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Esse texto tem a intenção de discutir as reverberações do golpe nas políticas sociais e educacionais, relacionando o acirramento do neoliberalismo com o movimento da privatização da educação. Nesse sentido, por meio de uma pesquisa bibliográfica, buscou-se na literatura, a discussão do golpe, e suas conexões com as políticas neoliberais, e como a justaposição dos dois campos reverberou nas políticas educacionais no pós-golpe. Deste modo, por meio de autores críticos como Freitas (2016; 2018); Garcia (2018); Saviani (2018), buscamos identificar o movimento percorrido pelas políticas, após 2016, o que nos levou a compreensão da agenda de privatização da gestão da educação, por meio, da inserção de tecnologias de gestão de empresas privadas dentro das escolas. Nesse sentido, as reverberações do golpe se apresentaram nos currículos, no financiamento, no direito à escola pública socialmente referenciada e de qualidade, e principalmente, na gestão da educação., This text aims to discuss the reverberations of the coup in social and educational policies, relating the intensification of neoliberalism with the movement of privatization of education. In this sense, through a bibliographical research, it was sought in the literature, the discussion of the coup, and its connection with neoliberal policies, and how the juxtaposition of the two fields reverberated in educational policies in the post-coup period. Thus, through critical authors such as Freitas (2016; 2018); Garcia (2018); Savianni (2018), we sought to identify the movement taken by the policies after 2016, which led us to understand the agenda of privatization of educational management, through the insertion of management technologies of private companies within schools. In this sense, the reverberations of the coup presented themselves in the curricula, in funding, in the right to socially referenced and quality public schools, and especially in the management of education

Este artículo tuvo como objetivo analizar cómo la red pública municipal de Canavieiras - BA garantizó el derecho a la educación en el contexto de la pandemia de COVID-19. El problema cuestiona: cual es el dominio de estos docentes para la enseñanza a través de la intermediación tecnológica? ¿Cuál es la calidad de acceso de docentes y estudiantes para realizar la docencia en línea? A través de una investigación cualitativa, a partir de los resultados del cuestionario aplicado a los docentes del Municipio de Canavieiras-BA, donde se cuestionó el uso de la mediación tecnológica durante la pandemia, así, se buscó describir cómo docentes y alumnos del Sistema Municipal de Educación - SME desarrolló actividades educativas en el período de distanciamiento social y aislamiento. En este sentido, se puede ver que los datos de la investigación indican que parte de los docentes optó por utilizar sólo la actividad impresa, en el período remoto, como era la forma encontrada para garantizar la enseñanza a los estudiantes, y, por lo tanto, este tipo de artificio hizo que la enseñanza de los estudiantes fuera responsabilidad de las familias, lo que comprometía el Derecho a la Educación de los estudiantes de familias sin los conocimientos básicos para ayudar a los estudiantes durante este proceso., This article aimed to analyze how the municipal public network of Canavieiras - BA ensured the right to education in the context of the COVID-19 pandemic. Its problem questions: what is the domain of these teachers for teaching through technological intermediation? What is the quality of access for teachers and students to carry out online teaching? Through a qualitative research, based on the results of the questionnaire applied to teachers in the Municipality of Canavieiras-BA, where the use of technological mediation during the pandemic was questioned, thus, it sought to describe how teachers and students of the Municipal Education System - SME developed educational activities in the period of social distancing and isolation. In this sense, it can be seen that the research data indicate that parts of the teachers chose to use only the printed activity, in the remote period, as it was the way found to ensure teaching to students, and, thus, this type of artifice made the teaching of students the responsibility of families, which compromised the Right to Education for students from families without the basic knowledge to help students during this process., O presente artigo objetivou analisar como a rede pública municipal de Canavieiras – BA assegurou o direito à educação no contexto da pandemia de COVID-19. Sua problemática questiona qual o domínio desses professores para o ensino por intermediação tecnológica? Qual a qualidade de acesso dos professores e alunos para a realização do ensino online? Por meio de uma pesquisa qualitativa, a partir dos resultados do questionário aplicado aos professores do Município de Canavieiras-BA, onde foi questionado o uso de mediação tecnológica durante a pandemia, assim, buscou descrever como os professores e alunos do Sistema Municipal de Educação – SME desenvolveram as atividades educativas no período de distanciamento e isolamento social. Neste sentido, pode-se constatar que os dados da pesquisa apontam que partes dos professores optaram por utilizar apenas a atividade impressa, no período remoto, pois foi a forma encontrada de assegurar o ensino aos estudantes, e, deste modo, esse tipo de artifício tornou o ensino dos alunos responsabilidade das famílias, o que comprometeu o Direito à Educação para os alunos oriundos de famílias sem o conhecimento básico para ajudar os estudantes durante este processo.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia (Mestrado Profissional), Florianópolis, 2022. Em 2019, surgiram os primeiros casos de pacientes acometidos pela COVID-19 na China e logo a doença se alastrou pelo mundo culminando em uma pandemia. Em janeiro de 2022 a pandemia causada pelo novo coronavírus supera marcas impressionantes de número de casos e mortes, sendo o Brasil o país com 3º maior número de casos acumulados. O novo coronavírus possui uma proteína estrutural importante chamada Spike que é amplamente expressa e sabidamente imunogênica. Em decorrência disso, já estão em uso no mundo 15 vacinas que utilizam a Spike ou suas subunidades nas formulações vacinais, com destaque para o seu domínio de ligação ao receptor. Entretanto, apesar da disponibilidade de algumas vacinas, ainda há uma grande parcela da população suscetível às formas graves da COVID-19 e a altos níveis de contágio. Somado a isso, a disseminação de variantes de preocupação alerta para o fato de que mesmo indivíduos vacinados, ou com infecção prévia por SARS-CoV-2, desencadeiam uma resposta humoral menos eficiente à essas cepas, remetendo à necessidade de que a população mundial tenha acesso rapidamente ao esquema vacinal completo, a fim de minimizar os impactos causados pela doença. Por isso, o Laboratório de Imunobiologia junto a um grupo multicêntrico, propõe o desenvolvimento de uma vacina brasileira hipotetizando que uma vacina de BCG recombinante expressando determinantes antigênicos das proteínas Spike (RBD) e do Nucleocapsídeo induz uma resposta humoral protetora contra o SARS-CoV-2. Para testar esta hipótese é preciso que estejam disponíveis métodos para detecção de imunoglobulinas, sendo assim é de grande valia o desenvolvimento desta ferramenta no laboratório de Imunobiologia. Baseado nesse cenário, o objetivo deste trabalho foi desenvolver um teste capaz de detectar imunoglobulinas anti-Spike e anti-RBD através da metodologia de ELISA indireto. Os ensaios foram padronizados e otimizados através da variação individual de parâmetros como a solução de bloqueio; a diluição do anticorpo secundário; a diluição das amostras e o tempo de desenvolvimento da reação enzima-substrato. Afinal, obteve-se quatro métodos imunoenzimáticos capazes de detectar IgG anti-SARS-CoV-2 em soro murino ou humano. Especificamente o ensaio para detecção de IgG anti-RBD murina, possibilita a titulação das amostras de soro e possui boas características de repetibilidade. Por fim, o custo estimado por amostra desse ensaio é por volta de 62x menor que o custo de kits comercializados no mercado, o que permite o uso escalável em laboratórios. Abstract: In 2019, the first cases of patients affected by COVID-19 were reported in China and this disease spread around the world, culminating in a pandemic. In January 2022, the pandemic caused by the new coronavirus overcomes impressive marks in number of cases and deaths, Brazil being the 3rd highest country in number of accumulated cases. The new coronavirus has an important structural protein called Spike that is widely expressed and known to be immunogenic. Hence, 15 vaccines developed targeting Spike protein or its subunits, with emphasis on its receptor-binding domain, are already in use worldwide. However, despite the availability of some vaccines, there is still a large portion of the world's population susceptible to severe forms of COVID-19 and high levels of transmission. In addition, the dissemination of variants of concern alerts to the fact that vaccinated individuals, or even those with previous SARS-CoV-2 infection, trigger a less efficient humoral response to these strains, leading to the need of quick access to the complete vaccination schedule for global population, to minimize impacts caused by the disease. Therefore, the Laboratory of Immunobiology, together with a multicenter group, proposed the development of a Brazilian vaccine, hypothesizing that a recombinant BCG vaccine expressing antigenic determinants of Spike protein (RBD) and Nucleocapsid protein induces a protective humoral response against SARS-CoV-2. In order to test this hypothesis, a method for detection of immunoglobulins must be available, and thus the development of this tool is of great value. Based on this scenario, the objective of this work was to develop a test capable of detecting anti-Spike and anti-RBD immunoglobulins through an indirect ELISA method. The assays were standardized and optimized through the individual variation of parameters such as the blocking solution; the dilution of the secondary antibody; the dilution of the samples and the time of the enzyme-substrate reaction. The result were four enzyme-linked immunosorbent methods capable of detecting anti-SARS-CoV-2 IgG in murine or human serum were obtained. Specifically, the assay for detecting murine anti-RBD IgG, allows titration of serum samples and has good repeatability. Finally, the estimated cost per sample of this assay is around 62x lower than the cost of commercially available kits, which allows scalable use in laboratories.

