Search

As the percentage of antibiotic-resistant bacteria increases, alternative treatment options to deprive their pathogenicity are needed. Bacterial pathogens like Vibrio parahaemolyticus manipulate the host proteome by effector protein-mediated AMPylation. By analyzing diverse MS quantification methods in combination with different infection strategies, this thesis established a proteomic profiling approach to identify bacterially induced host AMPylation targets under physiological conditions., Da der Anteil antibiotikaresistenter Bakterien zunimmt, werden Behandlungsmöglichkeiten benötigt, um sie ihrer Pathogenität zu berauben. Bakterielle Pathogene wie V. parahaemolyticus manipulieren das Wirtsproteom durch AMPylierung. Durch die Kombination von MS-Quantifizierungsmethoden mit unterschiedlichen Infektionsstrategien wurde in dieser Arbeit ein proteomischer Profiling-Ansatz etabliert, der bakteriell induzierte Wirts-AMPylierungsziele unter physiologischen Bedingungen identifiziert.

ClpP is a barrel-shaped serine protease, composed of two heptameric rings that forms a proteolytically active complex with ATP-dependent chaperone ClpX. In this thesis, a novel inhibitor class for human ClpXP is described that showed promising anti-proliferative activity against cancer cells. Furthermore, investigations with structurally modified ClpP mutants enabled the identification of novel substrates of the protease in human cells. A similar approach with modified phenyl ester peptidomimetics allowed for substrate identification in the human pathogen Staphylococcus aureus., ClpP ist eine fassförmige Serinprotease, die aus zwei heptameren Ringen besteht und mit dem ATP-abhängigen Chaperon ClpX einen proteolytisch aktiven Komplex bildet. In dieser Arbeit wird eine neue Inhibitorklasse für humanes ClpXP beschrieben, die eine vielversprechende antiproliferative Aktivität gegen Krebszellen zeigte. Darüber hinaus ermöglichten Untersuchungen mit strukturell modifizierten ClpP-Mutanten die Identifizierung neuer Substrate der Protease in menschlichen Zellen. Ein ähnlicher Ansatz mit modifizierten Phenylester-Peptidomimetika ermöglichte die Identifizierung von Substraten in Staphylococcus aureus.

