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Photolyasen reparieren UV-induzierte Cyclobutan-Pyrimidindimere (CPD) oder (6-4)-Photoprodukte in der DNA durch den lichtabhängigen Prozess der Photoreaktivierung. Sie sind nah verwandt mit den Cryptochromen, die als Blaulicht-Photorezeptoren regulatorische Funktionen ausüben. Mitglieder der Cryptochrom/Photolyase-Familie (CPF) sind in allen Domänen des Lebens vertreten. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass das Cryptochrom CryB aus Rhodobacter sphaeroides aus der Untergruppe der FeS-BCP neben seiner regulatorischen Funktion auch eine Reparaturaktivität zur Spaltung von (6-4)-Photoprodukten besitzt. Damit kann CryB den dual-function-Mitgliedern der CPF zugeordnet werden. Durch den Austausch von Aminosäuren konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der drei Cofaktoren von CryB bei der Photoreaktivierung gewonnen werden. Der Fokus lag dabei auf in vivo Untersuchungen der CryB-Varianten im Knockout-Stamm R. sphaeroides ΔcryB. Es wurde festgestellt, dass der Elektronentransferweg über die Tryptophan-Diade, die essenziell für die in vitro Reduktion des FAD und die Reparaturfunktion von CryB ist, für die in vivo Photoreaktivierung verzichtbar ist. Der in der CPF neuartige Antennenchromophor 6,7-Dimethyl-8-ribityllumazin (DLZ) ist bei geringen Lichtintensitäten von Bedeutung für eine effiziente Reparatur. Die Entfernung oder Beeinträchtigung einer der lichtabsorbierenden Cofaktoren, FAD oder DLZ, bewirkte keinen Funktionsverlust, jedoch eine stark verringerte Effizienz der Photoreaktivierung. Die Beeinträchtigung beider Cofaktoren zusammen durch Mutagenese verringerte die CryB-abhängige Photoreaktivierungsfähigkeit auf das Level von ΔcryB. Ein Eisen-Schwefel-Cluster kommt als Cofaktor von Photolyasen und Cryptochromen nur in der FeS-BCP-Untergruppe vor. Es konnte gezeigt werden, dass das Cluster für die strukturelle Integrität des Proteins unverzichtbar ist. Seine Funktion bei der DNA-Reparatur oder bei regulatorischen Prozessen ist nicht abschließend geklärt, dies bedarf weiterer Untersuchungen. Die Kultivierung verschiedener cryB-Knockoutstämme in An- und Abwesenheit von Antibiotika hat ergeben, dass Kanamycin einen deutlich stärkeren Einfluss auf den kanamycinresistenten Stamm ∆cryB hat, als dies bei anderen kanamycinresistenten Stämmen der Fall ist. Der Stamm zeigt vermutlich aufgrund einer eingeschränkten Expression seines Resistenzgens eine erhöhte Sensitivität gegenüber Kanamycin. Ein zuvor unter mikroaeroben Bedingungen beobachteter Phänotyp ist somit wahrscheinlich auf einen durch Kanamycin beeinflussten Effekt zurückzuführen. CryB interagiert mit dem Photorezeptor AppA. Durch Interaktionsanalysen konnte gezeigt werden, dass die Proteine wahrscheinlich an ihren jeweiligen C-Termini miteinander interagieren. Eine Co-Kristallisation war bislang nicht erfolgreich; weitere Versuche können in Zukunft Aufschluss über Details der Interaktion geben. Photolyases repair UV-induced cyclobutane pyrimidine dimers (CPD) or (6-4) photoproducts in DNA through the light-dependent process of photoreactivation. They are closely related to the cryptochrome blue light photoreceptors, which carry out regulatory functions. Members of the cryptochrome/photolyase family (CPF) are present in all domains of life. This study demonstrates that Rhodobacter sphaeroides cryptochrome CryB, belonging to the sub-group of FeS-BCP, exhibits a repair activity allowing cleavage of (6-4) photoproducts in addition to its regulatory function. Thus, CryB can be assigned to the dual function members of the CPF. Through amino acid exchanges, new insights about the role of the three cofactors of CryB in photoreactivation were obtained. The focus of this work was on in vivo investigations of the CryB variants in the knockout strain R. sphaeroides ΔcryB. It was found that the electron transfer pathway via a tryptophane diad, which is crucial for in vitro reduction of FAD and the repair function of CryB, is not required for in vivo photoreactivation. The novel antenna chromophore of the CPF, 6,7-dimethyl-8-ribityllumazin (DLZ), is of importance for an efficient repair at low light intensities. Removal or impairment of one of the two light-absorbing cofactors, FAD or DLZ, did not cause a loss of function, but strongly affected the efficiency of photoreactivation. The impairment of both cofactors together through mutagenesis decreased CryB-dependent photoreactivation to the level of ΔcryB. The occurence of an iron-sulfur cluster as a cofactor of photolyases and cryptochromes is restricted to the FeS-BCP sub-group. It could be shown that the cluster is indispensable for the structural integrity of the protein. Its function in DNA repair or in regulatory processes has not yet been conclusively settled, this requires further investigations. The cultivation of different knockout strains of CryB in presence or absence of antibiotics has shown that kanamycin has a much stronger influence on the kanamycin-resistant strain ΔcryB than on other strains resistant to kanamycin. This strain shows an increased sensitivity towards kanamycin, probably due to a decreased expression of its resistance gene. A phenotype previously observed under microaerobic conditions thus probably results from a kanamycin-induced effect. CryB interacts with the photoreceptor AppA. Interaction analyses could show that both proteins probably interact at their respective C-termini. A co-crystallisation has not been successful, but further attempts may give information about details of their interaction in the future.