A tuberculose (Tb) é uma doença infecciosa crônica ocasionada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb). No espaço alveolar, o bacilo entra em contato com células do sistema imune inato como as células dendríticas (DCs), assim como células epiteliais (AEC). Na Tb, o fator de transcrição HIF-1? (Fator Induzido por Hipóxia 1 alfa) se encontra elevado em macrófagos infectados e células epiteliais alveolares adjacentes. Por isso, o objetivo deste trabalho foi investigar o papel de HIF-1? na resposta pró- inflamatória de AEC do tipo II (AEC-II) e na modulação da função de DCs em contato com AEC-II durante a infecção por Mtb. Células MLE-15 foram infectadas com Mtb H37Rv (MOI10) para avaliação da permissividade à infecção (microscopia eletrônica), crescimento dos bacilos (CFU) e ativação através da análise de citocinas (ELISA), nitrito (ensaio de Griess), TLR2, TLR9 e HIF-1? (qPCR e/ou Western blotting). A modulação DCs derivadas da medula óssea (BMDCs) por AEC-II, foi analisada de forma direta (contato) ou indireta (meio condicionado - CM) de MLE-15 não infectadas (CM - NIC) ou infectadas (CM - IC). Foram determinadas citocinas (ELISA), nitrito (Ensaio de Griess), expressão de HIF-1?, enzimas glicolíticas, moléculas co-estimuladoras e CCR7 (citometria de fluxo). Ensaio de migração foi realizando em câmera de boyden. A proliferação de células T CD4+ naive em co-cultura com BMDCs e a manutenção da Th17 foram avaliadas por citometria de fluxo. Eventualmente, BMDCs foram previamente infectadas com Mtb (MOI2) e, em seguida, estimuladas com CM-NIC ou CM-IC. Células MLE-15 mostraram-se permissivas à infecção, não conseguindo controlar o crescimento dos bacilos. A infecção induziu aumento da produção de IL-6, NO2-,CCL5, S100A9 e IFN- ?. Apesar do acúmulo inicial de HIF-1?, a expressão gênica caiu com o passar do tempo. A expressão gênica de TLR2 e TLR9 também estava aumentada. A regulação positiva10 de HIF-1? em células epiteliais induziu uma redução de IL-6 e NO, sem, no entanto, interferir significativamente no número de CFU. BMDCs estimuladas com CM - IC mostraram maior produção de IL-1?, IL-12, IL-6 e IL-10, maior expressão gênica de GLUT1 e HK2, além do acúmulo inicial de HIF-1?, que foi degradado em 24 horas, acompanhado de baixa expressão de iNOS. A expressão MHC-II, CD80, CD86 e CCR7 estava aumentada em BMDCs submetidas ao CM - IC, enquanto a indução do acúmulo de HIF-1? através do seu estabilizador, DMOG, foi capaz de reverter negativamente essa resposta. A maior maturação de BMDCs ocasionou maior proliferação de células TCD4+ naive, desfavorecendo a indução de células T CD4+ IFN?+. Entretanto, as citocinas produzidas favorecerem a manutenção de células TCD4+ produtoras de IL-17. No entanto, o fenótipo de maior maturação foi perdido em BMDCs infectadas estimuladas com CM - IC, aliado à baixa produção de TNF e alta produção de IL-10. Em conclusão, HIF-1? mostrou uma função anti-inflamatória, reduzindo a produção de moléculas pró- inflamatórias por AEC-II e regulando negativamente a maturação e a migração de DCs. Além disso, apesar de AEC-II infectadas por Mtb favorecerem a maturação e migração de DCs, o Mtb é capaz de subverter essa resposta Tuberculosis (Tb) is a chronic infectious disease caused by the bacillus Mycobacterium tuberculosis (Mtb). In the alveolar space, the bacillus contacts cells from the immune system, such as dendritic cells (DCs), as well as alveolar epithelial cells (AEC). In Tb, the transcription factor HIF-1? (Hypoxia-inducible factor 1- alpha) is accumulated in infected macrophages and adjacent alveolar epithelial cells. Therefore, the aim of this work was to investigate the role of HIF-1? in the proinflammatory response of type II AEC (AEC-II) and modulation of DCs function upon contact with AEC-II during Mtb infection. MLE-15 cells were infected with Mtb H37Rv (MOI10) to evaluate the permissiveness to infection (electron microscopy), killing ability (CFU) and cell activation through cytokine analysis (ELISA), nitrite (Griess assay), TLR2, TLR9 and HIF-1? (qPCR and / or Western blotting). Bone marrow derived DCs (BMDCs) modulation by AEC-II, were analyzed directly (contact) or indirectly (conditioned medium - CM) of uninfected (CM-NIC) or infected (CMIC) MLE-15. We determined cytokines (ELISA), nitrite (Griess Assay), HIF-1? expression, glycolytic enzymes, co-stimulatory molecules and CCR7 (flow cytometry). Chemotaxie assay was performed on Boyden camera. Proliferation of naive CD4 + T cells in co-culture with BMDCs and maintenance of Th17 were assessed by flow cytometry. Eventually, BMDCs were previously infected with Mtb (MOI2) and then stimulated with CM-NIC or CM-IC. MLE-15 cells were permissive to infection, failing to control the bacilli growth. Infection induced increased production of IL-6, NO2-, CCL5, S100A9 and IFN-?. Despite the initial accumulation of HIF-1?, gene expression dropped over time. The gene expression of TLR2 and TLR9 was also increased. Positive regulation of HIF-1? in epithelial cells induced a reduction of IL-6 and NO, but did not significantly interfere with the number of CFU. BMDCs stimulated with CM-IC showed higher production of IL-1?, IL-12, IL-6, and IL-10, greater GLUT1 and HK2 gene expression, in addition to the initial12 accumulation of HIF-1?, which was degraded within 24 hours, accompanied by low iNOS expression. The expression of MHC-II, CD80, CD86 and CCR7 was increased in BMDCs undergoing CM-IC, while the induction of HIF-1? accumulation through its stabilizer, DMOG, was able to negatively revert this response. The higher maturation of BMDCs resulted in a greater proliferation of naive CD4 + T cells, but hampered induction of CD4 + IFN? + T cells. However, cytokines produced favor the maintenance of IL-17 producing CD4 + cells. The phenotype of higher maturation was lost in Mtb-infected BMDC, accompanied by low TNF production and high IL-10 production. In conclusion, HIF-1? showed an anti-inflammatory function, reducing the production of proinflammatory molecules by AEC-II and negatively regulating the maturation and migration of DCs. In addition, although Mtb-infected AEC-II favor maturation and migration of DCs, Mtbinfection of DCs is capable of subverting this response

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2019. Mycobacterium tuberculosis (Mtb), agente causador da tuberculose em humanos, desencadeia mecanismos que podem contribuir para o seu crescimento intracelular. Por meio de interações moleculares entre proteínas da bactéria e da célula hospedeira, o patógeno pode modular a resposta do hospedeiro durante a infecção. Considerando que Mtb pode infectar células-tronco, dados prévios do nosso laboratório demonstraram que durante a infecção em células tronco hematopoiéticas CD34+ (HSCs), Mtb induz robusta expressão de genes induzidos por ácido retinóico (atRA). Sabendo que o atRA é um potente indutor da expressão gênica, e que as enzimas ALDHs humanas são responsáveis pela sua formação e que Mtb também apresenta genes codificantes de ALDHs, o presente trabalho buscou investigar se as enzimas ALDHs do bacilo estariam participando da indução de genes RAREs de células CD34+ durante a infecção. Para isso, as bactérias foram previamente tratadas com um inibidor de enzimas ALDHs, Dietilaminobenzaldeído (DEAB) e expostas a células mononucleares do sangue periférico (PBMC) de doadores saudáveis (MOI 3) por 72h. Essas células foram marcadas com anticorpos anti-CD34 e anti-CD38 e adquiridas no citômetro de fluxo. Os resultados obtidos demonstram que durante a infecção em células CD34+, as ALDHs da bactéria participam da indução da expressão de genes induzidos por atRA (RAREs), como o CD38. Além disso, quando essas enzimas estão inibidas na bactéria, por meio do tratamento prévio com o DEAB, ocorre a redução da expressão do CD38, sugerindo que essas enzimas interagem com a indução de genes RAREs da célula hospedeira por meio