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CpOsm is an antifungal osmotin/thaumatin-like protein purified from the latex of Calotropis procera. The protein is relatively thermostable and retains its antifungal activity over a wide pH range; therefore, it may be useful in the development of new antifungal drugs or transgenic crops with enhanced resistance to phytopathogenic fungi. To gain further insight into the mechanism of action of CpOsm, its three-dimensional structure was determined, and the effects of the protein on Fusarium solani spores were investigated by atomic force microscopy (AFM). The atomic structure of CpOsm was solved at a resolution of 1.61Å, and it contained 205 amino acid residues and 192 water molecules, with a final R-factor of 18.12% and an Rfree of 21.59%. The CpOsm structure belongs to the thaumatin superfamily fold and is characterized by three domains stabilized by eight disulfide bonds and a prominent charged cleft, which runs the length of the front side of the molecule. Similarly to other antifungal thaumatin-like proteins, the cleft of CpOsm is predominantly acidic. AFM images of F. solani spores treated with CpOsm resulted in striking morphological changes being induced by the protein. Spores treated with CpOsm were wrinkled, and the volume of these cells was reduced by approximately 80%. Treated cells were covered by a shell of CpOsm molecules, and the leakage of cytoplasmic content from these cells was also observed. Based on the structural features of CpOsm and the effects that the protein produces on F. solani spores, a possible mechanism of action is suggested and discussed.

Texto completo: acesso restrito. p. 781-789 Submitted by Suelen Reis (suziy.ellen@gmail.com) on 2014-01-14T15:25:49Z No. of bitstreams: 1 1-s2.0-S0981942807001611-main.pdf: 891719 bytes, checksum: bbe6914b49384aecafa43c84573a0cef (MD5) Approved for entry into archive by Alda Lima da Silva (sivalda@ufba.br) on 2014-01-23T16:52:59Z (GMT) No. of bitstreams: 1 1-s2.0-S0981942807001611-main.pdf: 891719 bytes, checksum: bbe6914b49384aecafa43c84573a0cef (MD5) Made available in DSpace on 2014-01-23T16:52:59Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1-s2.0-S0981942807001611-main.pdf: 891719 bytes, checksum: bbe6914b49384aecafa43c84573a0cef (MD5) Previous issue date: 2007 The laticifer fluid of Calotropis procera is rich in proteins and there is evidence that they are involved in the pharmacological properties of the latex. However, not much is known about how the latex-containing proteins are produced or their functions. In this study, laticifer proteins of C. procera were pooled and examined by 1D and 2D electrophoresis, masses spectrometry (MALDI-TOF) and characterized in respect of proteolytic activity and oxidative enzymes. Soluble laticifer proteins were predominantly composed of basic proteins (PI > 6.0) with molecular masses varying between 5 and 95 kDa. Proteins with a molecular mass of approximately 26,000 Da were more evident. Strong anti-oxidative activity of superoxide dismutase (EC 1.15.1.1) (1007.74 ± 91.89 U g−1 DM) and, to a lesser extent ascorbate peroxidase (EC 1.11.1.1) (0.117d ± 0.013 μMol H2O2 g−1 min−1), were detected. However, catalase (EC 1.11.1.6) was absent. The strong proteolytic activities of laticifer proteins from C. procera were shown to be shared by at least four distinct cysteine proteinases (EC 3.4.22.16) that were isolated by gel filtration chromatography. Serine and metaloproteinases were not detected and aspartic proteinase activities were barely visible. Chitinases (EC 3.2.1.14) were also isolated in a chitin column and their activities quantified. The presence of these enzymatic activities in latex from C. procera may confirm their involvement in resistance to phytopathogens and insects, mainly in its leaves where the latex circulates abundantly.

The mobilization of seed proteins from Pisum arvense L. during germination in the absence of light was studied. The seeds were found to be completely consumed 22 days after germination and seedlings ceased growth after the 18th day. SDS-PAGE indicated that the main protein bands correspond to high molecular mass storage proteins which undergo proteolysis in the initial stages of germination and are not detected after the 7th day of germination. However, the corresponding lectin profiles were detected during the entire germination process, suggesting that these proteins are strongly resistant to seed proteolytic enzymes and should be important for seedling establishment. Furthermore, haemagglutinating activity in cotyledons was detected until 22 days after germination, indicating that the lectins remain active even in senescent cotyledons. A mobilização das proteínas de sementes de Pisum arvense L. durante a germinação na ausência de luz foi estudada. As sementes foram completamente exauridas de suas reservas após 22 dias de germinação e as plântulas cresceram até o 18° dia de germinação. Experimentos de eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS indicaram que as principais bandas protéicas, correspondendo às proteínas de reserva de alta massa molecular, foram detectadas apenas até o 7° dia após a germinação. Entretanto, as bandas protéicas correspondentes às lectinas da semente puderam ser detectadas ao longo de todo o processo germinativo, sugerindo que essas proteínas são fortemente resistentes à ação das proteases da semente e devem, de alguma forma, ser importantes para o estabelecimento das plântulas. A atividade hemaglutinante nos cotilédones foi detectada até o 22° dia de germinação, indicando que as lectinas também permaneceram ativas quando os cotilédones estavam bastante exauridos de suas reservas.

Phytoremediation, with the use of microalgae, is a technique used in the treatment of different types of effluents, aiming at the removal of compounds that can cause eutrophication, such as nitrogen and phosphate. The present study evaluated the phytoremediation of urban and farm fish effluents using the microalgae Chlorella vulgaris and the addition of its biomass in the diet of the marine shrimp Litopenaeus vannamei. The microalgae were cultivated in three treatments (effluent from the sewage treatment plant, aquaculture effluent and standard medium Guillard f/2), conducted in quintuplicate for each culture medium, using a carboy of 20 L for 8 days. The experiment with shrimp was realized with three treatments in quintuplicate, in a completely randomized design, for 15 days. The animals were kept in aquariums of 100 L under constant aeration, fed four times a day (8:00, 11:00, 14:00 and 16:00 h) offering commercial ration with 35% of crude protein, commercial ration plus addition of 5% dry biomass of C. vulgaris cultiveted in effluent from a treatment plant and commercial feed plus addition of 5% of dry biomass of C. vulgaris cultivetd in aquaculture effluent, respectively. The efficiency of C. vulgaris in the phytoremediation of aquaculture effluent and treated effluent was 80.7 and 75.7%, respectively. The nitrite was completely removed in the 3 treatments and the nitrate had a bioremoval of 95.1; 92.0 and 98.6% for cultivation in Aquaculture Effluent, Treated Effluent and Standard Medium, respectively. Phosphorus was completely absorbed in cultures with Aquaculture Effluent and Standard Medium, with 67.7% removal in cultures with Treated Effluent. The productive results of the microalgae cultivated in Aquaculture Eluent were similar to the performance of the cultivation in Standard Medium, demonstrating the potential of cultivation in wastewater. The additive with the best zootechnical performance was the commercial ration plus the addition of 5% of dry biomass of C. vulgaris cultivated in aquaculture effluent. A fitorremediação, com o uso de microalgas, é uma técnica empregada no tratamento de diferentes tipos de efluentes, visando a remoção de compostos que podem causar a eutrofização, como por exemplo os nitrogenados e fosfatados. O presente estudo avaliou a fitorremediação de efluentes urbano e piscícola utilizando a microalga Chlorella vulgaris e adição de sua biomassa na dieta do camarão marinho Litopenaeus vannamei. As microalgas foram cultivadas em três tratamentos (efluente da estação de tratamento de esgoto, efluente aquícola e meio padrão Guillard f/2), conduzidos em quintuplicata para cada meio de cultura, utilizando garrafão de 20 L por 8 dias. O experimento com os camarões foi realizado com três tratamentos em quintuplicata, em delineamento inteiramente casualizado, durante 15 dias. Os animais foram mantidos em aquários de 100 L sob aeração constante, alimentados quatro vezes ao dia (8:00, 11:00, 14:00 e 16:00 h) ofertando ração comercial com 35% de proteína bruta, ração comercial mais adição de 5% de biomassa seca de C. vulgaris cultivada em efluente de estação de tratamento e ração comercial mais adição de 5% de biomassa seca de C. vulgaris cultivada em efluente aquícola, respectivamente. A eficiência da C. vulgaris na fitorremediação de Efluente Aquícola e Efluente tratado foi de 80,7 e 75,7%, respectivamente. O nitrito foi removido em toda sua totalidade nos 3 tratamentos e o nitrato teve biorremoção de 95,1; 92,0 e 98,6% para os cultivos em Efluente Aquícola, Efluente Tratado e Meio Padrão, respectivamente. O fósforo foi completamente absorvido nos cultivos com Efluente Aquícola e Meio Padrão, com 67,7% de remoção nos cultivos com Efluente Tratado. Os resultados produtivos da microalga cultivada em Eluente Aquícola foram semelhantes ao desempenho do cultivo em Meio Padrão, demonstrando o potencial do cultivo em águas residuárias. O aditivo com melhor desempenho zootécnico foi o da ração comercial mais adição de 5% de biomassa seca de C. vulgaris cultivada em efluente aquícola.

Calotropis procera is a plant whose parts have been used in alternative medicine, aiding in treatment of various pathologies, such as: joint pain, asthma, malaria, eczema, leprosy, bleeding, skin burns and inflammation. The process of dialysis and centrifugation of the latex of C. procera results in protein fractions with differentiated effects over the cell immunity. The protein fraction LP and its subfractions (LPPI, LPPII and LPPIII), administered by different routes in animal models, induce different effects over cell mediated immunity in the organism. The current study aimed to evaluate the modulatory capacity of protein fractions LPPII and LPPIII from Calotropis procera latex in a model of inflammation induced by lethal infection by Salmonella Typhimurium. The latex protein fraction (LP) obtained was fractionated by ion-exchange chromatography to obtain three fractions: LPPI, LPPII and LPPIII. Swiss mice were treated with LPPII and LPPIII (5 and 10 mg/kg), by intraperitoneal route, and then were challenged with S. Typhimurium in lethal injections (106 UFC/ml). All treatments protected the animals in different degrees, but LPPIII the dose of 5 mg/kg exhibited a bigger survival rate and, consequently, were used to evaluate the following parameters: 1- bacterial enumeration in blood, peritoneal fluid, spleen and liver; 2- histopathological analysis; 3- total and differential count of leukocytes in peripheral blood and peritoneal cavity; 4- effect over the total plasma coagulation; 5- modulation of cytokines and nitric oxide. The fraction LPPIII (5 mg/kg) was capable of protection 70 % of animals against lethal infection. This protective effect was due to the control of the onset inflammation, through modulation of IL-1β, IL-10 and NO release, inducing an inflammatory stimulus prior to the infection, mainly by increasing the neutrophilic infiltration in the infection locus. It was also observed the maintenance of hemostasis of the coagulation pathways. These results demonstrate the biotechnological potential present in the latex of Calotropis procera, it also corroborates and expands upon the knowledge regarding the mechanism of protection against Salmonella Typhimurium infection reported for LP. Calotropis procera é uma planta cujas partes têm sido utilizadas na medicina alternativa, no auxílio ao tratamento de diversas patologias, tais como: dores em articulações, asma, malária, eczema, lepra, sangramentos bucais, queimaduras na pele e quadros de inflamação. O processo de diálise e centrifugação do látex de C. procera resulta em frações proteicas com efeitos diferenciados sob a imunidade celular. A fração proteica (LP) e suas subfrações (LPPI, LPPII e LPPIII), administradas por diferentes vias em modelos animais, geram efeitos diferentes sobre o organismo. Tendo isso em vista, o presente trabalho visa avaliar a capacidade moduladora das frações proteicas LPPII e LPPIII do látex de Calotropis procera em um modelo de inflamação induzida pela infecção letal de Salmonella Typhimurium. A fração proteica do látex (LP) obtida foi fracionada por cromatografia de troca iônica para a obtenção de três frações: LPPI, LPPII e LPPIII. Camundongos receberam LPPII e LPPIII (5 e 10 mg/ kg), por via intraperitoneal, e em seguida foram desafiados com S. Typhimurium em injeções letais (106 U.F.C./ mL). Todos os tratamentos protegeram os animais em diferentes níveis, mas a dose de 5 mg/kg induziu o maior percentual de sobrevivência e, consequentemente, foi utilizada para avaliação dos seguintes parâmetros: 1- contagem bacteriana no sangue, fluido peritoneal, baço e fígado dos animais; 2- análise histopatológica; 3- contagem total e diferencial de leucócitos no sangue e fluido peritoneal; 4- efeito sobre a coagulação plasmática; 5- modulação dos níveis de citocinas e óxido nítrico. A fração LPPIII (5 mg/kg) foi capaz de proteger 70 % dos animais contra a infecção letal. Esse efeito protetor foi devido ao controle da inflamação decorrente da infecção, através da modulação da liberação de IL-1β, IL-10 e NO, instaurando um estímulo inflamatório prévio à infecção, constituído principalmente pelo aumento no infiltrado neutrofílico. Observou-se também a manutenção da hemostasia das vias de coagulação durante o processo infeccioso severo. Esses resultados demonstram o potencial biotecnológico presente no látex de Calotropis procera, corroborando e expandindo os conhecimentos sobre o mecanismo de proteção de LP contra infecção por Salmonella Typhimurium.

The plant Calotropis procera synthesizes a variety of secondary metabolites, such as cardenolides, a type of toxic metabolite of defense against herbivores. Thirty-five cardenolides have already been identified in C. procera and had their molecular structure resolved. Cardenolides are toxic by inhibiting the enzymatic activity of ATPases of Na+/K+, causing cell death. However, herbivorous insects Danaus plexippus (Lepidoptera), Oncopeltus fasciatus and Aphis nerii (Hemiptera) are capable of using C. procera as host. Why does the plant synthesize a variety of cardenolides? Which are the structural and chemical characteristics of these molecules? How do these herbivores prevent the action of these metabolites? In this work, the C. procera cardenolides were classified in three groups, one of them with three subgroups, according to their structural characteristics. The hydropaticity index was defined through the partition coefficient log (Log P). Three-dimensional (3D) models of the ATPα1 of Na+/K+ from D. plexippus, O. fasciatus and A. nerii were constructed through comparative modeling using the SWISS-MODEL and Phyre2 servers, and were subsequently validated and refined. After refinement, the 3D structures were validated again. The binding site of cardenolides in the 3D structures of these three enzymes was identified and analyzed. With the aid of structural data described in the literature about the binding of ouabain (the most commonly used cardenolides for toxicity studies) in ATPα1 of Na+/K+, it was proposed that the resistance of D. plexippus, O. fasciatus, and A. nerii to the toxic effects of C. procera cardenolides is also related to amino acid substitutions with different chemical properties in specific enzyme sites. Probably, substitutions in positions 104, 115 and 302 have the higher effect on the increased insensitivity of the ATPα1 of Na+/K+ of these herbivores to cardenolides. Through molecular docking of the 3D structures of these ATPα1 of Na+/K+ with the cardenolides from C. procera was possible to establish a relationship between the specificity of polarity of the cardenolides sequestered by these herbivores and the selectivity of these metabolites about their ATPα1 of Na+/K+. Therefore, it is presumable that cardenolides that are not sequestered by these herbivores can bind in active site of their ATPα1 of Na+/K+, thus the selectivity of these metabolites to these enzymes is directly related to their polarity. It is concluded that C. procera diversifies the cardenolides structure in an attempt to any of them can interact with ATPα1 of Na+/K+ of the herbivores and promote their chemical defense. Insects, in turn, achieve the resistance excluding potentially toxic cardenolides from their bodies and sequestering those that are not selective for them or modifying the structure of the cardenolides, although this latter strategy is not metabolically known. A planta Calotropis procera sintetiza uma variedade de metabólitos secundários, dentre os quais se destacam os cardenolídeos, um tipo de metabólito tóxico de defesa contra herbívoros. Trinta e cinco cardenolídeos já foram identificados em C. procera e tiveram sua estrutura molecular estabelecida. Cardenolídeos são tóxicos ao inibir a atividade enzimática de ATPases Na+/K+, provocando a morte celular. Entretanto, os insetos herbívoros Danaus plexippus (Lepidoptera), Oncopeltus fasciatus e Aphis nerii (Hemiptera) são capazes de utilizarem C. procera como hospedeira. Porque a planta sintetiza tamanha variedade de cardenolídeos? Quais as características estruturais e químicas destas moléculas? Como esses herbívoros driblam a ação destes metabólitos? Neste trabalho, os cardenolídeos de C. procera foram classificados em três grupos, um deles com três subgrupos, de acordo com as suas características estruturais. O índice de hidropaticidade foi definido por meio do log do coeficiente de partição (Log P). Modelos tridimensionais (3D) das ATPα1 de Na+/K+ de D. plexippus, O. fasciatus e A. nerii foram construídos através da modelagem comparativa utilizando os servidores SWISS-MODEL e Phyre2, e posteriormente foram validados e refinados. Após refinamento, as estruturas 3D foram novamente validadas. O sítio de ligação de cardenolídeos nas estruturas 3D dessas três enzimas foi identificado e analisado. Com auxílio de dados estruturais descritos na literatura, sobre a ligação de ouabaína (cardenolídeo mais utilizado para estudos de toxicidade) em ATPα de Na+/K+, foi proposto que a resistência de D. plexippus, O. fasciatus e A. nerii aos efeitos tóxicos dos cardenolídeos de C. procera também está relacionada às substituições de aminoácidos com propriedades químicas diferentes em locais específicos das enzimas. Provavelmente, substituições nas posições 104, 115 e 302 exerçam o maior efeito sobre o aumento da insensibilidade das ATPα de Na+/K+ desses herbívoros aos cardenolídeos. Por meio dos procedimentos de docking molecular das estruturas 3D dessas ATPα1 de Na+/K+ com os cardenolídeos de C. procera foi possível estabelecer uma relação entre a especificidade na polaridade dos cardenolídeos sequestros por esses herbívoros e a seletividade desses metabólitos sobre suas ATPα de Na+/K+. Logo, é presumível que os cardenolídeos que não são sequestrados por esses herbívoros sejam capazes de se ligarem no sítio ativo de suas ATPα de Na+/K+, de modo que a seletividade desses metabólitos sobre essas enzimas está diretamente relacionada à sua polaridade. Conclui-se que a C. procera diversifica as estruturas dos cardenolídeos na tentativa de que algum deles possa interagir com ATPases de Na+/K+ de herbívoros e promover sua defesa química. Os insetos, por sua vez, alcançam a resistência, excluindo de seu organismo os cardenolídeos potencialmente tóxicos e sequestrando aqueles que não são seletivos para eles ou ainda modificando a estrutura do cardenolídeo, embora esta última estratégia não seja metabolicamente conhecida.