Natural products have played an important role in the history of modern drug discovery, since penicillin was discovered by Scottish scientist Alexander Fleming in 1927. Afterwards, scientists concentrated on the isolation or extraction of the bioactive substrates from natural products. From 1950s, a number of scientists started not only to isolate or extract something, but also to analyze the chemical structure of it with the advent of NMR spectroscopy to date. With the development of it, researchers have been able to synthesize natural products or synthetic compounds in the lab, which could be leads or candidates for drug development. Activity-based protein profiling (ABPP) is a very powerful tool of chemical proteomics. And the ABP probe is derived from its original bioactive-compound by introducing cell permeable moieties such as a terminal alkyne or an azide, thereby being tagged to a reporter group which enables isolation of probe-labeled protein(s). This thesis describes the entire process of early part of drug discovery, from discovery and synthesis of natural products, artificial compounds, and their ABP probes to target identification and validation by the ABPP experiment and other biological assays. The first part of the thesis covers synthetic approaches towards the total synthesis of smenothiazole A, B and their probes. Next, degrasyn originally developed as the human deubiquitination enzyme (DUB) inhibitor was repurposed as an antimicrobial compound, and its activity against gram positive bacteria, Staphylococcus aureus (S. aureus) and its methicillin-resistant strains was confirmed. Subsequently, a polypharmacological mode-of-action was corroborated by the ABPP experiments, competitive isoDTB-ABPP, and global proteome analysis. Last, a hybrid of the indolin-2-one and the nitroimidazole compound, LK1602, exhibited excellent activity against both gram positive and negative bacteria, and its ABP probes preserves the bioactivities against S. aureus. Theref, Seit der Entdeckung des Penicillins 1927 durch Alexander Fleming ist die enorme Bedeutung von Naturstoffen in der Medikamentenentwicklung bekannt. Die Isolation und Extraktion solcher aktiven Substanzen steht seither im Mittelpunkt vieler Wissenschaftler. Durch moderne Methoden wie der NMR-Spektroskopie konnten die Strukturen auch aufgeklärt werden. Damit sind sie synthetisch zugänglich und potentielle Kandidaten für die Medikamentenentwicklung. Aktivitäts-basiertes Protein (ABPP) ist eine leistungsfähige Methode für chemische Proteomik. Dazu wird eine aktivitäts-basierte Sonde (ABP) von der bioaktiven Ursprungsstruktur abgeleitet, welche zellpermeabel ist und eine Alkin- oder Azid-Funktionalität besitzt, um die gebundenen Zielproteine später durch Affinitätschromatographie isolieren zu können. Diese Arbeit befasst sich mit dem kompletten Prozess der frühen Medikamentenentwicklung, von der Entdeckung und Synthese von Naturstoffen sowie anderen aktiven Molekülen und deren ABP’s, um damit die Zielproteine identifizieren und validieren zu können. Der erste Teil handelt von synthetischen Ansätzen, die Naturstoffe Smenothiazol A, B und deren ABP’s herzustellen. Danach wurde die Aktivität des ursprünglich als Inhibitor des humanen deubiquitinylierungs-Enzyms (DUB) geltende Degrasyn gegenüber gram-positive Staphylococcus aureus und dessen Methicillin-resistente Stämme auf antimikrobielle Eigenschaften getestet. Weiterhin wurde ein polypharmakologischer Wirkungsmechanismus durch konventionelle ABPP- sowie kompetitive isoDTB-ABPP-Experimente und globale Proteomanalysen bestätigt. Zuletzt wird die hervorragende Aktivität der Verbindung LK1602, ein Indolin-2-on Derivat mit einer Nitroimizalol-Einheit, gegen gram-positive als auch gram-negative Bakterien beschrieben. Für die Entschlüsselung der Zielproteine dieser Verbindung wurden abermals ABP’s synthetisiert, wovon zwei Sonden die Aktivität bewahrten und somit in weiteren ABPP-Experimenten zum Einsatz kommen werden.

The impact of Lewis acids on photochemical reactions of conjugated carbonyl compounds was studied in two projects. The first project used model complexes and a combination of experiments, theory and spectroscopy to evaluate mechanistic hypotheses and find novel reactivity. The second project investigated the photoinduced E-Z isomerization of cycloheptene derivatives, including cyclohept-2-en-1-one and cyclohept-1-ene-1-carbaldehyde. Thermal background reactions with Lewis acids rendered them unsuitable for photoinduced Diels-Alder reactions., Der Einfluss von Lewis-Säuren auf photochemische Reaktionen konjugierter Carbonylverbindungen wurde untersucht. Modellkomplexe und eine Kombination aus Experimenten, Theorie und Spektroskopie wurden genutzt, um mechanistische Hypothesen zu bewerten und neue Reaktivitäten zu finden. Außerdem wurde die photoinduzierte E-Z-Isomerisierung von Cycloheptenderivaten untersucht, einschließlich Cyclohept-2-en-1-on und Cyclohept-1-en-1-carbaldehyd. Thermische Hintergrundreaktionen mit Lewis-Säuren machten sie für photoinduzierte Diels-Alder-Reaktionen ungeeignet.

Most drugs bind proteins and modulate their functions. Chemoproteomic methods allow to profile drugs for their binding affinity to thousands of proteins in a single experiment, enabling the identification of drug targets and the understanding of drug mode of action. Here, chemoproteomic technologies were developed to perform drug target deconvolution and selectivity profiling of over 50 HDAC inhibitors. Our results question claimed selectivities of widely-used inhibitors, identified MBLAC2 as common off-target, and uncovered HDACs as targets of the approved drug lipoic acid., Die meisten Wirkstoffe binden Proteine und modulieren deren Funktionen. Mit chemoproteomischen Methoden können Wirkstoffe in einem einzigen Experiment auf ihre Bindungsaffinität zu Tausenden von Proteinen hin geprüft werden, was die Identifizierung von Wirkstoff-Zielproteinen und das Verständnis der Wirkungsweise von Arzneimitteln ermöglicht. In dieser Arbeit wurden chemoproteomische Technologien entwickelt, um die Dekonvolution von Zielproteinen und die Erstellung von Selektivitätsprofilen von über 50 HDAC-Inhibitoren durchzuführen. Unsere Ergebnisse stellen die behaupteten Selektivitäten weit verbreiteter Inhibitoren in Frage, identifizierten MBLAC2 als häufiges Off-Target und deckten HDACs als Ziele des zugelassenen Medikaments Liponsäure auf.

