Search

Dispersion of transferable oxazolidinone resistance genes among enterococci poses a serious problem to human health. Prompt detection of bacteria carrying these genes is crucial to avoid their spread to multidrug-resistant bacteria. The aim of the study was to describe the presence of optrA-positive isolates among enterococci in a Spanish hospital, and to determine their genetic context and location through whole genome sequencing. All enterococci recovered in a Spanish hospital (Hospital El Bierzo; HEB) from February to December 2018 (n = 443), with minimal inhibitory concentrations (MICs) to linezolid (LZD) ≥4 mg/L, were tested by polymerase chain reaction for the presence of cfr, optrA, and poxtA transferable genes. Only four Enterococcus faecalis isolates (0.9%) had LZD MICs ≥4 mg/L and none of them was positive for cfr or poxtA genes. However, the optrA gene was detected in three isolates collected from urine samples of community patients, whose genomes were sequenced and subjected to bioinformatics analysis. These isolates belonged to different clones: ST7, ST480, and ST585. In these three isolates, the optrA gene was located on plasmids, associated with IS1216 in different arrays. In one isolate, the optrA plasmid coexists with a second plasmid, which carried multiple resistance genes for different classes of antibiotics. Detection of optrA-positive E. faecalis isolates in the community is a matter of concern. The spread of these bacteria into hospital settings, particularly in those, such as the HEB, where vancomycin-resistant enterococci are endemic, should be avoided, to preserve the efficacy of the last-resort oxazolidinones., The authors are grateful to Regional Ministry of Science of Asturias (IDI/2021/000033), Spain, for supporting this work.

Resumen del trabajo presentado en la VII Reunión Red Española de Bacteriófagos y Elementos Transductores - RED FAGOMA, celebrada en Trujillo, Cáceres (España), del 26 al 28 de octubre de 2022, Enterococcus hirae una especie bacteriana que está presente de forma habitual en el tracto gastrointestinal de animales, incluido humanos, y en alimentos elaborados con ingredientes de origen animal como los productos lácteos. Sin embargo, ciertas cepas de E. hirae se han descrito como productoras de compuestos tóxicos como las aminas biógenas tiramina y putrescina, que se pueden acumular en alimentos como el queso, en altas concentraciones. La ingesta de estos alimentos puede provocar reacciones de intoxicación en los consumidores. Por otro lado, ciertas cepas de E. hirae se han identificado como agentes causales de endocarditis o bacteriemia, y algunas de ellas, además, se ha visto que son portadoras de genes de resistencia a antibióticos. Los bacteriófagos son una herramienta eficaz para la eliminación de bacterias patógenas y alterantes en ambientes de gran diversidad microbiana, dada su gran especificidad. Uno de los retos para aplicar de forma efectiva el biocontrol con fagos es la necesidad de disponer de una amplia colección de fagos bien caracterizados. En el caso de E. hirae no aparecen descritos en la literatura fagos líticos y solamente el análisis de los genomas disponibles revela la presencia de posibles profagos en los mismos. Por lo tanto, en este trabajo nos planteamos el aislamiento de fagos líticos capaces de infectar E. hirae a partir de muestras de queso con alto contenido en tiramina y putrescina. A partir de una muestra de queso manchego, aislamos el fago vB_EhiS_268, perteneciente a la familia Siphoviridae. Realizamos una caracterización microbiológica y tecnológica del mismo y comprobamos que posee un rango de hospedador muy estrecho. El análisis de su genoma reveló la ausencia de genes de virulencia y la presencia de genes con potencial antimicrobiano que podrían compensar el problema de su estrecho rango de hospedador

Resumen del trabajo presentado en el I Asturias International Meeting on Clinical Microbiology and Infectious Diseases - AIMID , celebrado en Oviedo (España) , los días 22 y 23 de septiembre de 2022, Introduction The rise of antimicrobial resistant (AMR) bacteria is a major health concern, especially with regard to members of the ESKAPE group, to which vancomycin-resistant Enterococcus faecium (VRE) belongs. Phage therapy has emerged as a novel alternative for the treatment of AMR infections. However, it relies on the isolation and characterization of a large collection of phages. This work describes the exploration of human faeces as a source of new E. faecium-infecting phages. Material and methods Phage vB_EfaH_163 was isolated from the faeces of a human volunteer after applying a microbiota separation method. Phage vB_EfaH_163 was then characterized at the microbiological level: Host range against strains of E. faecium from different origins -including VRE clinical isolates- capsid morphology, and one-step growth curve. The vB_EfaH_163 genome was sequenced and analysed. In addition, technological characterization-specifically pH and thermal stability- was performed. Finally, the biocontrol capacity of vB_EfaH_163 against a clinical VRE strain was assayed in broth and in a Galleria mellonella animal model. Results and discussion vB_EfaH_163 phage is a new member of Herelleviridae, subfamily Brockvirinae. Its genome consists in a dsDNA genome of 150.836 bp that do not harbours any toxin-encoding or antibiotic resistance genes. It infects a wide range on E. faecium strains of different origin, including VRE strains. Interestingly, it can also infect E. faecalis strains, even some that are linezolid-resistant. Its capacity to control the growth of a clinical VRE isolate was shown in broth culture. Moreover, the phage vB_EfaH_163 was shown to significantly reduce mortality in a Galleria. mellonella animal model of E. faecium infection. The discovery and characterization of vB_EfaH_163 increases the number of phages that might be used therapeutically against AMR bacteria.

Trabajo presentado al XXII Congreso Nacional de Microbiología de los Alimentos, celebrado en Jaén (España), del 12 al 15 de septiembre de 2022, La histamina es una amina biógena que se sintetiza mediante descarboxilación enzimática del aminoácido histidina y que debido al metabolismo de algunas bacterias se puede acumular en concentraciones elevadas en los alimentos, provocando reacciones adversas en los consumidores. El queso es uno de los alimentos en los que más frecuentemente se acumula histamina a concentraciones tóxicas, siendo Lentilactobacillus parabuchneri el principal responsable. Trabajos previos revelaron la capacidad de algunas de sus cepas de formar biofilms en distintas superficies, lo que constituye un riesgo de contaminación de los quesos durante su producción, especialmente de los quesos procesados, como los rallados y cortados. Los biofilms son comunidades de microorganismos que permanecen adheridos a una superficie y embebidos en una matriz extracelular. Su presencia en la industria alimentaria es muy habitual, pudiendo adherirse a las superficies de los equipamientos utilizados, provocando la contaminación de los alimentos. Dependiendo de las especies pueden causar su deterioro, con la consecuente pérdida económica, e incluso pueden ser responsables de intoxicaciones alimentarias. El objetivo del presente trabajo fue identificar los genes de L. parabuchneri involucrados en la formación del biofilm y determinar su funcionalidad. Con este fin, se secuenció y analizó el genoma de 6 cepas con diferentes capacidades de producción de biofilm (fuertes, moderadas y débiles). En ellas, se confirmó la presencia del cluster HDC de producción de histamina. Además, se identificó un cluster de 4 genes, presente únicamente en las cepas formadoras de biofilm fuerte, que mostró similitud con genes implicados en la formación de pili, siguiendo el modelo sortase-mediated pilus, y que por tanto podría estar relacionado con la capacidad de adhesión a superficies. Se realizó la clonación de las 8kb del cluster, y su expresión heteróloga en Lactococcus lactis NZ9000 permitió comprobar su funcionalidad e implicación en la adhesión y formación de biofilms., This work is part of a project that has received funding from the European Union’s Horizon 2020 research and innovation programme under the Marie Skłodowska-Curie Grant Agreement No. 813439

Trabajo presentado a la 15ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas: Bacterias Lácticas en Alimentación y Salud, celebrad en Valencia (España), los días 26 y 27 de mayo de 2022., El ácido gamma aminobutírico (GABA) es un aminoácido no proteico que presenta distintos efectos beneficiosos para la salud, como por ejemplo, la reducción del estrés y de la ansiedad, la prevención de la diabetes y efectos hipotensivos, entre otros. Algunas bacterias del ácido láctico (BAL) tienen la capacidad de sintetizar este compuesto bioactivo. Este hecho, ha despertado el interés de Industria Alimentaria por utilizar BAL productoras de GABA para elaborar alimentos fermentados funcionales enriquecidos en GABA que sean beneficiosos para la salud del consumidor. Lactococcus lactis es una BAL en las que se han descrito cepas productoras de GABA. Esta especie es el cultivo iniciador más utilizado en la industria láctea para la elaboración de productos lácteos fermentados como el queso y la mantequilla, estando considerada segura para el consumo (Qualified Presumption of Safety, QPS) por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA). Las cepas de L. lactis productoras de GABA lo hacen mediante descarboxilación enzimática del ácido glutámico. Los genes implicados en esta descarboxilación están organizados en el cluster de la glutamato descarboxilasa (GAD), que consiste en tres genes: gadR (codifica un posible regulador positivo), gadD (codifica el transportador de membrana GABA-ácido glutámico) y gadB (codifica la enzima glutamato descarboxilasa). En este trabajo se describen 6 cepas de Lactococcus lactis productoras de GABA que se aislaron a partir de muestras de leche cruda de camella procedentes de distintas regiones de Argelia. A la vista de la relevancia tecnológica que podría suponer para la Industria Láctea este tipo de microorganismos productores de GABA, se llevó a cabo una caracterización exhaustiva de los mismos: caracterización fenotípica, genómica (secuenciación del genoma), tecnológica (capacidad acidificadora; actividad proteolítica; producción de dextrano, compuestos volátiles y compuestos antimicrobianos) y de seguridad alimentaria (producción de aminas biógenas y presencia de genes de resistencia a antimicrobianos). Esta caracterización reveló que las 6 cepas portaban el cluster GAD para la biosíntesis de GABA y tenían buenas características tecnológicas y de seguridad alimentaria. Seguidamente, se evaluó su potencial como cultivos iniciadores para elaborar quesos funcionales tipo Cabrales enriquecidos en GABA. Los quesos elaborados con estas cepas, acumularon concentraciones de GABA entre los 350 y 457 mg/kg. Estos buenos resultados indican que estas cepas se podrían utilizar como cultivos iniciadores para la elaboración de quesos funcionales enriquecidos en GABA que pudieran ser beneficiosos para la salud de los consumidores.

