertações

Studies with streptomycetes in biocontrol programs and plant growth promotion are presented as technological alternatives for environmental sustainable production. This work has the objective of characterizing six isolates of streptomycetes aiming the production of extracellular enzymes, indole acetic acid, capacity for phosphate solubilization, root colonization and growth under different pH and salinity levels. For detection of enzyme activity the isolates were grown in culture media with the enzyme substrates as sole carbon source. The root colonization assay was performed on tomato seedlings grown on 0.6% water-agar medium. Growth under different pH and salinity levels was evaluated in AGS medium with 1%, 1.5%, 2%, 2.5%, and 3% NaCl, and pH levels adjusted to 5.0, 5.5, 6.0, 6.5, and 7.0. All isolates produced the enzymes amylase, catalase, and lipase, as well as indole acetic acid. With one exception (AC-92), all isolates presented cellulolytic and chitinolytic activity, and only AC-26 did not show xylanolytic activity. The isolates AC-147, AC-95, and AC-29 were the highest producers of siderophores. The isolates AC-26 and AC-29 did not show capacity for phosphate solubilization. All isolates colonized tomato roots in vitro, and AC-92 grew under all pH and salinity levels tested. The streptomycetes tested were considered as potential biocontrol and plant growth promotion agents. Estudos com estreptomicetos em programas de biocontrole e promoção de crescimento de plantas são alternativas tecnológicas de produção sustentáveis ao ambiente. O presente trabalho teve como objetivo caracterizar seis isolados de estreptomicetos quanto à produção de enzimas extracelulares, ácido indolacético e sideróforos, capacidade de solubilização de fosfatos, colonização radicular e de crescimento em diferentes níveis de pH e salinidade. Para detectar a produção das enzimas extracelulares, os isolados foram cultivados em meio de cultura contendo os substratos dessas enzimas, como única fonte de carbono. Para determinar a capacidade de colonizar o sistema radicular, sementes de tomate foram cultivadas em meio ágar-água 0,6% e inoculadas com os estreptomicetos. O crescimento em diferentes níveis de salinidade e pH foram avaliados em meio de cultura AGS, com os níveis de NaCl 1%, 1,5%, 2%, 2,5% e 3% e níveis de pH ajustados em 5,0, 5,5, 6,0, 6,5 e 7,0. Todos os isolados produziram as enzimas amilase, catalase e lípase, assim como o ácido indolacético. Todos os isolados apresentaram atividade celulolítica e quitinolítica, com exceção do AC-92. Somente o AC-26 não demonstrou atividade xilanolítica. Os isolados AC-147, AC-95 e AC-29 foram os maiores produtores de sideróforos. Os isolados AC-26 e AC-29 não demonstraram a capacidade in vitro de solubilizar fosfatos. Todos os isolados colonizaram as raízes das plântulas de tomateiro e AC-92 apresentou crescimento em todos os índices de salinidade e pH avaliados. Os estreptomicetos testados neste estudo foram considerados potenciais agentes de biocontrole de doenças e promoção do crescimento de plantas.