In this work, the mechanism of action of the natural product xanthocillin X was elucidated, which exhibits impressive activity against numerous bacterial pathogens. As it turned out, xanthocillin X binds to the cofactor heme and a dysregulation of the heme biosynthesis is the lethal consequence. In the second part of the work, probes based on the pyridoxal scaffold have been developed, which allow a reliable detection of pyridoxal kinases in bacteria that form a hemithioacetal with pyridoxal during catalysis., Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Wirkungsmechanismus des Naturstoffs Xanthocillin X aufgeklärt, der eine beeindruckende Aktivität gegen zahlreiche bakterielle Krankheitserreger aufweist. Wie sich herausstellte, bindet Xanthocillin X an den Cofaktor Häm und eine Dysregulierung der Häm-Biosynthese ist die letale Folge. Im zweiten Teil der Arbeit wurden Sonden basierend auf dem Grundgerüst des Pyridoxals entwickelt, mit denen Pyridoxalkinasen, die bei der Katalyse mit Pyridoxal ein Hemithioacetal bilden, in Bakterien zuverlässig nachgewiesen werden können.

PK150, a new antibiotic derived from the anti-cancer drug sorafenib, is active against MRSA, kills persister cells, reduces biofilms, and does not induce resistance under laboratory conditions. Mode-of-action analysis unveiled two independent protein targets: the inhibition of menaquinone methyltransferase (MenG) and activation of SpsB, a signal peptidase in the secretory pathway. MenG, but not SpsB, was further found to be a molecular target of the structurally related disinfectant triclocarban., PK150, ein neues Antibiotikum abgeleitet vom Krebsmedikament Sorafenib, ist aktiv gegen MRSA, tötet Persister-Zellen, reduziert Biofilme und erzeugt keine Resistenz unter Laborbedingungen. Die Analyse des Wirkmechanismus offenbarte zwei unabhängige Protein-Zielstrukturen: die Inhibition der Menachinon-Methyltransferase (MenG) und die Aktivierung von SpsB, einer Signalpeptidase im Sekretionsweg. MenG, aber nicht SpsB, wurde zudem als molekulare Zielstruktur des strukturell verwandten Desinfektionsmittels Triclocarban bestätigt.

The ClpXP protease complex is important for targeted protein degradation in bacteria and in organelles of eukaryotic cells. The complex consists of the AAA+ chaperone ClpX and the peptidase ClpP. While the majority of bacteria utilize only a single ClpP, Listeria monocytogenes expresses two isoforms. LmClpPs assemble into either a LmClpP2 homocomplex or a LmClpP1/2 heterocomplex. In this thesis, the function of the ClpP1/2 heterocomplex and the structure of the ClpXP1/2 complex is examined., Der ClpXP-Proteasekomplex ist wichtig für gezielte Proteolyse in Bakterien und in Organellen von eukaryotischen Zellen. Der Komplex besteht aus dem AAA+ Chaperon ClpX und aus der Peptidase ClpP. Während die meisten Bakterien nur ein ClpP haben, besitzt Listeria monocytogenes zwei Isoformen. Sie bilden entweder einen ClpP2-Homokomplex, oder einen ClpP1/2-Heterokomplex. In dieser Dissertation werden die Funktion des ClpP1/2-Heterokomplexes und die Struktur des ClpXP1/2-Komplexes untersucht.