Colistin is a last-resort antibiotic in fighting severe infections caused by multidrug resistant Gram negative pathogens in hospitals. Zoonotic bacteria acquire colistin resistance in animal reservoirs and mediate its spread along the food chain. This is the case of non-typhoid serovars of Salmonella enterica. Colistin-resistant S. enterica in foods represents a threat to human health. Here, we assessed the prevalence of colistin-resistance in food-borne isolates of S. enterica (2014–2019; Asturias, Spain), and established the genetic basis and transferability of this resistance. Five out of 231 isolates tested (2.2%) were resistant to colistin. Four of them, belonging to the European monophasic ST34 clone of S. Typhimurium, were characterized in the present study. They were collected from pork or pork and beef meat-derived products, either in 2015 (three isolates) or 2019 (one isolate). Molecular typing with XbaI-PFGE and plasmid profiling revealed distinct patterns for each isolate, even though two of the 2015 isolates derived from the same sample. The MICs of colistin ranged from 8 to 16 mg/L. All isolates carried the mcr-1.1 gene located on conjugative plasmids of the incompatibility groups IncX4 (2015 isolates) or IncHI2 (2019 isolate). Apart from colistin resistance, the four isolates carried chromosomal genes conferring resistance to ampicillin, streptomycin, sulfonamides and tetracycline [blaTEM–1, strA-strB, sul2, and tet(B)] and heavy metals, including copper and silver (silESRCFBAGP and pcoGE1ABCDRSE2), arsenic (arsRSD2A2BCA1D1) ± mercury (merEDACPTR), which are characteristically associated with the European ST34 monophasic clone. The 2019 isolate was also resistant to other antibiotics, comprising third generation cephalosporins and cephamycins. The latter phenotype was conferred by the blaCMY–2 gene located on an IncI1-I(α)-ST2 plasmid. Results in the present study identified meat-derived products as a reservoir of a highly successful clone harboring transferable plasmids which confer resistance to colistin and other clinically important antibiotics. An important reduction in the number of food-borne S. enterica detected during the period of the study, together with the low frequency of colistin resistance, underlines the success of One Health initiatives, such as those implemented at the UE, to control zoonotic bacteria along the food chain and to halt the spread of antimicrobial resistance.

Trabajo presentado en la 9th International Anual Conference Phages 2019, Bacteriophage in Medicine, Food and Biotechnology, celebrada en Oxford, del 11 al 12 de septiembre de 2019, Biogenic amines (BA) are nitrogenous compounds with important biological activities. However, due to the metabolism of certain bacteria, BA can accumulate in high concentrations in food and its consumption constitutes a toxicological threat. Cheese is one of the foods that higher concentrations of BA can accumulate, being lactic acid bacteria (LAB) the main BA-producers. Consequently, most of the methods proposed for reducing BA in food, which are based on reducing the presence of BA-producing bacteria, have not only failed to completely solve the problem, they also affect non-BA producing LAB that are essential in the development of the organoleptic characteristics of cheese. Therefore, new and more specific solutions are needed. Bacteriophages have arisen, in recent years, as a promising antimicrobial weapon both in clinical and food safety applications. They present some properties that made them ideal biotechnological tools against food spoilage microorganisms such as BA-producing bacteria: they are extremely host-specific, are food-grade, have a long shelf life, are able to resist the environmental stresses encountered during food processing. In addition, in the case of food spoilage microorganisms there is no need to kill all the population of the target microorganism, as could happen fighting against a pathogen, but maintain the population levels below a certain threshold is enough. In this communication, we present the isolation and further characterization of dairy phages against Enterococcus faecalis, species mainly responsible of the accumulation of tyramine and putrescine in cheese. Among them, we have chosen phage 156 for an in deep characterization and to perform a proof-of-concept challenge to reduce the presence of tyramine and putrescine in a cheese experimental model. The addition of 156 reduced the concentration of tyramine and putrescine below its toxic threshold limit., This work was funded by the Spanish Ministry of Science (AGL2016-78708-R), CSIC (201870I091) and PCTI of the Principality of Asturias and EU Regional Development Funds (idi/2018/0 00114 ).

Trabajo presentado en la 13ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas (RedBAL), celebrada en Madrid (España) del 17 al 18 de junio de 2019, La tiramina es una amina biógena traza que los seres vivos sintetizan a partir de la descarboxilación enzimática de la tirosina. A pesar de su importancia fisiológica, se sabe que la ingesta de alimentos que contienen altas concentraciones de tiramina puede ocasionar distintos problemas de salud en el consumidor, como hipertensión, dolores de cabeza, migrañas, etc. En alimentos fermentados como productos cárnicos, derivados del pescado y productos lácteos se pueden acumular concentraciones altas de tiramina. El queso es el alimento fermentado en el que se han registrado concentraciones más elevadas de tiramina (hasta 2130 mg/kg). De hecho, la primera vez que se describieron los efectos tóxicos hipertensivos de la tiramina fue en pacientes con depresión que estaban recibiendo tratamiento con inhibidores de MAO, después de comer queso. Debido a esto, se conoce como >reacción del queso> al conjunto de efectos tóxicos que la ingesta de alimentos ricos en tiramina causa en el consumidor. Los principales responsables de la acumulación de tiramina en quesos son bacterias del ácido láctico pertenecientes a la especie Enterococcus faecalis; nuestros estudios indican que en estos microorganismos la producción de tiramina es una característica de especie. A pesar de que la tiramina se considera una de las AB más tóxicas, no existen límites máximos legales para la concentración de esta AB en alimentos. En el último informe que emitió sobre aminas biógenas (2011), la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria (EFSA) consideraba necesario realizar estudios científicos que cuantificasen la toxicidad de la tiramina, para poder determinar cuáles son las concentraciones máximas de esta AB en alimentos, cuya ingesta no afecte la salud de los consumidores. Motivados por este informe, desarrollamos un modelo in vitro con el que hemos cuantificado la citotoxicidad de la tiramina en líneas intestinales humanas (HT29), así como la citotoxicidad de otras AB alimentarias que se encuentran frecuentemente y en altas concentraciones en quesos, concretamente la histamina, putrescina y cadaverina. Este modelo in vitro se basa en la tecnología RTCA (Real Time Cell Analysis) que permite monitorizar cambios en la línea celular en tiempo real. Nuestros estudios demuestran que la tiramina es citotóxica a concentraciones que se encuentran frecuentemente en alimentos como el queso. De hecho, la tiramina fue la AB más citotóxica de todas la AB alimentarias analizadas. Además, presentó citotoxicidad sinérgica con la histamina, otra de las AB alimentarias más tóxicas y que se suele encontrar en altas concentraciones en queso, conjuntamente con la tiramina. Cabe destacar que la histamina, a concentraciones por debajo del límite legal establecido para pescado (sólo existe límite legal de histamina en pescado y derivados del pescado, en ningún otro alimento), aumenta la citotoxicidad de la tiramina. El modo de acción del efecto citotóxico de la tiramina es mediante la inducción de necrosis celular. Para profundizar en la respuesta molecular que la tiramina induce en las células intestinales, hemos analizado el efecto de ésta AB en el patrón de expresión de genes relacionados con diferentes rutas oncogénicas y con rutas de señalización de daños en el DNA. Nuestros resultados indicaron que la tiramina, a concentraciones que se pueden encontrar en alimentos, modifica el perfil de expresión de ciertos genes implicados en mecanismos de reparación de daños en el DNA, ciclo celular, apoptosis y metabolismo de ácidos grasos. Estos resultados sugieren que la tiramina podría ser genotóxica para las células intestinales humanas y que podría incluso inducir carcinogénesis intestinal. Financiación: Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2016-78708-R), Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2016-78708-R)