do ácido retinóico. Observamos também que a multiplicação do bacilo durante a infecção é dependente de enzimas ALDHs da célula e da bactéria, sugerindo a importância das ALDHs do Mtb na detoxificação de aldeídos gerados durante a infecção. Desta forma, estes dados sugerem que durante a infecção em células CD34+, as ALDHs do Mtb participam do metabolismo de atRA da célula hospedeira, que resulta no aumento da expressão de genes RAREs, e que as ALDHs são importantes para o crescimento intracelular do bacilo. Abstract : Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis in humans, triggers mechanisms that may contribute to its intracellular growth. By means of molecular interactions between bacterial and host cell proteins, the pathogen can modulate host response during infection. Considering that Mtb can infect stem cells, previous data from our laboratory demonstrate that during the infection in CD34+ hematopoietic stem cells (HSCs), Mtb induces robust expression of genes induced by retinoic acid (atRA). Knowing that atRA is a potent inducer of gene expression, and that human ALDH enzymes are responsible for its formation and that Mtb also has genes encoding ALDHs, the present work sought to investigate whether the enzymes ALDHs of the bacillus would be participating in the induction of genes CD34+ RAREs during infection. For this, the bacteria were previously treated with an inhibitor of ALDHs, Diethylaminobenzaldehyde (DEAB) and exposed to peripheral blood mononuclear cells (PBMC) from healthy donors (MOI 3) for 72h. These cells were labeled with anti-CD34 and anti-CD38 antibodies and acquired on the flow cytometer. The results obtained demonstrate that, during infection in CD34+ cells, bacterial ALDHs participate in induction of atRA gene expression (RAREs), such as CD38. In addition, when these enzymes are inhibited in the bacterium, by prior treatment with DEAB, the CD38 expression is reduced, suggesting that these enzymes interact with the induction of RAREs genes of the host cell by means of retinoic acid. We also observed that the growth of bacillus during infection is dependent on cell and bacterial ALDH enzymes, suggesting the importance of Mtb ALDHs in the detoxification of aldehydes generated during infection. Thus, these data suggest that during infection in CD34+ cells, Mtb ALDHs participate in the atRa metabolism of the host cell, which results in increased expression of RAREs genes, and that ALDHs are important for the intracellular growth of the bacillus.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2017. A proteína ISG15 é o produto de um gene estimulado por interferons (IFN) do tipo I. Além de um papel de proteína semelhante à ubiquitina, ela é frequentemente descrita na literatura interagindo com o sistema imune, sendo capaz de regular proteínas que participam de vias de sinalização importantes como a JAK1, ERK1, STAT1 e RIG-I. ISG15 é também importante na resposta a infecções virais. Além dessas atividades intracelulares, ISG15 é secretada sendo capaz de induzir quimiotaxia em neutrófilos, estimular a proliferação de células NK, estimular a atividade citotóxica de monócitos e induzir a produção de IFN? por linfócitos T e células NK. Os mecanismos responsáveis pela capacidade de ISG15 de ativar células e genes imunes são pouco conhecidos, diante disso, buscou-se investigar o papel de citocina dessa proteína e seus potenciais mecanismos de ação. Nessa tese, foi observado que ISG15 é capaz de induzir a produção de IL-10 em monócitos primários de forma dose-dependente. Além disso, utilizando dados de transcriptoma, foi observada uma correlação significativa entre células mielóides, ISG15 e IL-10 e entre células linfóides e IFN?, essa última, corroborando estudos anteriores. Também com o auxílio dos bancos de dados, foi observado que a produção de IL-10 induzida por ISG15 está associada a MAPKs e PI3K em indivíduos saudáveis. Esse dado foi demonstrado com experimentos in vitro. Além disso, demonstrou-se que o eixo ISG15/IL-10 está amplificado em lesões causadas por M. leprae, mas ausente em indivíduos com tuberculose ativa embora ISG15 per se esteja fortemente correlacionada à inflamação e gravidade dessa patogenia. Por último, com a finalidade de identificar um possível receptor de ISG15, ensaios de purificação por afinidade em tandem foram realizados utilizando ISG15 fusionada aos motivos STREP e FLAG e proteínas de membranas de leucócitos totais. A precipitação permitiu identificar alvos de ISG15 já descritos na literatura além de proteínas de membrana que podem atuar como possíveis receptores, porém outros estudos precisam ser realizados para avaliar um potencial mecanismo de sinalização desencadeado por essa ligação. Em conclusão, esse estudo determina a produção de IL-10 como uma nova atividade biológica para ISG15, propõe essa proteína como um marcador de gravidade da para infecções por micobactérias e sugere alvos de ISG15 presentes na superfície de leucócitos humanos que podem atuar como potenciais receptores dessa proteína. Abstract : In humans, interferon stimulated gene (ISG) 15 deficiency may lead to inflammatory interferonpathies and mycobacterial disease, which has been previously linked to its extracellular cytokine-like activity. Here, a novel role for secreted ISG15 as IL-10 inducer, unique to human primary monocytes, is demonstrated. Moreover, a significant correlation of ISG15-induced monocyte/IL-10 and lymphoid/IFN? expression, which was associated with p38 MAPK and PI3K signalling in healthy volunteers, was found employing targeted in vitro and ex vivo system analysis of novel and established human transcriptomic datasets. In human mycobacterial infections, the ISG15/IL10 axis was amplified in leprosy, whereas ISG15 strongly correlated to inflammation and disease severity in active tuberculosis (TB). The specificity and MAPK/PI3K-dependence of ISG15-induced monocyte IL-10 production was confirmed in vitro using CRISPR/Cas9 knockout and pharmacological inhibitors. In this study, we have also attempted to identify a potential receptor using tandem affinity purification assays with ISG15 fused to STREP-FLAG motifs and membrane proteins from total leukocytes. This assay led to the identification of potential ISG15 receptors but other studies must be carried out to evaluate a signalling mechanism potentially triggered by this binding. In conclusion, this study determines the production of IL-10 as a new biological activity for ISG15, proposes this protein as a marker of severity of mycobacterial infections and suggests new ISG15 targets present on the surface of human leukocytes that can act as potential receptors.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2016. Elie Metchnikoff descreveu pela primeira vez os macrófagos e suas funções, uma delas é a fagocitose e eliminação de patógenos. Porém, alguns microrganismos desenvolveram estratégias para sobreviver dentro destas células, um exemplo de sucesso é o Mycobacterium tuberculosis (Mtb), o agente causador da tuberculose. Este bacilo ganha acesso ao interior dos macrófagos utilizando receptores na superfície destas células. Devido à sua grande heterogeneidade, os macrófagos apresentam diversas moléculas em sua superfície, é possível que Mtb utilize diferencialmente essas moléculas para sua sobrevivência intracelular. A heterogeneidade dos macrófagos foi explorada neste trabalho através de duas subpopulações distintas de macrófagos derivados de medula óssea (MMOs). Estas subpopulações foram separadas, por citometria de fluxo, baseadas em características de tamanho, complexidade e por moléculas expressas em sua superfície. A subpopulação maior e mais complexa, foi denominada A e apresenta uma frequência média de 65%, já a subpopulação menor e menos complexa, denominada B, apresenta uma frequência média de 15%. Para estudar a interação destas subpopulações com Mtb, ensaios de adesão e fagocitose foram