The dynamics of mesophilic and thermophilic bacterial population was studied in the bulk soil and rhizosphere of the grass Aristida adscensionis L. in a caatinga of the semi-arid Brazilian Northeast. Mesophilic heterotrophic bacteria, sporeforming bacteria and actinomycetes were significantly more abundant than thermophiles, and their counts were 10(6) - 10(7) CFU g-1 dry soil, showing weak fluctuations over the one-year study period. Thermophiles were below 10(6) CFU g-1 dry soil and, in general, demonstrated stronger fluctuations over the studied period. Among them, thermophilic actinomycetes showed the greatest decline during the dry season. No significant differences in microbial number were observed between bulk and rhizosphere soil. Mesophilic bacteria were represented mainly by Gram positive, filamentous organisms (actinomycetes) and by Gram positive, endospore-forming, rod-shaped organisms. All isolates of thermophilic bacteria were Gram positive, endospore-forming rods. Most of mesophilic isolates produced amylases and proteases, and 38% of isolates produced all studied extracellular enzymes: amylases, proteases, cellulases and chitinases. Among thermophilic bacteria, all isolates showed proteolytic activity and 77% produced amylases, but no one produced cellulases or chitinases. A dinâmica das populações bacterianas meso e termofílicas foi estudada no solo sem raízes e rizosférico associado à gramínea Aristida adscensionis L. na caatinga da zona semi árida do nordeste brasileiro. As bactérias totais heterotróficas, as bactérias esporuladoras e actinomicetos mesofílicos foram significativamente mais abundantes que os termofílicos, suas contagens variando na ordem de 10(6) - 10(7) UFC g-1 de solo seco, apresentando flutuações discretas ao longo de um período de um ano. Microrganismos termófilos foram encontrados numa ordem de 10(6) UFC g-1 de solo seco e demonstraram, em geral, flutuações mais evidentes durante o mesmo período de estudo. Entre os termófilos, os actinomicetos apresentaram um maior declínio durante a estação seca. Nenhuma diferença significativa no número de microrganismos foi observada entre o solo rizosférico e o solo não rizosférico. As bactérias mesofílicas mais observadas foram as filamentosas Gram positivas (actinomicetos) e os bastonetes esporulantes Gram positivos. Todos os isolados termofílicos foram bactérias esporuladoras Gram positivas em forma de bacilo. A maioria dos isolados mesofílicos produziu amilases e proteases, enquanto que 38% das linhagens produziram todas as enzimas extracelulares estudadas: amilases, proteases, celulases e quitinases. Entre as bactérias termofílicas, todos os isolados apresentaram atividade proteolítica e 77% produziram amilases, mas nenhum produziu quitinases ou celulases.

Orientador: Silvio Roberto Andrietta Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: Dextranas são polissacarídeos produzidos pela bactéria pertencente à família Lactobacileae constituídos de moléculas de glicose unidas por ligações a-(1-6) na cadeia principal e ligações a-(1-4), a-(1-3) e a-(1-2) nas ramificações. A enzima dextranasacarase, responsável por sua síntese, é extracelular e tem a sacarose como principal indutor. Este biopolímero possui aplicações nas indústrias farmacêuticas, químicas e de alimentos. Na indústria farmacêutica é que a dextrana tem a sua maior aplicação. A dextrana de baixa massa molecular, dextrana clínica, é utilizada como expansor volumétrico sanguíneo e como facilitador da fluidez do sangue. Este trabalho teve como objetivo otimizar o processo de produção de dextrana por três novas linhagens de bactérias denominadas 4-03, 4-30 e 4-26 isoladas da cana-de-açúcar, dentro deste objetivo principal estão incluídos a caracterização da estrutura de cadeia destes biopolímeros e a identificação das linhagens das bactérias isoladas. Para a otimização, tanto da produção de dextrana como da produção de dextrana-sacarase, realizaram-se ensaios em frascos agitados, analisando a influência das seguintes variáveis: concentração de tampão (controle do pH), concentração de substrato (sacarose) e concentração da fonte de nitrogênio (extrato de levedura). Conduziram-se os ensaios de otimização com base em planejamento experimental fatorial e análise de superfície de resposta. As linhagens 4-26 e 4-30 apresentaram modelos estatisticamente significativos, portanto, podem ser utilizados na previsão da composição do meio de fermentação para produção da dextrana-sacarase. Para a otimização da produção de dextrana, somente a linhagem 4-26 mostrou variação significativa estatisticamente das variáveis respostas frente ás variáveis estudadas na região avaliada. Realizaram-se ensaios para a obtenção da dextrana a qual teve sua estrutura de