Throughout evolution, the plants have been developing defense mechanisms for their protection, an example of this is the production of latex as a vegetal resource in the defense against herbivores and phytopathogens. The chemical and functional diversity of the laticiferous fluids is being studied, with emphasis on secondary metabolites and defense proteins. The species Calotropis procera belongs to the family Apocynaceae and is prominent in latex production. Three classes of proteins isolated from latex: proteases, osmotin and chitinases. However, the objective of this study was to trace a relationship between the proteins present in the latex of C. procera and their role in plant defense against biotic and abiotic stresses. For this, methodologies for the in vitro control of the mycelial growth and germination of the phytopathogenic fungi Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium tupiense e F. oxysporum f. sp. cubense testing the synergistic effect of total proteins and their isolated fractions. Thus, it was verified the total proteins present a greater effect when compared to the latex fractions of C. procera, but the combination of the proteases with the osmotin enhaces the effect compared to the isolated osmotin. The total proteins of C. procera latex were tested as elicitors in the defense of banana seedlings challenged with the fungus F. oxysporum f. sp. cubense. It was observed that plants who were previously treated with latex proteins showed a reduction in the occurrence and severity of the disease, maintenance of growth, reduction in membrane damage and increase in the activity of the antioxidant system enzymes. Osmotins are defense-related proteins when it comes to biotic and abiotic stresses. To test this hypothesis to the sequence of the process of Nicotiana tabacum with the osmotin of C. procera (CpOsm). After confirming the transformation of the first generation of plants, the total proteins of tobacco leaves were extracted and tested in the inhibition of the germination and mycelial growth of the fungi F. tupienses and F. oxysporum f. sp. cubense. The results show plants transformed with the CpOsm gene inhibit the mycelial growth of phytopathogenic fungi with greater efficiency when compared to the untransformed plants. The transformed and control plants were submitted to salinity resistance test. For this, the plants were maintained in nutrient medium MS with 300 mM NaCl for seven days, after the transformed plants had no difference in growth and number of leaves, however they were able to increase the concentration of free proline when compared to the non-plants transformed. It is possible to measure a probable effect of C. procera latex proteins on the plant defense mechanism against the attack of phytopathogens and to relate the CpOsm protein with mechanisms of action of protection of plants to saline stress and attacks by phytopathogens. Ao longo da evolução, as plantas desenvolveram diferentes estratégias de defesa para sua proteção. O látex é um composto presente em uma ampla variedade de espécies sendo um recurso para a defesa contra herbívoros e fitopatógenos. Sua diversidade química e funcional tem sido bastante estudada, contendo metabólitos secundários e proteínas predominam. A espécie Calotropis procera (Apocynaceae) é laticífera. Três classes de proteínas isoladas do látex dessa espécie já foram bem caracterizadas: proteases, osmotinas e quitinases. O objetivo desse estudo foi traçar uma correlação entre proteínas presentes no látex de C. procera e sua participação na defesa das plantas frente a estresses bióticos e abióticos. Foram realizados ensaios para mensurar o controle in vitro do crescimento micelial e germinação de esporos de fungos fitopatogênicos (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium tupiense e F. oxysporum f. sp. cubense) testando o efeito sinérgico das proteínas totais assim como suas frações isoladas. Dessa forma, foi verificado que as proteínas totais apresentam um maior efeito quando comparado com as proteínas fracionadas do látex. Porém a combinação das proteases com as osmotinas potencializam o efeito quando comparado com a ação isolada das osmotinas. As proteínas totais do látex foram testadas como agentes elicitores na defesa de mudas de bananeira desafiadas com o fungo F. oxysporum f. sp. cubense. Foi observado que as plantas que passaram por um tratamento prévio com proteínas do látex apresentaram uma redução na ocorrência e severidade da doença. Mantiveram o crescimento e redução no dano de membrana assim como aumento na atividade das enzimas do sistema antioxidante. Plantas de Nicotiana tabacum foram transformadas com o gene da osmotina do látex de C. procera (CpOsm). Após a confirmação da transformação da primeira geração de plantas, as proteínas totais de folhas de tabaco foram extraídas e testadas na inibição da germinação e crescimento micelial dos fungos F. tupiens e F. oxysporum f. sp. cubense. Os resultados mostram que as plantas transformadas com o gene CpOsm conseguiram inibir o crescimento micelial de fungos fitopatogênicos com maior eficiência quando comparadas com as plantas não transformadas. As plantas, transformadas e controle, foram submetidas a teste de resistência a salinidade. As plantas transformadas não exibiram diferença de tamanho e número de folhas, porém conseguiram aumentar a concentração de prolina livre quando comparada com as plantas não transformadas. É possível aferir um provável efeito das proteínas do látex de C. procera no mecanismo de defesa das plantas ao ataque de fitopatógenos e relacionar a proteína CpOsm com mecanismos de ação de proteção das plantas ao estresse salino e a ataques por fitopatógenos.

The Amazon Forest is seen as one of the main focus of global biodiversity, and it represents the most complex ecosystem of the planet. Historically, the daily use of forest species by traditional populations, for the most diverse purposes, has attracted the researchers’ attention. However, the scientific study of forest species has its challenges. To overcome the difficulties of territorial access/ exploration, seasonality of the climate, and the intrinsic characteristics of each species strongly restrict the prospecting and systematic studies. This work was planned in response to an initiative of the Federal Government (CAPES) that stimulated the biological prospecting in the Brazilian Amazon. Focused on plant seeds, the study aimedto investigate proteins in native species. After botanical collection, fifty species of the Fabaceae family were selected for study. Seed proteins were extracted in saline and the extracts were tested in a growth inhibition assays of the following phytopathogenic fungi: Aspergillus sp., Aspergillus flavus, Aspergillus niger, Fusarium sp., Fusarium oxysporum, Penicillium chysogenum and Phomopsis sp. Extracts belonging to species that were identified as endemic of the Brazilian Amazon [Dimorphandra caudate, Dimorphandra parviflora (Caesalpinieae); Swartzia longistipitata, Swartzia recurva (Swartzieae); Zygia trunciflora (Ingeae)] were further evaluated by SDS-PAGE, proteomic analysis by mass spectrometry (MS/MS) of selected spots, and prospected for enzymatic activities of proteases and chitinases. Protein fractionation through ion exchange matrices allowed the partial purification of a lectin and three chitinases which were evaluated for their antifungal activities and mechanism of action. The antifungal activity of the extracts was widely observed among the tested fungi and was most representative in the Ingeae tribe. Proteases, chitinases and protease inhibitors were identified in the samples and chitinolytic activity was predominant. Fluorescence microscopy assays demonstrated the binding of propidium iodide to DNA of Fusarium oxysporum spores, suggesting that spore integrity was lost when exposed by the partially purified proteins. It was observed that the protein extracts of the seeds collected in the Amazon had a strong antifungal action and that chitinase activity was associated with this effect. These findings may be good subsidies for further molecular study of these seed chitinases from endogenous plants and their defense activities, considering that the seeds of 15 these plants are subjected to a complex set of adversities inherent to the Amazonian ecosystem, especially to the fungal attack when they fall on the ground and germinate. Considerada um dos principais centros de biodiversidade global, a Floresta Amazônica representa o mais complexo bioma do planeta. Historicamente, o uso de espécies da floresta no cotidiano das populações tradicionais, para os mais diversos propósitos, atrai a atenção de pesquisadores. Entretanto, estudar cientificamente essas espécies tem seus desafios. Vencer as dificuldades de acesso/exploração territorial, a sazonalidade do clima e as características intrínsecas de cada espécie restringem fortemente a prospecção e estudos sistemáticos. Este trabalho foi desenvolvido em resposta a uma iniciativa do Governo Federal (CAPES) que apoiou a prospecção biológica na Amazônia brasileira. Centrado em sementes de plantas, o estudo buscou investigar proteínas em espécies nativas. Após expedição de coleta botânica, cinquenta espécies da família Fabaceae foram selecionadas para estudo. As proteínas das sementes foram extraídas em solução salina e os extratos foram testados em ensaios de inibição de crescimento dos fungos fitopatogênicos: Aspergillus sp., A. flavus, A. niger, Fusarium sp., F. oxysporum, Penicillium chysogenum e Phomopsis sp. Os extratos de espécies identificadas como endêmicas da Amazônia brasileira [Dimorphandra caudata, D. parviflora (Caesalpinieae); Swartzia longistipitata, S. recurva (Swartzieae); Zygia trunciflora (Ingeae)] foram avaliados por SDS-PAGE e as proteínas presentes foram identificadas por espectrometria de massas (MS/MS), além da prospecção de atividades proteolíticas e quitinásicas. O fracionamento proteico em matrizes de troca iônica permitiu a purificação parcial de uma lectina e três quitinases, que foram avaliadas quanto as suas atividades antifúngicas e mecanismo de ação. A atividade antifúngica dos extratos foi observada entre os fungos testados e mais representativa na tribo Ingeae. Proteases, quitinases e inibidores de proteases foram identificados nas amostras, sendo que a atividade quitinolítica foi predominante. Os ensaios de microscopia de fluorescência evidenciaram a ligação de iodeto de propídio ao DNA de esporos de Fusarium oxysporum, sugerindo que a integridade da membrana dos esporos foi perdida quando exposta às proteínas parcialmente purificadas. Foi observado que os extratos proteicos das sementes coletadas na Amazônia apresentavam forte ação antifúngica e que a atividade quitinásica estava associada a este efeito. Estes achados podem ser bons subsídios para o estudo molecular mais amplo destas quitinases de 12 sementes de plantas nativas e suas atividades na defesa, considerando que as sementes destas plantas são submetidas a um complexo conjunto de adversidades inerentes ao ecossistema amazônico, especialmente ao ataque fúngico quando caem no solo e germinam.

ROCHA JUNIOR, Pedro Abílio Vieira. Uso das proteases do látex de Calotropis procera em dietas para tilápia do Nilo (Oreochromis niloticus): Desempenho zootécnico, digestibilidade e parâmetros hematológicos. 2018. 104 f. Dissertação (Mestrado em Engenharia de Pesca)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2018. Among the productive costs involved in aquaculture, artificial feeding is the most expressive, justifying the performance of several studies prioritizing the appropriate balance of rations that increases productivity and reduces environmental impact. The use of enzymes is a promising strategy to maximize the efficiency of the use of diets, because they reduce the costs of production while maintaining the performance of the animals, as they improve the digestibility and reduce antinutritional factors. The objective of this work was to evaluate the effect of the inclusion of different concentrations of Calotropis procera latex (LP) proteases on Nile tilapia rations by means of zootechnical performance, hematological parameters, digestibility, centesimal composition of fillets and rations, and water quality parameters. The experiment lasted 60 days with the use of 160 fingerlings with initial weight of 3.10 ± 0.55 g, distributed in 16 aquariums, fed rations with three levels of inclusion (LP) (100, 200, 300 mg kg-1) respectively (Lp-Cp 01; Lp-Cp 02; Lp-Cp 03) and a control (without LP). The experiments were performed with four replicates each and the animals were fed three times a day (8, 12, and 16 hours), ranging from 10 to 5% of their biomass. The obtained data were submitted to ANOVA, with the multiple comparison test of Tukey averages (p

Submitted by Mario BC (mario@bc.ufrpe.br) on 2018-03-14T12:26:00Z No. of bitstreams: 1 Jacqueline Ellen Camelo Batista Albuquerque.pdf: 1563098 bytes, checksum: 993e6d21852ba5b6790a3c951b311ae4 (MD5) Made available in DSpace on 2018-03-14T12:26:00Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Jacqueline Ellen Camelo Batista Albuquerque.pdf: 1563098 bytes, checksum: 993e6d21852ba5b6790a3c951b311ae4 (MD5) Previous issue date: 2017-03-14 Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES Plant lectins represent a class of proteins that perform various biological activities, including an immunomodulatory actions. In particular, lectins ConBr (Canavalia brasiliensis) and CFL (Cratylia argentea) have demonstrated an ability to modulate cytokines of the proinflammatory cascade as well as the production of nitric oxide in the murine model of Salmonella infection. Immunomodulatory molecules represent a promising alternative in the prevention and treatment of infections and can enhance immunological and adaptive mechanisms of the host improving the efficacy of antibiotics and vaccines against pathogens. This study evaluated the biotechnological potential of the ConBr and CFL as therapeutic and vaccine adjuvants against the antigen Vi from S. typhi, which has been used with limited success for immunization against typhoid fever. Initially, cytotoxicity assays with lectins were performed with cultured murine peritoneal macrophages to define non-toxic proteins concentrations for assays. Then, macrophages were treated with lectins and infected with a virulent strain of Salmonella Typhimurium. For this purpose, macrophages were incubated with ConBr and CFL lectins (1 and 10 μg / mL) before (preventive treatment) or after (curative treatment) the onset of infection. The following analyses were conducted: macrophage cell viability, intracellular bacterial quantification, iNOS plus pro-and anti-inflammatory cytokines and Toll-like receptor´s (TLR2, TLR4 and TLR9) gene expression. Both preventive and curative treatments significantly reduced the intracellular bacterial load and increased cell viability of infected macrophages. In the preventive treatment with CFL there was an increase in the level of transcripts for IL-6 and TNF-α, whereas ConBr induced an increase of IL-12 (p40). In the curative treatment, CFL induced significant expression of IL-12 (p40), whereas ConBr increased gene expression of IL-1β and TNF-α. In addition, the curative treatment with CFL increased approximately 130 fold the expression of TLR-4 and 24 fold expression of TLR2. In view of the importance of the TLR2 and TLR4 for the control of Salmonella infection, we evaluated the participation of these receptors in the immunomodulatory action of the CFL. Thus, bone marrow-derived macrophages (BMDM) knockout for TLR2/TLR4 were treated with the lectin and gene expression for IL-1β, TNF-α and IL-6 cytokines was evaluated. Naïve BMDM demonstrated high levels of gene expression, increasing 258-fold the number of transcripts for IL-1β, 233-fold for IL-6, and 25-fold for TNF-α. Conversely, double knockout BMDM for TLR2/TLR4 produced low levels of transcripts. Finally, ConBr and CFL were tested as vaccine adjuvants in Swiss mice immunized with the purified Vi antigen through evaluation of anti-Vi IgG antibodies. The results showed that as CFL and ConBr lectins were not able to induce an increase of specific IgG anti-Vi antibodies. Although the lectins did not demonstrate a potential as vaccine adjuvant against the Vi antigen, they showed therapeutic properties beneficial to the control of Salmonella-infected macrophages and were capable to interact with Toll-like receptors, which play a key role on activation of innate immune response and development of adaptive immune response. Such results represent a promising prospect for the development of new drugs against Salmonella. Lectinas vegetais representam uma classe de proteínas que desempenham diversas atividades biológicas, incluindo a ação imunomoduladora. Recentemente, as lectinas ConBr (Canavalia brasiliensis) e CFL (Cratylia argentea) demonstraram a capacidade de modular a cascata pró-inflamatória de citocinas, bem como a produção de óxido nítrico em modelo murino de infecção por Salmonella. Moléculas imunomoduladoras representam uma alternativa promissora na prevenção e no tratamento de infecções, podendo atuar nos mecanismos imunológicos naturais e adaptativos do hospedeiro, aprimorando a eficácia de antibióticos e vacinas contra patógenos. Diante disso, este estudo avaliou o potencial biotecnológico das lectinas, ConBr e CFL, como adjuvantes terapêuticos, frente ao antígeno vacinal Vi de S. Typhi, que tem sido usado com sucesso limitado para imunização contra a febre tifoide. Inicialmente, foram realizados ensaios de citotoxicidade das lectinas em cultura de macrófagos peritoneais murinos para definir as concentrações proteicas não tóxicas de uso nos ensaios. A seguir, os macrófagos foram tratados com as lectinas e infectados por uma cepa virulenta de Salmonella Typhimurium. Para tanto, os macrófagos foram incubados com as lectinas ConBr e CFL (1 e 10 μg/mL) antes (tratamento preventivo) ou após (tratamento curativo) infecção experimental com Salmonella. Foram realizadas análises de viabilidade celular dos macrófagos, quantificação intracelular bacteriana e expressão gênica de iNOS, citocinas pró- e anti-inflamatórias e receptores Toll-like (TLR2, TLR4 e TLR9). Ambos os tratamentos preventivo e curativo reduziram significativamente a quantificação bacteriana intracelular de Salmonella e aumentaram a viabilidade celular dos macrófagos. Os tratamentos preventivos com CFL aumentaram os níveis de transcritos para IL-6 e TNF-α, já ConBr induziu o aumento de IL-12 (p40). No tratamento curativo, CFL induziu expressão significativa de IL-12 (p40), enquanto ConBr aumentou a expressão gênica de IL-1β e TNF-α. Além disso, o tratamento curativo com CFL foi capaz de aumentar cerca de 130 vezes a expressão de TLR-4 e 24 vezes a expressão de TLR2. Considerando a importância dos receptores TLR2 e TLR4 para o controle da infecção por Salmonella, este trabalho avaliou a participação desses receptores na ação imunomoduladora da lectina CFL. Para tanto, macrófagos derivados da medula óssea (BMDM) e duplo nocautes para TLR2/TLR4 foram tratados com a lectina e a expressão gênica das citocinas IL-1β, TNF-α e IL-6 foi avaliada. Os BMDM demonstraram elevados níveis de expressão gênica, induzindo o aumento de cerca de 258 vezes para IL-1β, 233 vezes para IL-6 e 25 vezes para TNF-α. No entanto, BMDM duplo nocautes para TLR2/TLR4, produziram níveis significativamente mais baixos de transcritos. Por fim, ConBr e CFL foram testados como adjuvante vacinais em camundongos Swiss imunizados com antígeno Vi purificado, através da avaliação de anticorpos IgG anti-Vi. Os resultados mostraram que as lectinas CFL e ConBr não foram capazes de induzir o aumento no título de anticorpos específicos IgG anti-Vi. Apesar das lectinas não terem demonstrado potencial adjuvante vacinal frente ao antígeno Vi, tais proteínas apresentaram propriedades terapêuticas benéficas no controle de células infectadas por Salmonella, além de serem capazes de interagir com receptores do tipo Toll, essenciais na ativação da resposta imune inata e desenvolvimento da resposta adaptativa. Assim, tais resultados representam uma perspectiva promissora para o desenvolvimento de novos fármacos contra Salmonella.

VASCONCELOS, Mirele da Silveira. Hidrogel cicatrizante a partir de hemiceluloses vegetais de Caesalpinea pulcherrima e proteínas laticíferas de Calotropis procera. 2017.139 f.Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2017. Calotropis procera (Ait.) R. Br. is well known for being a latcifers plant and for its medicinal properties. Its latex has already been used in traditional medicine in the treatment of dermis disorders. Scientific studies have shown that laticifers proteins isolated from C. procera have several pharmacological properties and their anti-inflammatory, antiseptic, analgesic and wound healing effects are reported. The aim of this work was to evaluate the effect of the CpPII protein fraction of C. procera on cicatricial process modulation in experimental wound models. For this, a hydrogel (Hg) was developed using natural hemicelluloses (galactomannans) from Caesalpinea pulcherrima, as excipient, and laticifers proteins (CpPII), rich in proteolytic enzymes as active principle. In the present study, laticifers proteins containing proteolytic activity (CpPII) or inhibited with iodoacetamide (IAA) were incorporated at different concentrations (w/v) in galactomannan hydrogels (Hemi) to obtain the following formulations tested: HgCpPII 0.2%, HgCpPII 0.5% and HgCpPII-IAA 0.2%. Male Swiss mice were used for in vivo tests (wound healing and dermal irritability) according to experimental procedures approved by the institutional ethics committee under number 64/2014. Tissue modifications and target mediators of cicatricial response were evaluated according to morphometric, biochemical, immunological and histological parameters in excisional wound models (1cm2). The results showed that the hydrogel formulations presented satisfactory quality after microbiological analysis, storage stability at 4ºC and dermal biocompatibility. Wounds treated with the CpPII fraction showed modulation of inflammatory mediators (MPO, NO, IL-1β, IL-6) and reduction of lipid peroxidation (MDA). The number of mast cells degranulated in the CpPII-treated animals increased significantly on day 14, and the mast cells degranulation in the group treated with 0.5% HgCpPII (p

In the previous step to this work, a protein identified as osmotin (CpOsm) was purified from Calotropis procera latex which showed strong antifungal activity. The protein was expressed in prokaryotic and eukaryotic systems, but a suitable protocol for purification has not been achieved. In the present work, from inclusion bodies (IB) obtained from Escherichia coli BL21 (DE3) proceeded to a survey by different solubilization protocols of proteins in an attempt to obtain the recombinant protein (rCpOsm) soluble, and then evaluates it as its activity and finally, exploring new methods for purification. The bacterial culture was induced at different conditions of temperature and time of induction. IB were subjected to chemical treatments with surfactants (CTAB; Cetrimide; ARG-12, a derivative surfactant Argenine) and a denaturing agent (guanidine hydrochloride); physical treatment by sonication and the enzymatic treatment with protease native C. procera latex. Electrophoresis assays suggested that two chemical surfactants were effective in solubilizing rCpOsm while not ARG-12. Although these cationic compounds solubilized rCpOsm more than other proteins of IB, while the sonication process samples produced with a greater variety of soluble proteins including rCpOsm. The enzymatic treatment showed that IB proteins are, in some range, digested while rCpOsm did not. All samples were evaluated for action on Colletotrichum gloeosporiodes after dialysis and lyophilization and showed inhibitory activity of spore germination and mycelial growth. However, it was shown that the activity could be related to the solubilising agents. Insoluble proteins obtained from E. coli containing the plasmid integrity, taken as a negative control showed no activity in these assays. The rCpOsm solubilized by CTAB was subjected to chromatography on Ni ++ column (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7.0; in hydrophobic media (FenilSepharose CL-4B) and ion exchange (Resource-S). None of the applied protocols resulted in the purification of rCpOsm and these data repeated what was observed previously for rCpOsm purified from Pichia pastoris. Em etapa anterior a este trabalho, uma proteína identificada como osmotina (CpOsm) foi purificada do látex de Calotropis procera a qual apresentou forte atividade antifúngica. A proteína foi expressa em sistemas procarionte e eucarionte, mas um protocolo adequado para sua purificação não foi alcançado. No presente trabalho, partindo de corpos de inclusão (CI), obtidos de E. coli BL21(DE3) procedeu-se uma prospecção por diferentes protocolos de solubilização de suas proteínas, na tentativa de obter a proteína recombinante (rCpOsm) solúvel, para então avaliá-la quanto a sua atividade e por fim, prospectar novos métodos para sua purificação. A cultura bacteriana foi induzida em diferentes condições de temperatura e tempo de indução. Após 3 horas de indução a 37 °C, 180 rpm, os CI foram lisados e submetidos a tratamentos químicos com surfactantes (CTAB; Cetrimida; ARG-12: um surfactante derivado de argenina) e um agente desnaturante (Cloridrato de Guanidina); tratamento físico por sonicação (4 ciclos de 2,5 min. cada a 50% de potência) e tratamento enzimático com protease nativa do látex de C. procera. Ensaios de eletroforese sugeriram que os dois surfactantes químicos foram eficientes na solubilização de rCpOsm enquanto que ARG-12 não. Ainda, estes compostos catiônicos solubilizaram rCpOsm mais do que as demais proteínas dos CI, enquanto que o processo de sonicação produziu amostras com maior diversidade de proteínas solúveis, incluindo rCpOsm. O tratamento enzimático mostrou que proteínas de CI são, em algum alcance, digeridas enquanto que rCpOsm não. O efeito do tratamento dos CI com protease foi analisado por imagens de microscopia de força atômica e as diferenças de estrutura entre os CI tratados e não tratados documentados. Todas as amostras foram avaliadas quanto à ação sobre Colletotrichum gloeosporiodes após diálise e liofilização. Os produtos dos tratamentos com surfactantes apresentaram atividade antifúngica, demonstrando atividade inibitória de germinação de esporos e crescimento micelial. Entretanto, foi demonstrado que a atividade poderia estar relacionada aos agentes solubilizantes. Proteínas insolúveis obtidas de E. coli contendo o plasmídeo íntegro, tomadas como controle negativo, não apresentaram atividade nestes ensaios. A rCpOsm solubilizada com CTAB foi submetida a cromatografia em coluna de Ni++ (Ni Sepharose 6 Fast Flow) pH 7,0; em meio hidrofóbico (FenilSepharose CL-4B) e troca iônica (Resource-S). Nenhum dos protocolos aplicados resultou na purificação de rCpOsm e estes dados repetem o que foi observado previamente para a rCpOsm purificada a partir de Pichia pastoris.