Trabajo presentado en el 6th Annual Meeting of Spanish Network of Bacteriophages and Transducer Elements (FAGOMA), celebrado en Bilbao (España), del 20 al 22 de octubre de 2021, El aumento de bacterias resistentes a antimicrobianos (AMR) supone un problema de salud pública, especialmente en el caso de bacterias pertenecientes al grupo ESKAPE, al que pertenece Enterococcus faecium resistente a la vancomicina (VRE). La terapia fágica puede ser una alternativa para el tratamiento de las infecciones causadas por estas bacterias. Sin embargo, se necesita el aislamiento previo y la caracterización de una gran colección de fagos. En este trabajo exploramos el uso de heces humanas como fuente de nuevos fagos capaces de infectar a E. faecium. A partir de una muestra se aisló el fago vB_EfaH_163 que fue caracterizado a nivel microbiológico, genómico y funcional. El fago vB_EfaH_163 es un nuevo miembro de la familia Herelleviridae, subfamilia Brockvirinae y posee un genoma de dsDNA de 150.836 pb. El análisis de su genoma no reveló la existencia de genes que codifiquen toxinas o resistencias a antibióticos y además, es capaz de Infectar una amplia variedad de cepas de E. faecium de diferente origen, incluidas cepas VRE. Curiosamente, también puede infectar cepas de Enterococcus faecalis, incluyendo cepas resistentes a linezolid, un antibiótico de último recurso. Se analizó la estabilidad de los viriones a diferentes temperaturas y valores de pH. Finalmente, se ensayó su capacidad para controlar el crecimiento de un aislado clínico de E. faecium VRE, tanto en medio de cultivo como en un modelo animal de Galleria mellonella. El aislamiento y la caracterización de vB_EfaH_163 aumenta el número de fagos que podrían usarse para combatir las bacterias AMR y amplía el número de posibles fuentes de fagos con aplicaciones terapéuticas.

Trabajo presentado en el VII Congrès International de Biotechnologie et Valorisation des Bio-Ressources, celebrado en Tabarka (Túnez), del 20 al 23 de marzo de 2019, Au cours des dernières décennies, une plus grande attention est portée à la sécurité alimentaire afin de protéger la santé humaine que ce soit sur les contaminants chimiques, contaminants physiques ou contaminants d¿origine biologique. Le secteur des aliments fermentés nécessite une attention particulière en raison de la complexité de leur processus de transformation biotechnologique. La recherche de contaminants d¿origine naturelle et biologique tels que les amines biogènes est particulièrement importante, car certaines de ces molécules, notamment l¿histamine, sont dangereuses pour l¿homme si la dose ingérée est trop élevée. L¿objectif de cette étude consiste en la détéction des souches de bactéries lactiques spécifiques (Lactobacillus, Lactococcus et Enterococcus) productrices d¿amines biogènes ainsi que la recherche des gènes codant pour les enzymes impliquées dans la production de deux amines biogènes (Tyramine, Histamine) avec des amorces spécifiques de chaque amine biogène étudié par PCR ainsi qu¿une étude sur milieu de culture spécifique. Les bactéries lactiques ont notamment été identifiées à partir_de l¿ARNr16S.

Trabajo presentado en 2nd Food Chemistry Conference: Shaping the Future of Food Quality, Safety, Nutrition and Health, celebrada en Sevilla (España), del 17 al 19 de septiembre de 2019, Consumers' demand for functional foods that contains health-promoting substances is currently increasing. Gamma amino butyric acid (GABA) is a beneficial amino compound highly valued for its anti-hypertensive, anti-diabetic and relaxing effects. A multifactorial analysis has been performed to classify cheese according to their GABA content. We have analysed thirty-seven cheese manufactures (one-hundred samples) including dominant climate, milk treatment, milk origin, moulds presence, proteolysis, ripening time, final texture and fat content as categorical variables. We also quantified free amino acids, glutamic acid, glutamine and ammonium ions as chemical signatures of GABA metabolism. Cheese samples were classified into four distinct clusters. The spatial correlation between samples and variables revealed the existence of two profiles of high-GABA-content cheeses. These findings may help the food industry design functional cheeses with high GABA contents.

Resumen del trabajo presentado a la 14ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas (RedBAl), celebrada de forma telemática del 8 al 10 de Septiembre de 2021, Se denomina biofilms o biopelículas a comunidades de microorganismos que permanecen adheridos a una superficie y embebidos en una matriz extracelular formada por polisacáridos, proteínas, ADN de las células lisadas y/o ácidos teicoicos. La formación y el desarrollo de los biofilms dependen de múltiples factores, incluyendo la especie y cepa microbiana, las propiedades de los materiales de la superficie a la que se adhieren y las condiciones ambientales (pH, temperatura¿). La presencia de biofilms es habitual en la industria alimentaria, ya que las bacterias pueden adherirse a la superficie de algunos de los materiales empleados: plástico, metal, goma y madera. Estos biofilms son muy resistentes a los métodos de lavado y desinfección de las instalaciones y actúan como un reservorio de microorganismos que contaminan los alimentos, deteriorándolos y provocando pérdidas económicas significativas. Además, dependiendo de las especies presentes en el biofilm, pueden incluso ser responsables de intoxicaciones alimentarias y de la transmisión de enfermedades. Las bacterias del ácido láctico (BAL) cumplen un papel fundamental en la industria alimentaria. Sin embargo, algunas BAL son responsables de la acumulación de aminas biógenas (AB), como la histamina, en altas concentraciones en alimentos fermentados. El consumo de alimentos con concentraciones elevadas de histamina provoca reacciones adversas en los consumidores y por este motivo, las autoridades sanitarias recomiendan evitar su presencia en los alimentos. Lentilactobacillus parabuchneri ha sido descrito como el principal responsable de la acumulación de histamina en quesos. Trabajos previos realizados en nuestro grupo de investigación revelaron la capacidad de algunas cepas de L. parabuchneri de formar biofilms, incluso sobre el acero empleado en la maquinaria industrial, lo que constituye un riesgo de contaminación de los quesos durante el proceso de elaboración que tendrá como consecuencia la posterior acumulación de histamina. El objetivo inicial de este trabajo fue caracterizar los biofilms formados por 25 cepas de L. parabuchneri de origen lácteo. Las cepas fueron clasificadas como fuertes, moderadas o débiles formadoras de biofilms. Se seleccionaron dos cepas de cada uno de estos grupos y se cuantificó su capacidad de formar biofilms en diferentes condiciones: pH ácido, bajas temperaturas, distintas concentraciones de sal o en presencia de diferentes azúcares. Además, se evaluó el efecto de distintas bacteriocinas como una herramienta para la eliminación de biofilms de L. parabuchneri. Este estudio pretende avanzar en el conocimiento del proceso de formación de los biofilms de BAL productoras de aminas biógenas, con el objetivo de evitar su desarrollo y mejorar así la seguridad de los productos fermentados en general y del queso en particular. Fuente de financiación: Horizonte2020, MSCA ¿ ITN, Horizonte2020, MSCA – ITN

Resumen del trabajo presentado en el 13th International Symposium on Lactic Acid Bacteria, celebrado online del 23 al 25 de agosto de 2021, Lentilactobacillus parabuchneri is a heterofermentative lactic acid bacteria usually present in fermented dairy products that was identified as the main responsible for the production and accumulation of elevated concentrations of histamine in cheese. The consumption of cheeses with high concentration of this biogenic amine has toxicological effects in consumers and is a safe concern. Our group has found that some L. parabuchneri strains produce biofilms on the surface of dairy industry equipment. These biofilms are very resistant against cleaning and disinfection procedures, and act as reservoirs of histamine-producing bacteria. Therefore, the cheeses become contaminated during the elaboration processes and when consumed, they may have undesirable concentrations of histamine. The present work was aimed to investigate the biofilm production of 25 dairy L. parabuchneri strains. The strains were categorized as strong, moderate and weak biofilms formers and two of them were selected from each category. The influence of temperature, surface materials, and pH on their ability to form biofilms was studied. In addition, the nature of extracellular matrix was also investigated. This study highlights the importance of the industrial environment control to decrease undesired bacterial biofilms and improve cheese safety.

Trabajo presentado en el 5th Annual Meeting of Spanish Network of Bacteriophages and Transducer Elements (FAGOMA), celebrado en Alcalá de Henares (Madrid), del 22 al 23 de octubre de 2018

En un artículo previo en DCIENCIA [1] comentamos que gracias a la rapidez con la que se obtuvo y se hizo pública la secuencia genómica del SARS-CoV-2 se ha podido avanzar a velocidades inusitadas tanto en el conocimiento de las peculiares características de este nuevo coronavirus, como en la dilucidación de la forma de entrada en nuestras células; la caracterización de la llave vírica (espícula) capaz de abrir la cerradura celular (ACE-2) para empezar el proceso de infección viral, que sin duda permitirán el desarrollo de nuevos métodos terapéuticos y preventivos. En este artículo queremos profundizar algo más en las implicaciones que ha tenido y tendrá este descubrimiento. Para ello, queremos empezar por analizar el artículo en el que se incluyó dicha secuencia genómica “A new coronavirus associated with human respiratory disease” (Un nuevo coronavirus asociado con la enfermedad respiratoria humana) depositado el 25 de Enero en BioRxiv y publicado en Nature [2] el 3 de febrero de 2020 por la fórmula de acceso abierto (Open Access).