The data obtained in the presented work again emphasise the importance of bacterial sRNA as regulators that fine-tune the metabolism and promote the stress defence upon changes in the environment (reviewed in Wagner and Romby, 2015). For the investigated model R. sphaeroides, a microorganism displaying a great metabolic versatility, many proteinaceous factors in the adaptation and response to environmental stimuli are known which mainly comprise receptors, transcription factors, and alternative sigma factors (described in 1.4, 1.6, 1.9.2, and 1.9.4). Since the discovery of a vast set of sRNAs in 2009 (Berghoff et al., 2009), the function of four of these sRNAs, namely PcrZ, CcsR1-4, SorY, and SorX, has been described (1.9.5), giving an even more detailed overview of the adaptation abilities of R. sphaeroides. In line with these descriptions, the here investigated sRNAs Pos19, PcrX, and RSs0827 affect adaptive metabolic changes as well as the cells response in the defence against oxidative stress. The sRNA Pos19 was found to affect pathways in the sulphur- and following glutathione (GSH) synthesis, by repressing a set of sulphur genes and the hypothetical protein RSP_0557. For the latter, a balanced expression seems to be required for a balanced cellular GSH pool. By means of these fine-tuning aspects of the sulphur metabolism that result in balanced cysteine and GSH levels, the RpoE-dependent sRNA Pos19 contributes to the refined response to oxidative stress. Additionally, Pos19 encodes a small peptide whose function so far remains enigmatic. Still, the survey concerning the peptide translation indicated that in R. sphaeroides the Shine-Dalgarno sequence is not essential for translation initiation, as it is known for other prokaryotes (Omotajo et al., 2015). The sRNA PcrX was found to be encoded in and processed from the 3’UTR of the puf mRNA. In the last years more and more focus was put on 3’UTR derived sRNAs (reviewed in Miyakoshi et al., 2015). Interestingly, PcrX was found to regulate its parental mRNA via binding to the pufX part of the polycistronic mRNA. The obtained data hint towards the hypothesis that PcrX is involved in the segmental stability of the puf mRNA which is needed to ensure the translation of the encoded photosynthetic components in a stoichiometric amount. Another facet of the sRNA besides the “selfcontrol” of its parental mRNA could be the regulation of additional genes. This idea is supported by the findings that the PcrX over-expression affects the mRNA levels of bchN and bchY, and that PcrX was found to be Hfq-bound, even though the effect on pufX seems to be independent of Hfq. Taken together, PcrX displays the second sRNA involved in the photosynthesis gene regulation of R. sphaeroides besides PcrZ. Regarding the sRNA RSs0827, the newly obtained data strongly support the finding that the sRNA interacts with and thereby regulates the rpoE mRNA. Therefore RSs0827 could display a potential regulator that ensures the attenuation of the RpoE-dependent stress response under certain conditions. So far an effect of RSs0827 on the RpoE-dependent sRNA Pos19 could only be found during the stationary phase, but not during conditions of photo-oxidative stress. Die hier präsentierte Arbeit betont erneut die bereits häufig beschrieben Bedeutung von bakteriellen sRNAs als regulatorische Faktoren in der Stressantwort und der Adaption an Umwelteinflüsse (besprochen in Wagner and Romby, 2015). In dem betrachteten Modellorganismus R. sphaeroides sind in diesem Zusammenhang bisher vor allem Proteine mit regulatorischer Funktion bekannt. Diese umfassen Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, sowie alternative Sigma-Faktoren (beschrieben in 1.4, 1.6, 1.9.2 und 1.9.4). Seitdem im Jahr 2009 von Berghoff und Kollegen (Berghoff et al., 2009) eine Reihe von sRNAs in R. sphaeroides identifiziert wurden, konnte bereits für vier dieser sRNAs eine Funktion belegt werden (1.9.5). Darauf aufbauend konnten für die drei hier untersuchten sRNAs Pos19, PcrX, und RSs0827, Funktionen in der Regulation des Metabolismus und der oxidativen Stressantwort beschrieben werden. Die sRNA Pos19 beeinflusst den Schwefel- und den darauf folgenden Glutathion (GSH) Metabolismus indem sie reprimierend auf eine Reihe von Genen aus den entsprechenden Stoffwechselwegen, sowie auf das hypothetische Protein RSP_0557, wirkt. Für letzteres scheint eine genau definierte Expression die Voraussetzung für ein ausgeglichenes GSH Level zu sein. Durch den Einfluss auf den Schwefel-, Cystein- und GSH-Metabolismus trägt die RpoE-abhängig exprimierte sRNA Pos19 so zur ausbalancierten Antwort auf oxidativen Stress bei. Des Weiteren kodiert Pos19 ein kleines Peptid, dessen Funktion bisher noch unbekannt bleibt. Die Untersuchungen bezüglich des Peptids haben allerdings gezeigt, dass in R. sphaeroides die Shine-Dalgarno Sequenz für die Initiation der Translation nicht zwingend notwendig ist. Ähnliche Beobachtungen sind bereits für weitere Prokaryoten beschrieben (Omotajo et al., 2015). Die sRNA PcrX ist im 3’UTR der puf mRNA kodiert und wird aus der parentalen mRNA heraus prozessiert. In den letzten Jahren ist das Interesse an solchen in 3’- und 5‘-UTRs kodierten sRNAs stetig gewachsen (besprochen in Miyakoshi et al., 2015). Bemerkenswerterweise deuten die gezeigten Daten darauf hin, dass PcrX den pufX Bereich der parentalen mRNA bindet und für die Prozessierung der puf mRNA eine Rolle spielt. Diese Prozessierung ist notwendig, um das stöchiometrische Verhältnis der durch die puf Gene kodierten Bestandteile des Photosyntheseappartes sicherzustellen. Neben dieser „Selbstkontrolle“, scheint die Regulation weiterer Gene durch PcrX möglich zu sein, da die Überexpression von PcrX neben pufX auch weitere Gene wie bchN und bchY stark beeinflusst. Und obwohl die Regulation von pufX durch PcrX Hfqunabhängig ist, wurde PcrX unter den sRNAs gefunden, die eine Bindung an Hfq aufgewiesen haben. Für die sRNA RSs0827 konnten die gewonnen Daten die bereits vermutete Interaktion mit der rpoE mRNA nachweisen. Durch diese Interaktion könnte RSs0827 die RpoE-induzierte Stressantwort unter ausgewählten Bedingungen abschwächen. Ein Effekt von RSs0827 auf die RpoEabhängige sRNA Pos19 wurde bisher aber lediglich in der stationären Phase gefunden.