VIANA, Carolina de Araújo. Caracterização bioquímica e atividades biológicas de quitinases laticíferas de Calotropis procera. 2015. 181 f. Tese (Doutorado em Bioquímica)-Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2015. Calotropis procera is a latificer plant in the Apocynaceae family. Defensive proteins with activity against phytophagous insects and phytopathogenic fungi in latex have been described. Latex’s proteic fraction also performs pharmacological activities, such as selective cytotoxic effect in carcinogenic cells. From the proteic fraction effective against neoplastic cells, this work had the goal to identify and further characterize cytotoxic protein(s) biochemically, biologically, and evaluate their biotechnological prospects. Soluble proteins in latex (LP) have been fractioned in ion-exchange matrix, and the fraction capable of cytotoxicity was further fractioned in another ion-exchange matrix (Mono-Q) coupled to a medium-pressure system. P4 was identified as cytotoxic fraction, showing an IC50 of 2.2, 1.2 and 2.9 mg/mL for the cell lines HCT-116, Ovcar-8 and SF-295, respectively. Proteomic analysis of the cytotoxic fraction by two-dimensional electrophoresis allowed 15 spots to be identified, comprising acid proteins (pI among 4 and 6) with 30 kDa apparent molecular weight. All spots were identified as chitinases when evaluated by mass spectrometry, and showed intact mass of 27.4 kDa. The sample reacted positively to the Schiff reagent, suggesting glycosilations. The carbohydrate content was estimated at 12.8%. The amino-terminal sequence obtained (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revealed 50% similarity with Solanum lycopersicum, Oryza sativa and Nicotiana tomentosiformes chitinases, among others. The enzymes showed strong chitinolytic activity, with optimal pH varying between 5-6 and optimal temperature of 25 °C. The chitinolytic activity was diminished when treated with increasing concentrations of DTT (3, 10 and 30 mM), which suggests the presence of disulfide bonds stabilizing the enzyme. Circular dichroism analyses indicate a larger presence of alpha helices in the structure and that the isoforms has low resistance to pH and temperature variation. High-resolution images generated through atomic force microscopy suggested sample homogeneity and a hexameric configuration. The chitinases did not inhibit mycelial growth of phytopathogenic fungi Fusarium oxysporum and Colletotrichum gloeosporioides, however reduced the germination C. gloeosporioides spores. In consonancy the chitinases did not induce spore oxidative stress, but caused a slight change in membrane permeability of the evaluated spores. Laticifer chitinases (0.1% w/w) showed a strong deleterious effect on the phytophagous insect Callosobruchus maculatus. Effects produced a 57% survival reduction, larval weight reduction (7.8 mg ± 0.2 / 4.0 ± 0.8), adult insets emergence reduction (50%), in addition to prolonging the mean maturation time from 28 to 33 days. The chitinases (2 mg/Kg, i.v.) showed a strong anti-inflammatory activity, reducing 95% of neutrophil infiltration into the peritoneal cavity in mouse in an inflammation induced by carrageenan assay. L-NAME and Aminoguanidine, two inhibitors of nitric oxide synthase, reversed this effect, possibly indicating involvement of nitric oxide in the effects observed. This action was associated to a reduction of pro-inflammatory cytokines TNF-α and IL-1 levels within the peritoneal cavity and increased serum levels of pro-inflammatory cytokines TNF-α, IL-6 and IL-1. The conclusion is reached that many isoforms of chitinases coexist in C. procera latex. These proteins act possibly in defense against insects, though low action against fungi is shown. Laticifer chitinases were identified as latex proteins cytotoxic on neoplastic cells and they have even been able to modulate pro-inflammatory cytokines levels and nitric oxide in an acute inflammation model. C. procera laticifer chitinases represent interesting molecules for biotechnology prospection in plant defense and pharmacology. Calotropis procera é uma planta laticífera, pertencente à família Apocynaceae. Proteínas de defesa foram descritas no látex com atividade contra insetos fitófagos e fungos fitopatogênicos. A fração proteica do látex também apresenta atividades farmacológicas, dentre tais efeito citotóxico seletivo em células carcinogênicas. A partir da fração proteica efetiva sobre células neoplásicas, o trabalho teve por meta central identificar proteína(s) citotóxica(s) e proceder a sua caracterização bioquímica, biológica e suas perspectivas biotecnológicas. As proteínas solúveis do látex (PL) foram fracionadas em matriz de troca iônica e a fração proteica detentora da citotoxicidade foi refracionada em outra matriz de troca iônica (Mono-Q) acoplada a sistema de média pressão. P4 foi identificado como a fração citotóxica, apresentando uma IC50 de 2,2, 1,2 e 2,9 µg/mL para as linhagens celulares HCT-116, Ovcar-8 e SF-295, respectivamente. A análise proteômica da fração citotóxica por eletroforese bidimensional permitiu identificar 15 spots, contendo proteínas ácidas (pI entre 4 e 6) e com massa molecular aparente de 30 kDa. Quando avaliados por espectrometria de massas todos esses spots foram identificados como quitinases e apresentaram massa intacta de 27,4 kDa. A amostra reagiu positivamente ao reagente de Schiff, sugerindo glicosilações. O teor de carboidratos foi estimado em 12,8%. A sequência amino terminal obtida (1QPVMNLEYPRYLNDINDYRDDNNYD28) revelou 50% de similaridade com quitinases de Solanum lycopersicum, Oryza sativa, Nicotiana tomentosiformes dentre outras. As enzimas apresentaram forte atividade quitinolítica, com pH ótimo variando entre 5-6 e temperatura ótima de 25 °C. A atividade quitinolítica foi reduzida quando tratada com concentrações crescentes de DTT (3, 10 e 30 mM) o que sugere a presença de pontes dissulfeto estabilizadoras da enzima. Análises por dicroísmo circular indicam a presença majoritária de alfa-hélices na estrutura e que as isoformas se mostraram pouco resistentes a variações de temperatura e pH. Imagens de alta resolução geradas por microscopia de força atômica sugeriram homogeneidade na amostra e um arranjo hexamérico foi evidenciado. As quitinases não inibiram o crescimento micelial dos fungos fitopatogênicos Fusarium oxysporum e Colletotrichum gloeosporioides, mas reduziram a germinação de esporos de C. gloeosporioides. Em consonância as quitinases não induziram estresse oxidativo nos esporos, mas causaram leves alterações na permeabilidade membranar dos esporos avaliados. As quitinases laticíferas (0,1 % m/m) apresentaram forte efeito deletério sobre o inseto fitófago Callosobruchus maculatus. Os efeitos produziram 57% de redução na sobrevivência larval, redução do peso de larvas (7,8 mg ± 0,2 /4,0 ± 0,8) e emergência de insetos adultos (50%), além de prolongar de 28 para 33 dias o tempo médio de desenvolvimento de insetos adultos. As quitinases (2 mg/Kg, e.v.) apresentaram forte atividade anti-inflamatória, reduzindo em 95% a infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal em ensaio de inflamação induzido por carragenina em camundongos. Este efeito foi revertido por L-NAME e Aminoguanidina, dois inibidores da enzima óxido nítrico sintase, indicando o possível envolvimento do óxido nítrico no efeito observado. Esta ação foi associada à redução dos níveis das citocinas pró-inflamatórias TNF-α e IL-1 na cavidade peritoneal e do aumento dos níveis séricos das citocinas pró-inflamatórias TNF-α, IL-6 e IL-1. É concluído que várias isoformas de quitinases coexistem no látex de C. procera. Estas proteínas atuam possivelmente na defesa contra insetos, mas têm pouca ação contra fungos. As quitinases laticíferas foram identificadas como as proteínas citotóxicas do látex sobre células neoplásicas e ainda foram capazes de modular os níveis de citocinas pró-inflamatórias e síntese de óxido nítrico em modelo de inflamação aguda. As quitinases do látex de C. procera representam interessantes moléculas para prospecção biotecnológica em defesa vegetal e farmacologia.

SILVA, Rayanne Farias da. Análise histológica de tecidos cultivados in vitro de plantas laticíferas, perfil de proteínas solúveis e ação contra fitopatógenos. 2015. 121 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. Laticifers plants have been studied by presenting a wide range of proteins related to plant defense in its latex. The aim of this study was to investigate, in tissue cultured in vitro, proteins and activities described for latex laticíferas two species. Tissue callus and roots of Cryptostegia grandiflora were obtained by in vitro tissues culture protocols and subjected to histological analysis for laticifers characterization. Cultured tissue of Calotropis procera were used as comparative reference in the analysis. There wasn’t any laticifer structure in callus or roots of C. grandiflora while in C. procera laticifers are formed in the roots. Soluble proteins were extracted from the cultured tissue and characterized using enzymatic assays, biochemical, immunological techniques and mass spectrometry. The presence of activity against phytopathogenic fungi was investigated and all data obtained were compared with the previously one determined for the plants studied latex. Callus and roots proteins of C. procera showed antifungal activity against pathogenic fungi. The percentage inhibition of the vegetative hyphae growth in the presence of callus and roots C. procera protein respectively were 75.5% and 82.6% for Fusarium solani, 76.7% and 57.1% for Rhizoctonia solani, 88.8% and 79.8% for Fusarium oxysporum, 93.7% and 90.2% for Colletotrichum lindemuthianum and 80.2% and 79.7% for Colletotrichum gloesporioides, however, showed no effect on Mucor sp. Callus and roots proteins of C. grandiflora showed no inhibitory effect on the hyphae growth or spores germination of assayed fungi. Through assays using fluorescent markers, it was demonstrated that proteins extracted from in vitro culture of C. procera interact with the membrane of C. gloesporioides causing leakage of cytoplasmic contents, possibly suggesting that its mechanism of action against fungi is related to the change in plasma membrane permeability. Also oxidative stress was observed in C. gloesporioides spores treated with callus and roots protein C. procera by hydrogen peroxide production. Protease inhibitors, chitinases, osmotins and proteases were detected in the C. procera callus and roots samples, however, osmotins and proteases were not observed in C. grandiflora callus and roots. The activity of antioxidant enzymes APX, G-POD and catalase were observed in tissue cultured in vitro of C. grandiflora. Considering that C. grandiflora laticifers proteases were demonstrated exert action against fungi, the results observed in this study suggest that the absence of antifungal activity in C. grandiflora cultured tissue is due to the absence of proteases in these tissues as well exclude chitinases and proteases inhibitors as antifungal proteins. The study concludes that the use of cultured tissues that do not differentiate laticifers is an interesting model to study activities associated to proteins founded in latex. Antifungal proteases present in C. grandiflora latex were not found in the tissues without laticifer formation. Plantas laticíferas têm sido estudadas por apresentarem uma grande diversidade de proteínas relacionadas à defesa vegetal em seu látex. O objetivo deste trabalho foi pesquisar em tecidos cultivados in vitro, proteínas e atividades descritas para o látex de duas espécies laticíferas. Tecidos de calos e raízes de Cryptostegia grandiflora foram obtidos através de protocolos de cultura in vitro de tecidos e submetidos à análise histológica para caracterização de laticíferos. Tecidos cultivados de Calotropis procera foram utilizados como referencial comparativo nas análises. Não foi detectada qualquer estrutura laticífera em calos ou raízes de C. grandiflora enquanto que em C. procera laticíferos se formam nas raízes. Proteínas solúveis foram extraídas dos tecidos cultivados e caracterizadas por meio de ensaios enzimáticos, técnicas bioquímicas, imunológicas e espectrometria de massas. A presença de atividade contra fungos fitopatogênicos foi investigada e todos os dados obtidos foram comparados com dados previamente determinados para os látex das espécies estudadas. Proteínas dos calos e raízes de C. procera, apresentaram atividade antifúngica sobre fungos fitopatogênicos. Os percentuais de inibição do crescimento vegetativo de hifas na presença de proteínas de calos e raízes de C. procera, respectivamente, foram: 75,5% e 82,6% para Fusarium solani, 76,7% e 57,1% para Rhizoctonia solani, 88,8% e 79,8% para Fusarium oxysporum, 93,7% e 90,2% para Colletotrichum lindemuthianum e 80,2% e 79,7% para Colletotrichum gloesporioides, no entanto, não demonstraram nenhum efeito sobre Mucor sp. As proteínas de calos e raízes de C. grandiflora não apresentaram qualquer efeito inibitório sobre o crescimento de hifas ou germinação de esporos dos fungos avaliados. Por meio de ensaios com marcadores de fluorescência, foi possível demonstrar que as proteínas extraídas da cultura in vitro de C. procera interagem com a membrana de C. gloesporioides causando extravasamento do conteúdo citoplasmático, sugerindo que possivelmente seu mecanismo de ação contra fungos esteja relacionado à alteração na permeabilidade da membrana plasmática. Também foi observado estresse oxidativo em esporos de C. gloesporioides tratados com proteínas de calos e raízes de C. procera através da produção de peróxido de hidrogênio. Inibidores de proteases, quitinases, osmotinas e proteases foram detectados nas amostras de calos e raízes de C. procera, porém, osmotinas e proteases não foram observadas em calos e raízes de C. grandiflora. A atividade das enzimas antioxidantes APX, G-POD e catalase foram observadas nos tecidos cultivados in vitro de C. grandiflora. Considerando que proteases laticíferas de C. grandiflora foram demonstradas exercer ação contra fungos, os resultados observados nesta pesquisa sugerem que a ausência de atividade antifúngica em tecidos cultivados de C. grandiflora deve-se a ausência de proteases nestes tecidos e ainda excluem quitinases e inibidores de proteases presentes como proteínas antifúngicas. Em calos e raízes de C. procera, além de proteases, outras proteínas tais como, quitinases, inibidores de proteases e osmotinas detectadas podem estar envolvidas na atividade antifúngica observada, e/ou agir sinergicamente na defesa contra fungos. O estudo conclui que o uso de tecidos cultivados que não diferenciam laticíferos é um interessante modelo para estudar atividades associadas às proteínas encontradas no látex. Proteases antifúngicas presentes no látex de C. grandiflora não foram encontradas nos tecidos sem formação laticífera.

SOUZA, Isabel Cristina da Cósta. Caracterização bioquímica de calos de espécies laticíferas em resposta ao estresse salino e análise da transcrição de osmotinas. 2015. 107 f. Dissertação (mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora are laticiferous plants. It was found osmotin protein. The literature shows that the osmotinas are associated to plant defence mechanisms in situations of biotic or abiotic stress. However, there are still several inconsistencies in this hypothesis. In this context, it was used in vitro tissue culture techniques as model to assist in the understanding of how the C. procera and C. grandiflora callus cells respond to salt stress in biochemical terms, and whether the transcripts level for osmotin has raised in response to exposure to NaCl. It was added NaCl to the culture medium of Murashige e Skoog (MS) in increasing concentrations (0, 20, 40, 60 e 80 mM). The results show that callus treated with 80 mM NaCl have reduced the growth and the humidity percentage of respectively 33% and 10% in C. procera and 83% and 39% in C. grandiflora compared to the control treatment callus. Under the same conditions, it was seen an increase in ions concentrations of Na+ and Cl-, 98.9% and 98% in C. procera and 98.8% and 96% in C. grandiflora respectively. It was also seen a reduction in K+ level in callus treated with 80 mM NaCl, 43% in C. procera and 18% in C. Grandiflora, when compared to the control. The callus treated with 80 mM NaCl, showed a tendency of the proline accumulation and soluble sugars, increasing 26% and 37% in C. procera callus and 55.4% and 45% in C. grandiflora callus, respectively, when compared to control conditions. The increase in the activity of enzymes that break H2O2 has been observed in C. grandiflora callus under the salt stress, suggesting a possible oxidative damage, this increase was 73% in the ascorbate peroxidase activity and 62% in guaiacol peroxidase activity when compared to the activity of enzymes of the control callus with the treaty in 80 mM NaCl. None connection was seen between changes in the activity of the enzymes of the oxidative system and the salt stress in C. procera callus. It was evaluated the behaviour of osmotin in the osmotin transcription at 0, 2, 12, 24, 48 hours and at 4, 7, 14, 28 days of callus contact under stress. The osmotin transcripts were observed from 12 hours of contact of callus in 80mM NaCl in both species. However, it was not found osmotin by electrophoresis assays, dot blotting and mass spectrometry in the protein extracts of C. procera and C. grandiflora callus grown in control conditions and in 80 mM NaCl. Thus, the salt stress evaluation using in vitro cell model study was effective, providing cellular behaviour information for these two laticifers plants species showing their physiological, biochemical and molecular changes. The results suggest that the induced salt stress has favoured the increase of osmotin gene expression in both cases and suggests a possible relationship between osmotin of these species with the protection to salinity conditions. The failure to detect the proteins corresponding to genes provides the conception of several new hypotheses to be validated. Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora são plantas laticíferas. Em seus fluidos laticíferos, foram encontradas proteínas do tipo osmotina. A literatura reporta que osmotinas são proteínas relacionadas com mecanismos de defesa vegetal em situações de estresse biótico e/ou abiótico. Entretanto, ainda há várias inconsistências nessa afirmação. Nesse contexto, técnicas in vitro de cultura de tecidos vegetais foram aplicadas como modelo para auxiliar na compreensão de como as células de calos de C. procera e C. grandiflora respondem ao estresse salino, em termos bioquímicos, e se o nível de transcritos para a osmotina seria aumentado em resposta à exposição a NaCl. Para indução desse estresse, NaCl foi adicionado à formulação nutritiva de Murashige e Skoog (MS), em concentrações crescentes (0, 20, 40, 60 e 80 mM). Os resultados mostram que os calos cultivados com NaCl a 80 mM tiveram o crescimento e o teor de umidade reduzidos, respectivamente, em 33% e 10%, em C. procera e de 83% e 39%, em C. grandiflora, em comparação ao seu tratamento controle. Nessas mesmas condições, foi observado um aumento nas concentrações dos íons Na+ e Cl- de, respectivamente, 98,9% e 98%, em C. procera, e de 98,8% e 96%, em C. grandiflora. Foi também observada diminuição no teor de K+ nos calos tratados com NaCl a 80 mM. Essa redução foi de 43%, em C. procera, e de 18% em C. grandiflora, quando comparado ao tratamento controle. Os calos tratados com NaCl a 80 mM, apresentaram uma tendência de acúmulo de prolina e açúcares solúveis, alcançando, respectivamente valores, 26% e 37% maiores em calos de C. procera, e 55,4% e 45% maiores, em calos de C. grandiflora, que aqueles em condições controle. O aumento na atividade das enzimas que degradam H2O2 foi observado em calos de C. grandiflora submetidos a estresse salino, sugerindo um possível dano oxidativo. Esse aumento foi de 73%, para a ascorbato peroxidase, e de 62% para a peroxidase do guaiacol, nos calos tratados com NaCl a 80 mM, em relação ao controle. Não foi observada qualquer alteração significante na atividade das enzimas do sistema antioxidativo em razão do estresse salino em calos de C. procera. Em relação à transcrição da osmotina, foi avaliado o perfil de seus transcritos nos intervalos de tempo de 0, 2, 12, 24, 48 horas e de 4, 7, 14 e 28 dias sob estresse. Os transcritos de osmotina foram observados a partir de 12 horas de contato dos calos com NaCl a 80 mM, em ambas as espécies. Contudo, nos extratos proteicos dos calos de C. procera e C. grandiflora cultivados em condições controle e de 80 mM de NaCl, não foi detectada a presença da proteína osmotina quando avaliado pelos ensaios de eletroforese, Dot blotting e espectrometria de massas. Assim, a avaliação do estresse salino utilizando como modelo de estudo células in vitro foi eficiente, fornecendo informações do comportamento celular de duas espécies laticíferas, mostrando suas alterações fisiológicas, bioquímicas e moleculares. Os resultados sugerem que o estresse salino favoreceu o aumento da transcrição do gene da osmotina em calos das duas espécies em estudo e permite propor uma possível relação das osmotinas dessas espécies com a tolerância à salinidade. A falha em detectar as proteínas correspondentes aos genes propicia a concepção de várias novas hipóteses a serem validadas.