Antes de entrar en profundidad en los mecanismos moleculares que han hecho del SARS-CoV-2 un virus muy eficiente, y que con una meditada estrategia operativa se ha extendido por todos los países, haciendo que la enfermedad que provoca, covid-19, haya sido declarada pandemia mundial por la Organización Mundial de la Salud (OMS) [1], queremos saludar al periodismo científico de calidad. Para quienes somos devotos seguidores de la divulgación científica y esforzados cultivadores de la misma es motivo de satisfacción la publicación el domingo 10 de mayo de 2020 de un artículo que marca un hito en la relativamente joven historia de la comunicación científica en nuestro país [2]. Manuel Ansede, A. Galocha y M. Zafra han publicado un texto de primer nivel, tanto en el estilo como en la forma, con un magnifico esfuerzo en la consulta de fuentes y un derroche infográfico que se sitúa en la línea de los textos que publica desde sus orígenes la revista líder Scientific American (y su versión española Investigación y Ciencia) con otro dato significativo: se acerca a una línea editorial que la puntera revista empezó hace unos pocos años y que consiste en que los relatos de los temas científicos de actualidad y éxito no se contribuyeran solo por destacados científicos sino de modo progresivo por lo que llaman escritores sobe ciencia “science writers”. En estos apasionantes tiempos de la investigación científica sobre la Covid-19, el texto que glosamos empieza por atraer la atención con el título, ”La secuencia de 12 letras que ha cambiado el mundo” y el siguiente antetítulo: “Los científicos creen haber encontrado la virulencia del patógeno” [2]. Otra contribución notable de este trabajo periodístico para los que somos defensores de la interdisciplinariedad es que los autores han optado por esa visión en la selección de las fuentes, otra sorpresa en el ámbito de la comunicación de la ciencia en España.

[ES] Las aminas biógenas son compuestos nitrogenados de pequeño tamaño con actividad biológica que se forman por la descarboxilación enzimática de ciertos aminoácidos. Las aminas biógenas se encuentran presentes en todos los seres vivos, en los que participan en procesos biológicas de gran importancia. Sin em­bargo, debido al metabolismo de algunos microorganismos, estos compuestos se pueden acumular en alimentos en concentraciones elevadas, constituyendo un riesgo para la salud de los consumido­res. Para que las aminas biógenas alcancen estas concentraciones elevadas en los alimentos se requiere, como condición indispensa­ble, la presencia de microrganismos productores, por lo que se han desarrollado diferentes métodos para detectar la presencia de los mismos. Entre estos métodos, aquellos basados en técnicas inde­pendientes de cultivo, como la PCR, presentan ventajas como su gran especificidad, el hecho de ser rápidos y de fácil realización, y que en muchos casos ni siquiera es necesario un tratamiento previo de la muestra, lo que facilita su incorporación a las plantas de elabo­ración. En este trabajo se describen algunos de los métodos dispo­nibles en la actualidad para la detección de microorganismos pro­ductores de aminas biógenas, así como sus posibles aplicaciones. [EN] iogenic amines are low molecular weight nitrogenous compounds with biological activity that are formed by decarboxylation of certain amino acids. Biogenic amines are present in all living organisms, in which they have important physiological functions. However, due to the metabolism of certain microorganisms, these compounds can accumulate in food at high concentrations, constituting a health risk for consumers. The presence of biogenic amine-producing microorganisms is the indispensable condition for the presence and further accumulation of biogenic amines in food. Because of this, several methods for the detection and identification of these biogenic amine-producing microorganisms have been developed. Among them, those based on culture independent techniques, such as the PCR, have several advantages such as their specificity, they are methods that are fast and easy to perform, and in many cases there is no need for pre-processing of food material which facilitates their incorporation at production plants. In this work, some available methods for the detection of biogenic amine-producing microorganisms are described, as well as their potential applications Este trabajo ha sido realizado gracias a la financiación recibida del Ministerio de Economía y Competitividad a través de la Agencia Estatal de Investigación (AGL2016-78708-R; AEI/FEDER, UE), CSIC (CSIC201770E086 and CSIC201870I091) y el Principado de Asturias (IDI/2018/0 00114, cofinanciado con fondos FEDER)

A este SARS-CoV-2 sigiloso, pero a la vez altamente litigioso, se le están atribuyendo muchas potencialidades. Los más optimistas preocupados socialmente llegan a declarar que va a cambiar el mundo, o al menos transformar nuestra sociedad configurada tras cuarenta años de estrategia neoliberal, tan definida en sus objetivos y tan contradictoria en sus resultados que ha sido identificada con variadas denominaciones. De lo que no hay duda a estas alturas de la pandemia es que se ha colocado a la ciencia en el centro del debate político y en el corazón del discurso mediático aupándola como un referente de la sociedad en estos tiempos de crisis. Sin embargo, esto no ha podido evitar que al sistema de ciencia y tecnología le haya tocado el turno de sufrir embates de corte político e incluso de experimentar una conmoción brutal en los primeros días del mes de junio.

Que vivimos en una sociedad saciada de contradicciones es algo que hemos venido declarando en diversas ocasiones, situación que la pandemia de covid-19 ha agudizado. Contradicción en lógica es “una incompatibilidad entre dos proposiciones”. Nosotros aplicamos el término para destacar incompatibilidades diversas: entre discursos y hechos, entre conceptos, entre deseos y realidades, entre apetencias y medios disponibles.

Cuando uno de nosotros, Emilio Muñoz, grabó un vídeo sobre el coronavirus para la Unidad de Divulgación, Cultura Científica y Edición digital del Centro de Ciencias Humanas y Sociales del CSIC ya se anticipó que el virus era astuto y un gran estratega, declaración sustentada en la lectura intensa de lo que se publicaba en la edición online del periódico The Scientist, sobre la información genómica, la alta transmisibilidad del virus y su baja tasa de mortalidad y sobre todo la existencia de portadores asintomáticos y el urgente problema del diagnóstico. Son características del SARS-CoV-2 que se han hecho familiares desde que se declaró la pandemia.

Trabajo presentado en la 11ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas (RedBAL), celebrada en Gijón (Asturias, España) del 28 al 30 de Junio de 2017, La histamina se puede acumular en los alimentos debido a la descarboxilación de la histidina llevada a cabo por algunos microorganismos y está considerada por la autoridad europea de seguridad alimentaria (EFSA) como una de las aminas biógenas (AB) más tóxicas. La intoxicación por histamina se ha asociado tradicionalmente con el consumo de pescados poco frescos y productos derivados del pescado. De hecho, el contenido máximo de histamina sólo está legalmente establecido en estos alimentos (200-400 mg/kg). Sin embargo, en alimentos fermentados, y especialmente en queso, se pueden acumular concentraciones muy superiores de esta AB. Los microorganismos que contribuyen en mayor medida a la producción y acumulación de histamina en alimentos fermentados son bacterias del ácido láctico (BAL) con actividad histidina-descarboxilasa. Recientemente, hemos determinado que la especie principalmente responsable de la acumulación de histamina en queso es Lactobacillus parabuchneri, la cual forma parte de la microbiota habitual de este alimento. Además, tiene la capacidad de adherirse a superficies de acero y de formar biofilms sobre este material, lo que aumenta su potencial para contaminar el queso durante su procesamiento. Ya que la presencia de BAL productoras de histamina en queso es difícil de evitar porque forman parte de su microbiota natural, nos propusimos determinar si el almacenaje a temperaturas de refrigeración es un método eficaz para evitar la acumulación de histamina en este alimento. En esta comunicación, presentamos un análisis de la fisiología de producción de histamina en L. parabuchneri a temperaturas de refrigeración. Se determinó el crecimiento y la capacidad de producción de histamina de L. parabuchneri IPLA11122, una cepa aislada de queso, en un rango de temperaturas de 4 a 14ºC. Posteriormente, se analizó la dinámica de la acumulación de histamina en quesos comerciales inoculados con esta cepa y almacenados durante 70 días a 4 y 8ºC. Los resultados en medio de cultivo muestran que L. parabuchneri, aunque lentamente, crece a 4ºC, llegando a alcanzar valores muy altos de densidad óptica. La concentración de histamina que se acumuló al final de la fase exponencial de crecimiento a 4ºC fue similar a la alcanzada a 8 y 14ºC, y muy cercana a la producida a 37ºC, la temperatura óptima de crecimiento de este microorganismo. Además, aunque a 4ºC el acúmulo de histamina fue más lento y las concentraciones alcanzadas más bajas que a 8ºC, después de 70 días de almacenamiento, la mayoría de los quesos inoculados con L. parabuchneri contenían concentraciones de histamina superiores a los límites legales establecidos por la EFSA para la histamina en pescado (200 mg/kg). La concentración máxima de histamina que se acumuló en los quesos almacenados a 4ºC fue de 1.052 mg/kg y en los almacenados a 8ºC de 1.861 mg/kg. También comprobamos que L. parabuchneri IPLA11122 mantenía su capacidad de adherirse al acero inoxidable a 4ºC. Además, se comprobó que otras cepas de L. parabuchneri aisladas de queso crecen y producen histamina a temperaturas de refrigeración. Los resultados de este estudio ponen de manifiesto la necesidad de encontrar otras estrategias que permitan evitar, o al menos reducir, la acumulación de histamina en queso., Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-45431-R) y por el proyecto GRUPIN14-137 (cofinanciado por el Principado de Asturias y por los fondos FEDER).