realizados. Foi possível observar que Mtb adere e é mais fagocitado pela subpopulação B, a qual foi caracterizada como SSCloFSCloF4/80intCD11bint quando comparada à subpopulação A. As análises de citometria de fluxo indicavam que CD195 (CCR5) era um receptor envolvido no aumento da interação entre a subpopulação B e Mtb, porém MMOs derivados de camundongos nocautes para este receptor apresentam o mesmo perfil de adesão que MMOs de camundongos selvagens. Além disso, também foi investigado se o estágio de maturação da subpopulação B poderia estar envolvido com o aumento da adesão destes macrófagos à Mtb, contudo o estágio de maturação não parece participar neste processo. Em conjunto, os dados deste trabalho mostram que macrófagos de medula óssea apresentam duas subpopulações distintas, chamadas A e B. A subpopulação B apresenta maior interação com Mtb e esta interação não é dependente de CD195. Além disso, a subpopulação B foi caracterizada como SSCloFSCloF4/80intCD11bint quando comparada à subpopulação A. Abstract : Elie Metchnikoff first described macrophages and its functions, one of them is the phagocytosis and killing of pathogens. However, some microorganisms developed strategies to survive inside macrophages, one successful example is Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causing agent of tuberculosis. This bacilli access the macrophage s intracellular environment through surface receptors. Because of its great heterogeneity macrophages express different surface molecules and it is possible that Mtb exploits these differentially expressed molecules to survive inside the cell. The heterogeneity of macrophages was explored here using two distinct subpopulations of bone marrow macrophages (BMMs). These subpopulations were separated by flow cytometry based on size and complexity and also by expression surface molecules. The subpopulation, which was bigger and more complex, was called A and displays a mean frequency of 65%, on the other side the smaller and less complex subpopulation, was called B and displays a mean frequency of 15%. To study the interaction between Mtb and these two subpopulations binding and phagocytosis assays were performed. It was observed that subpopulation B presents higher bacterial binding and phagocytosis and it was phenotypically characterized as SSCloFSCloF4/80intCD11bint when compared to subpopulation A. The flow cytometry analysis indicates that CD195 (CCR5) was involved in higher bacterial binding of subpopulation B, nevertheless BMMs from mice knockout for CD195 showed the same levels of bacterial binding then wild-type BMMs. Furthermore, it was also investigated if the maturation status of subpopulation B could be associated with the augmented mycobacterial binding, however it does not seems to participate in this process. Taken together, these data shows that BMMs presents two distinct subpopulations, which were named A and B. The subpopulation B, displays higher bacterial binding and phagocytosis and CD195 does not participate in these processes. Additionally, subpopulation B was phenotypically characterized as SSCloFSCloF4/80intCD11bint when compared to subpopulation A.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2015. Após a infecção com o bacilo Mycobacterium tuberculosis (Mtb), causador da tuberculose (TB), observa-se a formação de uma estrutura celular característica denominada granuloma. Esse agregado celular é responsável por restringir a infecção e manter a doença em estado latente. Porém, quando a forma ativa da doença se desenvolve, o infiltrado de células apresenta necrose caseosa e as bactérias entram em intenso estado replicativo. Diante deste quadro, faz-se uso de antibióticos como a isoniazida (INH), um dos pilares da quimioterapia da TB. A INH é uma pró-droga que requer ativação por uma catalase peroxidase bacteriana codificada pelo gene katG, a fim de inibir a síntese de ácidos micólicos, importantes componentes estruturais da bactéria. Entretanto, dados recentes indicam que a INH pode também ser ativada por enzimas presentes em células do hospedeiro. É possível que este fármaco aja diretamente em células que abrigam o Mtb, contribuindo para o controle do seu crescimento intracelular. Entretanto, estudos que avaliam os efeitos da INH em sistemas biológicos complexos como o granuloma são escassos. Dessa forma, a partir de um modelo de granuloma humano in vitro investigamos os mecanismos iniciais do tratamento com INH que promovem a morte micobacteriana nesse sistema. Nossos resultados demonstram que o modelo utilizado mimetiza a fase ativa da infecção, com populações celulares semelhante às encontradas na infecção in vivo, como macrófagos, células dendriticas, linfócitos e granulócitos. Ainda mais, o granuloma apresenta intensa replicação bacteriana associada à necrose celular. Verificamos ainda que a INH possui capacidade bactericida nesse sistema celular, mas que, ao menos nas fases iniciais de tratamento in vitro, esse efeito não está relacionado com ativação de células T ou monócitos e independe de importantes citocinas, como IL-1ß ou TNF. Utilizando cepas clínicas resistentes à INH, bem como experimentos de coinfecção do granuloma com cepas sensível e resistente à INH, constatamos que o fármaco age diretamente sobre a bactéria, e sua forma ativa não age diretamente nas células do granuloma para promover a morte bacteriana. O desenvolvimento desta tese, em conjunto com outros dados presentes na literatura, confirmou a necessidade de ativação do fármaco pelo patógeno para a atividade inicial bactericida da INH localmente no granuloma. Abstract : Following infection with the bacilli Mycobacterium tuberculosis (Mtb), causative agent for tuberculosis (TB), there is formation of a characteristic cellular structure named granuloma. This cellular aggregate is responsible for restricting infection and keeping disease in its latent form. However, when the active disease manifests, the cellular infiltrate undergoes caseous necrosis and bacteria start intense replication. In this scenario, it is initiated the use of antibiotics such as isoniazid (INH), one of the pillars for TB chemotherapy. INH is a pro drug that needs activation by a bacterial catalase peroxidase encoded by katG gene, in order to inhibit mycolic acids synthesis, important bacteria structural components. Nevertheless, recent data indicate that INH can also be activated by cell host enzymes. It is possible that the drug acts directly on host cells infected with Mtb, contributing to the control of intracellular growth. However, studies that evaluate INH s effect in complex biologic systems such as the granuloma are scarce. Therefore, using an in vitro human granuloma model we investigated the early mechanisms by which treatment with INH promotes mycobacterial killing in this system. Our results show that the model mimics the active phase of infection, with the same cellular population seen in in vivo infection, such as macrophages, dendritic cells, lymphocytes and granulocytes. Moreover, the granuloma presents intense bacterial replication associated to cellular necrosis. We could also confirm INH s bactericidal activity in this cellular system, though at least during early in vitro treatment, this effect was not related to T cells or monocytes activation and does not depend on important cytokines, such as IL-1ß or TNF. By using INH resistant clinical strains, as well as performing coinfection experiments with sensible and resistant INH strains, we could confirm the drug s direct action over bacteria, and that its active form does not act directly upon granuloma cells to promote bacterial killing. These thesis conclusions, together with literature data, confirmed the need of pathogen drug activation for early bactericidal activity of INH locally in the granuloma.