SILVA, Maria Zelandia Rocha. Isolamento em cromatografia de imunoafinidade e atividade antifúngica de osmotinas de fluidos laticíferos. 2015. 85 f. Dissertação (Mestrado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2015. Plants are constantly exposed to a variety of stresses conditions. However, they react to biotic stresses by triggering a set of defense mechanisms including the synthesis of defensive substances as the pathogenesis-related (PR) proteins. The PR-protein named osmotin can be induced under osmotic stress and water shortage conditions. Osmotin-like proteins have been purified from latex and some of them are related to antifungal activity. The aim of this study was to investigate the osmotin in the following species laticifers: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus and C. papaya to isolate and evaluate its antifungal activities. Immunoaffinity column chromatography with anti-CpOsm antibodies were performed in order to purify these osmotin-like. They were detected in latex of C. grandiflora and P. rubra by immunoassays the ELISA, Dot Blot and Western Blot using anti-CpOsm antibody (the osmotin of C. procera latex). Osmotin of C. procera, C. grandiflora, P. rubra and H. drasticus were identified by mass spectrometry. However, the osmotin from C. procera was co-purified with cysteine proteases. The co-purified cysteine protease from C. procera was identified as Procerain B. The alignment and the 3-D structure analysis of Procerain B and CpOsm revealed the presence of a similar sequence in both proteins. This sequence might be an epitope which allows the anti-antibody recognition. The osmotin from C. grandiflora, and P. rubra did not show antifungal activity against Fusarium solani and Colletotrichum gloesporioides. Since no correlation between the antifungal activity and the presence of these osmotins were found, the proteolytic activities of these latex protein fractions were evaluated in order to correlate with the antifungal activity C. procera and C. grandiflora showed a strong proteolytic activity. In latex, the cysteine proteases are more often related to antifungal activity than osmotin, which might explain, at least in part, the antifungal activity performed by C. grandifora and not for its osmotin. Further studies on the role of osmotin in physiology laticifers plants are needed. As plantas estão constantemente sujeitas a diversos tipos de estresse, tanto bióticos como abióticos, resultando em respostas de defesa. Decorrente disto, os vegetais sintetizam certas proteínas denominadas de proteínas relacionadas à patogênese (PR proteína). As Pr-proteínas chamadas de osmotinas podem ser induzidas sob condições de estresse osmótico, frio e escassez de água. Osmotinas tem sido purificadas de fluidos laticíferos e algumas delas estão relacionadas com a atividade antifúngica. O objetivo do presente trabalho foi prospectar osmotinas, bem como isolá- las e avaliar suas atividades antifúngicas, nos fluidos laticíferos das seguintes espécies: C. grandiflora, P. rubra, T. peruviana, H. drasticus e C. papaya. Nos látex de C. grandiflora e P. rubra foram detectadas osmotinas através de imunoensaios em placa de ELISA, Dot Blot e Westen Blot, utilizando os anticorpos anti-CpOsm (osmotina do látex de C. procera). Cromatografia de imunoafinidade em coluna com anticorpos anti-CpOsm foram realizadas com o intuito de purificar estas osmotinas. Análises por meio de espectrometria de massas, revelaram a presença de osmotina em C. procera, C. grandiflora, P. rubra e H. drasticus. No entanto, a osmotina de C. procera foram co-purificadas com proteases cisteínicas. A protease cisteínica co- purificada no látex de C. procera foi identificada como Proceraina B. O alinhamento e a análise da estrutura tridimensional da Proceraina B e CpOsm revelaram a presença de uma sequência semelhante em ambas as proteínas, que pode ser um epítopo disponível ao reconhecimento do anticorpo anti-CpOsm. As osmotinas isoladas de C. grandiflora e P. rubra não apresentaram atividade antifúngica contra F. solani e C. gloesporioides. Desde que não houve correlação entre a atividade antifúngica e à presença destas osmotinas, as atividades proteolíticas das frações proteicas foram avaliadas a fim de correlaciona-las à atividade antifúngica. Nos fluidos laticíferos, as proteases cisteínicas estão mais frequentemente relacionadas à atividade antifúngica do que as osmotinas. Estudos mais aprofundados sobre a função das osmotinas na fisiologia de plantas laticíferas são necessários.

Infectious diseases are a leading cause of death throughout the world. Among these, bacterial infections stand out due to the enormous diversity of bacteria and their evolutionary and adaptive abilities. Inappropriate inflammatory responses have been associated with these infections and despite contemporaneous scientific approaches, timely diagnosis and proper treatment of systemic bacterial infection are still a challenge for public health. Thus, this study evaluated the ability of Canavalia brasiliensis (ConBr) and Cratylia argentea (CFL) lectin in modulating systemic inflammation caused by Salmonella enterica serovar Typhimurium. The lectins were purified by affinity chromatography on Sephadex G50. Toxicology and the pharmacological security of lectins was evaluated. Both lectins exhibited no toxicity up to 2000 mg/kg. Mice were inoculated intraperitoneally with lectins (10 mg/kg) within 72, 48 and 24 h before infection with Salmonella (107 CFU/mL). Animals treated with ConBr and CFL, respectively, showed 100% and 90% survival, seven days after infection. This protocol significantly reduced the bacteria in blood, peritoneal fluid and in main organs such as liver and spleen. It was also observed a reversal of the neutrophil migration failure, leukopenia, as well as reduction of cytokine levels (TNF- α, IL- 1 and IL -10) and nitric oxide on the serum. In addition, elevated peritoneal fluid concentration of nitric oxide and increase in the number of platelets were found. In vitro analyzes identified that both lectins did not exhibit antibacterial activity, can decrease the time of activation of complement system and increase intrinsic and extrinsic clotting time. Lectins had no curative effect when administered after infection and none protective effect when inoculated either intravenously or orally. Through proteomic analysis, proteins related to infection and to modulating action of lectins were identified. According to our results, we found that lectins can act on macrophages/monocytes, controlling their activation and thereby influencing the inflammatory process, protecting the animals from septic shock. These results represent an interesting approach for the control of infections, using lectins independently or associated with antibiotics whose action is directly on microorganisms. Doenças infecciosas constituem a principal causa de morte em todo o mundo. Dentre estas, as causadas por infecções bacterianas se destacam devido à diversidade de bactérias e à sua capacidade evolutiva e adaptativa. Respostas inflamatórias inadequadas estão associadas a essas infecções e em detrimento de avanços científicos, o diagnóstico precoce e o tratamento de quadros de infecções bacterianas sistêmicas permanecem um desafio à saúde pública. Neste contexto, este estudo avaliou a capacidade da lectina de Canavalia brasiliensis (ConBr) e Cratylia argentea (CFL) em modular a inflamação sistêmica causada por Salmonella enterica sorotipo Typhimurium. As lectinas foram purificadas por cromatografia de afinidade em coluna de Sephadex G-50 e ensaios de avaliação toxicológica e segurança farmacológica foram realizados. Ambas as lectinas não demonstraram toxicidade até a máxima dose de 2000 mg/kg. Então, camundongos foram inoculados, por via intraperitoneal, com as lectinas (10 mg/kg), 72, 48 e 24 horas antes de serem infectados com a Salmonella (107 UFC/mL). Foi observada uma sobrevida de 100% e 90% dos animais tratados com a ConBr e CFL, respectivamente, avaliados no sétimo dia. Este protocolo reduziu significativamente o número de bactérias no sangue, fluído peritoneal e nos principais órgãos da infecção (baço e fígado). Foi observado ainda reversão da falência na migração de neutrófilos, leucopenia, bem como, redução nos níveis de citocinas (TNF-α, IL-1 e IL-10) e óxido nítrico no soro. Foi também verificado um aumento na concentração de óxido nítrico no fluido peritoneal e do número de plaquetas no sangue. Análises in vitro mostraram que ambas as lectinas não apresentam atividade bactericida, reduzem o tempo de ativação do sistema complemento e aumentam o tempo de coagulação intrínseca e extrínseca. As lectinas não apresentaram efeito curativo quando administradas após a infecção e não demonstraram efeito preventivo quando inoculadas por via endovenosa ou oral. Através da análise proteômica, proteínas relacionadas à infecção e à ação moduladora das lectinas foram identificadas. Assim, as lectinas possivelmente atuam sobre os macrófagos/monócitos, controlando sua ativação, e desta forma, atenuando o processo inflamatório e protegendo os animais do choque séptico. Estes resultados representam uma interessante perspectiva para o controle de infecções, com uso independente ou associado a antibióticos de ação direta sobre microrganismos

Several plant species produce a fluid with milky aspect called latex, which is synthesized and stored under pressure in a system of channels formed by specialized cells termed laticifers. Latex is an emulsion of many kind of substances suspended in aqueous media. Many studies have suggested that latex compounds are involved in plant defense. Here, we describe the purification, cDNA cloning and molecular modeling of an osmotin (CgOsm) from Crytostegia grandiflora latex. Osmotin of C. grandiflora, named CgOsm, was purified by using a simple protocol consisting cation exchange chromatography on MonoS column coupled to FPLC system. The protein purity was confirmed by mass spectrometry. Total RNA was isolated from young leaves of C. grandiflora by Concert (Invitrogen) method. The yield and purity of RNA was determined spectrophotometrically and the quality of RNA was tested on 1% agarose gel. The first strand of cDNA was synthesized by the process of reverse transcription standard. The second strand of cDNA and then subsequent amplification of CgOsm cDNA was performed using forward primer (based on first seven N-terminal amino acid of CgOsm) and oligo dT as reverse primer. The PCR products were subcloned into pGEM-T vector and then introduced into Escherichia coli cloning host TOP10F'. The recombinant plasmids were purified from transformed bacterial cell and submitted to DNA sequencing. The 3D model of CgOsm was constructed using SWISS-MODEL program by homology modeling using X-ray crystal structure of act d 2 (PDB ID: 4BCT). Model quality was evaluated by MolProbity server. The computational analysis of the deduced sequence of CgOsm shown that it is an protein of apparent molecular weight about 21.966 Da and isoelectric point of 8.1. The complete structure of CgOsm is composed of three domains: domain I consists of 11 beta-strands, arranged in the shape of a beta-sandwich, domain II consists of several loops extending from domain I and stabilized by four disulfide bonds and domain III consists of a small loop with two disulfide bonds. MolProbity analysis revealed that 96.5% residues were present in most favored region. In silico analysis revealed that the structural segments of CgOsm show similarity with folding adiponectin, a human protein hormone synthesized by adipocytes whose action has implications in obesity, type II diabetes, cardiovascular disease and atherosclerosis. Tests have demonstrated that modeling CgOsm could interact with the adiponectin receptor, fact that leads to the hypothesis that CgOsm could mimic activities of human adiponectin. Thus, the results described in this study show a perspective to be explored about the pharmacological potential of this protein Diversas plantas produzem um fluido de aspecto leitoso denominado de látex, que é sintetizado e armazenado sob pressão em sistemas de canais formados por células especializadas, os laticíferos. A mais atrativa e estudada hipótese sobre a relevância biológica dos laticíferos sugere que estes participem ativamente da defesa vegetal. Partindo desta Tese, aspectos bioquímicos e moleculares foram estudados no látex da planta Cryptostegia grandiflora. É descrita a purificação e caracterização molecular de uma proteína do látex cuja identificação sugeriu ser uma osmotina e por isto foi designada como CgOsm. CgOsm foi purificada por meio de cromatografia de troca catiônica em coluna MonoS acoplado ao sistema de FPLC. A pureza e a identificação da proteína foi avaliada por SDS-PAGE, sequência NH2-terminal e espectrometria de massas. O RNA mensageiro total de C. grandiflora foi isolado, purificado e usado para a síntese da primeira fita do cDNA através de PCR. A segunda fita de cDNA foi amplificada utilizando iniciadores degenerados e o produto com aproximadamente 600 pb foi subclonado no vetor pGEN-T easy e introduzido em Escherichia coli eletrocompetentes. Os plasmídeos recombinantes foram purificados e sequenciados. A sequência de aminoácidos deduzida revelou alta identidade com osmotinas de Heliathus annuus e Piper columbrinum. O modelo da estrutura tridimensional da CgOsm deduzida foi realizada por modelagem por homologia utilizando a estrutura da act d2 (PDB: 4BCT) resolvida por raio X. CgOsm é composta por três domínios: domínio I consiste de 11 folhas beta, formando uma conformação do tipo beta sanduiche; domínio II é formado por diversos loops que se estendem até o domínio I e o domínio III consiste de um pequeno loop. Analise in silico revelou que a CgOsm possui seguimentos estruturais com estrutura similar a adiponectina, um hormônio proteico humano sintetizado pelos adipócitos cuja ação tem implicações na obesidade, diabetes do tipo II, doenças cardiovasculares e ateroscleroses. Ensaios de modelagem demonstraram que CgOsm poderia interagir com o receptor de adiponectina favoravelmente, fato que conduz a hipótese de que CgOsm poderia mimetizar atividades da adiponectina humana. Assim, os resultados descritos neste trabalho apontam uma perspectiva a ser explorada sobre os potenciais farmacológicos desta proteína.

An increasing number of peptides isolated from a range of tissue plants have highlighted these molecules as a potential study target. Those peptides demonstrate a large functional variety and, therefore, have been frequently described in the scientific literature of the last years. The present work reports a molecular prospecting and functional characterization of plant "short-peptides". Initially, the Calotropis procera latex was partitioned into five fractions: hexane (49.4%), dichloromethane (5.2%), ethyl acetate (2.0%), butanol (2.1%) and aqueous (41.1%) (Chapter 1). The phytochemical profile and the spectroscopic analysis showed that the dichloromethane fraction was chemically the most heterogeneous. The dichloromethane and ethyl acetate fractions showed in vitro cytotoxicity against tumor cell lines (LD50 ranging from 0.05 to 3.9 mg/mL) and in vivo citotoxity against the crustacean Artemia salina (LD50 ranging from 10.9 to 65.7 mg/mL). These same fractions showed anti-inflammatory activity in carrageenan-induced peritonitis model in rats, associated to an inhibition of neutrophil migration for the dichloromethane (67%) and ethyl acetate (56%) fractions. A positive reaction with tolidine and ninhydrin suggests the presence of cyclopeptides in the bioactive ethyl acetate fraction. In Chapter 2, twenty primary sequences of peptides derived from the 1 fraction of Jatropha curcas seeds were deduced by de novo sequencing and confirmed by searches against genomic Jatropha database. The comparison of MS/MS fragmentation patterns between the doubly charged ion (671.79 m/z) found in fractions 1 and PII-C and its analogue synthetic peptide has shown that the use of additional analytical steps for the identification and characterization of these peptides would be not necessary. The BlastP search tool showed that the sequence APTLSGGSVPRDAD is homologous to and it is inserted into the conserved domain of the late embryogenesis protein (LEA_6). In Chapter 3, the two analogues synthetic peptides, linear (1342.44 g/mol) and cyclic (1324.44 g/mol), obtained by solid phase synthesis, showed differences that characterize their arrangement when compared to the pattern fragmentation by MS/MS and ion mobility. The net charge and the retention time had similar physicochemical parameters in both peptides. Dichroism circular studies showed the presence of a disordered state to both peptides. The biological assays of peptides showed no apparent signs of functional activity, however this fact do not exclude the possibility to test additional biological models. The results arising from this study generate new prospects and provide a basis for further work aiming the isolation and characterization of peptides in C. procera and J. curcas species. Um número crescente de peptídeos isolados a partir dos mais diversos tecidos vegetais tem destacado essas moléculas como alvo potencial de estudo. Estes peptídeos apresentam uma grande diversidade funcional e, por isso, vem sendo descritos frequentemente na literatura científica dos últimos anos. No presente trabalho são relatadas a prospecção molecular e caracterização funcional de “short-peptides” vegetais. Inicialmente, o látex de Calotropis procera foi particionado, gerando cinco frações: hexânica (49,4%), diclorometano (5,2%), acetato de etila (2,0%), butanólica (2,1%) e aquosa (41,1%) (Capítulo 1). O perfil fitoquímico e as análises espectroscópicas mostraram que a fração diclorometano foi quimicamente a mais heterogênea. As frações diclorometano e acetato de etila apresentaram toxicidade in vitro contra linhagens de células tumorais (DL50 variando de 0,05 a 3,9 µg/mL) e, in vivo, contra o crustáceo Artemia salina (DL50 variando de 10,9 a 65,7 µg/mL). Estas mesmas frações apresentaram atividade antiinflamatória no modelo de peritonite induzida por carragenana em ratos, associadas a uma inibição da migração de neutrófilos de 67% (diclorometano) e 56% (acetato de etila). A reação positiva com tolidina e ninidrina sugere a presença de ciclopeptídeos na fração bioativa acetato de etila. No Capítulo 2, vinte e uma sequências primárias de peptídeos, oriundas da fração 1 de sementes de Jatropha curcas, foram deduzidas por meio de sequenciamento de novo e confirmadas através de buscas contra um banco de dados genômico de Jatropha. A comparação do padrão de fragmentação por MS/MS entre o íon duplamente carregado de m/z de 671,79, presente nas frações 1 e PII-C, e um peptídeo sintético, análogo àquele, mostrou que o uso de passos analíticos adicionais para a identificação e caracterização destes peptídeos não seria necessário. A ferramenta de busca BlastP mostrou que a sequência APTLSGGSVPRDAD apresenta homologia e está inserida no domínio conservado das proteínas de embriogênese tardia (LEA_6). No Capítulo 3, os dois peptídeos sintéticos análogos, linear (1342,44 g/mol) e cíclico (1324,44 g/mol), obtidos por síntese química em fase sólida, mostraram diferenças que caracterizam seus arranjos, quando comparados pelo padrão de fragmentação por MS/MS e mobilidade iônica. O estado de carga e o tempo de retenção foram similares, do ponto de vista físico-químico. Os estudos de dicroísmo circular mostraram a presença de um estado desordenado para os peptídeos. Os ensaios biológicos com os peptídeos não revelam sinais aparentes de atividade funcional, porém não se pode descartar a possibilidade de que modelos biológicos adicionais sejam testados. Os resultados advindos deste estudo geram novas perspectivas e servem de base para a realização de trabalhos subsequentes que tratem do isolamento e caracterização de peptídeos nas espécies Calotropis procera e Jatropha curcas.