cadeia determinada utilizando o método da perioxidação e o método da degradação de Smith. A primeira metodologia consiste em determinar os tipos e as proporções das ligações a-(1-6), a-(1-4) e a-(1-2), e a-(1-3) por meio do consumo do oxidante e produção de ácido quando as dextranas são sujeitas a uma oxidação com periodato. A segunda metodologia citada, consiste na oxidação do polissacarídeo seguida de redução ao poliálcool correspondente e por fim realiza-se hidrólise ácida gerando fragmentos de Dgliceraldeído, característico de ligações a- (1,2), D-glicose, característico de ligações a-(1,3), eritritol, característico de ligações a- (1,4), glicerol e glicoaldeído, característicos de ligações a- (1,6) e terminal não-redutor. Quando compara-se os dois métodos de determinação da estrutura de cadeia da dextrana, a solubilidade em água da dextrana formada pela linhagem 4-03 é confirmada, pois a sua cadeia em ambas as análises apresentou uma maior porcentagem das ligações a-(1,6), característica contrária a goma produzida pela linhagem 4-30, que apresenta-se de forma insolúvel por ter uma cadeia ramificada. O resultado para o biopolímero formado pela linhagem 4-26 apresentou-se os mesmos valores para as duas metodologias, porém no método da degradação de Smith sua estrutura não aproximou-se da dextrana padrão Abstract: Dextran is a polysaccharide produced by bacteria of the Lactobacillaceae family and it consists of D-glucose monomeric units linked at the position a-(1,6) in the linear chain and a-(1-4), a-(1-3) and a-(1-2) positions at the branching points. The enzyme dextransucrase, responsible for dextran synthesis, is extracellular and has sucrose as its main inductor. This biopolymer is used by the pharmaceutical, chemistry and the food industry. Dextran has its main application in the pharmaceutical industry. The low molecular weight dextran, the clinical dextran, is used as blood volume expander and blood flow improver. This work had as objective to optimize the dextran production by three new bacteria strains named 4-03, 4-26 and 4-30 isolated from sugar cane, into this main objective are including the characterization the structure of the chain of these bacteria biopolymers and to identification bacteria strains isolated. The influence of the following variable was analyzed for the dextransucrase and dextran production optimization: buffer (pH control), substrate (sucrose) and nitrogen source (yeast extract) concentrations. The experimental assays were performed on the basis of factorial design and response surface techniques. The strains 4-26 and 4-30 presented statically significant models, therefore, these models may be used for predict the optimum composition of the fermentation medium for dextransucrase production. Only strain 4-26 showed statically significant variation of the dependent variables in the evaluated region dextran production optimization. The dextran structure of the three strains was determined by the periodate oxidation and Smith degradation methods. The first methodology consist in to determine kinds and proportions of the a-(1,6), a-(1-2) e a-(1-4) e a-(1-3) linkages by the consumption of oxidant and the production of acid when the dextran is subject to periodate oxidation analysis. The second methodology consists in the oxidation of the polysaccharide followed by reduction and hydrolysis with dilute acid which produces characteristic fragments: D-glyceraldehydes, characteristic of the a-(1,2) linkages, D-glucose, characteristic of the a-(1,3) linkages, erythritol, characteristic of the a-(1,4) linkages and glycerol or glycolaldehyde, characteristic of the a-(1,6) linkages and no reducing terminal. The results obtained confirmed the high solubility of the dextran produced by strain 4-03 due to its high proportion of the a-(1,6) linkages in contrast with gum produced by strain 4- 30 that is highly insoluble due to its branched chain. The biopolymer produced by strain 4- 26 presented the same values for the both methodologies, however, the Smith degradation result showed that its structure is not close to the standard dextran Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Doutor em Engenharia Química