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2014. A infecção por Mycobacterium tuberculosis (Mtb) pode levar a um estado latente no qual o hospedeiro é capaz de controlar o crescimento do patógeno. Embora uma resposta imune celular seja fundamental para o controle de Mtb dentro de macrófagos, foi demonstrado que fatores associados à micobactéria apresentam um papel importante no desenlace da infecção. Levando em consideração o alto impacto na saúde mundial causado pela tuberculose (TB), a ineficiência de vacinas e o surgimento de cepas de Mtb resistentes, há uma necessidade do desenvolvimento de novas estratégias para diagnósticos, tratamentos e vacinas contra TB. O nosso grupo descreveu previamente uma nova lectina de 13 kDa secretada pelo M. tuberculosis (sMTL-13) e embora tenha sido sugerida a importância desta proteína em pacientes com tuberculose, ainda restam questões fundamentais da biologia desta lectina que precisam ser elucidadas. Para investigar o possível papel da sMTL-13 durante a infecção, um nocaute (?Rv1419) foi gerado. Um aumento significativo na morte celular foi observado em macrófagos infectados com ?Rv1419, assim como o crescimento intracelular exacerbado em comparação com a infecção pela bactéria selvagem. Análises in silico da proteína, assim como a sua detecção na superfície do Mtb, sugerem que a sMTL-13 pode atuar na entrada da bactéria durante interação inicial patógeno-hospedeiro. Isto foi confirmado através de experimentos de adesão, onde foi observado que a capacidade do bacilo em se ligar à membrana do macrófago é afetada pela ausência da sMTL-13. Além disto, níveis mais baixos de TNF foram detectados em macrófagos infectados com ?Rv1419, sugerindo que esta lectina pode ser importante para o reconhecimento do bacilo. Ademais, foi observado que a proteína purificada pode levar à morte celular via necrose em condições onde a função de caspase está bloqueada. Portanto, nós especulamos que a sMTL-13 regula a morte celular e produção de citocina pró-inflamatória como uma estratégia de sobrevivência, permitindo o crescimento do patógeno sem levar as células hospedeiras à morte prematura. Abstract : Infection by Mycobacterium tuberculosis (Mtb) can lead to a latent state in which the host is able to control pathogen growth. While effective cellular immune responses are critical to control Mtb growth inside macrophages, it has been demonstrated that mycobacteria-associated factors play an important role in the outcome of infection. Given the high impact in public heath caused by tuberculosis (TB), inefficient vaccine and emergence of Mtb resistant strains, there is a need for novel diagnosis, treatment and vaccine strategies against TB. We have previously described a novel secreted 13-kDa lectin in pathogenic Mtb (sMTL-13) and although a possible importance for this protein as a major mycobacterial antigen was shown in TB patients, fundamental questions on the biology of this lectin remain to be answered. In order to investigate the possible role of sMTL-13 during infection, a knock out mutant (?Rv1419) was generated. Significant cell death was observed in ?Rv1419-infected macrophages as well as increased knockout intracellular growth compared to infection with wild type bacteria. In silico analysis of the protein as well as its detection on the surface of Mtb suggests sMTL-13 may act during bacteria entry in the cell in the initial pathogen-host interactions. This was confirmed by binding experiments where it was observed that the adhesion of bacilli is affected in the absence of sMTL-13. Furthermore, lower levels of TNF were detected in ?Rv1419-infected macrophages, suggesting that this lectin may be important for cell recognition. In addition, it was shown that this purified protein can lead to cell death in a necrotic pathway in conditions where the function of caspases is impaired. Therefore, we speculate that sMTL-13 regulates cell death and pro-inflammatory cytokine production as a survival strategy, allowing pathogen growth without leading host cells to a premature death.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia e Biociências, Florianópolis, 2013. A pesquisa racional de novos candidatos a antígenos vacinais ou imunodiagnóstico destinados ao controle da tuberculose bovina (bTB) requer o conhecimento básico da imunopatogênese da doença. No entanto, ainda há escassez de informações sobre os aspectos imunopatológicos da interação Mycobacterium bovis-hospedeiro durante a infecção natural de bovinos. Na análise de uma coorte de 349 bovinos positivos no teste tuberculínico (PPD), em 247 bovinos foi confirmada a infectação natural pelo M. bovis. Dos animais positivos para M. bovis, 92% (228/247) não apresentavam sinais sugestivos da doença, entretanto, apresentavam lesões de bTB graves e disseminadas. Além disso, a disseminação das lesões de bTB estava correlacionada positivamente com a gravidade da patologia da doença e carga bacteriana viável no tecido. Adicionalmente, o encapsulamento do granuloma foi correlacionado negativamente com o crescimento do M. bovis nos tecidos, bem como com a gravidade da patologia, sugerindo que o encapsulamento é um mecanismo dinâmico e pode ser eficaz para controlar a proliferação/disseminação micobacteriana intragranuloma durante a infecção natural. Além disso, a avaliação detalhada da resposta granulomatosa nos pulmões demonstrou que o número de células gigantes multinucleadas tipo Langhans correlaciona negativamente com a contagem micobacteriana. Em contraste, a população de neutrófilos na resposta granulomatosa tuberculosa foi associado com o aumento na proliferação do M. bovis intragranuloma. Os achados aqui apresentados sugerem que o encapsulamento e as células gigantes multinucleadas estão associados ao controle da infecção pelo M. bovis, enquanto que os neutrófilos podem servir como um biomarcador celular de proliferação bacteriana durante a infecção natural. Como prova de conceito de que a dinâmica celular incitada durante a infecção por M. bovis influencia o controle do crescimento micobacteriano, analisamos parâmetros imunopatológicos durante a co-infecção natural com o vírus da leucose enzoótica bovina (BLV), um patógeno que modula a resposta imune adaptativa. Bovinos coinfectados com M. bovis e BLV apresentaram maior carga micobacteriana intragranuloma e uma doença mais grave. Na análise histomorfológica das lesões granulomatosas, observamos uma diminuição significativa na população de linfócitos, seguido por um aumento no número de neutrófilos e menor deposição de tecido conjuntivo. Estes dados sugerem uma alteração no fluxo de células para o ambiente intragranuloma devido a defeitos linfocitários. Consistente com essa hipótese, observamos uma menor resposta de hipersensibilidade do tipo tardia (DTH) em animais com linfocitose persistente (LP-BLV+). Estas evidências indicam que a infecção pelo BLV está associada à perda da homeostase da resposta imune celular do hospedeiro e possivelmente ao aumento da suscetibilidade do hospedeiro a bTB. Em conjunto, nossos dados integram a resposta granulomatosa do hospedeiro com a carga infecciosa micobacteriana e revelam novos elementos para o entendimento da imunopatogênese da bTB que poderiam ser empregados na implementação de estratégias racionais de controle da tuberculose bovina.