PEREIRA, D. A. Proteases e inibidores de proteases em látex vegetal e intestino de lagartas: aspectos sobre resistência e suscetibilidade das plantas alvo. 2014. 116 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2014. Plant latex is produced and stored in channels formed by highly specialized cells structures. A remarkable feature of these fluids is the presence of complex proteolytic systems. Many studies report that latex possesses a variety of defense proteins against insects and fungi. However, some insects overlap this defense and feed on latex-producing plants, for example Pseudosphinx tetrio and Danaus plexippus, both of the order Lepidoptera. The biochemical aspects of insect resistance to latex defense proteins are still not widely elucidated. This issue was addressed in this work. Initially, the proteolytic activity of Pseudosphinx tetrio gut was characterized and evaluated in its ability to degrade latex proteins of its host plant (Plumeria rubra) and non-host plants (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Furthermore, we assessed whether protease inhibitors from latex fluids (C. procera, P. rubra and Cr. grandiflora) inhibit intestinal proteases from P. tetrio and D. plexippus and vice versa. The effect of latex enzymes on peritrophic membrane (PM) of D. plexippus was also assessed. Intestinal proteases from P. tetrio are predominantly of serine type and their activities are higher in basic pHs. P. tetrio gut proteases rapidly and completely digested latex proteins of its host plant and C. procera and partially digested proteins from Cr. grandiflora. D. plexippus larvae were not affected when fed on artificial diet containing latex proteins (1%) from non-host plants. In vitro assays detected serine and cysteine peptidase inhibitors in both gut homogenates and latex fluids. Protease inhibitors from latex inhibited the proteolytic activity of gut homogenates of both larvae. Nevertheless, in vivo analysis demonstrated that latex inhibitors do not affect the development of D. plexippus. Only the gut homogenate from D. plexippus showed inhibitory activity towards proteases latex from its host plant (Calotropis procera). Slight changes were observed in the protein profile of the PMs from D. plexippus subjected to latex protein fractions in vivo, whilst in vitro treatment resulted in more severe damage. This study concludes that proteolysis and inhibition of proteolysis are involved in the defensive systems of both caterpillars and their host plants. Even though latex peptidase inhibitors inhibit gut peptidases (in vitro), the ability of gut peptidases to promptly digest latex proteins (in vivo) regardless of their origin seems to be a pivotal event favoring caterpillars overcoming plant defense. O látex vegetal é produzido e estocado em sistemas de canais formados por células altamente especializadas, os laticíferos. Uma característica marcante destes fluidos é a presença de sistemas proteolíticos complexos. Muitos estudos relatam que proteínas de defesa contra insetos e fungos são encontradas em látex. No entanto, alguns insetos sobrepõem esta defesa e alimentam-se de plantas laticíferas, como Pseudosphinx tetrio e Danaus plexippus, ambas da ordem Lepidoptera. As bases bioquímicas da resistência de insetos às proteínas defensivas do látex ainda não são amplamente elucidadas. Esta problemática foi abordada neste trabalho. Inicialmente a atividade proteolítica do extrato intestinal de P. tetrio foi caracterizada e avaliada sua capacidade de degradar as proteínas do látex de sua planta hospedeira, Plumeria rubra, bem como de plantas laticíferas não hospedeiras (Calotropis procera e Cryptostegia grandiflora). Além disso, foi avaliado se inibidores de proteases de fluidos laticíferos (C. procera, P. rubra e Cr. grandiflora) inibem as proteases intestinais de P. tetrio e D. plexippus e vice-versa. Em adição, foi analisado o efeito de enzimas laticíferas sobre a membrana peritrófica (MP) de D. plexippus. As proteases intestinais de P. tetrio são predominantemente do tipo serínica e suas atividades são maiores em pHs básicos. O extrato intestinal de P. tetrio rapidamente e completamente digeriu as proteínas do látex de sua planta hospedeira e de C. procera, bem como digeriu parcialmente as proteínas do látex de Cr. grandiflora. Larvas de D. plexippus se desenvolveram plenamente quando alimentadas com dieta artificial contendo 1% das frações proteicas dos látex de plantas não hospedeiras. Ensaios in vitro indicaram que ambos, extratos intestinais e látex das espécies em estudo, possuem inibidores de proteases serínicas e cisteínicas. Inibidores provenientes dos fluidos laticíferos em estudo inibiram a atividade proteolítica dos extratos intestinais de ambas as larvas. Entretanto, análise in vivo demonstrou que estes inibidores não afetam o desenvolvimento de D. plexippus. Somente o extrato intestinal de D. plexippus apresentou atividade inibidora de proteases do látex de sua planta hospedeira (Calotropis procera). Apenas discretas mudanças foram observadas no perfil proteico das MPs de D. plexippus submetidas às frações proteicas dos fluidos laticíferos in vivo, enquanto que o tratamento in vitro resultou em danos mais acentuados. A partir dos resultados obtidos conclui-se que proteólise e a inibição de proteólise fazem parte do sistema defensivo das larvas especialistas em plantas laticíferas e de suas plantas hospedeiras. Embora inibidores de proteases de fluidos laticíferos sejam capazes de inibir as proteases intestinais das larvas (in vitro), in vivo, a habilidade das proteases intestinais em prontamente digerir as proteínas do látex parece ser crucial para a sobreposição da defesa vegetal.

Himatanthus drasticus (Apocynaceae) is traditionally used in folk medicine in Northeastern Brazil. The plant is wildly distribuited from Guianas until Southeast Brazil. Latex obtained by cutting its stem bark is mixed with water and extensively sold in public markets. People use Janaguba milk (“Leite de Janaguba”- LJ) to treat or prevent different inflammatory disorders such as gastritis, ulcers as well as cancer, among other uses. Despite, there is not enough scientific data confirming these pharmacological properties. In this work, Janaguba milk was preliminarily investigated in an attempt to validate its anti- inflammatory activity. Its major protein fraction (HdLP) was assessed for the presence of anti- inflammatory, anti-nociceptive and toxicological effects. LJ inhibited the inflammatory response induced by carrageenan in rats (98%, p < 0.05), whereas HdLP did it independent of the route of administration. HdLP significantly reduced the infiltration of neutrophils into the peritoneal cavity (96%, p < 0.05) concomitant with increased nitric oxide synthesis in plasma and decrease of pro-inflammatory cytokines IL- 1 and TNF-α in peritoneal fluid. This fraction also prevented vacuolization and Kupfer cell hyperplasia caused by carrageenan in liver. Further, the anti-inflammatory properties were shown to be associated with the protein fraction of LJ. HdLP exhibited anti-inflammation, even after heat-treatment (100 C, 30 min) or proteolysis. Moreover, a pro-inflammatory effect was observed after HdLP treatment. It also suppressed abdominal constrictions in acetic acid-treated mice and reduced paw licking induced by formalin, both in a dose-dependent manner. An acute toxicological evaluation demonstrated no toxic effects after 14 days from LJ and HdLP administration by oral route even when high doses were tested. A qualitative phytochemical analysis showed the absence of lupeol and presence of saponinas, tannins and free steroids in HdLP. However, pharmacological properties are probably not related to them. It is therefore concluded that the latex of Himatanthus drasticus exhibits both the anti-inflammatory and anti-nociceptive activities claimed by its users. The protein fraction of the latex is an important contributor to the pharmacological properties of LJ. Resistance to heat and proteolytic treatment can explain the effectiveness of HdLP even when administered orally. The absence of toxic effects by oral route confirms the potential use of this plant as a phytotherapic agent. Himatanthus drasticus (Apocynaceae) é uma espécie tradicionalmente utilizada na medicina popular da região nordeste deste país. Sua distribuição ocorre das Guianas ao sudeste do Brasil. O látex desta planta é obtido após uma injúria no caule e amplamente comercializado em mercados públicos. As pessoas ingerem o látex, conhecido como Leite de Janaguba (LJ), para o tratamento e/ou prevenção de diferentes doenças inflamatórias, gastrite, úlcera, câncer, entre outras. Apesar das diversas informações oriundas da medicina popular, não existem relatos científicos suficientes confirmando tais propriedades farmacológicas. Neste trabalho, LJ foi investigado com o propósito de validar sua tão popularmente relatada atividade anti-inflamatória. A fração proteica deste látex (HdLP) também foi investigada quanto à presença de atividades anti-inflamatória, antinociceptiva, além de seus efeitos toxicológicos. LJ inibiu a resposta inflamatória induzida por carragenina em ratos (98%, p < 0.05), assim como o fez a fração HdLP, independente da rota de administração. HdLP reduziu a infiltração de neutrófilos na cavidade peritoneal (96%, p < 0.05). Paralelamente a isto, ocorreu o aumento da síntese de óxido nítrico no plasma e a redução de citocinas pró-inflamatórias (IL-1 e TNF-α) no fluido peritonal. Esta fração também preveniu a vacuolização e hiperplasia das células de Kupfer, causadas pelo efeito da carragenina no fígado. Atividade anti-inflamatória está provavelmente associada com a fração proteica de LJ. HdLP exibiu um efeito anti-inflamatório mesmo após aquecimento (100 C, 30 minutos) ou proteólise. Além desta atividade, um efeito pró-inflamatório foi observado após o tratamento com HdLP. Esta também suprimiu contrações abdominais induzidas por ácido acético e reduziu a lambedura de pata induzida por formalina, ambos de maneira dose-dependente. A avaliação da toxicidade aguda demonstrou a ausência de efeitos tóxicos após tratamento com LJ e HdLP (v.o.) mesmo utilizando doses 5000 vezes maiores que as recomendadas. Uma dosagem qualitativa de fitoquímicos em HdLP mostrou a ausência de lupeol e presença de saponinas, taninos e esteróides livres. Entretanto, as propriedades farmacológicas provavelmente não estão relacionadas com estas moléculas. Desta forma, concluímos que o látex de H. drasticus exibe duas das atividades farmacológicas relatadas por seus usuários e a fração proteica deste látex é um importante contribuinte para tais propriedades medicinais. A resistência ao aquecimento e à proteólise pode explicar a efetividade de HdLP quando administrada oralmente. A ausência de efeitos tóxicos por via oral torna esta planta uma potencial candidata a fitoterápico.

VASCONCELOS, Eliane Silva Araújo de. Proteases do látex de Calotropis procera: purificação, caracterização bioquímica, enzimática e molecular e atividades biológicas. 2013. 140 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2013. Studies have shown that latex of plants is a rich source of enzymes with proteolytic activities. Isolation and characterization of cysteine proteases of latex have recently been reported. In this work we report the purification and characterization of three new cysteine proteases of laticifer fluid of Calotropis procera, as well as its activity in plasma coagulation assays. The three proteases, termed CpCP-1, 2-CpCP and CpCP-3 are isoforms of cysteine proteases and were purified using two sequential steps of ion exchange chromatography on CM-Sepharose and Resource S columns, coupled to FPLC system. Their molecular masses were determined by ESI-Q-TOF mass spectrometry: CPCP-1 had mass = 26.213, CPCP-2 = 26.133 and CPCP-3 = 25.086 Da. The amino acid sequences of the N-terminal region was identical for all three enzymes, being composed of 30 amino acid residues. Analysis revealed high sequence identity with others cysteine proteases. The proteolytic activity of these enzymes was tested against different substrates (azocasein, BANA and BApNA) and at different pH and temperature. The three enzymes are capable of degrading azocasein and BANA, substrates nonspecific and specific for cysteine proteases, respectively. CPCP-1 showed proteolytic activity twice that CPCP-3, and this, a little bigger than CPCP-2. Enzymes maintained 60-80% of their activities even when tested at 60 °C temperature, and the optimum pH for these activities was 6.0. Circular Dichroism Analysis showed that the secondary structure of the proteases was composed of 15.1 to 19.9% of alpha-helices and 20.6 to 21.3% of beta-sheets. The spectra deconvolution of proteases showed that their structures were altered in the presence of the reducing agent DTT, suggesting the presence of disulfide bridges stabilizing the three dimensional structures. In biological tests proteases were able to strongly inhibit the germination of spores of the fungus Colletotrichum gloeosporioides and also exhibited plasma coagulation activity by thrombin-like mechanism. Estudos têm demonstrado que látex de plantas é uma rica fonte de enzimas com atividades proteolíticas. O isolamento e a caracterização de proteases cisteínicas de látex têm sido recentemente relatados. Neste trabalho nós reportamos a purificação e caracterização de três novas proteases cisteínicas do fluido laticífero de Calotropis procera, bem como sua atividade em ensaios de coagulação plasmática. As três proteases, denominadas CpCP-1, CpCP-2 e CpCP-3 são isoformas de proteases cisteínicas e foram purificadas utilizando dois passos sequenciais de cromatografias de troca iônica em colunas de CM-Sepharose e Resource S, acoplada a sistema FPLC. Suas massas moleculares foram determinadas por espectrometria de massas em aparelho do tipo ESI-Q-TOF, onde: CpCP-1 apresentou massa=26,213, CpCP-2=26,133 e CpCP-3=25,086. A sequência de aminoácidos da região N-terminal foi idêntica para as três enzimas, sendo constituída de 30 resíduos de aminoácidos. Análises de sequências revelaram alto nível de identidade (88%) com proteases cisteínicas A atividade proteolítica dessas enzimas foi testada frente a diferentes substratos (Azocaseína, BANA e BApNA) e em diferentes valores de pH e temperatura. As três enzimas foram capazes de degradar Azocaseína e BANA, substratos inespecífico e específico para proteases cisteínicas, respectivamente. CpCP-1 apresentou atividade proteolítica duas vezes maior que CpCP-3, e esta, um pouco maior que CpCP-2. As enzimas mantiveram 60-80% de suas atividades mesmo quando ensaiadas a 60ºC de temperatura, e o pH ótimo para essas atividades foi 6,0. Análises de Dicroísmo Circular revelaram que a estrutura secundária das proteases era composta de 15,1-19,9% de alfa-hélices e 20,6-21,3% de folhas-beta. Os espectros de desconvolução das proteases mostrou que suas estruturas foram alteradas na presença do agente redutor DTT, sugerindo a presença de pontes dissulfeto na estabilização das estruturas tridimensionais. Em testes biológicos as proteases foram capazes de inibir fortemente a germinação de esporos do fungo Colletotrichum gloesporioides e também exibiram atividade de coagulação plasmática por um mecanismo do tipo trombina.

OLIVEIRA, Jefferson Soares de. Caracterização bioquímica e atividade citotóxica in vitro e antitumoral in vivo de proteínas do látex de Calotropis procera. 2011. 149 f. : Tese (Doutorado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. Latex of Calotropis procera was described as a source of pharmacologically active proteins such as anti-inflammatory and analgesic activities. This study evaluated the cytotoxic activity in vitro of proteins (LP) recovered from the latex of the medicinal plant C. procera against human cancer cells and the in vivo growth inhibition of Sarcoma 180. LP exhibited significant cytotoxicity for cell lines with IC50 values ranging from 0.11 to 1.36 µg/ml for tested cell lines (HL-60, SF295, HCT-8 and MDA-MB-435). There were no visible effects on the viability or morphology of healthy mononuclear cells exposed to PL (10 µg / ml) for 72 h, showing that PL was selective for malignant cells. Fractionation of PL by ion exchange chromatography (pH 5.0) gave rise to three new protein fractions (PI, PII and PIII) and almost all cytotoxicity present in PL was retained in fraction PI. The cytotoxic effects of PL and PI were diminished when pre-treated with pronase or 2-mercaptoethanol, reinforcing the protein nature of active molecules. PI was absent on cysteine protease activity, indicating that this enzyme abundantly found in PL is not involved in cytotoxicity. Mechanistic studies of LP cytotoxicity using HL-60 cells revealed that PL induces apoptosis probably due to changes in DNA topology since PL interfered in the activity of topoisomerase I. The cytotoxic activity present in PI seems to be performed by the synergic action of different proteins. This hypothesis is suggested since PI subjected to gel filtration chromatography produced distinct protein peaks that shared cytotoxic activity, although with lower extent than PI. Studies on growth inhibition of Sarcoma 180 showed that animals treated with PL by oral (10 or 20 mg/kg) or intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) rout reduced tumor growth significantly (up 51.83%, po) and increased life span of transplanted animals for up to four days. The inhibitory activity of tumor growth was lost when the LP was subjected to proteolysis, acidic treatment or collected in iodoacetamide. On the other hand, LP maintained its in vivo activity after heat treatment, suggesting that thermo stable proteins are involved in the suppression of tumor growth. Biochemical parameters such as the enzymatic activity of aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) and the content of urea in serum were not affected in animals treated with LP. Treatment of animals with LP induced increasing of leukocyte numbers and protected from leukopenia induced by 5-FU administration. In addition, no significant changes in the histopathology of liver of animals treated with oral LP were seen. In vivo antitumor activity was retained in the PII and this activity was observed even when animals received a single dose of PII. It seems that the in vivo action of latex proteins is related to an immunestimulant event and not to the cytotoxic action of protein on cells Sarcoma 180. PII-3, recovered after PII fractionation on ion exchange column at pH 6.0, retained the tumor growth inhibition activity found in PII. PII-3 was shown to possess cysteine proteinase and papain inhibitor activities; however is not completely clear weather this molecules are involved in the antitumor activity. This study confirms the pharmacological potential of latex proteins from C. procera to control the development of tumor cells. O látex de Calotropis procera foi descrito como uma fonte de proteínas farmacologicamente ativas como atividade antiinflamatória e analgésica. O presente trabalho avaliou a atividade citotóxica in vitro das proteínas (PL) recuperadas do látex da planta medicinal C. procera contra células de câncer humano e a inibição do crescimento do Sarcoma 180 transplantado em camundongos. PL apresentou significante citotoxicidade para as linhagens celulares com valores de IC50 variando entre 0,11 a 1,36 µg/ml para as linhagens celulares testadas (HL-60, SF295, HCT-8 e MDA-MB-435). Não foram observados efeitos visíveis sobre a viabilidade ou a morfologia de células mononucleares saudáveis expostas a PL (10 µg / ml) por 72 h, mostrando que PL apresentou seletividade para células tumorais. O fracionamento de PL por cromatografia de troca iônica (pH 5,0) deu origem a três novas frações (PI, PII e PIII) e quase toda citotoxicidade presente em PL ficou retida na fração PI. Os efeitos citotóxicos de PL e PI foram diminuídos quando previamente tratados com pronase, ou 2-mercaptoetanol, sugerindo uma natureza protéica de moléculas ativas. PI não apresentou atividade de proteinase cisteínica, indicando que esta enzima, encontrada em abundância em PL, não está envolvida na citotoxicidade. Estudos do mecanismo da ação citotóxica de PL utilizando células HL-60 revelou que PL induz apoptose celular provavelmente devido a alterações na topologia de DNA, já que PL interferiu na atividade de topoisomerase I. A atividade citotóxica presente em PI parece ser desempenhada pela ação combinada de diferentes proteínas uma vez que PI submetida à cromatografia de filtração em gel gerou picos protéicos distintos que compartilharam atividade citotóxica, embora com menor potência que PI. Estudo de inibição do crescimento do Sarcoma 180 revelou que animais tratados com PL por via oral (10 or 20 mg/kg) ou intraperitoneal (2 or 5 mg/kg) reduziram de modo significativo o crescimento do tumor (em até 51,83%; v.o.) e prolongou o tempo de sobrevivência dos animais transplantados por até quatro dias. A atividade inibitória do crescimento do tumor foi perdida quando a fração PL foi submetida à proteólise, tratamento ácido ou com iodoacetamida. No entanto, PL conservou a sua atividade in vivo após o tratamento térmico, sugerindo que proteínas termoestáveis estão envolvidas na supressão do crescimento tumoral. Os parâmetros bioquímicos, como a atividade enzimática da aspartato aminotransferase (AST) e alanina aminotransferase (ALT) e o teor de uréia no soro, não foram afetados nos animais tratados com PL. PL induziu aumento no número de leucócitos de animais tratados e ainda eliminou completamente a leucopenia induzida pela administração do 5-FU. Em adição, não foram observadas mudanças na histopatologia do fígado de animais tratados com PL por via oral. Atividade antitumoral in vivo ficou retida no PII e esta atividade foi observada mesmo quando animais transplantados receberam uma única dose de PII sugerindo que a ação in vivo de proteínas do látex está relacionada a um evento imunoestimunate de proteínas e não à ação citotóxica sobre as células do Sarcoma 180. PII-3, obtido após fracionamento de PII em coluna de troca iônica em pH 6,0 reteve a atividade de inibição do crescimento tumoral de PII. Esta fração possui atividade de proteinase cisteínica e atividade de inibidor de papaína, porém não é completamente claro o envolvimento dessas moléculas na atividade in vivo. Este estudo confirma o potencial farmacológico das proteínas do látex de C. procera para controlar o desenvolvimento de células tumorais.