Bakterien kommen in den unterschiedlichsten Habitaten vor und haben sich über eine Vielzahl von regulatorischen Mechanismen an diese Habitate angepasst. So wird der zelluläre Metabolismus beispielweise den vorhandenen Nährstoffen angepasst und häufig zusätzlich stressabhängig reguliert. Hierbei werden neben einer Vielzahl von regulatorischen Proteinen auch kleine nicht-kodierende RNAs (sRNAs) genutzt, die unter ausgewählten Bedingungen exprimiert werden und die Expression spezifischer Gene regulieren. Im photosynthetisch aktiven Alphaproteobakterium Rhodobacter sphaeroides gibt es einen Cluster aus den vier homologen sRNAs CcsR1 bis CcsR4, das unter oxidativen Stressbedingungen zusammen mit der mRNA für ein hypotethisches Protein (RSP_6037) exprimiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Funktion dieser sRNAs in R. sphaeroides analysiert und zusätzlich die Frage adressiert, ob es eine mögliche Konservierung der sRNAs in anderen Alphaproteobakterien gibt. Hierbei konnte einerseits gezeigt werden, dass CcsR1-4 unter oxidativen Stressbedingungen und Hitzestress über die Repression des LuxR-Transkriptionsaktivators FlhR Einfluss nehmen auf die Expression von Genen des Glutathion-abhängigen C1-Metabolismus und des Pyruvatdehydrogenase Komplexes. Andererseits konnte gezeigt werden, dass es verschiedene CcsR RNA Cluster in verschiedenen Alphaproteobakterien gibt, deren Expression häufig an sehr ähnliche Bedingungen gekoppelt ist. Abschließend konnte gezeigt werden, dass die regulatorische Funktion der CcsR RNAs wahrscheinlich nicht auf oxidative Stressbedingungen beschränkt ist, sondern auch auf anaerobe Wachstumsbedingungen erweitert werden kann. Insgesamt konnten die CcsR RNAs also als sRNAs beschrieben werden, die spezifische Teile des zellulären Metabolismus in Zusammenhang mit einem Schutz vor Sauerstoff steuern. Bacteria can be found in a wide range of habitats and have adopted to these habitats via a broad range of regulatory mechanisms. These mechanisms for example lead to regulation of metabolism under stress conditions. Mechanisms of such regulations are based on a wide range of regulatory proteins and regulatory RNAs. These RNAs and proteins are expressed under specific conditions and influence the expression of specific genes. In the photosynthetically active Alphaproteobacterium Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 a cluster of four homologous sRNAs was identified, that shows expression under oxidaitve stress conditions. These sRNAs are encoded in an operon together with a gene that is for a hypothetical protein (RSP_6037). In this work the function of the four sRNAs in Rhodobacter sphaeroides was analyzed. In addition analysis of homologoues sRNAs in other Alphaproteobacteria was performed in order to gain insights into a possible conservation of underlying mechanisms. The analyses in different Alphaproteobacteria showed, that expression of the four sRNAs CcsR1-CcsR4 is not limited to oxidative stress conditions but is rather related to general stress conditions. Moreover molecular analyses proved, that CcsR1-CcsR4 in Rhodobacter sphaeroides influence the activity of the pyruvate dehydrogenase complex and of the C1 -metabolism through repression of the transcriptional activator FlhR, which same as the CcsR RNAs is conserved among different Alphaproteobacteria.

Light excitation of humic matter generates reactive oxygen species (ROS) in surface waters of aquatic ecosystems. Abundant ROS generated in humic matter rich lakes include singlet oxygen (O-1(2)) and hydrogen peroxide (H2O2). Because these ROS differ in half-life time and toxicity, we compared their effects on microbial activity (C-14-Leucine incorporation) and bacterial community composition (BCC) in surface waters of humic Lake Grosse Fuchskuhle (North-eastern Germany). For this purpose, experiments with water samples collected from the lake were conducted in July 2006, September 2008 and August 2009. Artificially increased O-1(2) and H2O2 concentrations inhibited microbial activity in water samples to a similar extent, but the effect of the respective ROS on BCC varied strongly. BCC analysis by 16S rRNA gene clone libraries and RT-PCR DGGE revealed ROS specific changes in relative abundance and activity of major bacterial groups and composition of dominating phylotypes. These changes were consistent in the three experiments performed in different years. The relative abundance of Polynucleobacter necessarius, Limnohabitans-related phylotypes (Betaproteobacteria), and Novosphingobium acidiphilum (Alphaproteobacteria) increased or was not affected by photo-sensitized O-1(2) exposure, but decreased after H2O2 exposure. The opposite pattern was found for Actinobacteria of the freshwater AcI-B cluster which were highly sensitive to O-1(2) but not to H2O2 exposure. Furthermore, group-specific RT-PCR DGGE analysis revealed that particle-attached P. necessarius and Limnohabitans-related phylotypes exhibit higher resistance to O-1(2) exposure compared to free-living populations. These results imply that O-1(2) acts as a factor in niche separation of closely affiliated Polynucleobacter and Limnohabitans-related phylotypes. Consequently, oxidative stress caused by photochemical ROS generation should be regarded as an environmental variable determining abundance, activity, and phylotype composition of environmentally relevant bacterial groups, in particular in illuminated and humic matter rich waters.