Trabajo presentado en el 12th International Symposium on Lactic Acid Bacteria, celebrado en Egmond aan Zee (Holanda) del 27 al 31 de agosto de 2017, Lactic acid bacteria (LAB) play an essential role in the production of a large diversity of fermented foods. The long and harmless history of use of LAB in food fermentations has resulted in them being generally recognized as safe. However, some LAB possess enzymatic activities that produce undesirable toxic compounds, such as the biogenic amines (BA) tyramine and histamine. In cheese, one of the foods in which the highest concentrations of BA can be found, they are produced predominantly by LAB. More specifically, Enterococcus faecalis is the main responsible for the accumulation of tyramine, while Lactobacillus parabuchneri is the species mainly responsible for the accumulation of histamine. Although the European Food Safety Authority (EFSA) deems tyramine and histamine to be the most toxic BA, it also concludes that our present knowledge of their toxicity is limited, and that further research is needed. In this communication, we present an analysis of the in vitro cytotoxicity of tyramine and histamine, individually and in combination, towards intestinal cells in culture. To perform these analyses, we have developed an in vitro model of the human intestinal epithelium based on the HT29 cell line and the Real Time Cell Analyzer (RTCA) technology. Tyramine and histamine were found to be cytotoxic at concentrations commonly found in some types of cheese. Surprisingly, tyramine -a BA for which no legal limit has been established- had a stronger and more rapid cytotoxic effect than histamine. Their mode of action was also different, while tyramine caused cell necrosis, histamine induced apoptosis. We further found that tyramine and histamine have synergistic cytotoxicity in the range of concentrations that can be found in foods.

Trabajo presentado en la 11ª Reunión de la Red Española de Bacterias Lácticas (RedBAL), celebrada en Gijón (Asturias, España) del 28 al 30 de Junio de 2017, Las Aminas Biógenas (AB) son compuestos nitrogenados presentes en todos los organismos y que poseen actividad biológica. Sin embargo, debido a la acción de ciertos microorganismos, las AB se pueden acumular en altas concentraciones en los alimentos y su consumo provoca una serie de efectos tóxicos (hipertensión, migrañas, taquicardia, etc).Debido a ello, la EFSA recomienda reducir la presencia de AB en alimentos. El queso es uno de los alimentos con mayor riesgo de acumular AB en altas concentraciones, siendo las AB más frecuentes la tiramina, la histamina y la putrescina. Los principales responsables de la acumulación en quesos de estas AB son bacterias del ácido láctico. Entre ellas, destaca Enterococcus faecalis, responsable de la producción y acumulación de tiramina y putrescina. Las medidas tecnológicas más efectivas para la reducción de AB en alimentos, también afectan a las bacterias lácticas necesarias para llevar a cabo la fermentación y el desarrollo de las propiedades organolépticas típicas del producto final. Debido a ello, es necesario el desarrollo de estrategias nuevas para reducir de forma específica la presencia de bacterias productoras de aminas biógenas. Como consecuencia del aumento de las resistencias a los antibióticos en bacterias patógenas, los bacteriófagos han resurgido como una posible herramienta en la lucha frente a las enfermedades infecciosas, debido a su capacidad bactericida y a su gran especificidad. Estas características han hecho que también se estén utilizando para la eliminación de patógenos en alimentos. Sin embargo, su utilización como agentes de biocontrol de microorganismos alterantes, como es el caso de la BAL productoras de aminas biógenas, ha sido poco explorada. Recientemente, hemos demostrado en quesos experimentales el potencial de Q69, un bacteriófago de E. faecalis aislado y caracterizado en nuestro laboratorio, para reducir la acumulación de tiramina por debajo de los niveles que se consideran peligrosos para el consumo. El resultado obtenido nos motivó para ampliar la búsqueda de nuevos bacteriófagos de E. faecalis a partir de diferentes ambientes, incluidos distintos tipos de quesos. Posteriormente, se procedió a su caracterización funcional: rango de hospedador, perfil de restricción, etc. y basándonos en diferentes propiedades, seleccionamos los más interesantes para secuenciar su genoma completo. El análisis de sus secuencias genómicas permite una mejor caracterización de los fagos, además de posibilitar la identificación de genes con potencial antimicrobiano que podrían ser utilizados como nuevas herramientas biotecnológicas en la reducción de la presencia de AB en alimentos., Este trabajo ha sido financiado por el Ministerio de Economía y Competitividad (AGL2013-45431-R) y por el proyecto GRUPIN14-137 (cofinanciado por el Principado de Asturias y por fondos FEDER).

Trabajo presentado en The 1st Food Chemistry Conference, celebrada en Amsterdam (Holanda) del 30 de octubre al 1 de noviembre de 2016, The biosynthesis of biogenic amines (BAs) through enzymatic decarboxylation of their precursor amino acids by bacteria is associated with seafood safety and quality. Histamine is the BA most directly linked to food poisoning, although putrescine and cadaverine may act as enhancers of histamine effect. Tyramine is a BA not so prevalent in fish, but it has been found to be even more toxic than histamine. Moreover, a synergistic cytotoxic effect of histamine and tyramine has been recently demonstrated in vitro. Some technological processes such as salting, ripening, fermentation or marination with vegetal oils can increase the possibility of formation of BAs. In this context, the possibility of detect and/or quantify simultaneously all the potential toxic BAs and their precursor amino acids results highly valuable to prevent BAs accumulation throughout the seafood manufacture chain. In this work, the simultaneous determination of nine BAs (histamine, tyramine, putrescine, cadaverine, ß-phenylethylamine, ethanolamine, ethylamine, tryptamine and agmatine) alongside ammonium ions and twenty-one amino acids has been accomplished in four different seafood matrices subjected to olive oil treatment and canned: tuna, sardines, anchovies and mussels. All of them are highly consumed in western countries and have traditionally been related to histamine poisoning. The procedure involves an acidic extraction of amino acids and BAs from the seafood matrix followed by a pre-column derivatization with diethylethoxymethylenemalonate, an agent never tried on seafood-derived matrices before. Then, an ultra-HPLC separation of the thirty-one aminoenone derivatives was achieved in less than 14 minutes. Precision and accuracy of the method was tested by slope comparison values and recovery analysis in the four seafood matrices. The method allows for more samples to be assayed per unit time, reducing costs and the associated waste. Therefore, it could be a valuable tool to monitor the safety and quality of canned seafood in relation to BAs.

Trabajo presentado en el XXIII Congreso Nacional de la Sociedad Española de Enfermedades Infecciosas y Microbiología Clínica (SEIMC), celebrado en Madrid, del 23 al 25 de mayo de 2019, Linezolid (LZD) y tedizolid son antimicrobianos pertenecientes a la familia de las oxazolidinonas activos frente a bacterias Gram-positivas. Actúan inhibiendo la síntesis proteica por unión al centro peptidil transferasa del ribosoma bacteriano. El principal mecanismo de resistencia a LZD en enterococos y estafilococos son las mutaciones en el domino V del gen que codifica el ARNr 23S. Sin embargo en los últimos años ha cobrado especial importancia la resistencia mediada por genes transferibles como el cfr y el optrA. Ambos genes confieren además resistencia a fenicoles, como el florfenicol, antimicrobiano usado en veterinaria y que se cree implicado en el aumento de bacterias resistentes a LZD.