VIANA, C. A. Caracterização bioquímica da atividade pró-coagulante de proteases de fluidos laticíferos. 2011. 103 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2011. Latex proteases have grown in attention because of their ability to exhibit both thrombin and plasmin-like effects. In this study, the plant latex proteins Calotropis procera (CpLP), Cryptostegia grandiflora (CgLP) and Plumeria rubra (PrLP) were investigated in terms of these activities. For both samples were investigated for their fibrinogenolytic and fibrinolytic activity in human plasma and by incubation with human fibrinogen by measuring the clotting time, electrophoretic or spectrophotometric assays and diffusion in agarose gel. In vivo effect of CpLP on clot formation of plasma of healthy and septic mice that have been experimentally infected with Salmonella enterica serovar Typhimurium was also studied. Groups of five mice were treated with CpLP (30 mg/Kg), S. enterica (107 CFU/mL) or CpLP 24 h prior bacteria. After sacrificing animals, blood samples were examined for coagulation time, platelet content and protein profile. The protein fractions of C. procera exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to thrombin, while the protein fractions of Cr. grandiflora exhibiting proteolytic activity were capable to hydrolyze fibrinogen similar to plasmin. The samples exhibited fibrinogenolytic activity in a dose and time manner, but were not able to dissolve the fibrin clot. Procoagulant activity was eliminated by inhibition of latex proteases with cysteine proteinase inhibitor E-64. Pepstatin, PMSF and EDTA were not inhibitory. Time of clot formation of plasma in septic mice and platelet content were consistently reduced as compared to healthy animals. CpLP exhibited antagonistic effects. It statistically reversed the effects of sepsis on clot-time formation associated to preservation on platelet content. However, CpLP exhibited opposite effect on non-septic mice, inducing faster clot formation, compared to healthy animals but without changing platelet content. Results reported in this work confirm fibrinogenolytic activity associated to cysteine proteases of latex and show a very intriguing in vivo protective activity of CpLP on platelet content on septic animals with apparent benefit effect against disseminated vascular coagulation, a pivotal event associated to lethal sepsis. This effect was however not observed when CpLP was given to healthy animals. As proteases de látex têm atraído atenção devido à habilidade de exibir atividades semelhantes à trombina e à plasmina. Neste estudo, as proteínas do látex das plantas Calotropis procera (CpPL), Cryptostegia grandiflora (CgPL) e Plumeria rubra (PrPL) foram avaliadas em termos destas atividades. Para tanto, as amostras foram investigadas quanto as suas atividades fibrinogenolíticas e fibrinolíticas, em plasma humano e por incubação com fibrinogênio humano através da medida do tempo de coagulação, ensaios eletroforéticos, espectrofotométricos, ou de difusão em gel de agarose. O efeito de CpPL in vivo, sobre o tempo de coagulação no plasma de camundongos saudáveis ou sépticos, que foram experimentalmente infectados com a bactéria Salmonella enterica sorotipo Typhimurium, também foi estudado. Grupos de cinco camundongos foram tratados com CpPL (30 mg/Kg), S. enterica (107 UFC/mL) ou CpPL 24 h antes da inoculação bacteriana. Depois do sacrifício dos animais, as amostras de sangue foram examinadas quanto ao tempo de coagulação, conteúdo de plaquetas e perfil protéico. As frações protéicas de C. procera exibindo atividade proteolítica foram capazes de hidrolisar o fibrinogênio de forma similar à trombina, enquanto que as frações protéicas de Cr. grandiflora exibindo atividade proteolítica foram capazes de hidrolisar o fibrinogênio de forma similar à plasmina. As amostras exibiram atividade fibrinogenolítica de forma dose e tempo dependente, mas não foram capazes de dissolver totalmente o coágulo de fibrina. As atividades fibrinogenolíticas foram eliminadas pela inibição das proteases dos látices com E-64, um inibidor de protease cisteínica. Pepstatina, PMSF e EDTA não se mostraram inibitórios. O tempo de formação do coágulo no plasma de camundongos sépticos e o conteúdo de plaquetas foram consistentemente reduzidos quando comparados aos animais saudáveis. CpPL exibiu efeitos antagonistas. Foi capaz de reverter, estatisticamente, o efeito da sepse no tempo de formação do coágulo associado à preservação do conteúdo de plaquetas. Contudo, CpPL exibiu efeito oposto em camundongos não sépticos, induzindo rápida formação do coágulo, comparado aos animais saudáveis, porém sem alterar o conteúdo de plaquetas. Os resultados relatados neste trabalho confirmam a atividade fibrinogenolítica associada a proteases cisteínicas de látex e mostram uma efeito protetor in vivo muito intrigante de CpPL no conteúdo de plaquetas em animais sépticos, com aparentes efeitos benéficos contra a coagulação intravascular disseminada, um evento crucial associado à sepse letal. Este efeito, porém, não foi observado quando CpPL foi dado aos animais saudáveis.

SOUZA, D. P. Proteínas inibidoras de fitopatógenos em fluidos laticíferos: atividade e mecanismo de ação. 2010. 82 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2010. Canal systems containing secretions, such as latex, are widely disseminated in the plant kingdom. These fluids are chemically complex and exhibit intense metabolism. Despite their origin, latex is the cytoplasm of specialized cells growing intrusively into organized tissues and organs, forming an interconnected network allowing latex exudation immediately after tissue damage. Insecticidal effects of latex proteins have been described, however minor studies were devoted to investigate antifungal activities in latex. In this study proteins extracted from latex of Calotropis procera (Ait.) R.Br (PLCp), Plumeria rubra L.(PLPr), Carica candamarcensis Hook F.(P1 G10), Cryptostegia grandiflora (PLCg), and Euphorbia tirucalli L. (PLEt) were tested for antifungal activity against six phytopathogens (Fusarium solani, F. oxysporium, Aspergilus niger, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. and Colletrotricum gloerosporioides). PLCp, PLCg and P1G10 exhibited antifungal activity and PLPr and PLEt were not efetive. Inhibitory activity of the protein fractions correlated with the cysteine-type proteolytic activity found in these fractions. The endogenous proteolytic activity and inhibitory activity on fungal growth were both increased when samples were first activated with DTT, a cysteine proteinase activator. Conversely, pre-treatment of samples with iodoacetamide, an inhibitor of these proteases rendered all samples deficient of both, proteolytic and antifungal activities. Antifungal of activity of cysteine proteinases of latex origin was also confirmed when papain, obtained from latex of Caryca papaya was tested while purified trypsin and chemotrysin, two serine-type proteases were not antifungal. A cysteine proteinase was thus, purified form PLCg by ion exchange chromatography on a Mono-S Sepharose matrix monitored by a FPLC system. The protein, named Cg24-I exhibited molecular mass of 26.118 KDa determined by MALDI spectrometry; maximum of proteolysis at pH 8.0 and inhibited by iodoacetamide and E-64 when assayed with azocazein or BANA as substrates. Cg24-I inhibited germination of F. solani and altered membrane permeability of spores at a minimum concentration of 90 ng/ml. Results present here suggest that cysteine proteinases of laticifer fluids are proteins with antifungal activity capable of damaging spore structure and inhibiting hyphae growth. Reports of antifungal activity of latex proteases are still scarce in literature and this work appears as an important contribution to this field. Furthermore, this work gives important evidence for the multiple defensive role of latex in plants. Um relevante número de espécies vegetais é descrito como plantas produtoras de um fluido leitoso comumente denominado de látex. Nestas espécies, o látex é sintetizado e armazenado sob pressão em um sistema de canais formados por células altamente especializadas denominadas de laticíferas, em cujos citoplasmas estão presentes todas as estruturas eucariontes em meio à água, borracha e inúmeras moléculas, muitas das quais específicas deste conteúdo. Muitos estudos têm sugerido que moléculas produzidas nestes fluidos participam da defesa vegetal. Neste trabalho, o látex de 5 espécies foi coletado e processado em laboratório para obtenção de suas frações protéicas e estas foram avaliadas quanto a atividade sobre fungos fitopatogênicos através de ensaios de inibição da germinação de esporos e crescimento de hifas. Proteínas do látex de C. procera (PLCp), Cryptostegia grandiflora (PLCg) e Carica candamarcensis (P1 G10) apresentaram atividade antifúngica enquanto que Plumeria rubra (PLPr) e Euphorbia tirucalli (PLEt) não apresentaram atividade sobre qualquer dos fungos avaliados (Colletotrichum gloeosporioides, Fusarium oxysporum, Fusarium solani, Rhizoctonia solani, Neurospora sp. e Aspergillus niger). A atividade inibitória das frações protéicas se correlacionou diretamente com a presença de atividade proteolítica do tipo cisteínica presente nas amostras de PLCp, PLCg e P1G10. A atividade antifúngica foi aumentada na presença de DTT, um ativador destas proteases e foi diminuída ou eliminada quanto às amostras foram pré-tratadas com iodoacetamida (IAA), um inibidor específico de proteases cisteínicas. Além disso, a atividade antifúngica foi observada quando papaína, uma protease cisteínica purificada do látex de Carica papaya foi avaliada, mas tripsina e quimotripsina, duas proteases serínicas não apresentaram atividade. Através de cromatografia em coluna de Mono-S Sepharose acoplada ao sistema de FPLC, uma protease cisteínica foi isolada de PLCg. A proteína purificada (Cg24-I) apresentou massa molecular de 24,118 KDa. A Cg24-I apresentou atividade proteolítica máxima em pH 8,0 e foi inibida por IAA e E-64, utilizando azocaseína e BANA como substratos, respectivamente. Cg24-I inibiu a germinação de F. solani e foi capaz de alterar a permeabilidade das membranas dos esporos na concentração de 90 ng/ml. Esse conjunto de resultados sugere que proteinases cisteínicas de fluidos laticíferos participam da defesa das plantas contra fungos fitopatogênicos e que o provável mecanismo de ação destas proteínas seja a alteração da permeabilidade da membrana plasmática destes microrganismos. A descrição de atividade antifúngica de proteases cisteínicas oriundas de fluidos laticíferos não é ainda descrita em detalhes na literatura, sendo este um trabalho com caráter original.

Latex of the medicinal plant Calotropis procera (Apocynaceae) possesses molecules displaying different pharmacological activities, including pro- and anti-inflammatory. In this study immune inflammatory modulation of the soluble protein fraction (LP) recovered from the latex was investigated in experimental models of sepsis induced by CLP and inoculation of the S. Typhimurium. Biochemical aspects of laticifers proteins were investigated and biochemical, pharmacological and histopathological parameters were evaluated in experimental animals. LP protected animals and a unique dose (30 mg/Kg; i.p.) lead to 100% survival while non-treated infected animals (Salmonella group) reached 100% mortality within 24 h. Protection was only observed when LP was given 24 earlier of infection. LP did not exhibit in vitro bactericide activity suggesting indirect mechanism of action, probably by immune modulation. After 4 and 24 h of infection bacteria was similarly disseminated in liver, spleen and peritoneal fluid, local of bacteria inoculum. However, in blood viable bacteria was reduced only in animals given laticifers proteins. The protective effect of LP was also observed in its three sub-fraction, denominated of PI, PII and PIII, obtained after protein fractionation by ion exchange chromatography on a CM-Sepharose performed at pH 5.0. Neither, heat-treatment (100 C, 30 min) nor inhibition of its endogenous proteolytic enzymes, by iodoacetamide, eliminated the protective effect of LP. Nitric oxide (NO) an important signaling molecule was augmented in serum of non-treated animals whereas it was unaltered in control and LP/PI-treated animals 24 h after infection. Increasing of NO in serum is known to directly contribute to inhibit neutrophil migration in septic animals. Accordingly, failure of neutrophil migration to the infectious focus in septic animals was confirmed. Conversely, in animals given LP and PI, influx of neutrophils was evident. In addition, NO was also elevated in the infectious focus of LP/PI treated animals, probably due neutrophil activity as part of their microbicidal activity. Activity of adenosine deaminase (ADA) was measured locally after 4 and 24 h of infection was initiated. ADA was augmented in LP/PI treated animals and unaltered in non treated animals. Thrombocytopenia was observed in non treated animals but not in LP/PI protected animals. Neutrophilia and lymphopenia were documented in non-treated animals. Neutrophilia would result of high NO content in serum, which inhibits neutrophil migration and lymphopenia is part of immune suppression caused by sepsis. Neutrophilia was observed 7 days after infection in animals given LP/PI, suggesting a hematopoiesis stimulus. Lymphopenia first observed (24 h) in septic animals was only detected after 7 days in PL/PI treated animals. Activity of oxalacetic-glutamic transaminase was altered in all groups while glutamic-pyruvic transaminase not. Lactate dehydrogenase was augmented in all groups. Histopathological examination of liver and spleen revealed tissue damage caused by sepsis, but these alterations appeared later (7 days) in PL/PI-treated animals. Results reported in this study suggest that PL modulates immune inflammatory activity in septic animals by an indirect mechanism that remains to be investigated. Activity of LP leads to animal survival, even under infection. It is proposed that LP modulates NO synthesis, reducing NO levels in serum of infected animals and abolishing the failure of neutrophil migration. The pharmacological properties of LP previously described in classical models of inflammation, is now confirmed in a model of systemic inflammatory response elicited by microbial infection. O látex da planta medicinal Calotropis procera (Apocynaceae) possui moléculas com diferentes atividades farmacológicas, dentre estas, pró- e antiinflamatória. Neste trabalho, o efeito imunomodulatório da fração de proteínas solúveis do látex (PL) foi investigado em modelos experimentais de sepse induzida por CLP e por inoculação de S. Typhimurium. Aspectos bioquímicos das proteínas do látex foram investigados e parâmetros bioquímicos, hematológicos e histopatológicos foram determinados em animais experimentais. PL exibiu um significativo efeito protetor nos animais. Uma dose de 30 mg/Kg levou à sobrevivência de até 100%, comparada com 100% de mortalidade no grupo de animais infectados e não tratados (grupo Salmonella). Este efeito foi somente observado quando PL foi administrado 24 horas antes da indução da sepse. PL não apresentou atividade antibacteriana in vitro sugerindo um mecanismo de ação indireto, possivelmente intervindo nos processos imunes. A população microbiana no fígado, baço e fluido peritoneal - local do foco infeccioso - estava similar entre todos os grupos, 4 e 24 horas após inoculação bacteriana. No sangue, entretanto, a quantidade de bactérias viáveis estava reduzida apenas nos animais tratados com proteínas do látex. O efeito protetor de PL foi revisto através de suas três sub-frações protéicas, denominadas de PI, PII e PIII, obtidas através de fracionamento por cromatografia de troca iônica em coluna de CM-Sepharose a pH 5,0. As três sub-frações protéicas apresentaram efeito protetor e de forma similar. Nem o tratamento térmico de PL (100 °C, 30 min.) ou inibição de suas proteases endógenas com iodoacetamida alterou o efeito protetor observado. O óxido nítrico (NO), um importante sinalizador molecular, estava aumentado no soro de animais do grupo Salmonella enquanto que animais protegidos com doses de PL e PI apresentaram níveis similares ao controle após 24 horas da infecção. Este resultado corroborou com a observação de que animais com sepse letal apresentaram falência na migração de neutrófilos para o foco infeccioso enquanto que, de forma evidente, animais tratados com PL ou PI favoreceram o influxo de células para a cavidade peritoneal. Além disto, nestes animais, o nível de NO estava aumentado no foco infeccioso, uma provável atividade dos neutrófilos presentes como parte de sua atividade microbicida. A atividade da adenosina desaminase (ADA) mensurada no foco infeccioso, após 4 e 24 horas de infecção, estava aumentada apenas nos animais tratados com PL ou PI, e inalterada em animais do grupo Salmonella. Plaquetopenia foi observada em animais com sepse, mas não em animais protegidos com PL ou PI. Neutrofilia e linfopenia ocorreram em animais do grupo Salmonella. Neutrofilia seria concordante com o elevado teor de NO, um inibidor da migração de neutrófilos, enquanto que a linfopenia é parte da imunossupressão estabelecida na sepse. Em animais tratados com PL ou PI foi observada neutrofilia sete dias após a infecção, sugerindo um estímulo na hematopoiese. Linfopenia, observada no início da sepse (24 h), só ocorreu aos sete dias nos animais tratados com PL ou PI. Atividade de transaminase glutâmico oxalacética estava aumentada em todos os grupos. Transaminase glutâmico pirúvica não teve atividade alterada. A atividade da lactato desidrogenase estava aumentada em todos os grupos. Análises histopatológicas do fígado e baço mostraram que os danos teciduais causados pela sepse foram retardados nos animais tratados com PL, como observado após sete dias. A análise integrada de todos os resultados sugere que as proteínas do látex modulam a resposta imunoinflamatória por mecanismo indireto, revertendo à falência da migração de neutrófilos causada pela sepse letal e, desta forma, induzem uma resposta imunológica ainda não esclarecida, que permite a sobrevivência dos animais, mesmo sob infecção. Os resultados sugerem que a modulação de NO estaria diretamente envolvida no efeito protetor final observado. As propriedades farmacológicas de PL previamente descritas em modelos clássicos de inflamação são agora confirmadas em um modelo de resposta inflamatória sistêmica resultante de um processo infeccioso previamente estabelecido.

ARAÚJO, E. S. Látex de Plumeria rubra L. (jasmim): perfil protéico, caracterização enzimática e ação contra insetos. 2009. 90 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2009. Plumeria rubra L. is a laticífera plant belonging to the family Apocynaceae popularly known as Jasmim. For spicy and fragrant flowers make this tree is commonly seen ornate squares and gardens of residential urban centers. Laticífer plants are well known for producing a fluid endogenously generally milky in appearance - latex - that exudates from the plant when it undergoes some type of injury, either by mechanical damage or attack by predators. Latex is a material that has been the subject of biochemical and pharmacological studies show that it is a promising source of compounds with potential biotechnological application. In this study the latex of P. rubra was the subject of biochemical and biological research with emphasis on the search for proteins that could make any deleterious action against agricultural insect pests. Laboratory procedures that employ centrifugation and dialysis allowed the fractionation of latex into three distinct components: rubber (BL), proteins (PLPr) and low molecular weight molecules (DL). The PLPr fraction was subject to biochemical and enzymatic characterization and was used in bioassays with the bean weevil-of-rope, Callosobruchus maculatus and the fruit fly, Ceratitis capitata. The full latex and its fractions were used in testing the repellency of oviposition of C. maculatus and Zabrotes subfasciatus. The BL fraction is the major component of latex, 70 %, while PLPr and DL fractions are about 15 % each one. The content of soluble protein in PLPr fraction was 0.33 mg / mL. Espectrometric and electrophoretic analysis revealed the presence of proteins with molecular weights ranging from 12 to 117 kDa, with a maximum of protein with 26 kDa and pI

OLIVEIRA, Jefferson Soares de. Múltiplas proteínas estão envolvidas nas atividades antiinflamatória e antinociceptiva do látex da planta medicinal Calotropis procera (AIT.) R. Br. 2009. 101 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2009. Latex is a general term used to describe fluid exudates from plants after mechanical injury. Latex from Calotropis procera is well known for its medicinal properties mainly in Indian traditional medicine. Moreover, it has been experimentally shown that it exhibits interesting biological activities such as anti-inflammation. However its latex has been reported to induce proinflammatory responses. In the present work, (1) the latex was fractionated to segregate pro- and anti-inflammatory activities; (2) assays were carried out to characterize the mechanism of action of active fractions and (3) attempts were done to identify molecules involved in anti-inflammatory and antinociceptive activities. First, the latex was collected in distilled water (1:1; v/v) and submitted to centrifugation and dialysis steps to obtain three different fractions (FD, PL and B). These fractions were evaluated to pro- and anti-inflammatory activities using peritonitis model in rats. FD, constituted by compounds with molecular mass lower than 8,000 Da, did not exhibited anti-inflammatory activity, however induced intense neutrophil migration into peritoneal cavity of rats. The inflammation induced by FD was time and dose dependent. Moreover, it was seen that previous injection of Dexamethasone, Thalidomide and Meclizine in animals inhibited FD inflammatory responses suggesting that inflammation triggered by this fraction occurs through histamine and TNF-α release. Peptides, present in FD as shown in electrophoresis, should be involved in inflammation responses displayed by FD since such activity was diminished after 24 hour pronase treatment. Fractions PL, and B did not induce inflammatory response when injected into peritoneal cavity of animals, however intravenous injection displayed strong anti-inflammatory activity against inflammation induced by carrageenan. The anti-inflammatory activity promoted by B seems to be related to PL proteins present in B. PL fraction inhibited neutrophil migration trigged by FD. PL anti-inflammatory activity ought to be related to proteins since such activity was completely abolished after heat or pronase treatment and it still remained after acetone precipitation. Three protein sub-fractions (PI, PII and PIII) were recovered after PL chromatography on ion-exchange column (CM-Sepharose Fast flow) at pH 5.0. In spite of the fact that PI, PII e PIII were seen to be different by electrophoresis they were equally able to inhibit neutrophil migration induced by carrageenan in rats as well as abdominal writhes stimulated by acetic acid in mice. Intravital microscopy assay revealed that, PI, PII and PIII inhibit both leucocyte rolling and adhesion in mice mesenteric tissues. In addition, PI was able to induce nitric oxid production and inflammation induced by FD. These results show that multiples proteins in PL display anti-inflammatory activity and they act at different pathway of inflammation. Several experiments were performed aiming to detect the anti-inflammatory activity of PL when it was administered by oral route however, we did not obtain success. This is the first report which confirms the presence of pro- and anti-inflammatory activities and it shows that such activities are displayed by compounds suitable to be fractionated on the basis of their molecular size. In addition, these results show that anti-inflammatory and antinociceptive activities are displayed by proteins present in the latex A planta Calotropis procera, pertencente à família Apocinaceae, tem como uma de suas principais características a produção constitutiva de látex. Este fluido é amplamente utilizado na medicina popular, principalmente da Índia, por apresentar diversas propriedades curativas. Na literatura, o produto da extração do látex íntegro com solvente aquoso e/ou orgânico desta planta é citado por apresentar atividade antinociceptiva e antiinflamatória. Por outro lado, a mesma preparação do látex também é relatada por induzir processos inflamatórios. O presente trabalho teve como objetivo fracionar o látex da planta Calotropis procera para separar as atividades pró- e antiinflamatória; caracterizar estes mecanismos e avançar na identificação das moléculas envolvidas na atividade antiinflamatória e antinociceptiva. O látex coletado em água destilada (1:1; v/v) foi submetido às etapas de centrifugação e diálise e três frações foram obtidas (FD, PL e B) e inicialmente avaliadas quanto à presença de atividade pró- e antiinflamatória, utilizando o modelo de peritonite em ratos. A fração FD, rica em compostos de massa molecular inferior a 8.000 Da, não se mostrou antiinflamatória quando administrada por via endovenosa nos animais. Por outro lado, uma forte atividade pró-inflamatória foi observada quando esta foi injetada na cavidade peritoneal de ratos. A resposta inflamatória induzida por FD foi dependente de tempo e dose e parece estar relacionada com a presença de peptídeos detectados na fração, já que esta atividade foi diminuída quando a fração foi tratada com pronase durante 24 horas antes de sua administração nos ratos. A inflamação induzida por FD foi inibida por Dexametasona, Talidomida e Meclizina sugerindo um processo inflamatório induzido por vias de liberação de histamina e TNF-α. A fração PL, rica em proteínas, e a fração borracha (B) não foram pró-inflamatórias e apresentaram forte atividade antiinflamatória por via endovenosa. A atividade promovida por B parece estar relacionada à presença de proteínas pertencentes à fração PL, como observado em ensaio de detecção imunológica. PL inibiu o processo inflamatório induzido por FD. A atividade antiinflamatória promovida pela fração PL parece ser um evento promovido pela ação de proteínas, visto que a atividade antiinflamatória da fração foi perdida após aquecimento ou tratamento com pronase, e permaneceu ativa após precipitação com acetona. Três novas sub-frações (PI, PII e PIII) foram obtidas após aplicação da fração PL em coluna de troca iônica (CM-Sepharose Fast Flow) em pH 5,0. As sub-frações, distintas entre si, como observado através de eletroforese em gel de poliacrilamida, foram igualmente capazes de reverter a inflamação induzida por carragenina no modelo de peritonite em ratos, bem como reduzir as contorções abdominais induzidas por ácido acético, evidenciando o envolvimento de múltiplas proteínas na resposta antiinflamatória e antinociceptiva produzida pela fração PL. Ensaio de microscopia intravital revelou que PI, PII e PIII inibem o rolamento e a adesão leucocitária no mesentério de camundongos. Somente PI induziu intensa produção de óxido nítrico em ratos além de ter sido a única sub-fração capaz de reverter a resposta pró-inflamatória promovida pela fração FD, evidenciando diferentes mecanismos antiinflamatórios promovidos por diferentes proteínas do látex. A atividade antiinflamatória não foi observada quando a fração PL foi administrada por via oral nos animais. Este é o primeiro trabalho que confirma a presença de duas atividades antagonistas no látex de C. procera e que estas são promovidas por moléculas distintas passíveis de serem separadas com base em seu tamanho molecular. O conjunto de resultados aqui apresentados mostra que a atividade antiinflamatória e antinociceptiva do látex foram promovidas por moléculas protéicas