The so far unexplored, cytotoxic natural product neocarzilin A (NCA) was detected to inhibit cell proliferation and cell migration of human breast cancer cells. ABPP (Activity-based protein profiling) approaches identified VAT-1 as cellular target protein of NCA. Orthogonal approaches confirmed the identity of the protein and detected the region involved in natural product binding. Further, VAT-1, which is mainly relevant for inhibition of cell migration, was revealed to be intricated in a network of proteins involved in cell adhesion by mass spectrometry-based co-immunoprecipitation., Eine Hemmung der Zellproliferation und Migration von humanen Brustkrebszellen wurde für den bisher unerforschten, cytotoxischen Naturstoff Neocarzilin A (NCA) gezeigt. VAT-1 wurde als zelluläres Zielprotein von NCA durch ABPP (Aktivitäts-basiertes Protein-Profiling) identifiziert. Orthogonale Ansätze bestätigten das Zielprotein und die Region in der Proteinsequenz, die für die Interaktion relevant ist. Zusätzlich zeigte eine Massenspektrometrie-basierte Ko-Immunopräzipitation, dass VAT-1, welches vor allem für die Hemmung der Zellmigration verantwortlich ist, in einem Netzwerk von Zelladhäsions-Proteinen verwickelt ist.

The molecular targets of natural product vioprolide A were elucidated in the human cancer cell line Jurkat by the application of diverse mass spectrometry-based proteomics experiments, elucidating U2SURP and NOP14 as molecular targets. Diverse biochemical and MS-based methods were utilized to validate the identified targets. In a second project, the global impact on the proteome and the metabolome of S. aureus by the protolytic ClpXP machinery was elucidated, using MS-based whole proteome and secretome studies, as well as initial metabolomics experiments., Die molekularen Angriffsziele des Naturstoffes Vioprolid A wurden in der humanen Krebszelllinie Jurkat durch die Anwendung unterschiedlicher massenspektrometrie-gestützter Proteomikexperimente ermittelt. Hierbei wurden U2SURP und NOP14 als Zielstrukturen identifiziert. Diese wurden in weiterführenden biochemischen und MS-basierten Experimenten validiert. Im zweiten Projekt wurde der globale Einfluss der ClpXP Maschinerie auf das Metabolom und Proteom von S. aureus mittels MS-basierten Vollproteom- und Sekretomstudien sowie erster Metabolomexperimente evaluiert.

ClpP is a barrel-shaped serine protease, composed of two heptameric rings that forms a proteolytically active complex with ATP-dependent chaperone ClpX. In this thesis, a novel inhibitor class for human ClpXP is described that showed promising anti-proliferative activity against cancer cells. Furthermore, investigations with structurally modified ClpP mutants enabled the identification of novel substrates of the protease in human cells. A similar approach with modified phenyl ester peptidomimetics allowed for substrate identification in the human pathogen Staphylococcus aureus., ClpP ist eine fassförmige Serinprotease, die aus zwei heptameren Ringen besteht und mit dem ATP-abhängigen Chaperon ClpX einen proteolytisch aktiven Komplex bildet. In dieser Arbeit wird eine neue Inhibitorklasse für humanes ClpXP beschrieben, die eine vielversprechende antiproliferative Aktivität gegen Krebszellen zeigte. Darüber hinaus ermöglichten Untersuchungen mit strukturell modifizierten ClpP-Mutanten die Identifizierung neuer Substrate der Protease in menschlichen Zellen. Ein ähnlicher Ansatz mit modifizierten Phenylester-Peptidomimetika ermöglichte die Identifizierung von Substraten in Staphylococcus aureus.