As bactérias do gênero Aeromonassão consideradas como patógenos emergentes de animas e humanos, causando diarreia e infecções extra intestinais tais como, infecções de pele e septicemia. Várias enzimas extracelulares e toxinas tem sido apontadas como potenciais fatores de virulência em Aeromonas. Contudo, a importância de cada fator em particular ou sua interação durante os processos patogênicos não está bem definida. No presente trabalho, a distribuição e a atividade fenotípica dos genes que codificam aerolisina/hemolisina, serina protease, metaloprotease, lipase e glicerofosfolipideo-colesterol aciltransferase (GCAT) foram investigados em 15 linhagens tipos, representando 12 das 14 espécies do gênero, e 30 isolados clínicos e ambientais em Aeromonas. Os genes analisados estão altamente conservados entre os gêneros e os isolados. O gene lipA foi identificado em 93% das amostras, podendo ser usado como um gene alvo para a rápida identificação de Aeromonas em amostras clínicas, ambientais e de alimentos. Os genes que codificam aerolisina, elastase, lipase e GCAT estiveram presentes tanto nos isolados clínicos como nos ambientais. Contrariamente, o gene ahpA foi mais prevalente nos isolados clínicos, indicando papel direto ou indireto no mecanismo patogênese destes microrganismos. Variações em relação às enzimas extracelulares foram evidenciadas entre as espécies e os isolados de Aeromonas. Contudo, nenhuma relação foi encontrada entre as atividades enzimáticas e os isolados clínicos. A relação entre atividade hemolítica sobre o sangue humano e a presença do gene aerolisina/hemolisina (aerA) pode ser considerada um indicativo de que aerolisina seja particularmente ativa contra eritrócitos humanos. Aeromonas are considered as emerging animal and human pathogens causing diarrhea and extraintestinal infections, such as wound infection and septicemia. Several extracelular enzymes and toxins have been pointed as potential virulence factors in Aeromonas. However, the importance of each particular fator or their interation during the pathogenic processes is not well defined. In the presente work, the distribution and phenotypic activity of the genes encoding the aerolysin/hemolysin, serine protease, metalloprotease, lipase and glycerophospholipid-cholesterol acyltransferase (GCAT) were investigated in 15 type strains, representing 12 of the 14 species of the genus, and 30 clinical and environmental isolates of Aeromonas. The former genes were found to be highly conservered among the genus and isolates. The lipA gene was identified in 93% of the samples and may be used as a target gene for the rapid identidication of Aeromonas in clinical, food and environmental samples. Aerolysin, elastase, lipase and GCAT genes were presente in both clinical and environmental isolates. Conversely, ahpA gene was more prevalente in clinical isolates, indicating their direct or indirect role in the mechanism of pathogenesis of thease microorganisms. Variation on the extracelular enzymes eas evidenced among the species and isolates of Aeromonas. However no relation was found between enzymatic activities and clinical isolates. The relation between hemolytic activity on human blood and the presence of aerolysin/hemolysin gene (aerA) can be seen as na indicative that aerolysin are particularly active against human erythrocytes.

A total of 26 strains of marine bacteria with proteolytic activity was isolated from sea water contaminated with fishing effluents; they were evaluated in basis of their growth and formation of activity halos in Marine Agar supplemented with casein to 1%, pH 8,0 and incubated to 25 ºC per 72 hours. Selected five strains were evaluated on the basis of displaying the best halos of activity as well by their growth and production of proteases at different concentrations of NaCl, temperature ranges and pH; being finally considered as moderate halotolerants bacteria, psicrotrophics and alkalophile. These strains also were evaluated by their specific proteolytic activity on the casein, being strain CM48 (Pseudomonas sp.) the one that presented the best specific activity (17,38 U/mg) at 72 hours, and followed by strain CM45 (Alcaligenes sp.) (12,09 U/mg) and three strains of Aeromonas sp. (CM43, CM44 and CM46) with values of 12,02; 10,07 and 10,10 U/mg respectively., Un total de 26 cepas de bacterias marinas con actividad proteolítica fueron aisladas de agua de mar contaminadas con efluentes pesqueros; las mismas que se evaluaron en base al crecimiento y formación de halos de actividad en Agar Marino suplementados con caseína al 1%, pH 8,0 e incubados a 25 ºC por 72 h. Cinco cepas, seleccionadas por presentar los mejores halos de actividad fueron evaluadas a su vez por su crecimiento y producción de proteasas a diferentes concentraciones de NaCl, rangos de temperatura y pH; siendo consideradas finalmente como bacterias halotolerantes, psicrotróficas y alcalófilas moderadas. Estas cepas también fueron evaluadas por su actividad proteolítica específica sobre la caseína, siendo la cepa CM48 (Pseudomonas sp.) la que presentó la mejor actividad específica (17,38 U/mg) a las 72 horas, y seguidas por las cepas CM45 (Alcaligenes sp.) (12,09 U/mg) y tres cepas de Aeromonas sp. (CM43, CM44 y CM46) con valores de 12,02; 10,07 y 10,10 U/mg respectivamente.