Póster presentado en el congreso 1st Food Chemistry Conference, celebrado en Amsterdam, Holanda, del 30 de octubre al 1 noviembre de 2016, The biogenic amines (BA) tyramine and histamine are often found at high concentrations in certain foods. Prompted by the limited knowledge of BA toxicity and the increasing awareness of the risks associated with high intakes of dietary BA, the in vitro cytotoxicity of tyramine and histamine was investigated. For that, we developed an in vitro model of the human intestinal epithelium based on the HT29 cell line and the Real Time Cell Analyzer (RTCA) technology. The RTCA system is used to gather information on cell proliferation, migration and cytotoxicity via changes in cell morphology and adhesion. The dose-response curves, the IC50 (the concentration of BA required to achieve half of the strongest cytotoxic effect observed), the NOAEL (non-observed adverse effect level), and the LOAEL (lowest observed adverse effect level) values, were calculated for tyramine and histamine in proliferating cell cultures. Tyramine and histamine were found to be cytotoxic at concentrations commonly found in BA-rich food. Surprisingly, tyramine -a BA for which legal limit has not been established- had a stronger and more rapid cytotoxic effect than histamine. Their mode of action was also different, while tyramine caused cell necrosis, histamine induced apoptosis. We further found that tyramine and histamine have synergistic cytotoxicity in the range of concentrations that can be found in foods. In fact, histamine at concentrations below the European legal limit increased the cytotoxicity of tyramine at concentrations frequently reached in some foods. In conclusion, to avoid health risks, the accumulation in food of both BA should be reduced, and legal limits that ensure consumer safety should be established for tyramine. Moreover, the synergistic cytotoxicity of tyramine and histamine should be taken into account when establishing legal limits.

Trabajo presentado en la 9ª Reunión de la red temática BAL, celebrada en Madrid, España, el 29 y 30 de junio de 2015, La histamina es una amina biógena que se puede acumular en los alimentos debido a la descarboxilación enzimática de la histidina llevada a cabo por determinados microorganismos. El consumo de alimentos con elevadas concentraciones de histamina puede provocar una serie de efectos toxicológicos de carácter neurológico, gastrointestinal o respiratorio. De hecho, la histamina es una de las aminas biógenas más tóxicas y que más frecuentemente se encuentra en alimentos, principalmente en pescado y alimentos fermentados. Entre los alimentos fermentados, es en queso donde se encuentran las mayores cantidades, habiéndose descrito concentraciones superiores a 1800 mg de histamina por Kg de queso. Aunque se cree que los microorganismos responsables de la producción y acumulación de histamina en alimentos fermentados son principalmente bacterias del grupo de las BAL, existe poca información sobre cuáles son las especies responsables de su acumulación en queso. El objetivo de este trabajo ha sido el aislamiento de bacterias productoras de histamina a partir de muestras de queso con elevadas concentraciones de histamina. En total se han obtenido 121 aislados productores de histamina que han sido identificados mediante secuenciación del ARNr 16S. De todos los aislados, 58 han sido identificados como Lactobacillus parabuchneri, 21 como Lactobacillus vaginalis y 42 como Lactobacillus reuteri. La tipificación de los aislados mediante PFGE, nos ha permitido identificar 8 linajes de L. parabuchneri, 7 linajes de L. vaginalis, y 2 linajes de L. reuteri. Además, se han secuenciado los genes implicados en la biosíntesis de histamina. Estos genes se encuentran agrupados en un ¿cluster¿ constituido por hdcP, que codifica un intercambiador de histidina/histamina (HdcP), hdcA, que codifica la histidina descarboxilasa (HdcA) y hdcB, que codifica una proteína implicada en la maduración de HdcA. Las secuencias obtenidas del gen hdcA, además de las presentes en las bases de datos, han permitido desarrollar y optimizar un nuevo método de detección e identificación de bacterias Gram positivas productoras de histamina, basado en la técnica independiente de cultivo PCR-DGGE. Este método se está utilizando para analizar muestras comerciales de queso y nos está permitiendo conocer mejor la diversidad de microorganismos productores de histamina presentes en distintos tipos de quesos.

Trabajo presentado en el 6th Congress of European Microbiologists, FEMS, celebrado en Maastricht, Países Bajos, del 7 al 11 de junio de 2015, [Background] Biogenic amines (BA) are low molecular weight nitrogenous compounds mainly formed by the microbial decarboxylation of amino acids. The primary relevance of BA is that the consumption of foods or beverages containing high concentration of BA may cause food intoxication. Dairy products are among the foods likely to contain the highest concentrations of BA, being lactic acid bacteria the main BA-producers.. Objectives Increase our knowledge on BA synthesis in order to adopt strategies for surveillance and prevention of BA accumulation in foods and towards the development of new biotechnological tools., [Methods] Strategies to reduce the BA content in fermented products: - Avoid the presence of bacteria synthesizing BA through the food chain. The identification of BA gene clusters has allowed the design of molecular methods to identify and quantify the presence of BA producers in cheese samples. - Identify key factors which favor BA accumulation. Different physicochemical and technological factors have been studied in order to determine their impact on BA accumulation either affecting bacterial growth or BA gene expression. - Recently, the use of biogenic amine-degrading microorganisms has been proposed. It is necessary to identify and select highly competitive adjunct cultures capable of in situ reduce the content of BA during the elaboration of fermented products. Beside of this, understand the transcriptional regulation of BA synthesis clusters offer opportunities for the development of new expression vectors., [Conclusions] The study of BA synthesis, is needed to propose new strategies to avoid BA accumulation in foods and can be used for the development of new biotechnological tools

The invention relates to a bacterial strain, Lactobacillus casei IPLA12038 with deposit number CECT 8590, and its use for the degradation of gluten, gliadin or derivative peptides. The strain has been isolated from an acidic dough used to make bread. Its advantages include the ability to use gliadin as nitrogen source, possess peptidase activities involved in the degradation of it and be able to completely degrade the immunotoxic (33) amino acid peptide involved in triggering of celiac disease in a short period of time. The fact of considering it a GRAS and QPS microorganism, isolated from a fermented food, sensitive to antimicrobial gastrointestinal agents and resistant to gastrointestinal conditions tested in vitro, guarantees its use as a probiotic or nutraceutical supplement., Consejo Superior de Investigaciones Científicas (España), A1 Solicitud de patente con informe sobre el estado de la técnica

Trabajo presentado en la 9ª Reunión de la red temática BAL, celebrada en Madrid, España, el 29 y 30 de junio de 2015, Lactococcus lactis es el cultivo iniciador más utilizado en la Industria Láctea. Sin embargo, algunas cepas de L. lactis aisladas de productos lácteos producen la amina biógena putrescina. El consumo de alimentos con altas concentraciones de putrescina puede inducir efectos tóxicos directos (taquicardia e hipotensión) e indirectos (potencia los efectos tóxicos de otras aminas frecuentemente encontradas en productos lácteos como tiramina e histamina). Además, la putrescina y las poliaminas que derivan de ella (espermina y espermidina) están relacionadas con el desarrollo de determinados tumores. En L. lactis la putrescina se sintetiza a través de la ruta de la agmatina deiminasa (AGDI). Los genes implicados en esta ruta -aguR, aguB, aguD, aguA y aguC- están agrupados formando el cluster AGDI. Los cuatro últimos genes codifican las proteínas implicadas directamente en la biosíntesis de putrescina y se transcriben como un único ARNm policistrónico, constituyendo el operón aguBDAC, cuya transcripción está inducida por agmatina, el sustrato de la reacción. En cambio, aguR se transcribe constitutivamente como un ARNm monocistrónico, independientemente del operón aguBDAC. La construcción del mutante L. lactis ¿aguR nos ha permitido comprobar que AguR es un activador transcripcional esencial para la producción de putrescina. AguR es una proteína transmembrana cuyo extremo C-terminal se encuentra en el citoplasma y posee un dominio de unión a ADN tipo hélice-giro-hélice (helix-turn-helix, HTH), muy similar al que se encuentra en proteínas pertenecientes a la familia LuxR. Nuestros datos indican que AguR es un sistema de transducción de señal de un componente, cuyo dominio extracelular detecta la concentración de agmatina del medio y el dominio citoplasmático regula la transcripción del operón aguBDAC. Basándonos en estos resultados, hemos construido un vector de expresión inducible por agmatina y hemos comprobado mediante la clonación y expresión del gen que codifica la prolil-endopeptidasa de Myxococcus xanthus, que su eficiencia es similar a la del sistema NICE, el sistema de expresión más utilizado en L. lactis.

Edited by: Giovanna Suzzi and Sandra Torriani, Fermented foods are among the food products more often complained of having caused episodes of biogenic amines (BA) poisoning. Concerning milk-based fermented foods, cheese is the main product likely to contain potentially harmful levels of BA, specially tyramine, histamine, and putrescine. Prompted by the increasing awareness of the risks related to dietary uptake of high biogenic amine loads, in this review we report all those elaboration and processing technological aspects affecting BA biosynthesis and accumulation in dairy foods. Improved knowledge of the factors involved in the synthesis and accumulation of BA should lead to a reduction in their incidence in milk products. Synthesis of BA is possible only when three conditions converge: (i) availability of the substrate amino acids; (ii) presence of microorganisms with the appropriate catabolic pathway activated; and (iii) environmental conditions favorable to the decarboxylation activity. These conditions depend on several factors such as milk treatment (pasteurization), use of starter cultures, NaCl concentration, time, and temperature of ripening and preservation, pH, temperature, or post-ripening technological processes, which will be discussed in this chapter.