The plant Calotropis procera belonging to Asclepiadaceae is found around a vast extension of the Northeast from Brazil. It is a lactifers plant and its endogenous production of latex is admirable. Despite continuous reports appearing in the literature give mention to the medicinal properties of different parts of the plant, including the latex, there is not scientific approaches comprising biochemical of functional aspects of the latex from C. procera. The aims this work was determine the presence of endogenous enzymatic activities and inhibitory activity against different proteases and a-amylase, to evaluate insecticidal properties against different crop pests and to correlate enzymatic content and insecticidal action with possible role of the latex in protecting the plant to insect pathogens. The major soluble protein fraction from the latex was prepared following the protocol previously defined that includes centrifugations and dialysis steps. The protein fraction devoided of rubber and low molecular mass molecules was assayed to the presence of endogenous proteolytic activities as well as a-amylase activity. Even, the presence of inhibitor of such activities was investigated. Additionally the latex proteins were submitted to proteolysis by digestive content of different insects. Bioassays base on artificial diets with different contents of native, pronase digested or heated treated (98 °C) latex proteins were performed against six insects belonging to 4 different orders. Increment in bodyweight of larvae, time of development and percentage of survive were the parameters considered to analyze detrimental effects of latex proteins upon insects. The effect of latex proteins upon Callosbruchus maculatus insects by continuous exposure until F-6 generation was reached was performed. It was found strong endogenous proteolytic activity and latex proteins were resistent to proteolysis by insect digestive extracts. In addition chitinolytic activity was also detected. The latex exhibited insecticidal activity against different insect groups and this effect may be correlated to the presence of a cysteine protease inhibitor associated to its proteolytic properties and chitinolytic activity. It is suggested that the protein fraction of the latex from Calotropis procera plays a relevant role in defending the plant against pathogens. A planta Calotropis procera pertencente à família Asclepiadaceae é encontrada em vasta extensão do Nordeste Brasileiro. É uma planta laticífera e sua produção endógena de látex é extraordinária. Embora haja na literatura científica diversas publicações que relatam o potencial medicinal de diversas partes da planta, principalmente de seu látex, não há ainda uma abordagem bioquímica e funcional de seu fluido laticífero. Esta pesquisa foi desenvolvida no sentido de proceder a um estudo bioquímico parcial de atividades endógenas da fração protéica majoritária do látex e de avaliar seus efeitos inseticidas sobre diferentes modelos de pragas agrícolas. A fração protéica majoritária do látex foi preparada a partir de um protocolo previamente desenvolvido no laboratório em que são envolvidas etapas de centrifugação e diálise. A fração protéica isenta de borracha e de moléculas de baixa massa molecular foi testada para atividades enzimáticas endógenas proteolíticas, quitinásicas e a-amilásica e atividades inibitórias para proteases e a-amilase. Ensaios enzimáticos de digestão das proteínas do látex por extratos digestivos de insetos foram também realizados. Bioensaios utilizando-se dietas artificiais contendo diferentes proporções das proteínas do látex íntegras, digeridas por pronase ou aquecidas a 98 °C foram realizados com seis insetos pertencentes a quatro ordens. Nos bioensaios foram avaliados parâmetros tais como desenvolvimento, sobrevivência, tempo de emergência dos indivíduos além de ser avaliado o efeito cumulativo de proteínas do látex na dieta por sucessivas gerações. Na fração protéica do látex foram encontradas atividades proteolíticas do tipo cisteínica e serínica, além de atividade quitinolítica. Não foi detectada atividade a-amilásica. Soluções de proteínas do látex não exibiram atividade inibitória do tipo a-amilásica e tripsínica ou quimiotripsínica. Após tratamento térmico, proteínas do látex ainda solúveis foram capazes de inibir a atividade da papaína. Posteriormente esta atividade inibitória foi capaz de inibir as atividades proteolíticas de Callosobruchus maculatus e Dysdercus peruvianus. As proteínas do látex foram inseticidas para C. maculatus, Zabrotes subfasciatus, Anticarsia gemmatalis e Ceratitis capitata enquanto que não foram para Spodoptera frugiperda e D. peruvianus. Não houve efeito deletério acumulativo em insetos submetidos a uma dieta contendo proteínas do látex durante seis gerações. Quando digeridas por pronase e aquecidas por 30 min a 98 °C, a ação inseticida das proteínas do látex ainda foi mantida sobre o C. maculatus. As proteínas do látex foram completamente resistentes à proteólise por enzimas digestivas de Dysdercus peruvianus e Callosobruchus maculatus. Entretanto, a ação proteolítica endógena do látex promoveu a proteólise do extrato enzimático de C. maculatus embora isto não tenha ocorrido no extrato intestinal de D. peruvianus. O látex de C. procera apresenta forte atividade proteolítica e resistência à proteólise por enzimas digestivas de insetos. Atividade quitinolítica foi também observada. O látex possui atividade inseticida para diferentes pragas agrícolas e esta atividade parece estar associada à presença de um inibidor de atividade proteolítica do tipo cisteínica, além da presença de quitinases e elevada atividade proteolítica endógena. Assim, a fração protéica do látex pode ser considera como parte constituinte da defesa da planta contra insetos.

BANDEIRA, G. P. Caracterização bioquímica parcial do látex de Calotropis procera (Ait.) R.Br. e efeito sobre a eclosão de ovos e desenvolvimento larval do mosquito transmissor da dengue. 2006. 97 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2006. Calotropis procera (Ait.) R.Br. (Asclepiadaceae) is a well-known medicinal plant with leaves, roots and bark being exploited by popular medicine to fight many human and animal diseases. Despite, the lack of information about its biochemical content has stimulated the present study. Healthy plants of C. procera growing in the field around the beaches of Fortaleza were used as the source of fresh latex. The latex was collected in distilled water to give a dilution rate of 1:2 (v:v). The mixture was gently agitated during collection to overcome the natural coagulation effect of the material. Later in the laboratory the samples were centrifuged at 5.000 x g during 10 min at room temperature. The rubber-rich precipitate was separated and the supernatant was exhaustively dialyzed against distilled water at room temperature and recentrifuged using the conditions described above. Three distinct fractions were obtained: LP (rich in proteins); DL (rich in low molecular weight molecules) and RL (rich in poly-isoprene rubber). LP fraction constitutes 10.03 % of the dry matter of the latex while DL > 1% and RL 84.97 %. The latex possesses relevant amounts of HCO-3, Mg+2, Cl-, lower quantities of SO4-2 , NO3- , NO2-, NH4+ and P-3, while Ca+2 and Fe+2 were not detected. Proteins in LP showed molecular mass varying between 8,000 - 97,000 Da further confirmed by mass spectrometry. They are essentially basic proteins. RL and LP exhibited similar protein profile and peptides were detected in DL. LP could be fractionated in three newly fractions by ion exchange chromatography and able to bind chitin. Enzymatic activity of chitinases, superoxide dismutase and ascorbate peroxidases were detected. Glicoproteínas bearing oligomanosídic and N-acetylgalactosamine seems to be present in LP. The whole latex was shown to cause 100 % mortality of 3rd instars within five minutes. Both LP and DL fractions were partially effective to prevent egg hatching and most of individuals growing under experimental conditions died before reaching 2nd instars or stayed in 1st instars. Besides, the fractions were very toxic to 3rd instars causing 100 % mortality within 24 hs. When both fractions were submitted to heat-treatment the toxic effects of LP were strongly diminished while that of DL diminished slowly suggesting low thermostability of the toxic compounds in LP. According to the results, the latex of C. procera exhibits strong insecticide action upon St. aegypti and it is expected that proteins are at least in part involved in that an activity. Título - Caracterização Bioquímica Parcial do Látex de Calotropis procera (Ait.) R. Br. e Efeito Sobre a Eclosão de ovos e Desenvolvimento do mosquito transmissor da Dengue. Autor – Glaís de Paiva Bandeira. Introdução - O arbusto Calotropis procera (Ait.) R.Br. é um membro da família Asclepiadaceae. É vastamente encontrado no Estado do Ceará e tem como característica a produção de látex. Ao látex são atribuídas propriedades tóxicas e farmacológicas. Neste trabalho, uma caracterização bioquímica parcial do látex foi estabelecida e seu efeito sobre a eclosão de ovos e desenvolvimento larval do Mosquito transmissor da Dengue (Stegomyia aegypti) foi avaliado. Métodos - O látex foi coletado de plantas não cultivadas e após etapas de diálise e centrifugação deu origem a três frações: LP (rica em proteínas), DL (compostos de pequeno tamanho molecular e solúveis em água) e RL (fração rica em isopreno, insolúvel em água). Uma análise físico-química de elementos inorgânicos foi realizada. As frações foram analisadas através de eletroforese em uma e 2 dimensões, espectrometria de massas, técnicas cromatográficas e atividades enzimáticas. A presença de glicoproteínas foi investigada através de coloração em gel e análise por Ressonância Plasmônica de Superfície. Bioensaios para atividade ovicida e larvicida foram realizados com as frações LP e DL, além do látex íntegro. Resultados – A fração LP representou 10,03 % da massa seca do látex enquanto que DL representou menos que 1 % e RL 84,97 %. O látex possui quantidades apreciáveis de HCO-3, Mg+2, Cl-, quantidades menores de SO4-, NO3- , NO-2, NH4+ e P-3, enquanto que Ca+2 e Fe+2 não foram detectados. A fração PL apresentou proteínas com massa molecular relativa entre 8.000 - 97.000 Da e isto foi confirmado por Espectrometria de massa. Foi verificado que as frações RL e LP eram similares e peptídeos foram detectados na fração DL. A fração LP mostrou-se heterogênea em gel de eletroforese 2-D e as proteínas exibiram caráter essencialmente básico. Três picos protéicos foram recuperados por troca iônica. A fração LP foi capaz de se ligar à matriz de quitina e foi detectada atividade quitinásica. Atividades para, superóxido dismutase e ascorbato peroxidase foram detectadas, mas não para catalase. Glicoproteínas do tipo oligomanosídicas e N-acetillactosamina parecem estar presentes na fração LP. O látex total causou 100 % de mortalidade para larvas do terceiro estágio de St. aegypti. As frações também foram tóxicas causando 100 % mortalidade em 24 hs. Quando as frações LP e DL foram aquecidas a 100 °C a ação larvicida da fração LP diminuiu e a da fração DL foi pouco afetada sugerindo pouca termoestabilidade dos componentes ativos em LP. As frações LP e DL foram parcialmente efetivas em prevenir a eclosão dos ovos do mosquito e muitos dos indivíduos não atingiram o primeiro ou segundo estágio. É esperado que os efeitos tóxicos observados sobre a eclosão dos ovos e desenvolvimento das larvas poderiam ser, em parte, devido ao conteúdo protéico de LP.

AGUIAR, Valéria Cavalcanti de. Aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta Calotropis procera (Ait.) R. BR. 2006. 182 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2006. The latex of the lactiferous plant Calotropis procera (Ait.) R. Br. is an important biologically active compound that displays relevant properties like antiinflammatory and antidiarrhea activities, although the latex has previously been shown to produce considerable toxic effects on animals. Another question is that it is not known yet whether the latex proteins from C. procera induce allergenic effects, just like the latex proteins from Hevea brasiliensis. The potential of the latex as a pharmaceutical, therefore, depends on separating the curative properties from the toxic and allergenic properties, but there has been a lack of scientific investigation in this area. The objective of the present study was to investigate biochemical, toxicological and allergenic aspects of the latex from the plant C. procera, through the study of in vitro and in vivo digestibility, evaluation of acute and subchronic toxicity by oral route, and analysis of immune response induction by subcutaneous and oral route of its fractions. The latex was fractionated into three distinct fractions according to their water solubility and molecular size. The fractions were named as: latex proteins (LP), corresponding to the major latex proteins; dialysis proteins (DP), representing low molecular size substances; and rubber latex (RL), which was highly insoluble in water. LP fraction was investigated in some biochemical aspects, like its protein profile by SDS-PAGE analysis and its amino acid composition determination. Latex proteins were also subjected to in vitro digestion with trypsin, chemotrypsin, pepsin and Streptomyces griseus protease and in vitro digestibility was evaluated by gel filtration and SDS-PAGE analysis. The in vivo digestibility of LP was analyzed when experimental animals ingested this fraction for 35 days. The volume uptake of LP was recorded daily and samples of fecal material from animals were collected, treated and submitted to SDS-PAGE analysis and radial double immunodifusion assays, with polyclonal antibodies raised against LP. In relation to toxicological aspects, LP fraction was orally administered to experimental animals for 35 days, to allow subchronic toxicity evaluation. Increases in body mass were recorded and blood samples were analyzed weekly. After the test period, the animals were sacrificed and a number of biochemical and physiological parameters determined. These included sera determinations of blood glucose, total cholesterol, HDL-cholesterol, triglycerides, hepatic function tests (total proteins, albumin, alanine aminotransferase – ALT and aspartate aminotransferase – AST), renal function tests (urea and creatinin), total and differential leukocyte counts in blood and peritoneal fluid and analysis of sera proteins by SDS-PAGE. Animals had internal key organs (liver, kidneys, spleen, small intestine, large intestine, pancreas and stomach) dissected and the relative fresh masses were determined. In the acute toxicity evaluation, LP fraction was administered by oral route to experimental animals and behavioral changes in animals were also monitored. With reference to allergenic aspects, immunological responses of latex from C. procera were investigated by oral and subcutaneous routes in mice. Anti-sera against LP, DP and RL fractions were assayed for IgG and IgA titration by ELISA, while IgE and IgG1 were accessed by passive cutaneous anaphylaxis (PCA) in rats and mice, respectively. Protein profiles of LP and RL fractions were analyzed by SDS-PAGE. Concerning biochemical aspects results, LP fraction possesses appreciable amount of protein, low content of sulphurated amino acids (methionine and cysteine) and a considerable number of amino acids (arginine, lysine, phenylalanine and tyrosine) that represent cleavage sites to animal proteolytic enzymes studied. LP fraction was digested by the action of pepsin, trypsin and chemotrypsin as revealed by gel filtration and SDS-PAGE analyses. The full LP digestion was easily achieved by S. griseus protease treatment. Rabbit polyclonal antibodies raised against LP failed to detect cross-reactive molecules in faeces of experimental rats. Similar patterns of electrophoresis were observed for the negligible amounts of protein observed in the fecal materials of control and test animals. With relation to subchronic toxicity evaluation results, no death was observed during the experiment. Experimental and control animals presented similar growth rate and key organs exhibited similar relative fresh masses. Hepatic and renal functions, sera glycemic and lipidemic parameters were determined to be at normal levels. Likewise, the electrophoretic protein patterns of sera from untreated and treated animals exhibited quite similar profiles. Uptake of latex proteins did not induce acute inflammation into peritoneal cavity of rats as determined by the total and differential leukocytes counts. The most relevant result discovered was an apparent proliferative effect of the latex proteins upon blood lymphocytes that tended to increase, whilst neutrophils remained at normal level. It should be emphasized that the experimental rats were normal in their behavior, morphological and biochemical aspects, indicating that it is unlikely that they were under any pathological or infectious condition. Therefore, the increment of lymphocytes population in the blood serum should be attributed to the staking effect of the latex proteins rather than any harmful event. LP fraction was unable of presenting acute toxicity in experimental animals, because no behavioral changes in animals were observed. Concerning allergenic aspects results, none of the fractions induced antibodies level increases when mice received latex fractions by oral route and thus, did not develop allergy. Nonetheless, anti-sera of mice sensitized with LP and RL by subcutaneous administration displayed considerable immunological response, while DP did not induce antibodies synthesis. IgG level augmented consistently against LP and RL, while IgA response was detected to LP solely. LP and RL induced very strong PCA reactions suggesting that both fractions would contain latex substances involved in allergenicity. Furthermore, protein analysis of LP and RL suggests that RL still retain residual proteins, co-precipitated with rubber, abundantly found in LP, that could explain its similar allergenicity. No IgG1 reaction was detected in any of the anti-sera tested. It can be concluded that latex proteins were partially susceptible to digestive proteolysis when accessed by in vitro assays, and were digested and absorbed, or were absorbed in its intact form, when ingested and analyzed by in vivo tests. Toxic events or lethality associated with latex, as described in the literature, are not related to LP fraction. Latex proteins produced partial proliferative effect upon mononuclear cells, mainly lymphocytes and did not induce an acute inflammatory response, when administered by oral route. Allergenic effects could be detected, by subcutaneous route, with LP and RL fractions, and were not observed by oral route. Evidences for an inducible tolerance acquired to latex proteins by oral route were provided. Latex proteins may act as immune stimulants. The proteins from the latex remain an interesting source of biologically active molecules that should be studied in detail for their structural, functional and applicative properties. O látex da planta lactífera Calotropis procera (Ait.) R. Br. é um composto biologicamente ativo importante que apresenta propriedades relevantes como as atividades antiinflamatória e antidiarréica, embora já tenha sido previamente mostrado que esse látex produz efeitos tóxicos consideráveis em animais. Um outro fato é que não é sabido, ainda, se as proteínas do látex de C. procera produzem efeitos alergênicos, assim como as proteínas do látex de Hevea brasiliensis. O potencial do látex como um fármaco, por essa razão, depende da separação das propriedades curativas das propriedades tóxicas e alergênicas, mas não existe investigação científica nessa área. O presente estudo teve como objetivo investigar aspectos bioquímicos, toxicológicos e alergênicos do látex da planta C. procera, através do estudo da digestibilidade in vitro e in vivo, avaliação da toxicidade subcrônica e aguda por via oral e análise da indução de resposta imune pelas vias subcutânea e oral das suas frações. O látex foi fracionado em três frações distintas de acordo com a sua solubilidade em água e tamanho molecular. As frações foram assim denominadas: proteínas do látex (PL), correspondendo às principais proteínas do látex; proteínas da diálise (PD), representando as substâncias de baixa massa molecular; e borracha do látex (BL) que é altamente insolúvel em água. A fração PL foi investigada, com relação a alguns aspectos bioquímicos, como seu perfil protéico por PAGE-SDS e análise da composição de seus aminoácidos. As proteínas do látex também foram submetidas à digestão in vitro com as enzimas proteolíticas pepsina, tripsina, quimiotripsina e protease de Streptomyces griseus e a digestibilidade in vitro foi avaliada por cromatografia de filtração em gel ou PAGE-SDS. A digestibilidade in vivo de PL foi analisada quando animais experimentais ingeriram essa fração por 35 dias. O volume de PL consumido foi registrado diariamente e amostras das fezes dos animais coletadas, tratadas e submetidas à PAGE-SDS e ensaios de imunodifusão radial dupla de Ouchterlony, com anticorpos policlonais contra PL. Com relação aos aspectos toxicológicos, a fração PL foi oralmente administrada a animais experimentais por 35 dias, para a avaliação da toxicidade subcrônica. Aumentos na massa corpórea foram registrados e amostras sangüíneas foram analisadas semanalmente. Após o período experimental, os animais foram sacrificados e um número de parâmetros bioquímicos e fisiológicos foram determinados. Esses incluíram determinações séricas de glicose sangüínea, colesterol total, HDL-colesterol, triglicerídeos, testes da função hepática (proteínas totais, albumina, alanina aminotransferase – ALT e aspartato aminotransferase – AST), testes da função renal (uréia e creatinina), contagens total e diferencial de leucócitos sangüíneos e do fluido peritonial e análise das proteínas séricas por PAGE-SDS. Os animais tiveram seus órgãos vitais (fígado, rins, baço, intestino delgado, intestino grosso, pâncreas e estômago) dissecados e as massas frescas relativas foram determinadas. Na avaliação da toxicidade aguda, a fração PL foi administrada por via oral a animais experimentais e a monitoração de alterações comportamentais desses animais também foi realizada. Quanto aos aspectos alergênicos, respostas imunológicas do látex de C. procera foram investigadas pelas vias oral e subcutânea em camundongos. Anti-soros contra as frações PL, PD e BL foram analisados quanto a IgG e IgA por ELISA, enquanto IgE e IgG1 foram monitoradas por anafilaxia cutânea passiva (PCA) em ratos e camundongos, respectivamente. Os perfis protéicos das frações PL e BL foram analisados por PAGE-SDS. Com relação aos resultados dos aspectos bioquímicos, a fração PL possui uma quantidade apreciável de proteínas, baixo conteúdo de aminoácidos sulfurados (metionina e cisteína) e um número considerável de aminoácidos (arginina, lisina, fenilalanina e tirosina) que representam sítios de clivagem para as enzimas proteolíticas animais usadas. A fração PL foi digerida pela ação da pepsina, tripsina e quimiotripsina como revelado por análises de filtração em gel e PAGE-SDS. A digestão completa das proteínas do látex foi facilmente obtida pelo tratamento com a protease de S. griseus. Anticorpos policlonais de coelho produzidos contra PL não apresentaram reação cruzada com as moléculas presentes nas fezes dos ratos experimentais. Padrões semelhantes de eletroforese foram observados para as quantidades desprezíveis de proteína observadas nos materiais fecais dos animais controle e experimentais. Quanto aos resultados da avaliação da toxicidade subcrônica, nenhuma morte foi observada durante o experimento. Animais controle e experimentais apresentaram taxa de crescimento semelhante e os órgãos vitais exibiram massas frescas relativas similares. As funções hepática e renal, parâmetros glicêmicos e lipidêmicos séricos situaram-se em níveis normais. Os padrões protéicos eletroforéticos dos soros dos animais controle e experimental exibiram perfis muito similares. A fração PL não induziu inflamação aguda na cavidade peritonial dos ratos, como determinado pelas contagens total e diferencial de leucócitos. O resultado mais relevante detectado foi um aparente efeito proliferativo das proteínas do látex sobre os linfócitos sangüíneos que tenderam a aumentar, enquanto os neutrófilos permaneceram em nível normal. Deve ser enfatizado que os animais experimentais exibiram comportamento, aspectos morfológicos e bioquímicos normais, indicando ser improvável que os mesmos estivessem sob qualquer condição patológica ou infecciosa. Portanto, o incremento da população de linfócitos no soro sangüíneo deve ser atribuído a um efeito notável das proteínas do látex e não a qualquer evento prejudicial. A fração PL foi incapaz de induzir toxicidade aguda, pois nenhuma mudança comportamental foi observada nos animais experimentais. Com relação aos resultados dos aspectos alergênicos, nenhuma das frações induziu aumentos nos níveis de anticorpos, quando os camundongos receberam as frações do látex por via oral e, portanto, não desenvolveram alergia. Entretanto, anti-soros de camundongos sensibilizados com PL e BL por administração subcutânea apresentaram resposta imunológica considerável, e PD não induziu síntese de anticorpos. O nível de IgG aumentou consistentemente contra PL e BL, enquanto a resposta de IgA foi detectada unicamente contra PL. PL e BL induziram reações de PCA muito fortes, sugerindo que ambas as frações contêm substâncias do látex envolvidas na alergenicidade. Além disso, a análise protéica de PL e BL sugere que BL ainda retém proteínas residuais, co-precipitadas com a borracha, abundantemente encontradas na fração PL, que poderiam explicar as alergenicidades semelhantes. Nenhuma reação de IgG1 foi detectada em quaisquer dos anti-soros testados. Conclui-se que as proteínas do látex foram parcialmente susceptíveis à proteólise em ensaios in vitro e, ou foram digeridas e absorvidas, ou foram absorvidas íntegras, quando ingeridas em ensaios in vivo. Eventos tóxicos ou letalidade associados ao látex, como descritos na literatura, não estão relacionados com a fração PL. A fração PL produziu efeito proliferativo parcial sobre as células mononucleadas, principalmente linfócitos e não induziu resposta inflamatória aguda, quando administrada pela via oral. Efeitos alergênicos puderam ser detectados, por via subcutânea, com as frações PL e BL, e não foram observados por via oral. Evidências para uma possível tolerância sistêmica às proteínas do látex por via oral foram fornecidas. As proteínas do látex podem atuar como imunoestimulantes. As proteínas do látex permanecem uma fonte interessante de moléculas biologicamente ativas que devem ser estudadas em detalhe quanto às suas propriedades estruturais, funcionais e aplicativas.