With the purpose to evaluate Candida albicans virulence in vivo, two strains selected were based on their phospholipase and proteinase activity, and used in a model of experimental infection. One strain, isolated from vaginal secretion, was stocked at the URM Culture Collection for 43 years and presented high phospholipase (Pz=0.217) and proteinase (1.386 U.mL-1) activity. The other strain was a fresh strain isolated from oropharyngeal secretion of an AIDS patient, and presented low phospholipase (Pz=0.482) and proteinase (0.780 U.mL-1) activity. The strains were inoculated via intraperitoneum in immunosuppressed and non-immunosuppressed mice (Mus musculus) and the infection was evaluated over a period of 21 days. Liver, spleen, lungs and kidneys were aseptically removed and the blood of the animals was collected every 72 h. The number of colony forming units (c.f.u) isolated from each organ was counted and a histopathologic examination was performed. The freshly isolated strain was more virulent than the stocked strain, as shown by the number of positive cultures and severity of the lesions observed at the histopathologic examination. A correlation between the in vitro enzymatic activity and the in vivo virulence was not observed. Com o objetivo de avaliar a virulência de Candida albicans in vivo, foram selecionadas duas cepas de acordo com a atividade enzimática de fosfolipase e protease, para utilização em modelo de infecção experimental. Utilizou-se um isolado de secreção vaginal, estocado na Micoteca URM por 43 anos com alta atividade de fosfolipase (Pz=0.217) e de protease (1.386 U.mL-1), e outro recém-isolado de secreção orofaríngea de paciente com AIDS, o qual apresentou baixa atividade de fosfolipase (Pz=0.482) e de protease (0.780 U.mL-1). As amostras foram inoculadas por via intra-peritoneal em camundongos (Mus musculus) na presença e ausência de imunossupressão e a infecção foi avaliada durante 21 dias. A cada 72 h foram assepticamente removidos o fígado, baço, pulmões e rins e coletado o sangue desses animais. Foi quantificado o número de unidades formadoras de colônias (u.f.c.) recuperadas de cada órgão e realizada avaliação histopatológica dos mesmos. A cepa recém-isolada mostrou-se mais virulenta in vivo, quanto ao número de culturas positivas e à severidade das lesões observadas ao exame histopatológico. Não foi observada correlação entre a atividade enzimática in vitro e a virulência in vivo.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:31:34Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-10-27Bitstream added on 2014-06-13T20:22:25Z : No. of bitstreams: 1 regina_m_dr_botfca.pdf: 906659 bytes, checksum: 2703d887158a2588e3476685424857a3 (MD5) Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) Universidade Estadual Paulista (UNESP) O cultivo de cogumelos comestíveis, em subprodutos energéticos, representa o principal exemplo da conversão direta de resíduos lignocelulósicos em um artigo com alto valor agregado, com benefício para o gênero humano e uma fonte de energia biosintética comercialmente importante. O objetivo do trabalho foi verificar a atividade de enzimas lignocelulolíticas do Lentinula edodes crescendo em resíduos agrícolas, utilizando-se três tipos de incubação: meio líquido, sistema estacionário e bioreator. As linhagens LE 95/17, LE 96/22 e Leax foram incubadas em substratos compostos de casca de arroz (CA), serragem de eucalipto (SE), bagaço de mandioca (BM) e bagaço de cana-de-açúcar (BC), suplementado com 20% de farelo de arroz e 1% de CaCO3. Foram avaliados a velocidade de crescimento miceliano e a atividade de enzimas oxidativas e hidrolíticas. As linhagens em meio de cultura líquido não apresentam atividades expressivas de manganês peroxidase e lacase. SE e BC, utilizados no sistema estacionário, mostraram ser os mais eficientes para as atividades de MnP, enquanto que para a atividade da lacase apenas SE. O sistema estacionário, em SE, foi melhor que o bioreator para atividade de enzimas hidrolíticas. O bagaço de mandioca pode ser uma alternativa