Trabajo presentado en el XIX Congreso Nacional de Microbiología de los Alimentos, celebrado en Zaragoza del 24 al 26de septiembre de 2014., Los antibióticos no solo se han utilizado para el tratamiento de enfermedades infecciosas, sino que durante décadas se han empleado también como agentes profilácticos y promotores del crecimiento en ganadería, acuicultura y agricultura. Este uso inadecuado ha favorecido la aparición de resistencias y su diseminación entre muchos tipos bacterianos. La resistencia a antibióticos en microorganismos patógenos y oportunistas es un problema de salud pública mundial, ya que complica y encarece el tratamiento de las enfermedades infecciosas. En los últimos años se está prestando especial interés a las resistencias que presentan los microorganismos comensales y beneficiosos de los alimentos, ya que estas poblaciones podrían servir de reservorios de determinantes de resistencia transferibles a patógenos. De hecho, se ha propuesto que la cadena alimentaria es una de las principales vías de transmisión, bien durante la elaboración de los alimentos o tras su consumo durante el tránsito intestinal. En el pasado, la identificación de las poblaciones microbianas resistentes a antibióticos se ha realizado cultivando los microorganismos resistentes y analizándolos de forma individual. En la actualidad se ensayan diversos métodos moleculares independientes de cultivo para la detección y cuantificación de las poblaciones resistentes y para la identificación de los determinantes genéticos de resistencia. En este trabajo se ha aplicado la técnica de DGGE para estudiar la composición de las poblaciones microbianas resistentes a tetraciclina y eritromicina en el queso de Cabrales y su evolución a lo largo de la elaboración y maduración. Los perfiles de DGGE revelaron que durante la fermentación y el inicio de la maduración enterobacterias y estafilococos constituyen las poblaciones mayoritarias resistentes a tetraciclina y eritromicina, mientras que las poblaciones resistentes mayoritarias durante la maduración fueron Lactococcus lactis y Enterococcus faecalis. Combinando la construcción de librerías metagenómicas y la secuenciación masiva hemos comprobado que la resistencia a tetraciclina está codificada principalmente en elementos genéticos móviles (trasposones y plásmidos). Además, determinamos que dicha resistencia está mediada por el gen tet(A) en las enterobacterias y los genes tet(S) y tet(M) en el resto de las poblaciones resistentes a este antibiótico durante las etapas iniciales de la elaboración. Sin embargo, al final de la maduración las poblaciones resistentes mayoritarias son diversas especies de BAL y el gen predominante que confiere resistencia a tetraciclina es tet(L). El conocimiento de las poblaciones resistentes y la identificación de los determinantes genéticos de resistencia pueden facilitar la adopción de medidas para reducir la carga de resistencias a antibióticos en el queso de Cabrales y en otros quesos tradicionales.

Trabajo presentado en el 2nd International Conference on Food Digestion, celebrado en Madrid del 6 al 8 de marzo de 2013., Celiac disease is a disorder of the small intestine caused by an inappropriate immune response to the gluten proteins of some cereals. The resulting intestinal inflammation often causes symptoms related to malabsorption, but in many patients extra-intestinal symptoms dominate, and in others the disease is clinically silent. During the last years the main peptides responsible of this disorder have been identified. Since these peptides are very rich in proline and glutamine residues, they can not be catabolized by any human digestive enzyme. Consequently, relatively large gluten-derived peptides remain in the gut, which predispose to activation of the small-bowel mucosal immune system. Although at present, the only available treatment is a strict gluten exclusion diet, the understanding of the molecular pathogenesis of this complex disease enables the rational design of new therapeutic strategies. An exciting strategy is the proteolysis of these peptides before they trigger the immune response. Lactic acid bacteria (LAB) are GRAS (general regarded as safe) microorganisms with a complex proteolytic system. Therefore, these bacteria are excellent candidates as source of enzymes able to degrade the inmunotoxic peptides associated to celiac disease. Different LAB strains were isolated from gluten-rich environments based on their ability to grow in a media with gliadin as the sole nitrogenous source. Their capacity to degrade the main inmunotoxic gluten peptide will be presented.

Comunicación presentada en la 7ª Reunión de la Red Temática BAL (Participación de las Bacterias Lácticas en la Salud Humana y en la Calidad Alimentaria), celebrada en Madrid los días 4 y 5 de julio de 2013.

Trabajo presentado en el 18ème colloque du Club des Bactéries Lactiques, celebrado en Clermont-Ferrand (Francia) del 22 al 24 de mayo de 2012.

Comunicación presentada en la 6ª reunión de la Red temática BAL (Participación de las Bacterias Lácticas en la Salud Humana y en la Calidad Alimentaria), celebrada el 28 y 29 de junio de 2012 en Tarragona.

Trabajo presentado en la 5ª Reunión de la Red Temática BAL (Red Española de Bacterias Lácticas), celebrada en Logroño del 30 de junio al 1 de julio de 2011.

2nd International Conference on Biology, Environment and Chemistry (ICBEC). 28-30 december, 2011, Dubai, United Arab Emirates., This work investigates the influence of incubation temperature and culture media on exopolysaccharides (EPS) production. The S. thermophilus BN1 an EPS-producer strain isolated from cow milk was examined in this study. Skimmed milk, whole milk and cheese whey, were selected as culture media and two different temperatures were also tested. The EPS produced in the different studied conditions was purified and quantified. The strain BN1 was able to produce EPS in all established conditions. However, significant differences were observed in the amounts of produced EPS. The production of EPS reached the maximum values at 37°C in skimmed milk with amount of 548 PDM mg l-1, followed by the amounts of 375 PDM mg l-1 and 325 PDM mg l -1 respectively in whey and whole milk. In addition, a slight significant difference was noted on the biomass, pH and lactic acid values obtained from the three fermented substrates (p

Biogenic amines (BAs) are defined as low molecular weight organic bases with biological activity. They are formed and degraded as part of the normal metabolism of microorganisms, plants and animals, in which they have important physiological functions. In humans, BAs are involved in brain activity, the regulation of body temperature and stomach pH, gastric acid secretion, the immune response, and cell growth and differentiation etc. However, the consumption of foods with high concentrations of BAs can induce adverse reactions such as nausea, headaches, rashes and changes in blood pressure. The accumulation of BAs in the food matrix is mainly due to the presence of bacteria able to decarboxylate certain amino acids. The most common and powerful BAs found in food are histamine, tyramine and putrescine. Their contents vary, sometimes reaching over 2 g per kg. Histamine is the only BA for which maximum levels in food have been set, although general interest exists in reducing the presence of all BAs in all food products. This review discusses the toxic effects of BAs when ingested with food., V. Ladero is the beneficiary of an I3P - CSIC contract financed by the European Social Fund. M. Calles is the recipient of a PhD fellowship (FPI programme) from the Spanish Ministry of Science and Innovation. This work was supported by the Ministry of Science and Innovation, Spain (AGL2010-01024) and the European Community’s Seventh Framework Programme (KBBE-CT-2007-211441).

β-phenylethylamine and tryptamine are biogenic amines (BA) often found in foods. In general, BA are assumed to be toxic and their accumulation in food is not recommended. However, present knowledge regarding the toxicity of β-phenylethylamine and tryptamine is limited; more information is needed if qualitative and quantitative risk assessments of foods are to be successfully conducted. This study describes a real-time analysis of β-phenylethylamine and tryptamine toxicity on a human intestinal epithelial cell line. Both BA caused cell necrosis and apoptosis, although the former was the main mode of action of β-phenylethylamine, and the latter the main mode of action of tryptamine. Only tryptamine was cytotoxic at concentrations found in BA-rich foods. The results presented in this work may contribute to establish legal limits for β-phenylethylamine and tryptamine in food., This work was funded by the Spanish State Research Agency (AEI), European Regional Development Funds (AGL2016-78708-R, AEI/FEDER, UE), the Principality of Asturias' Plan for Science, Technology and Innovation 2018-020 co-financed by ERDF (IDI/2018/000114, FICYT/FEDER, EU), and by the Spanish National Research Council (CSIC201870I091, CSIC).

High histamine concentrations in food can cause histamine poisoning. In spite of the cold chain, cheeses with high concentrations of histamine are on the market. In this work, we studied whether Lactobacillus parabuchneri, the microorganism mainly responsible for histamine accumulation in cheese, is able to grow and produce histamine at the usual temperature range of refrigerators. Further, we analysed whether refrigeration is really effective to prevent the accumulation of histamine in different types of cheeses supplemented with histidine and contaminated with L. parabuchneri. Our results showed L. parabuchneri to be able to grow and produce histamine at refrigeration temperatures. Moreover, L. parabuchneri produced toxic histamine concentrations in refrigerated cheeses from only 14 days. The results obtained in this work show that in the presence of L. parabuchneri, refrigeration delays but does not prevent the accumulation of toxic histamine levels in cheese., This work was funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (AGL2013‐45431‐R and AGL2016‐78708‐R), and by the GRUPIN14‐137 project (which is co‐financed by the Plan for Science, Technology and Innovation of the Principality of Asturias 2013–2017 and European Regional Development Funds)

Consumer demand for health-promoting foods is generating the need to develop biofunctional dairy products. Lactic acid bacteria are employed in cheese-making and some of them are able to produce beneficial compounds on human health such as γ-aminobutyric acid (GABA) and ornithine but also to synthetize biogenic amines. The aim was to investigate the effect of four selected autochthonous co-cultures on the free amino acid profile, with special emphasis on GABA and ornithine, and on the biogenic amine content of pasteurized sheep milk cheese during ripening. High average concentrations of GABA (1296.75 mg/kg cheese) and ornithine (2355.76 mg/kg cheese) were found in all the cheese batches at 240 days of ripening. Batch 2, manufactured with the co-culture containing autochthonous Lactococcus lactis strains as starter and Lactobacillus plantarum TAUL1588 as adjunct, showed 2.37 fold reduced biogenic amines concentration with respect to the batch 1 made with the starter during the ripening time. The microstructure and microbiological counts of cheeses were affected (P ≤ 0.001) by the ripening time, without appreciating differences (P ≥ 0.05) in the physico-chemical composition between batches. This study could be a good approach to the development of functional sheep milk cheese.