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2010 Estudos moleculares e de biologia demonstram que o táxon Trypanosoma cruzi é composto por diferentes linhagens. Em 2005, foi descrito um surto de doença de Chagas Agudo (DCA) no município de Navegantes em Santa Catarina associado ao consumo de caldo de cana contaminado com o T. cruzi. Análises moleculares identificaram as linhagens TcI em gambás (cepas SC90 e SC91), TcI/TcII em triatomíneos (cepas SC92 e SC93) e TcII em pacientes (cepas SC94-SC102). Neste sentido, o presente trabalho objetivou estudar possíveis mecanismos envolvidos na seleção de populações do grupo TcII em infecções humanas ocasionadas por cepas mistas TcI/TcII de T. cruzi. Para tanto, as cepas SC90, SC92, SC93, SC94, SC95, SC96 e Y foram utilizadas nos ensaios de lise pelo sistema complemento, interação com macrófagos murino e humano na presença e ausência de soro imune e IFN-?, ensaios de Western blot e cinética da proporção das linhagens TcI e TcII em cepas mistas após diferentes passagens em macrófagos humanos por meio de PCR semiquantitativo e PCR quantitativo. Os ensaios de lise pelo sistema complemento não mostraram diferenças de sensibilidade entre as cepas estudadas. Já nos estudos de interação T. cruzi-macrófagos murinos verificou-se um aumento na taxa de infecção e no número médio de amastigotas quando formas tripomastigotas das diferentes cepas foram previamente incubadas com soro chagásico. Além disso, as cepas do grupo TcII apresentaram uma maior taxa de infecção em macrófagos e após 72 horas de interação, apresentaram valores médios do número de amastigotas duas vezes superiores ao observado para cepas TcI. Contudo, não houve diferença significativa no número médio de amastigotas no tempo inicial de infecção entre TcI e TcII. Ensaios de Western blot confirmaram uma maior expressão da gp82 em formas tripomastigotas das cepas TcII. Macrófagos ativados com IFN-? infectados com as cepas Y, SC90 e SC96 foram capazes de controlar a proliferação dos parasitos independente da cepa utilizada, de forma dependente da NOS2. A análise da proporção de TcI e TcII nas cepas mistas SC92, SC93 e na mistura artificial, SC90+SC96, antes e após a conclusão do ciclo biológico em macrófagos murinos revelou uma alteração no perfil molecular dessas cepas, sendo observado um completo desaparecimento do fragmento de DNA de 200 pb (TcI) na cepa mista artificial (SC90+SC96), enquanto nas cepas SC92 e SC93 verificou-se uma diminuição de cerca de 3 vezes na intensidade do fragmento de 200 pb. Quando os ensaios foram realizados com a cepa SC92 (três passagens seriadas em macrófagos humanos), constatou-se um progressivo aumento na proporção de TcII, uma vez que a proporção inicial era de 77,4% para TcI e 22,6% para TcII e após a terceira passagem foi verificado 93,2% para TcII. Em conjunto, estes resultados sugerem que a manutenção de populações de T. cruzi II em infecções humanas ocasionadas por cepas mistas pode estar relacionada com características intrínsecas do parasito, como a capacidade infectiva e o tempo de duplicação intracelular. Embora seja ainda possível que mecanismos efetores dos macrófagos estejam envolvidos com essa seleção.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Programa de Pós-Graduação em Biotecnologia, Florianópolis, 2009 Embora adenovírus (Ad) humano do sorotipo 5 tenha sido utilizado como vetor vacinal contra inúmeras doenças infecciosas, a população humana apresenta imunidade pré-existente contra estes vírus. Para transpor este problema, Ad de outras espécies animais, tal como o Ad isolado de chimpanzés do sorotipo 6, denominado AdC6, tem sido utilizado. No entanto, existem poucos estudos sobre a resposta imune induzida por AdC6 em tecidos de mucosas. Este estudo avaliou células T ?/d e células NK das mucosas do trato genital de camundongos BALB/c após imunização intravaginal com o vetor AdC6 expressando a proteína Gag do HIV-1 (AdC6gag37). Análises de citometria de fluxo demonstraram que imunização com 1010 partículas virais de AdC6gag37 aumentou a frequência e o número de células T ?/d nas mucosas do trato genital. O número de células T ?/d atingiu seu pico três dias após a imunização, uma resposta que decresceu no sétimo dia. Além disso, detectou-se aumento relevante da expressão do marcador de ativação CD69 em células T ?/d do trato genital. Entretanto, não houve alteração na expressão da molécula CD25. Adicionalmente, para investigar o perfil de expressão gênica após exposição ao vetor adenoviral, células T ?/d do trato genital de camundongos imunizados foram isoladas magneticamente e avaliadas através de PCR em tempo real. Observou-se que AdC6gag37 foi capaz de aumentar a expressão de genes (1) relacionados com mecanismos de citotoxicidade mediado por células, tais como perforina e granzima B, (2) citocinas pró-inflamatórias, IL-6 e IL-12 e (3) quimiocinas CXCL-10, CCL5, CCL3 e CCL4. Demonstrou-se também que imunização com AdC6gag37 (105 e 107 partículas virais) foi capaz de induzir aumento expressivo na freqüência e no número de células NK do trato genital. Estes resultados indicam que AdC6gag37 modula a freqüência e o número de células T ?/d e células NK nas mucosas do trato genital e sugerem que estas células podem influenciar a resposta imune durante a imunização.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas, Programa de Pós-Graduação em Farmacologia, Florianópolis, 2010 A vetorização de agentes tuberculostáticos através de nanopartículas é uma estratégia promissora para o tratamento da tuberculose pulmonar. Dentre os fármacos integrantes do esquema terapêutico, a isoniazida (INH) é o mais antigo e utilizado, apresentando excelente atividade antimicobacteriana. Embora amplamente utilizada, a INH acarreta efeitos adversos relacionados à sua toxicidade hepática e neuronal, além do rápido desenvolvimento de resistência do bacilo devido principalmente à baixa penetração intracelular do fármaco. Mecanismos de resistência rapidamente desenvolvidos por este patógeno intracelular têm intensificado a busca por novas estratégias terapêuticas, bem como por moléculas com atividade antimicobacteriana. Além disso, problemas relacionados à baixa eficiência de encapsulação da isoniazida em nanopartículas poliméricas requerem o aprimoramento da formulação farmacêutica. Assim, o presente trabalho teve como objetivo principal o desenvolvimento de nanopartículas de PLGA contendo isoniazida e seu análogo, denominado JVA 001, bem como a avaliação comparativa da atividade antimicobacteriana de cada sistema. Para a obtenção de nanopartículas, foram testadas as técnicas de dupla-emulsão com evaporação do solvente, nanoprecipitação e salting-out. Após a padronização da formulação estéril, a eficiência de encapsulação e o teor de fármaco foram determinados nas nanopartículas através de um método de quantificação por cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), da isoniazida e seu análogo, o JVA 001. A eficiência de encapsulação média obtida com a isoniazida foi de 21%, enquanto que com o JVA 001, alcançou 61%. A formulação selecionada permitiu a obtenção de partículas esféricas submicrônicas, com diâmetro médio de 142 ?m. Fotomicrografias obtidas utilizando-se microscopia eletrônica de varredura, emissão de campo ou microscopia de força atômica mostraram partículas com formato esférico e superfície lisa. A análise por calorimetria exploratória diferencial indicou a ocorrência de interações entre JVA 001 e a matriz polimérica nas nanopartículas de PLGA. Além disso, o espectro de difração de raios-X mostrou diferenças na estrutura cristalina do composto sintetizado a partir da conjugação da isoniazida com o grupamento citral. A atividade antimicobacteriana do JVA 001 foi avaliada in vitro, empregando-se o método do MTT, através do tratamento direto em culturas de Mycobacterium tuberculosis (Mtb), cepa H37Rv, e intracelularmente, em macrófagos murinos infectados. Tanto a isoniazida livre quanto nanoencapsulada reduziram significativamente a viabilidade do Mtb em cultura, de maneira dose e tempo dependente. Da mesma forma, JVA 001 inibiu o crescimento micobacteriano in vitro, entretanto, nanopartículas contendo o análogo JVA 001 foram mais efetivas na inibição do crescimento micobacteriano em macrófagos infectados, reforçando o potencial de nanopartículas poliméricas como carreador intracelular de fármacos. Os resultados obtidos neste trabalho revelam um potente análogo da INH com alta atividade contra M. tuberculosis in vitro e sugerem uma investigação mais aprofundada da utilização de sistemas carreadores nanopartículados tratamento farmacológico da tuberculose pulmonar.