viável como substrato, ou na forma de complemento à outros substratos, por propiciar um rápido crescimento miceliano. A lignina peroxidase não foi detectada em nenhum dos experimentos. The cultivation of mushrooms in by-products represents the main example of the direct conversion of lignocellulosic residues in an article with high attached value with benefit for the mankind and source of commercially important biosynthetic energy. The aim of this work was verify the activity of the Lentinula edodes lignocellulolitic enzymes growing in agricultural residues utilizing three kinds of incubation: liquid culture medium, solid static state and bioreactor. The LE 17/95, LE 22/96 and Leax strains were incubated in substrates composed of peel of rice (PR), eucalyptus sawdust (ES), cassava bagasse (CB) and sugar cane bagasse (SB), supplemented with 20% of rice brans and 1% of CaCO3. The mycelium growth velocity, the oxidative and hydrolytic enzymes activity were evaluated. The strains in liquid culture medium don't presented expressive activities of manganese peroxidase (MnP) and laccase. SE and BC utilized in solid static state system showed to be more efficient to MnP activity while laccase only SE. The solid static state system was better than bioreactor to hydrolytic enzymes activity in SE. The cassava bagasse can be a substrate alternative for having a fast mycelium growth. The lignin peroxidase was not detected in the experiments.

Orientador: Silvio Roberto Andrietta Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica Resumo: Este traballio teve como objetivo isolar e selecionar linhagens potencialmente produtoras de goma presentes na cana-de-açúcar. Gomas são biopolimeros de origem vegetal (e.g., gomas guar, carragena) ou microbiana (e.g., gomas xantana, dextrana). As linhagens produtoras de goma do tipo dextrana são freqüentemente encontradas em amostras de cana deteriorada. A dextrana é um biopolimero constituído de unidades monoméricas de a-Dglicose. A enzima dextrana-sacarase, responsável por sua síntese, é extracelular e tem a sacarose com principal indutor. Na indústria farmacêutica é que a dextrana tem a sua maior aplicabilidade: a dextrana de baixa massa molecular é utilizada como substituto do plasma sanguíneo e facilitador do fluxo sanguíneo. O microrganismo Leuconostoc mesenteroides NRRL B-512F, utilizado na maioria das indústrias produtoras de dextrana no mundo, serviu de referência para a seleção dos isolados. Para o isolamento, foram colhidas amostras de canade-açúcar deteriorada de 4 diferentes regiões e o caldo foi plaqueado em meio rico em sacarose, específico para produtores de goma. Colônias que apresentaram formação gomosa foram purificadas e estocadas em Litmus Milk a -15°C. Foram realizados ensaios em frascos agitados a 150 rprn, 28:tl°C por 12 horas para produção da enzima onde cada isolado foi incubado em meio contendo 5% de sacarose. A atividade enzimática do caldo centrifugado foi determinada medindo-se a velocidade de liberação de frutose. A goma foi produzida em meio contendo 15% de sacarose em frascos agitados a 150 rpm e 28:f:l°C por 15 horas. Etanol foi adicionado ao caldo bruto para precipitar a goma. As linhagens foram caracterizadas quanto à massa molecular média da dextrana produzida e à capacidade produtiva. A distribuição de massa molecular foi determinada por meio de cromatografia de permeação em gel (GPC). As análises de açúcares foram feitas em HPLC utilizando coluna de troca iônica com detecção por amperometria pulsada. Foram isolados cinqüenta e seis microrganismos e atividade enzimática foi evidenciada no caldo de vinte e oito linhagens. Destas, cinco foram selecionadas para produção e separação da goma. As atividades variaram de 33 a 131 UDS contra 49 UDS da linhagem referência nas condições do ensaio. Entre as cinco linhagens selecionadas, três são diplococos e produzem goma solúvel e duas são streptococos e produzem goma insolúvel. A análise de distribuição de massa molecular evidenciou que as linhagens selecionadas produzem goma de alta massa