Lactic acid bacteria (LAB) are among the most widely used microorganisms in food fermentation. However, some LAB species can also be used as live vehicles for the in situ delivery of therapeutic molecules to the mucosa of the human gastrointestinal tract (GIT). Many LAB species have ‘qualified presumption of safety’ status and survive passage through the GIT. Indeed, some are part of the usual GIT microbiota. These are appropriate candidates for the in situ production of recombinant prophylactic and therapeutic proteins. Live recombinant LAB that produce microbial antigens have been shown to elicit an immune response that confers protection against the corresponding pathogens; these LAB could therefore be used as oral vaccines. In addition, some LAB have been genetically engineered to produce therapeutic, neutralizing antibodies. The variable domain of heavy-chain-only antibodies from camelids – known as VHH antibodies or nanobodies – has peculiar properties (nanoscale size, robust structure, acid resistance, high affinity and specificity, easily produced in bacteria, etc.) that make them ideal choices as LAB-produced immunotherapeutic agents. The present review examines the advantages offered by LAB for the in situ production of therapeutic proteins in the human GIT, discusses the use of in situ produced VHH antibody fragments, and assesses the usefulness of this strategy in the treatment of infectious and non-infectious gastrointestinal diseases., This work was funded by the Spanish Ministry of Economy and Competitiveness (AGL2016-78708-R).

Enterococcus faecalis is a lactic acid bacterium characterized by its tolerance of very diverse environmental conditions, a property that allows it to colonize many different habitats. This species can be found in food products, especially in fermented foods where it plays an important role as a biopreservative and influences the development of organoleptic characteristics. However, E. faecalis also produces the biogenic amines tyramine and putrescine. The consumption of food with high concentrations of these compounds can cause health problems. The present work reports the construction, via homologous recombination, of a double mutant of E. faecalis in which the clusters involved in tyramine and putrescine synthesis (which are located in different regions of the chromosome) are no longer present. Analyses showed the double mutant to grow and adhere to intestinal cells normally, and that the elimination of genes involved in the production of tyramine and putrescine has no effect on the expression of other genes., Tis work was performed with the fnancial support of AEI under grant number AGL2016-78708-R, (AEI/FEDER, UE) and the Plan for Science, Technology and Innovation 2013–2017 of the Principality of Asturias, co-funded by FEDER (GRUPIN IDI/2018/000114).

Trabajo fin de máster presentado en la Universidad de Oviedo, Máster Universitario en Biotecnología Alimentaria, La depresión es una enfermedad creciente en todo el mundo, que se estima afectan a más de 300 millones de personas. En la actualidad existen evidencias de que los microorganismos en el intestino podrían estar involucrados en los trastornos mentales a través del eje cerebro-intestino. De hecho, se ha propuesto el uso de probióticos como terapia adjunta en el manejo de la depresión. Recientemente, se ha visto que los efectos beneficiosos de estos microorganismos estarían mediados por su capacidad para producir y liberar compuestos neuroactivos. Entre estos microorganismos, destacan las bacterias del ácido láctico (BAL) ya que son especies seguras, que juegan un papel fundamental en la elaboración de alimentos fermentados, como el queso, y que podrían utilizarse para la elaboración de alimentos fermentados funcionales enriquecidos en compuestos neuroactivos para ayudar en el tratamiento de la depresión. Dentro de estos compuestos destaca la ¿-feniletilamina (PEA), la cual se utiliza en la actualidad como suplemento nutricional para mejorar el estado de ánimo y el bienestar, entre otros beneficios. En este trabajo se llevó a cabo una búsqueda de BAL capaces de producir PEA y que tuviese potencial biotecnológico para ser utilizadas como cultivos, ya sea iniciadores o adjuntos, para la elaboración de alimentos lácteos fermentados funcionales. Para ello se partió de muestras de queso con alto contenido en PEA y se llevó a cabo una búsqueda, identificación y tipificación de potenciales productores de PEA. Las cepas identificadas como Enterococcus durans, fueron caracterizadas a nivel tecnológico para su inclusión en productos lácteos fermentados. Se seleccionó la cepa con mejores aptitudes tecnológicas y se realizó un estudio de la influencia de factores tecnológicos en su capacidad de producir PEA, comprobando que la temperatura y la sal afectan positiva y negativamente a su producción.

Trabajo fin de grado presentado en la Universidad de León, Grado en Ciencia y Tecnología de los Alimentos.--Calificación: Sobresaliente, [ES] Durante los últimos años, los consumidores han mostrado gran interés por aquellos alimentos que contienen compuestos beneficiosos para la salud. En este estudio, se evaluó la capacidad de la cepa Lactiplantibacillus plantarum C3112 para producir un compuesto neuroactivo, el ácido γ-aminobutírico (GABA), los distintos factores que pueden afectar a dicha capacidad y al crecimiento de la bacteria, y diferentes aspectos tecnológicos y de seguridad alimentaria. La caracterización genética mediante PCR demostró la presencia del gen gadB1, el cual codifica para la enzima responsable de la producción de GABA, la glutamato descarboxilasa. Las concentraciones de GABA más altas se alcanzaron con concentraciones de 100 y 500 mM de glutamato. La capacidad de conversión a GABA aumentó significativamente durante la fase estacionaria de crecimiento y al incrementar la temperatura de incubación hasta 42 °C. Por el contrario, dicha capacidad disminuyó según aumentó la concentración de NaCl. Además, la cepa mostró ser capaz de metabolizar tanto glucosa como lactosa y de hidrolizar proteínas lácteas. Finalmente, se observó una lenta actividad acidificante, y no se detectó la producción de aminas biógenas. Todo esto permite afirmar su potencial uso como cultivo adjunto en la elaboración de leches fermentadas que aporten compuestos beneficiosos para la salud., [EN] Over the last years, consumers have shown great interest in those foods that contain beneficial compounds for health. In this study, the ability of the strain Lactiplantibacillus plantarum C3112 to produce γ-aminobutyric acid (GABA), a neuroactive compound, as well as several factors that can affect mentioned ability and bacterial growth were evaluated. In addition, different aspects related to technological aptitude and food safety were also study. Genetic characterization by PCR showed the presence of gadB1 gen, which encodes the glutamate decarboxylase enzyme, which is responsible for GABA production. The highest concentrations of GABA were achieved with glutamate concentrations of 100 and 500 mM. The GABA conversion ability increased significantly during the stationary phase of growth and by increasing the incubation temperature until 42 °C. On the contrary, this ability decreased as the NaCl concentration increased. Furthermore, the strain showed the ability to metabolize both glucose and lactose as well as to hydrolyze milk proteins. Finally, it was observed a slow acidifying activity, and it was not detected the production of biogenic amines. All of this allows affirm its potential use as adjunct culture for the production of fermented milks that could provide beneficial compounds for health.

En esta Tesis Doctoral se abordó el estudio de aislamientos de S. enterica pertenecientes a la variante monofásica del serotipo Typhimurium, con elevada incidencia a nivel mundial, y de otros serotipos con resistencias emergentes. Se utilizaron para ello técnicas experimentales, junto con secuenciación y análisis genómico. La primera parte de la Tesis se centró en el estudio de la variante monofásica, determinando su incidencia en el Principado de Asturias (PA) durante el periodo 2008-2018. Se analizaron un total de 741 aislamientos de los cuales 615 (83%) procedían de muestras clínicas y los 126 restantes (17%) de alimentos. En base al fenotipo de resistencia/genes responsables y su localización, estos aislamientos se asignaron a tres clones: los clones español y sud-europeo, que contienen plásmidos híbridos de resistencia-virulencia pertenecientes a los grupos de incompatibilidad IncC e IncR, respectivamente, y el clon europeo, con resistencia cromosómica, siendo este último prevalente en el PA. La secuenciación de genomas de aislamientos pertenecientes a los tres clones se llevó a cabo utilizando las plataformas Illumina y PacBio de segunda y tercera generación, respectivamente.