RNA processing and degradation are essential processes in the cell. The exosome of S. solfatarticus is able to degrade and polyadenylate RNA and is localized at the periphery of the cell. The in vitro reconstituted S. solfolobus exosome is built of a hexameric ring, containing Rrp41( the catalytically active subunit) and Rrp42 to which a trimeric cap of RNA binding proteins Rrp4 or Csl4 is bound. Rrp4 confers poly (A) specificity to the exosome. The archaeal DnaG protein which is homologues to the bacterial primase, and an Archaea specific exosomal subunit, directly binds to Csl4 protein in the exosome. The majority of Rrp41 and DnaG is detectable in the insoluble fraction and is localized at the cell periphery. In this study, it was found that the soluble and insoluble exosomes have different compositions. The soluble exosome contains less DnaG and less Csl4 than the insoluble exosome which co-sediments with ribosomal subunits in sucrose density gradients. However, after the RNase treatment the rRNA was completely degraded but the exosome sedimentation pattern was not changed. Furthermore potential interaction partners such as EF1α and Nop5 were found in the soluble exosome. The soluble and the insoluble exosomes were both active. However, different compositions of the exosome in the cell and thereby the localization could apparently be a common system in prokaryotes to separate biochemical processes in cells without compartmentalization. In this work Csl4 was co-immunoprecipitated with the exosome using anti-Rrp4 antibodies and vice versa. This finding clearly says that heteromeric RNA-binding caps are present in vivo. The presence of the heteromeric RNA binding cap probably ensures its interaction with different transcripts and probably different interaction partners. To understand the mechanism for poly (A) specificity of Rrp4, an exosome with an RNA-binding cap composed of truncated Rrp4 lacking the KH domain was reconstituted and analyzed. The deletion of the KH domain decreased the degradation activity, but the poly (A) specificity was retained. This finding says that the KH domain of the RNA binding Rrp4 protein is not responsible for the poly (A) specificity. It was further found that the proportion of soluble exosome increases in the stationary phase. Moreover the exosome amount increases under the cold stress conditions. The amount of exosome in pH high, pH low and heat stress was constant. These results strongly suggest that archeal exosome plays an important role under cold stress and in the stationary phase for the survival of the cells. Homologous cloning system was used to express recombinant His-tagged exosomal proteins in S. solfataricus. It was possible to clone the genes rrp4, csl4 and dnaG, as well as the dnaG parts encoding the N terminal and the C terminal portions of the protein, in to the pMJ0503 vector. However it was possible to transform and express only the full length DnaG-His6 in S. solfataricus M16. Overexpression was achieved in the stationary phase and the exosome containing DnaG-His6 and the native DnaG was isolated by Ni-NTA chromatography. For the first time, the native DnaG which was directly isolated from S. solfataricus was observed as a dimer with 2 lobes and a central pore using SPEM. The structure of the protein may help to solve many functions delusions. Parts of this work have been published: Witharana, C., V. Roppelt, G. Lochnit, G. Klug and E. Evguenieva-Hackenberg (2012). "Heterogeneous complexes of the RNA exosome in Sulfolobus solfataricus." Biochimie 94(7): 1578-87.

Ribonukleasen sind die Enzyme, welche für Prozessierung und Degradation der RNA-Moleküle in einer Zelle verantwortlich sind. Die zu diesen Enzymen zählende RNase J wurde erst vor einigen Jahren in B. subtilis identifiziert und unterscheidet sich von den bisher bekannten bakteriellen RNasen in zweierlei Hinsicht. Erstens kann dieses Enzym RNA sowohl endo- als auch exo-ribonukleolytisch spalten und zweitens besitzt die exoribonukleolytische Aktivität eine bislang für bakterielle Ribonukleasen nicht bekannte 5´-3´ Orientierung. In B. subtilis ist die RNase J1 essentiell und spielt zusammen mit der paralogen RNase J2 eine Schlüsselrolle bei der Prozessierung und Degradation vieler RNAs in diesem Gram-positiven Organismus. Im Rahmen der hier vorliegenden Arbeit konnten erste Einblicke in die Aktivität und Funktion des RNase J homologen Proteins von R. sphaeroides gewonnen werden. Bei den in vitro RNA-Degradationsstudien mit rekombinant aufgereinigter RNase J konnte gezeigt werden, dass dieses Enzym eine äußerst prozessive exoribonukleolytische Aktivität besitzt und hierbei eine Präferenz für RNA-Substrate mit einem monophosphorylierten 5´-Ende aufweist. Eine für die RNase J von B. subtilis beschriebene, nahezu vollständige Inhibition der exoribo-nukleolytischen Aktivität durch ein triphosphoryliertes 5´-Ende wurde während dieser Arbeit jedoch nicht beobachtet. Die außergewöhnliche 5´-3´ Orientierung der RNA-Degradation durch die RNase J konnte prinzipiell auch für das homologe Enzym in R. sphaeroides bestätigt werden. Eine endo¬ribo¬nukleolytische Aktivität der RNase J ließ sich während der in vitro RNA-Degradationsstudien jedoch nur in geringem Umfang feststellen. Die beobachteten ribonukleolytischen Charakteristika der RNase J von R. sphaeroides werden vergleichend zu bekannten Eigenschaften von RNase J Homologen aus anderen Organismen diskutiert. Zusätzlich werden einige Aspekte der ribonukleolytischen Aktivität auf der Basis veröffentlichter RNase J Protein-Struktur Daten näher erläutert. Die RNase J von R. sphaeroides ist unter Standardwachstumsbedingungen nicht essentiell und eine Deletionsmutante wies keinen veränderten Phänotyp zum Wildtyp auf. Auf der RNA-Ebene führte die Deletion der RNase J zum Ausbleiben der finalen Reifung der 5´- als auch 3´-Enden der ribosomalen 23S rRNA-Fragmente. Mit Hilfe von in vitro Experimenten konnte gezeigt werden, dass die RNase J von R. sphaeroides für die finale 5´-Prozessierung der 23S rRNA-Fragmente ver-antwortlich ist. Der sekundäre Effekt auf die Reifung der 3´-Enden führte zur Erstellung eines Modells für den Ablauf der einzelnen RNA-Reifungs Vorgänge an den 23S rRNA-Fragmenten. Die im Rahmen dieser Arbeit begonnene Auswertung einer RNASeq Transkriptom Analyse einschließlich erster Northern Blot Validierungen ergab, dass der RNase J möglicherweise eine weitere Funktion bei dem finalen Abbau einzelner Intermediate der RNA-Degradation in R. sphaeroides zukommt.