Tese (doutorado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia A tuberculose é uma doença causada pelo bacilo Mycobacterium tuberculosis que mata anualmente cerca de 2 milhões de pessoas no mundo. Dado um alto impacto na saúde pública causado pelo M. tuberculosis, a ausência de uma vacina preventiva eficaz e o surgimento de cepas resistentes ao tratamento convencional, existe uma clara necessidade de um melhor entendimento dos mecanismos de imunopatogênese da tuberculose e, sobretudo, a identificação de fatores determinantes do bacilo envolvidos nesse processo. Nesse contexto, as informações geradas pelo projeto genoma de seqüenciamento do M. tuberculosis apresentam um grande potencial a ser explorado, principalmente no que diz respeito a moléculas de superfície/secretadas que possam ser identificadas e avaliadas quanto ao seu envolvimento nos eventos iniciais de infecção e imunogenicidade. No presente estudo, nós identificamos uma nova lectina secretada de M. tuberculosis por uma abordagem bioinformática que é reconhecida durante a fase ativa da tuberculose em humanos tanto em termos de indução de IFN-. em células mononucleares do sangue periférico quanto na produção de anticorpos IgG anti-sMTL-13. Essa produção de anticorpos diminui logo após 1-2 meses de tratamento e permanece em níveis basais até os pacientes atingirem cura clínica, sugerindo que anticorpos anti-sMTL-13 poderiam ser utilizados como um biomarcador de sucesso terapêutico. Em adição, estudos de deleção gênica revelaram que o gene Rv1419 não é essencial para o crescimento in vitro do M. Tuberculosis em meio de cultura, mas que o mesmo parece afetar o crescimento intracelular do bacilo e modula a produção de TNF-a em macrófagos da linhagem RAW 264.7. Em conjunto, os nossos achados demonstram a existência de um novo antígeno de M. tuberculosis com potencial de uso em diagnóstico e de gerar informações relevantes sobre a biologia da interação do patógeno com o hospedeiro. Tuberculosis remains a major public health problem throughout the world and one-third of the world population carries an asymptomatic infection, which results in eight million new cases of tuberculosis and two million deaths every year. In general, infection by Mycobacterium tuberculosis leads to a latent state in which the host is able to control the pathogen growth. While effective cellular immune responses are suggested as critical to control M. tuberculosis growth inside macrophages, it has been demonstrated that mycobacteria-associated factors play an important role in tuberculose immunopathogenesis. In this study, we have identified a secreted 13 kDa lectin from M. tuberculosis by homology search of a non-redundant lectin database. Bioinformatic analysis revealed that sMTL-13 belongs to the ricin-type b-trefoil family of proteins containing a Sec-type signal peptide present in M. tuberculosis complex species, but not in nontuberculous mycobacteria. Following heterologous expression of sMTL-13 and generation of an mAb (clone 276.B7/IgG1k), we confirmed that this lectin is present in culture filtrate proteins from M. tuberculosis H37Rv, but not in non-tuberculous mycobacteria-derived culture filtrate proteins. In addition, sMTL-13 leads to an increased IFN-g production by PBMC from active tuberculosis patients. Furthermore, sera from tuberculosis patients displayed high titers of IgG Ab against sMTL-13, a response found to be decreased following successful antituberculosis therapy. We also investigated the role of Rv1419 gene of M. tuberculosis during in vitro infection. Our work shows that bacterial replication kinetics of Rv1419 mutant and wild type bacterium were comparable in liquid culture under static conditions. Moreover, the Rv1419 mutant was not impaired in its ability to growth upon macrophage infection. However, its ability to stimulate key cytokine such as TNF-á was reduced, which is in line with CFU counts at earlier time points post-infection (24h) Together, our findings reveal a secreted 13 kDa ricin-like lectin from M. tuberculosis, which is immunologically recognized during active tuberculosis and could serve as a biomarker of disease treatment. We believe that sMTL-13 is an important component of the bacterial-host interplay.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Santa Catarina, Centro de Ciências Biológicas. Programa de Pós-Graduação em Farmacologia A tuberculose (TB) é uma infecção das vias aéreas causada pela inalação de gotículas em suspensão do Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Em 2010, estima-se que aproximadamente 8,8 milhões de pessoas tenham desenvolvido a doença, levando a morte de 1,1 milhões de pessoas em todo o mundo. O tratamento farmacológico para TB apresenta-se efetivo na maioria dos casos, porém o prolongado tempo da terapia associado aos efeitos adversos e a toxicidade diminuem a adesão dos pacientes, tendo como consequência o aumento no número de recidivas e o potencial desenvolvimento de resistência bacteriana. O desenvolvimento de análogos da isoniazida, com propriedades químicas mais favoráveis a sua penetração celular pode ser considerada uma estratégia na busca de novos tratamentos para a TB. A síntese de um análogo lipofílico da INH, denominado JVA, apresentou atividade antimicobacteriana in vitro semelhante à isoniazida e o tratamento de macrófagos infectados com cepa de Mtb por nanopartículas (NPs) poliméricas de PLGA que continham o JVA demonstrou atividade antimicobacteriana superior à forma livre. No presente trabalho, investigamos a capacidade de interação de NPs poliméricas na superfície do bacilo e também a sua interação com a bactéria no meio intracelular, além da análise da farmacocinética do JVA livre e em sistemas de liberação poliméricos administrado em camundongos. Técnicas de citometria de fluxo, MALDI-TOF/MS, imagens por AFM e microscopia confocal revelaram que NPs poliméricas de PLGA são capazes de interagir diretamente com a superfície do bacilo no meio intra e extracelular, podendo aumentar a exposição do bacilo aos antimicobacterianos, resultando em uma maior eficácia terapêutica. Para a realização dos estudos farmacocinéticos, desenvolveu-se e validou-se uma metodologia analítica por cromatografia líquida de fase-reversa. A validação do método demonstrou seletividade, linearidade, exatidão e precisão, sendo adequado para a sua utilização nos estudos farmacocinéticos subsequentes. As análises farmacocinéticas realizadas após a administração de JVA livre em camundongos pelas vias intraperitoneal (IP) e oral (VO) demonstraram que este composto apresenta uma rápida absorção (Tmax = 10 e 15 min.), com uma meia-vida de eliminação curta (ca. 15 min.), alto volume de distribuição (~ 100 mL) e depuração plasmática (~5 mL/min.), resultando em uma rápida eliminação deste composto da circulação sistêmica. A administração pela VO reduziu sua biodisponibilidade em cerca de 40% quando comparado à via IP. Testes farmacocinéticos preliminares com a utilização de NPs poliméricas pela via IP não se mostraram capazes de modificar o perfil farmacocinético observado com a administração do JVA livre. A partir disso, micropartículas poliméricas de PLGA, com um tamanho médio de 2 µm, foram produzidas para encapsular JVA e mostraram uma eficiência de encapsulação acima de 80%, com alto teor de JVA associado ao carreador. Ensaios de liberação de JVA a partir destes carreadores revelaram uma liberação praticamente nula do JVA em pH ácido e uma rápida e quase completa liberação quando em pH alcalino. A administração desses carreadores pela via IP e oral não foram capazes de modificar os parâmetros farmacocinéticos de meia-vida de eliminação, volume de distribuição e depuração de maneira significativa, porém, reduziram a biodisponibilidade do JVA. De maneira interessante, constatou-se que parte da dose administrada de JVA foi biotransformada em isoniazida, independente da via de administração escolhida e se este foi administrado livre ou em MPs. Porém, a conversão pela via oral foi mais significativa do que aquela observada pela via IP, ocorrendo de maneira semelhante com a administração de JVA livre ou encapsulado em MPs. Desta maneira, apesar de os parâmetros farmacocinéticos do JVA não terem sido considerados ideais para uma substância que se pretende usar na terapia antimicobacteriana este ainda deve ser investigado quanto a sua efetividade bactericida em modelos animais de TB. Devido a sua facilidade de permeação através de membranas e sua alta distribuição entre os tecidos espera-se observar um aumento no aporte de fármaco ao sítio da infecção, com redução no risco de desenvolvimento de resistência bacteriana e possibilidade de aumento da efetividade terapêutica. Tuberculosis (TB) is an infection primarily caused by inhalation of droplets of Mycobacterium tuberculosis (Mtb). In 2010, it has been estimated that approximately 8.8 million people have developed the disease, leading to death of 1.1 million people worldwide. Pharmacological treatment for TB is thought to be effective in most cases, but the prolonged therapy associated with adverse effects and toxicity decreases patient compliance, resulting in an increased number of recurrences and the potential development of bacterial resistance. The development of isoniazid (INH) analogs, with enhanced chemical properties for cellular penetration can be considered a strategy in the research for new treatments for TB. We have recently demonstrated that an INH lipophilic analog, named JVA, displays an in vitro antimycobacterial activity similar to that of INH and the nanoenabled system using JVA within PLGA nanoparticles (NPs) enhanced Mtb killing inside macrophages. In this study, we investigated the interaction of polymeric NPs with the surface of the bacillus and also their interaction with the bacteria in the intracellular environment, as well as pharmacokinetic analysis of the free JVA and polymeric delivery systems administered in mice. Flow cytometry, MALDI-TOF/MS, confocal and atomic force microscopy analyses revealed that JVA-NPs associate with both intracellular Mtb and cell-free bacteria, indicating that NPs directly interact with the bacterium. Regarding pharmacokinetic studies, we developed and validated an analytical method using reverse phase liquid chromatography. The method validation showed specificity, linearity, accuracy and precision and is suitable for use in subsequent pharmacokinetic studies. The pharmacokinetic analysis carried out after the administration of free JVA by intraperitoneal (IP) and oral route in mice demonstrated that this compound exhibits rapid absorption (Tmax = 10 and 15 min.), with a short elimination half-life ( ~15 min.), high volume of distribution (~ 100 mL) and total clearance (~ 5 mL / min.), resulting in rapid elimination of this compound from circulation. Oral bioavailability is reduced by 40% compared to the IP route. Preliminary pharmacokinetic analyses with the IP polymeric NPs administration were not able to alter the pharmacokinetic profile observed with administration of free JVA. Furthermore, PLGA microparticles (MPs) were produced to encapsulate JVA, which displayed an entrapment efficiency above 80%, with high content of JVA associated with the carrier, and the average diameter of MPs-JVA was approximately 2 ìm. In vitro drug release studies for MPs-JVA have shown a very low drug release at acid pH and rapid and nearly complete when alkaline pH. The IP and oral administration of these carriers were not able to modify significantly the pharmacokinetic parameters of the elimination half-life, volume of distribution and clearance, but reducing the bioavailability of JVA. Interestingly, it was found that part of the administered JVA dose was biotransformed to isoniazid, independently of the administration routes and formulations. However, the JVA to INH conversion was higher by the oral than IP route, occurring in a similar way for free JVA or MPs-JVA administration. Although the pharmacokinetic parameters of JVA have not shown an extended half-life as expected, it deserves complementary investigations for their putative antimicrobial activity in animal models of TB. It is expected that its high permeation through the membrane and high distribution between tissues may increase the drug bioavailability to the site of infection, decreased risk of development bacterial resistance and increased therapeutic effectiveness.