Title: Molecular Basis of The Glycoconjugate Specificity of Lectins From SubTribe Diocleinae. Background: Proteins exhibiting non-catalytic binding sites towards carbohydrates form a class of very heterogeneous molecules commonly designed lectins. These proteins have been used as study-model molecules to understand the molecular basis of protein-carbohydrate interactions. Seeds of the subtribe Diocleinae are a rich source of lectins whose primary specificity is addressed to glucose/mannose monosaccharides. However, despite this and many other structural features shared by Diocleinae lectins they display difterent recognition to glycoconjugates like N-acetyllactosamine and oligomannoside types. The present work aimed to determine the molecular basis of the oligosaccharide specificity of the Diocleinae lectins towards glycoproteins and purified glycopeptides on a comparative basis to other legume lectins. The experimental strategy included analysis of the kinetic interaction (and inhibition) of soluble lectins with immobilized glycoproteins based on Surface Plasmon Resonance (RPS-BiaCore Technology); Aftinity of immobilized lectins to soluble radio-Iabelled oligosaccharides and glycopeptides and autoradiography analysis of the fractionated structures upon lectin aftinity column. Material and Methods: The seed lectins from Canavalia brasiliensis, C. maritima, C. bonariensis, Cratylia floribunda, Dioclea grandiflora, D. virgata and D. violacea, D. guianensis were purified by aftinity chromatography as previously described in the literature. The purified lectins were assayed for kinetic interaction analysis with immobilized glycoproteins exhibiting distinct oligosaccharide structures of N-acetyllactosamine and oligomannoside types and inhibition of the interaction by monosaccharides. Further, the glycoconjugate specificity of the lectins was investigated by aftinity chromatography of radio-Iabeled glycopeptides and oligosaccharides of difterent origins and well-defined structures on lectin-Sepharose 4B columns. The ability of these lectins to fractionate complex mixtures of closely related oligomannoside structures was determined by autoradiography analysis of the chromatography fractions eluted from the lectin columns. Results: The lectins showed ability to interact with glycoproteins exhibiting both Nacetyllactosamine and oligomannoside type glycans. The kinetic interaction varied considerably among the proteins under similar experimental conditions. The monosaccharides glucose and mannose were eftective to diminish lectinglycoprotein interactions at concentrations as lower as 25 mM. Upon affinity chromatography, the lectins showed interaction with N-acetyllactosamine type asparagin-glycopeptides but the recognition was limited to biantennary structures. Larger structures possessing three or more antennas were completely devoid of interaction. The lectins seem to bind and discriminate biantennary glyeopeptides/oligosaeeharides of N-aeetyllaetosamine type but failed to reeognize their eounterparts with multi-antennas. They were able to diseriminate native and asialo forms of the biantennary N-aeety//aetosamiane glyeopeptide purified from human serum transferrin. The affinity was maxima when the glycopeptide was previously digested to exhibit galactose and further N-acetylglucosamine in its non-reducing end. Its related oligosaccharide, devoid of sialic acid was recognized by D. virgata but not by D. violacea. Glycopeptides from Orosomucoide, containing mainly a mixture of bi- tri- and tetra-antennary glycopeptides were not recognized by the lectins. Interaction with oligomannosides was drastically differentiated. Affinity was proven to be stronger proportionally to the presence and number of mannose residues a-(1 -> 2) linked in the outer of structures. Thus Man9 was strongly recognized while Man5 was poorly. Of great relevance was that the lectins seems to be able to separate some of the oligomanoside structures within a complex mixture and it is not ruled out that Man8 or Man7 isomers could be fractionated under well-determined experimental conditions. Conclusions: Requisites for bind glycopeptides or oligosaccharides in the carbohydrate-binding site of the lectins include the presence of the monosaccharide inhibitor of the lectin activity and the accessibility for it, but does not define the affinity of the lectins for glycoconjugates. According to the results, the lectins may recognize internal mannose residues in the N-acetyllaetosamine type oligosaeeharides and the affinity increases as much exposed as the trimannoside core is presented. Regarding the recognition of oligomannosides the rule is opposite. The presence of Mannose residues a-(1->2) linked in the outer of structures seems to play a key role in the affinity. However the presence of these residues as occurs in Man6 and mainly in Man7 up to Man9 suggests that the monosaccharide that arbors the lectins should not be the same that plays this role in the interaction with N-acetyllactosamine type. Comparing this performance with that of other mannose-binding legume as Parkia platycephala and non-Iegume leetins it makes clear that the affinity to binding oligosaeeharides is not defined solely by the carbohydrate-binding but instead it, the vicinity of the monosaccharide pocket should possesses structural characteristies to differentiate each lectin-glycoconjugate complex that is supported by the concept of extended binding-site and epitope recognition. Divergences in affinity among Diocleinae lectins ought reflect this hypothesis and thus explain at least in part their differential performance in binding the same structure. This work was supported by grants from CAPES/COFECUB, CNPq, FUNCAPCe and International Foundation for Science. Título: Bases Moleculares da Interação de Lectinas da Sub-Tribo Diocleinae Com Glicoconjugados. Introdução: Proteínas que exibem um sítio de ligação não catalítico para carboidratos formam uma classe de moléculas muito heterogênea comumente denominada lectinas. Essas proteínas têm sido utilizadas como modelo de estudo no entendimento das bases moleculares das interações entre proteína-carboidrato. Sementes da subtribo Diocleinae são uma rica fonte de lectinas que apresentam especificidade primária dirigida para monossacarídeos glucose/manose. Todavia, apesar de lectinas Diocleinae compartilharem muitas características, elas exibem reconhecimento diferente para os glicoconjugados N-acetillactosamina e oligomanosídeo. O presente trabalho têm como objetivo determinar as bases moleculares da especificidade por oligossacarídeos de lectinas Diocleinae com realação a glicoproteínas e glicopeptídeos purificados comparando a outras lectinas de leguminosas. A estratégia experimental inclui análise da cinética de interação (e inibição) de lectinas solúveis com glicoproteínas imobilizadas baseado em Ressonância Plasmônica de Superfície (RPS-BiaCore Technology), afinidade de lectinas imobilidadas em Sepharose4B frente a glicopeptídeos e oligossacarídeos solúveis radiomarcados juntamente com a análise de autoradiografia de estruturas fracionadas a partir colunas de afinidade com lectinas imobilizadas. Material e Métodos: Lectinas de sementes de Canavalia brasiliensis, C. marítima, C. bonariensis, Cratylia floribunda, Dioclea grandiflora, D. Virgata, D. Víolacea e D. guianensis foram purificadas por cromatografia de afinidade como previamente descrito na literatura. As lectinas purificadas foram analisadas através de cinética de interação com glicoproteínas imobilizadas que exibiam diferentes estruturas oligossacarídicas dos tipos N-acetillactosamina e oligomanosídica e inibição destas interações por monossacarídeos. Além disso, a especificidade das lectinas por glicoconjugados foi investigada por cromatografia de afinidade de glicopeptídeos e oligossacarídeos de diferentes origens, com estruturas bem definidas, sobre colunas de lectinas-Sepharose 4B. A capacidade dessas lectinas de fracionar misturas complexas de estruturas oligomanosídicas com grande similaridade na estrutura linear foi determinada pela análise de autoradiografias das frações cromatográficas provindas das colunas de lectinas. Resultados: As lectinas mostraram habilidade de interagir com glicoproteínas que exibem glicanos dos tipos N-acetillactosamina e oligomanosídico. A cinética de interação variou consideravelmente entre as proteínas sobre as mesmas condições experimentais. Os monossacarídeos glucose e manose foram eficazes em reduzir a interação lectina-glicoproteínas em concentrações menor que 25mM. A partir do ensaio de cromatografia de afinidade, as lectinas mostraram interação com glicopeptídeos ligados a asparagina do tipo N-acetillactosamina, entretanto o reconhecimento foi limitado as estruturas biantenadas. Estruturas maiores possuindo três ou mais antenas foram completamente destituídas de interação. As lectinas parecem se ligar e diferenciar glicopeptídeos/oligossacarídeos biantenados do tipo N-acetillactosamina, mas falham em reconhecer estruturas multiantenadas. Foram capazes de diferenciar formas nativas e asialo de glicopeptídeos biantenados purificados da sorotransferrina humana. A atividade máxima observada foi quando o glicopeptídeo foi previamente digerido para exibir galactose e N-acetilglucosamina não reduzida na extremidade terminal. Este oligossacarídeo destituído de ácido siálico foi reconhecido por D. virgata, mas não por D. violacea. Glicopeptídeos de orosomucóide, apresentando principalmente uma mistura de glicanos bi- tri- e tetra-antenados não foram reconhecidos pelas lectinas. Interações com oligomanosídeos foram eficazmente diferenciadas. A afinidade foi demonstrada ser proporcionalmente mais forte quando há resíduos de manose ligado em a-(1 ~2) a estruturas externas. Neste caso Man9 foi fortemente reconhecido enquanto Man5 demonstrou uma fraca interação. A grande relevância foi que lectinas parecem ser capazes de separar estruturas oligomanisídicas dentro de uma mistura complexa. Isômeros de Man7 ou Man8 podem ser fracionados sob condições experimentais bem determinadas. Conclusões: Requisitos para ligações de glicopeptídeos ou oligossacarídeos em sítios de ligaçpes de carboidratos de lectinas incluem a presença de inibidor de monossacarídeos da atividade lectínica e a sua acessibilidade, mas não define a afinidade de lectinas para glicoconjugados. De acordo com os resultados, as lectinas podem reconhecer resíduos de manose interna em oligossacarídeos do tipo N-acetillactosamina e a afinidade é maior a proporção que a exposição do núcleo trimanosídeo aumenta. Com relação ao reconhecimento de oligomanosídeos o critério é oposto. A presença de resíduos de manose ligados a-(1 ~2) em outra estrutura parece ser a principal explicação para a afinidade. Entretanto a presença desses resíduos como ocorrem em Man6 e principalmente em Man7 até Man9 sugere que o monossacarídeo aceptor das lectinas poderia não ter o mesmo papel que desempenham na interação com o tipo N-acetillactosamina. Comparando esta performance com outras leguminosas que se ligam a manose como a lectina de semente de Parkia platycephala e lectina de não leguminosa fica claro que a afinidade de ligação a oligossacarídeos não se deve exclusivamente a ligação de carboidratos, além disso, as proximidades da cavidade para monossacarídeos poderiam possuir características estruturais diferenciadas em cada complexo lectina-glicoconjugado o que é sustentado pelo conceito de sítio de ligação estendido e reconhecimento de epítopo. Divergências de afinidades entre lectinas Diocleinae refletem essa hipótese e deste modo explica, ao menos em parte, suas diferenças de ligações pela mesma estrutura. Este trabalho foi financiado com auxílio de CAPES/COFECUB, CNPq, FUNCAP-Ce e International Foundation for Science (IFS). Bases moléculaires de Ia spécificité des lectines de Ia sous-tribu des Diocleinae envers les N- glycoprotéines. Situation du sujet: Les lectines sont des protéines três hétérogênes présentant des sites de reconnaissance des sucres et dépourvues d'activités enzymatiques. Ces lectines sont utilisées pour comprendre les bases moléculaires des interactions protéines-sucres. Les graines de Ia sous-tribu des Diocleinae sont três riches en lectines dites glucose ou mannose spécifiques. Cependant, malgré cette spécificité primaire et en dépit d'éléments structuraux communs, les lectines des Diocleinae reconnaissent différemment des N-glycoprotéines avec des glycannes de type N-acétyllactosaminique ou de type oligomannosidique. Ce travail a pour but Ia détermination des bases moléculaires de Ia reconnaissance par ces lectines de séquences oligosaccharidiques appartenant à des N-glycoprotéines ou à des N-glycopeptides. L'approche expérimentale fait appel à des études d'interaction et d'inhibition des interactions en temps réel entre des glycoprotéines immobilisées et les lectines en solution suivies par résonance plasmonique de surface (Technologie RPS-BiaCore) et à I'étude du comportement d'oligosaccharides ou de glycopeptides radiomarqués sur des colonnes de lectines immobilisées. Matériels et méthodes: Les lectines de graines de Canavalía brasiliensis, C. marítima, C. bonariensis, Cratylia floribunda, Dioclea grandiflora, D. virgata, D. violacea et D. guianensis ont été isolées par chromatographie d'aftinité selon les méthodes décrites dans Ia Iittérature. L'analyse des interactions entre ces lectines purifiées et des N-glycoprotéines avec des structures glycanniques de type N-acétyllactosaminique ou oligomannosidique connues immobilisées ainsi que I'inhibition de ces interactions par diftérents monosaccharides a été suivie en temps réel par résonance plasmonique de surface (appareil BiaCore). La spécificité fine de ces lectines a également été suivie par étude du comportement chromatographique d'oligosaccharides ou de N-glycopeptides de structures connues sur des colonnes de lectines immobilisées sur Sepharose 4B. La possibilité de fractionner un mélange complexe de structures oligomannosidiques à I'aide de ces lectines immobilisées a été étudiée par analyse autoradiographique des diftérentes fractions obtenues. Résultats: Les lectines de Diocleinae interagissent avec diftérentes Nglycoprotéines présentant des glycannes de type N-acétyllactosaminique ou oligomannosidique. Cependant, dans des conditions identiques, les cinétiques d'interaction obtenues avec les diftérentes lectines varient considérablement. O'autre part, même à faible concentration (25mM), le glucose et le mannose inhibent les interactions lectines-glycoprotéines. Les lectines immobilisées présentent une affinité pour des N-glycopeptides contenant des glycannes de type N-acétyllactosaminique biantennés ou pour les oligosaccharides correspondants. Des N-glycopeptides avec des glycannes de type N-acétyllactosaminique tri- ou tétraantennés ou les oligosaccharides correspondants ne sont pas reconnus. L'affinité optimale est dirigée envers des structures biantennées présentant 2 résidus de N-acétylglucosamine en position terminale non réductrice. Cependant, les asialoglycannes biantennés correspondants sont reconnus par Ia lectine de D. virgata alors que celle de D. violacea ne les reconnait pas. L'affinité des lectines envers différentes structures oligomannosidiques dépend de Ia présence et du nombre de résidus de mannose liés en, 1-2 en position terminale non réductrice.xwvutsrqponm Conclusions: Les résultats obtenus montrent que les lectines de Diocleinae étudiées sont capables de reconnaitre les résidus de mannose internes du noyau trimannosidique de glycannes de type N-acétyllactosaminique biantennés. Cette affinité augmente en fonction de I'accessibilité du noyau trimannosidique à Ia lectine. D'autre part, I'affinité de ces lectines envers différentes structures oligomannosidiques dépend de Ia présence de résidus de mannose liés en, 1-2 en position terminale non réductrice et augmente en fonction du nombre de ces résidus de mannose accessibles à Ia lectine. Ce travail a été subventionné par le CAPES/COFECUB, le CNPq, le FUNCAP-Ce et l'lnternational Foundation for Science.