Das Ziel dieser Arbeit war es, die natürliche Bildung eines neuen Restriktions-Modifikationssystem anhand des Beispiels der als nicht klonierbar geltenden S176N Mutante des Restiktionsenzyms R.HgiBI nachzuahmen. Die Nichtklonierbarkeit dieser Mutante sollte dabei entweder durch eine neue Spezifität oder durch eine im Vergleich zum Wildtyp erhöhte Aktivität hervorgerufen werden, die nicht mehr durch die Methyltransferase M.HgiBI abgedeckt wird. Als Untersuchungsobjekt boten sich die drei sehr nahe miteinander verwandten RM-Systeme RM.HgiBI. RM.HgiCII und RM.HgiEI an. In Gegenwart verschiedener Varianten der Methyltransferase M.HgiBI gelang es, die gesuchte S176N auch für R.HgiBI herzustellen. Ferner gelang es dieselbe vorher nicht erhaltene Mutante herzustellen, wenn neben einer der beiden Methyltransferasen M.HgiBI oder M.HgiEI auch noch ein kleiner offener Leserahmen (orfC) aus den RM-Operon anwesend war. Dieser sog. control orfC wurde bisher nur bei der Klonierung von R.HgiEI und R.HgiCII benötigt. Es wird daher spekuliert, dass dieser OrfC die Expressionsrate der Methyltransferasen positiv beeinflusst. Sowohl die Spezifität als auch die Aktivität der Methyltransferasen konnte durch die intensive Nutzung der DNA-Sequenzierung nach Bisulfit-Behandlung aufgeklärt werden. Während sowohl M.HgiBI als auch M.HgiEI neben der Haupterkennungssequenz GGWCC auch die verwandte Sequenz GGSCC methyliert, während die dritte Methyltransferase M.HgiCII diese Aktivität nicht zeigt. Umgekehrt ist M.HgiCII aber deutlich aktiver in der Methylierung der Hauptsequenz GGWCC. Schließlich wurden die drei Endonuklease mit einer speziell entwickelten Strategie darauf untersucht, ob sie neben der Haupterkennungssequenz auch andere Sequenzen erkennen. Die Verwendung eines sehr bequemen Expressionsassays für das grün fluoreszierende Protein GFP ließ schnell erkennen, dass die beiden Endonukleasen R.HgiCII und R.HgiEI keinerlei zusätzliche Spezifitäten besitzen. Nur R.HgiBI zeigt eine zusätzliche Aktivität, bei der die Sequenz GAACC spezifisch geschnitten wird. Durch Zufall wurde das Gen für die Methyltransferase M.HgiBI in zwei Proteine aufgeteilt. Während die Fähigkeit die Sequenz GGSCC zu methylieren verloren ging, konnte nun die bei der zugehörigen Endonuklease gefundene Sequenz GAACC methyliert werden. Die bis dato nicht erhaltene Mutante R.HgiBI S176N konnte in vier Fällen hergestellt werden. Es stellte sich heraus, dass deren Klonierung nur mit starken Methyltransferase-Varianten möglich ist. Das beweist, dass die Nichtklonierbarkeit dieser Mutante auf der Stärke der Endonuklease beruht. The aim of this work is to simulate the natural formation of a new Restriction-Modification-System (RM-system) by cloning the S176N mutant of restriction endonuclease R.HgiBI, which could not be achieved by other authors, before. The reason for this failure should either be the gaining of a new specificity or an increased activity, which cannot be controlled by the wildtype methyltransferase M.HgiBI, anymore. The three closely related RM-Systems RM.HgiBI. RM.HgiCII and RM.HgiEI were used as wildtype references. Using several variants of the methyltransferase M.HgiBI it was possible to isolate the mutant in demand R.HgiBI S176N. In addition, this mutant could be obtained in the presence of either M.HgiBI or M.HgiEI in the presence of a small open reading frame called orfC for control orf. This orfC was shown to be necessary for cloning both the RM.HgiEI and the RM.HgiCII system, before. Controlling the expression of the wildtype R.HgiBI it was not needed, but for cloning the S176N mutant thereoff. Thus, it is speculated, that the orfC increases the expression rate of the respective methyltransferase. Using bisulfite-sequencing the activity as well as the specificity of the respective methyltransferases has been investigated thoroughly. It turned out, that both the methyltransferases M.HgiBI and M.HgiEI possess the capability to methylate the sequence GGSCC in addition to the main target sequence GGWCC, while the third methyltransferase M.HgiCII lacks this capability. However, this third methyltransferase is more active in methylating the main target sequence GGWCC. Thereafter, the endonucleases have been checked for side activities by a newly developed strategy using the fairly convenient expression of the green fluorescence protein GFP. While the endonucleases R.HgiCII and R.HgiEI did not show any additional specificity, R.HgiBI shows an additional activity in cutting the GAACC sequence. By chance the methyltransferase M.HgiBI has been split into two separate proteins. While the capability to methylate the GGSCC sequence was lost, the GAACC could now be methylated by this enzyme. We could produce the seemingly unclonable mutant R.HgiBI S176N by using four different variants of methyltransferases. It was possible to clone this endonuclease mutant with variants of methyltransferases that were stronger than the wildtype M.HgiBI. Thie result shows that R.HgiBI S176N is a stronger endonuclease than the wildtype. It hasn’t gained any additional specificity.