FAPEMIG - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais Um terço da população mundial está infectada com o Mycobacterium tuberculosis. Novos métodos de diagnóstico e a vacinação contra tuberculose (TB) são necessários para o controle da doença. A resposta imunológica contra o M. tuberculosis envolve a produção de várias citocinas e quimiocinas, porém suas interações durante a infecção são bastante complexas. O presente trabalho teve como objetivo o estudo da produção de citocinas e quimiocinas durante a tuberculose pulmonar, frente a estímulos de antígenos do M. tuberculosis. Através do método citométrico de esferas ordenadas (CBA-Cytometric Bead Array) foi possível avaliar os níveis plasmáticos das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8, RANTES e MCP-1 em pacientes com tuberculose ativa não tratada (TBA), em pacientes sob tratamento (TBST), em pacientes tratados (TBT) e em indivíduos controles sadios (CS). Utilizando esse mesmo método também foi realizada a mensuração das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-10 e IL-4 e das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8, RANTES e MCP-1, produzidas em cultura de células mononucleares do sangue periférico após estímulo com os antígenos ESAT-6/CFP-10 e 16kDa, nos grupos de pacientes com tuberculose ativa não tratada (TBA), de pacientes tratados (TBT), de indivíduos controles sadios (CS) e de indivíduos contatos de pacientes com tuberculose (CT). As quimiocinas plasmáticas MIG, IP-10 e IL-8 estavam elevadas no grupo TBA, em comparação aos demais grupos (CS, TBST e TBT); e ainda os níveis das quimiocinas analisadas no plasma diminuíram após o início do tratamento. Nos ensaios “in vitro” com PBMC humanas, as citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2 e as quimiocinas MIG, IP-10, IL-8 e RANTES foram estimuladas em níveis maiores, pelo ESAT-6/CFP-10, nos grupos TBA e CT em relação aos controles e pacientes tratados, enquanto que o estímulo com antígeno 16kDa não permitiu diferenciar entre os grupos estudados quanto a produção dessas citocinas e quimiocinas. Já as citocinas IL-10 e IL-4 e a quimiocina MCP-1 apresentaram níveis elevados nas culturas de PBMC de indivíduos controles e contatos quando estimuladas com os antígenos do M. tuberculosis estudados em relação aos pacientes com tuberculose. O antígeno ESAT-6/CFP-10 diferenciou a tuberculose ativa quanto à produção das citocinas IFN-γ, TNF-α, IL-6 e IL-2, e das quimiocinas MIG, IP-10, IL-8 e RANTES, as quais podem contribuir para uma resposta protetora na tuberculose. O antígeno 16kDa se mostrou um forte estimulador de IL-10 e MCP1, moléculas que podem atuar como reguladoras ou inibidoras da resposta imunológica contra a infecção por M. tuberculosis, sugerindo o papel importante deste antígeno em favorecer a persistência do bacilo no hospedeiro. Os níveis de quimiocinas plasmáticas podem ser eficazes em diferenciar os pacientes com tuberculose ativa de indivíduos controles e ainda pode ser útil em monitorar o efeito do tratamento quimioterápico anti-tuberculose. O entendimento da dinâmica resposta imunológica contra antígenos do M. tuberculosis pode auxiliar no desenvolvimento de novas estratégias de combate à tuberculose. One-third of the world's population is currently infected with Mycobacterium tuberculosis. The development of new methods of diagnosis and vaccines against tuberculosis (TB) are necessary for disease control. The immune response against M. tuberculosis involves the production of many cytokines and chemokines, but their interaction during the infection is complex. The objective of this work was to study the production of cytokines and chemokines in pulmonary TB under stimulation of M. tuberculosis antigens. The method of Cytometric Bead Array (CBA) was used to evaluate plasma levels of chemokines MIG, IP-10, IL-8, MCP-1 and RANTES in untreated patients with active TB (ATB), in patients during treatment (DTB) and in treated patients (TTB) and healthy controls individuals (HC). We also evaluated, by CBA, the levels of cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2, IL-10 and IL-4, and chemokines MIG, IP-10, IL-8, MCP-1 and RANTES, in culture of peripheral blood mononuclear cells (PBMC) after stimulation with the antigens ESAT-6/CFP-10 and 16kDa, in groups of untreated patients with active TB (ATB), in treated patients (TTB), healthy controls individuals (HC) and in contact individuals of patients with TB (CT). The production of plasma chemokines, the levels of MIG, IP-10 and IL-8 were higher in the group ATB, compared to the other (HC, DTB and TTB), and the levels of chemokines analyzed in plasma decreased after the beginning of the treatment. In assays with human PBMC, the cytokine IFN-γ, TNF-α, IL-6, IL-2 and chemokines MIG, IP-10, IL-8 and RANTES were stimulated at higher levels, by the fusion protein ESAT-6 / CFP-10, in groups ATB and CT in relation to the controls and treated patients. The stimulation with antigen 16kDa did not allow for differentiation of these cytokines and chemokines between the groups. IL-10, IL-4 and MCP-1 showed high levels in the cultures of PBMC from healthy control individuals and contacts when stimulated with the studied M. tuberculosis antigens compared to patients with TB. The antigen ESAT-6/CFP-10 differentiated active TB with regard to the production of cytokines IFN-γ, TNF-α, IL-6 and IL-2 and chemokines MIG, IP-10, IL-8 and RANTES, which can contribute to a protective response in TB. The antigen 16kDa was a strong stimulator of IL-4, IL-10 and MCP-1 molecules that can regulate or inhibit the immune response against M. tuberculosis infection, demonstrating the important role of this antigen in promoting the persistence of the bacillus in the host. The plasma levels of chemokines can be effective in differentiating patients with active TB from the healthy control individuals, and can also be useful in monitoring the effect of anti-TB chemotherapy. The comprehension of the dynamics of the immune response against M. tuberculosis antigens can aid the development of new strategies to combat tuberculosis.