Natural products have played an important role in the history of modern drug discovery, since penicillin was discovered by Scottish scientist Alexander Fleming in 1927. Afterwards, scientists concentrated on the isolation or extraction of the bioactive substrates from natural products. From 1950s, a number of scientists started not only to isolate or extract something, but also to analyze the chemical structure of it with the advent of NMR spectroscopy to date. With the development of it, researchers have been able to synthesize natural products or synthetic compounds in the lab, which could be leads or candidates for drug development. Activity-based protein profiling (ABPP) is a very powerful tool of chemical proteomics. And the ABP probe is derived from its original bioactive-compound by introducing cell permeable moieties such as a terminal alkyne or an azide, thereby being tagged to a reporter group which enables isolation of probe-labeled protein(s). This thesis describes the entire process of early part of drug discovery, from discovery and synthesis of natural products, artificial compounds, and their ABP probes to target identification and validation by the ABPP experiment and other biological assays. The first part of the thesis covers synthetic approaches towards the total synthesis of smenothiazole A, B and their probes. Next, degrasyn originally developed as the human deubiquitination enzyme (DUB) inhibitor was repurposed as an antimicrobial compound, and its activity against gram positive bacteria, Staphylococcus aureus (S. aureus) and its methicillin-resistant strains was confirmed. Subsequently, a polypharmacological mode-of-action was corroborated by the ABPP experiments, competitive isoDTB-ABPP, and global proteome analysis. Last, a hybrid of the indolin-2-one and the nitroimidazole compound, LK1602, exhibited excellent activity against both gram positive and negative bacteria, and its ABP probes preserves the bioactivities against S. aureus. Theref, Seit der Entdeckung des Penicillins 1927 durch Alexander Fleming ist die enorme Bedeutung von Naturstoffen in der Medikamentenentwicklung bekannt. Die Isolation und Extraktion solcher aktiven Substanzen steht seither im Mittelpunkt vieler Wissenschaftler. Durch moderne Methoden wie der NMR-Spektroskopie konnten die Strukturen auch aufgeklärt werden. Damit sind sie synthetisch zugänglich und potentielle Kandidaten für die Medikamentenentwicklung. Aktivitäts-basiertes Protein (ABPP) ist eine leistungsfähige Methode für chemische Proteomik. Dazu wird eine aktivitäts-basierte Sonde (ABP) von der bioaktiven Ursprungsstruktur abgeleitet, welche zellpermeabel ist und eine Alkin- oder Azid-Funktionalität besitzt, um die gebundenen Zielproteine später durch Affinitätschromatographie isolieren zu können. Diese Arbeit befasst sich mit dem kompletten Prozess der frühen Medikamentenentwicklung, von der Entdeckung und Synthese von Naturstoffen sowie anderen aktiven Molekülen und deren ABP’s, um damit die Zielproteine identifizieren und validieren zu können. Der erste Teil handelt von synthetischen Ansätzen, die Naturstoffe Smenothiazol A, B und deren ABP’s herzustellen. Danach wurde die Aktivität des ursprünglich als Inhibitor des humanen deubiquitinylierungs-Enzyms (DUB) geltende Degrasyn gegenüber gram-positive Staphylococcus aureus und dessen Methicillin-resistente Stämme auf antimikrobielle Eigenschaften getestet. Weiterhin wurde ein polypharmakologischer Wirkungsmechanismus durch konventionelle ABPP- sowie kompetitive isoDTB-ABPP-Experimente und globale Proteomanalysen bestätigt. Zuletzt wird die hervorragende Aktivität der Verbindung LK1602, ein Indolin-2-on Derivat mit einer Nitroimizalol-Einheit, gegen gram-positive als auch gram-negative Bakterien beschrieben. Für die Entschlüsselung der Zielproteine dieser Verbindung wurden abermals ABP’s synthetisiert, wovon zwei Sonden die Aktivität bewahrten und somit in weiteren ABPP-Experimenten zum Einsatz kommen werden.

As the percentage of antibiotic-resistant bacteria increases, alternative treatment options to deprive their pathogenicity are needed. Bacterial pathogens like Vibrio parahaemolyticus manipulate the host proteome by effector protein-mediated AMPylation. By analyzing diverse MS quantification methods in combination with different infection strategies, this thesis established a proteomic profiling approach to identify bacterially induced host AMPylation targets under physiological conditions., Da der Anteil antibiotikaresistenter Bakterien zunimmt, werden Behandlungsmöglichkeiten benötigt, um sie ihrer Pathogenität zu berauben. Bakterielle Pathogene wie V. parahaemolyticus manipulieren das Wirtsproteom durch AMPylierung. Durch die Kombination von MS-Quantifizierungsmethoden mit unterschiedlichen Infektionsstrategien wurde in dieser Arbeit ein proteomischer Profiling-Ansatz etabliert, der bakteriell induzierte Wirts-AMPylierungsziele unter physiologischen Bedingungen identifiziert.