Licht stellt einen bedeutenden Umweltfaktor der Photosynthesegenregulation von phototropen Organismen dar. Da es neben seiner Funktion als Energieträger auch schädlichen Einfluss haben kann, müssen phototrophe Organismen Mechanismen entwickeln, um vorhandene Lichtreize in eine Genantwort umzusetzen. Blaulichtrezeptoren stellen dabei die häufigsten Proteine zur Lichtwahrnehmung in Prokaryoten dar und erlauben es ihnen, ihre Genantwort an die Bedingungen der Außenwelt anzupassen. In R. sphaeroides existieren mit dem AppA / PpsR und dem PrrB / PrrA - System bereits zwei Systeme mit einer gut charakterisierten Wirkung auf die Expression der Photosynthesegene. Kürzlich wurden mit dem Cryptochrom CryB und dem LOV - Domänen - Protein LOV zwei weitere Blaulichtrezeptoren in R. sphaeroides beschrieben. Während für das CryB - Protein eine Verbindung zur Regulation des Photosyntheseapparates hergestellt werden konnte, blieb die physiologische Rolle des LOV - Proteins noch unbekannt. Ziel dieser Arbeit war es das Verständnis der in vivo - Funktion dieser Proteine in R. sphaeroides zu verbessern. Durch die Analyse der Blaulichtsensitivität der BLUF - Domäne des AppA - Proteins konnte gezeigt werden, dass bereits minimale Blaulichtintensitäten ausreichen, um die Expression der Photosynthesegene bei gleichzeitigem Vorhandensein von Licht und Sauerstoff zu verhindern. Der lichtabhängige Anstieg der Photosynthesegenexpression bei geringem Sauerstoffpartialdruck durch das PrrB / PrrA - System konnte nur durch deutlich höhere Lichtintensitäten erreicht werden. Eine durchgeführte random Mutagenese der BLUF - Domäne führte nicht zu neuen Erkenntnissen zur Interaktion der BLUF - Domäne von AppA mit dem C - Terminus. Dafür konnte durch zielgerichtete Mutagenese von am Photozyklus beteiligen Aminosäuren gezeigt werden, dass Tryptophan 104 trotz seiner umstrittenen Rolle im Photozyklus in in vitro - Experimenten, in vivo die Blaulichtsensitivität der BLUF - Domäne beeinflussen kann. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ein Basenaustausch des konservierten Tyrosin 21 immer zum Verlust der in vivo - Aktivität der BLUF - Domäne führt. Eine Doppelmutante führte überraschenderweise zur Wiederherstellung der in vivo - Aktivität der BLUF - Domäne, während in vitro das Protein keinen Photozyklus mehr besaß. Zur genaueren Eingrenzung des regulatorischen Einflusses des CryB - Proteins wurde dessen Interaktion mit bereits bekannten Regulatorproteinen untersucht. Dabei konnte im Yeast - Two - Hybrid - System sowie in den anschließend durchgeführten pulldown - assays eine Interaktion von CryB mit dem redox - sensitiven C - Terminus von AppA nachgewiesen werden. Die Interaktion von AppA mit PpsR wurde jedoch in Gel - Retardations - assays nicht durch die Anwesenheit von CryB beeinflusst. Für das LOV - und das CryB - Protein konnte im Yeast - Two - Hybrid - System zudem eine Interaktion mit Kapselpolysaccharidtransportern nachgewiesen werden. Es konnte jedoch keine Kapselbildung in den verwendeten R. sphaeroides - Stämmen gezeigt werden. Um die bisher völlig unbekannte physiologische Rolle des LOV - Proteins zu untersuchen, wurde ein microarray - Transkriptomchip von Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 erstellt. Mit diesem wurde nach im Wildtyp 2.4.1 und der deltalov - Mutante differenziell exprimierten Genen, nach mikroaerobem Wachstum, Blaulichtbestrahlung und photooxidativem Stress, gesucht. In den Transkriptomanalysen konnten dabei eine große Zahl von Genen des Kohlenhydrat - und Aminosäurestoffwechsels und - transports, sowie der generellen Stressantwort identifiziert werden, welche durch den Einfluss des LOV - Proteins reprimiert werden. Gleichzeitig führte das Fehlen des LOV - Proteins zur Verringerung der Expression von Genen der Translation. Aus diesen Beobachtungen kann eine mögliche Beteiligung von LOV an der Regulation der stringent response gemutmaßt werden, deren Bestätigung jedoch noch weitere Untersuchungen erfordert. Light is one of the major factors in photosynthesis regulation of phototrophic organisms. Because it can act as an energy source for photosynthesis but also as an harmful generator of oxidative stress, phototrophic organisms have to evolve ways to transduce light signals into a transcriptional response. Blue light photoreceptors form the most abundant of photoreceptors in prokaryotes and allow them to adapt their genetic layout to environmental changes. The AppA / PpsR and PrrB / PrrA system in the facultative phototrophic R. sphaeroides are two well understood light dependent regulatory systems of the photosynthesis gene expression. Recently two additional blue light photoreceptors, a cryptochrome CryB and a LOV - domain protein called LOV were identified in R. sphaeroides. While a role in the regulation of photosynthesis gene expression for the CryB protein was shown, the physiological role of the LOV protein remains unclear. The goal of this work was to broaden the knowledge of the in vivo function of these photoreceptors in R. sphaeroides. By analyzing the blue light sensitivity of the BLUF domain of AppA I could show that minimal light intensities are sufficient to repress photosynthesis gene expression when light and oxygen are present