molecular, chegando a quase 2 milhões de Daltons Abstract: The aim of this work was to isolate and select potentia1ly gum producing strains present in sugar cane. Guns are biopolymers carne 1Tom vegetal (e.g., guar gurn, carragen gum) or microbian (e.g., xantan gum, dextran gum) source. Dextran producing bacteria are 1Tequently found in damaged sugar cane. Dextran is a biopolymer that consists of a-Dglucose monomeric units. The enzyme dextransucrase, responsible for dextran synthesis, is extracellular and has sucrose as its main inductor. ln the pharmaceutical industry is where dextran has its larger applicability: low molecular weight dextran, clinical dextran, is used as blood-plasma substitute and blood flow improver. Leuconostoc mesenteroides NRRL B512F strain, used in the majority of dextran producing industries around the world, was used as reference for the isolated microorganisms selection. Damaged sugar cane sarnples, :ITom four di:fferent regions, were used as the microorganisms isolation source and the cane juice was inoculated in a 10% sucrose solid medium. Strains that had presented gummy colony formation were purmed and maintained in Litmus Milk broth at -15°C. Assays were conducted for enzime production in Erlenmyer flasks on a rotatory shaker at 150 rprn, 28::tl°C for 12 hours where each isolated microorganism was incubated in a 5% sucrose medium. The enzymatic activity of the centrifugated broth was determined by measuring :fi:uctose production rate. Gum was produced in Erlenmyer flasks containing of 15% sucrose medium on a rotatory shaker at 150 rprn, 28::tl°C for 15 hours. Etanol was added to the crude broth for gum precipitation. The strains were characterized by the produced dextran average molecular weight and by the productive capacity. The molecular weight distribution was determined by gel permeation chromatography (GPC). The sugar determination analyses were made by HPLC using an ion exchange column with amperiometric detention. Fifty six microorganisms were isolated and enzymatic activity was found in centrifugated broth of twenty eight strains. From these, tive had been selected for gum production. The activities varied 1Tom 33 to 131 UDS against 49 UDS :ITom the reference strain in the assay conditions. Among the tive selected strains, three are diplococci and produce soluble gum and the other two are streptococci and produce insoluble gum. The molecular weight distribution analysis showed that the selected strains produce high molecular weight gurn, one ofthem reaching almost 2 million Daltons Mestrado Desenvolvimento de Processos Biotecnológicos Mestre em Engenharia Química

The verrucose caused by Cladosporium herbarum reduces production and quality of Passion fruit (Passiflora edulis Sims.), a largely consumed tropical fruit. This work aimed to investigate the antagonism of Trichoderma species (T. polysporum, T. koningii, T. viride and T. harzianum) against Cladosporium herbarum, and to study the production of extracellular hydrolytic enzymes by the pathogen and the antagonists. The results showed considerable antagonistic potential for the biocontrol of C. herbarum isolates by all Trichoderma species, except T. koningii. The most distinguished effect was observed for T. polysporum. In relation to the pattern of esterase obtained by electrophoresis in poliacrylamyde gel, the major activity presented by the isolates was observed after five days of incubation. The C. herbarum isolates produced extracellular enzymes, lipase, pectinase, cellulase, and protease, all possibly related to the infection process. Amylase excretion, not known to be associated with phytopathogens, was detected in Trichoderma species, but not in C. herbarum. In addition to amylase, all Trichoderma species tested produced also extracellular cellulase and pectinase, except T. koningii in relation to the latter enzyme. The demonstration of various esterase isoenzymes in zymograms of the Trichoderma species and C. herbarum isolates was markedly improved by washing the mycelia with detergents or EDTA. This fact suggested that a major fraction of extracelular enzymes may remain attached to outside fungal cell wall after being excreted. O maracujá (Passiflora edulis Sims.), um fruto tropical amplamente consumido, tem sua produção e a qualidade dos seus frutos reduzidos pela verrugose causada por Cladosporium herbarum. Este trabalho objetivou investigar o antagonismo de espécies de Trichoderma (T. polysporum, T.koningii, T. viride e T. harzianum) contra C. herbarum, e estudar a produção de enzimas hidrolíticas extracelulares pelo fitopatógeno e antagonistas. Os resultados mostraram considerável potencial antagônico para o biocontrole dos isolados de C. herbarum por todas as espécies de Trichoderma, exceto T. koningii. O efeito mais promissor foi observado para T. polysporum. Em relação ao padrão de esterase obtido por eletroforese em gel de poliacrilamida, a maior atividade apresentada pelos isolados foi observada cinco dias após a incubação. Os isolados de C. herbarum produziram enzimas extracelulares, lipase, pectinase, cellulase e protease, todas possivelmente relacionadas ao processo de infecção do hospedeiro. A excreção de amilase que parece não estar associada com fitopatógenos foi detectada nas espécies de Trichoderma, mas não em C. herbarum. Além disso, todas as espécies de Trichoderma testadas produziram também celulase e pectinase, exceto T. koningii com relação a esta última enzima. A demonstração de várias isoesterases no zimograma das espécies de Trichoderma e isolados de C. herbarum, foi notavelmente melhorada através da lavagem do micélio com detergentes ou EDTA. Este fato sugere que uma grande fração de enzimas extracelulares pode permanecer presa externamente na parede celular fúngica após excreção.

In order to select marine bacteria with the ability to produce extracellular enzymes (EEC), samples from Argopecten purpuratus and Crassostrea gigas in cultivation as well as from other interticlal and benthic invertebrates were analyzed. The selection of producer EEC strains was carried out in Marine Agar (MA) with addition of the relevant substratum (starch, casein, tween-80, lecithine, DNA and gelatine). The EEC producer strains evaluation was carried out on 102 isolates. The results show that bacteria associated toA. purpuratusand C. gigashave the best multienzymatic activities; however, Semimytilus algosus, Tetrapigus niger and Thais chocolata are also important sources of bacteria producers of EEC. The qualitative multienzymatic activity in MA (clear or opaque zones around the colonies in mm of diameter) varied from 6 to > 16 mm. The frequency of multienzymatic production was caseinase 62,74%, tween-esterase 57,84%, amylase 52,94%, gelatinase 38,23%, DNAse 33,3%, agarase 5,43% and lecithinase 90,0%. The results suggest the possibility of using native strains for biotechnological purposes., Con el fin de seleccionar las bacterias marinas con la capacidad de producir enzimas extracelulares ( CEE ) , se analizaron muestras de Argopecten purpuratus y Crassostrea gigas en el cultivo , así como de otros invertebrados interticlal y bentónicos. La selección de cepas de la CEE de productores se llevó a cabo en Agar Marino ( MA ) con la adición del sustrato relevante ( almidón , caseína , Tween - 80 , lecitina , ADN y gelatina ) . La CEE evaluación cepas productoras se llevó a cabo en 102 aislamientos . Los resultados muestran que las bacterias asociadas TOA . purpuratusand C. gigashave las mejores actividades multienzimáticos ; Sin embargo , Semimytilus algosus, Tetrapigus niger y Thais chocolata también son fuentes importantes de productores de bacterias de la CEE. La actividad multienzimático cualitativa en MA ( zonas claras u opacas alrededor de las colonias en mm de diámetro ) varió de 6 a > 16 mm . La frecuencia de la producción multienzimático fue caseinase 62,74 % , entre esterasa 57,84 % , 52,94 % de la amilasa , la gelatinasa 38,23 % , 33,3 % DNAsa , agarasa 5,43 % y 90,0 % lecitinasa . Los resultados sugieren la posibilidad de usar cepas nativas para fines biotecnológicos