simultaneously. The light dependent increase of photosynthesis gene expression mediated by PrrB / PrrA at low oxygen tension was only mediated by higher light intensities. While a random mutagenesis of the BLUF domain lead to no new insights in the interaction of the AppA and PpsR protein, site directed mutagenesis of amino acids involved in the photocycle, allowed a comparison of published in vitro data with in vivo experiments. An amino acid exchange in tryptophan 104 greatly decreased the in vivo light sensitivity of the protein, while changing tyrosine 21 lead to a loss of blue light dependent repression in the cell. Surprisingly a exchange of both amino acids lead to a recovered in vivo activity of the protein. To further characterize the function of the CryB protein in vivo, interaction against already known regulatory proteins was investigated. In a Yeast Two Hybrid screening and following pulldown analysis an interaction of the CryB protein with the redox sensitive C - terminus of the AppA protein was shown. The interaction between AppA and PpsR was not influenced by CryB in gel retardation assays. Furthermore the Yeast Two Hybrid screening hinted a connection between the LOV and CryB protein to capsule polysaccharide transporters. In different staining experiments no capsule synthesis was shown in the used R. sphaeroides strains. Because no physiological role of the LOV protein was known, a microarray transcriptome chip of Rhodobacter sphaeroides 2.4.1 was designed. This microarray chip was used to search for differentially expressed genes between the wild type 2.4.1 and the LOV mutant after microaerobic growth, blue light illumination and photooxidative stress. The transcriptome analysis revealed a higher expression of genes in the LOV mutant that are involved in carbon hydrate - and amino acid - metabolism, as well as the general stress response. The lower expressed genes in the mutant mainly belonged to genes involved in the ribosomal translation of the cell. This observation hints a possible role of the LOV protein in the regulation of the stringent response in Rhodobacter sphaeroides that needs to be further elucidated.

Das Gram-negative Bodenbakterium Myxococcus xanthus zeichnet sich durch ein hoch entwickeltes Sozialverhalten aus. Dies wird besonders in der kooperativen Jagd auf Beute-Organismen, sowie der Bildung vielzelliger Fruchtkörper bei Nährstoffmangel deutlich. Eine essentielle Grundlage dieser komplexen Lebensweise stellt das Gleiten der Zellen über feste Oberflächen dar. Diese Bewegung basiert auf den genetisch unterschiedlichen Systemen der A (adventurous) und S (social) Motilität, wobei eine gerichtete Bewegung durch die regulatorische Funktion des frz-Signaltransduktionssystems vermittelt wird. Die Komponenten dieses Systems weisen Ähnlichkeit zu den Proteinen enterobakterieller Chemotaxissysteme auf, zeigen aber auch einige auffällige Unterschiede. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war es, spezifische Aspekte der Signalweitergabe durch das frz-System zu klären. Im Mittelpunkt stand der response Regulator FrzZ, welcher zwei CheY-ähnliche Domänen vereint und als ausführende Komponente des Systems dient. Die durchgeführten Analysen ermöglichten ein detailierteres Bild der Funktionsweise des ungewöhnlichen Proteins. So konnte zunächst die Hypothese einer phosphorylierungsabhängigen Aktivierung von FrzZ untermauert werden. Das Vorhandensein einer funktionellen Domäne erwies sich dabei als essentiell für die Aktivität des response Regulators, während die volle Funktionsfähigkeit nur durch die Präsenz beider Domänen erreicht wurde. In diesem Zusammenhang konnte ebenfalls gezeigt werden, dass sich die Funktion der beiden Domänen von FrzZ in der Regulation der Zellbewegung voneinander unterscheidet. Weiterhin implizierte die immunologische Analyse fraktionierten Zellextraktes auch in M. xanthus die Bildung von Rezeptor-Signal-Komplexen, wie man sie aus chemotaktischen Organismen kennt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Kolokalisierung von FrzZ mit diesen Komplexen vom Vorhandensein der Kinase des frz-Systems FrzE abhängig ist, aber auch durch die Ser/Thr-Phosphatase Pph1 beeinflusst wird. Die Analyse einer möglichen Wechselwirkung von FrzZ mit der Phosphatase stellte einen weiteren Punkt der vorliegenden Arbeit dar. Die durchgeführten in vitro Interaktionsanalysen konnten keine direkte Wechselwirkung der beiden Proteine bestätigen. Dennoch deutet die Komplementation der Defekte pph1-defizienter Zellen durch die Expression verschiedener, durch Mutagenese veränderter Formen des FrzZ-Proteins, sowie der Phänotyp der konstruierten Doppelmutante auf eine Positionierung beider Proteine in einem Signalweg hin. Als weiterer möglicher Interaktionspartner des response Regulators konnte ein Protein identifiziert werden, das sich durch den Besitz von sechs TPR-Motiven (tetratricopeptide repeats) auszeichnet. Diese kennt man sowohl aus prokaryontischen als auch aus eukaryontischen Proteinen, wo sie an der Organisation von Multiproteinkomplexen beteiligt sind und Protein-Protein-Interaktionen vermitteln. Die Inaktivierung des korrespondierenden Gens führte zu einem charakteristischen Phänotyp, dessen Analyse eine verstärkte Bildung von Typ IV Pili (TFP) auf den Zelloberflächen bestätigte. Dieser Effekt konnte auch in einer pilC-Punktmutante, nicht aber in einer pilC-Deletionsmutante beobachtet werden, was auf eine Wechselwirkung dieser beiden Proteine, in Form einer Inhibition von PilC durch TPR, hindeutet. Da das PilC-Protein an der TFP-Assemblierung beteiligt ist, wurde daraufhin ein Modell postuliert, das eine Möglichkeit der Regulation des sozialen Gleitens durch FrzZ vorschlägt, in welchem TPR die Interaktionsbasis einer Wechselwirkung des response Regulators mit PilC bietet. The gram-negative soil bacterium Myxococcus xanthus is characterized by its highly sophisticated social behaviour. This becomes particularly obvious in the cooperative prey on other bacteria as well as the formation of multicellular fruiting bodies upon nutrient depletion. Gliding over solid surfaces is crucial for that lifestyle under all conditions. In M. xanthus this movement depends on the genetically distinct systems of A (adventurous) and S (social) motility and is directed by the frz-chemosensory system. This signal transduction pathway is formed by proteins that share significant homology with chemotaxis proteins from enteric bacteria, but also possess some striking differences. The aim of this work was to resolve some of the specific aspects of signal transduction through the frz-system. The performed analyses focused on the FrzZ Protein, an unusual response regulator composed of two CheY-like domains, resuming an output of the system. Complementation analyses in an frzZ-negative background strongly indicated a phosphorylation dependent activation of the protein. Moreover the presence of one functional domain of FrzZ turned out to be crucial for activity of the response regulator whereas unlimited functionality was only observed by the presence of both domains. In this regard it could also be shown that the two domains of FrzZ function differently in controlling motility. Furthermore immunological analysis of fractionated cell extracts implicated the formation of receptor-signalling-complexes known from chemotactic organism, in M. xanthus as well. Colocalization of FrzZ with these complexes could be shown to depend on the presence of the kinase of the frz-system FrzE, but also to be influenced by the Ser/Thr phosphatase Pph1. Analyzing the potential interaction of FrzZ with that phosphatase was another aim of the present work. In vitro interaction analyses using the purified proteins could not verify a direct interaction of FrzZ and Pph1. Complementation of the defects of pph1-deficient cells by expression of differently mutagenized FrzZ forms, as well as the phenotype of the constructed doublemutant however point to a localization of the two proteins in the same signalling pathway. As another potential interaction partner of FrzZ a protein was identified, containing six TPR-motifs (tetratricopeptide repeats). These motifs are known from prokaryotic as well as eukaryotic proteins to coordinate multiprotein-complexes and to mediate protein-protein-interactions. Inactivation of the corresponding gene led to a characteristic phenotype caused by the overproduction of type IV pili (TFP) on the cellular surface. This effect was also observed in a pilC-pointmutant but not in a pilC-in frame deletion mutant, indicating an inhibition of PilC by TPR in vivo. As the PilC-protein is involved in TFP assembly, this finding led to a model of FrzZ regulating social motility in vivo by the use of the TPR-protein to interact with PilC.

Die komplexe Lebensweise von Sorangium cellulosum So ce56 in Form eines vegetativen Lebenszyklus sowie der Fähigkeit zur multizellulären Differenzierung wirft unweigerlich die Frage auf, welche Signale für die Entscheidung zwischen vegetativem Wachstum und Differenzierung verantwortlich sind. Die vorliegende Arbeit sollte zur Charakterisierung der morphologischen Differenzierung in So ce56 und beteiligter Proteine beitragen. Für die Charakterisierung der morphologischen Differenzierung von So ce56 war zunächst die Etablierung eines geeigneten Nährstoffmangelmediums notwendig. Ferner wurden für die weitere Untersuchung der Differenzierung Mutanten konstruiert, die einen Defekt in der Differenzierung aufwiesen. Im Laufe der Arbeit verschob sich der Schwerpunkt auf die Beteiligung der Lon-Proteasen im Stickstoffmetabolismus von So ce56 und deren spezifischer Substrate. Die Ergebnisse der Arbeit zeigten, dass die Differenzierung von So ce56 von einer drastischen Reduzierung der Nährstoffe sowie von einer bestimmten Zelldichte abhängig ist. Höhere Nährstoffkonzentrationen sowie eine geringere Zelldichte konnten die Differenzierung von So ce56 nicht initiieren. Zur weiteren Untersuchung der Differenzierung von So ce56 wurden differenzierungsdefekte Mutanten konstruiert. Analysen des Genoms von So ce56 ergaben Übereinstimmungen zu den aus Myxococcus xanthus bekannten und für die Differenzierung notwendigen Genen asgA und bsgA (= lonD). Es wurden ein asgA-homologes und fünf lon-homologe Gene identifiziert. Anhand von Expressionsstudien wurde für das asgA-Gen von So ce56 gezeigt, dass dessen Expression positiv unter Differenzierungsbedingungen reguliert wird. Weiterhin zeigte sich durch Expressionsstudien, dass die asgA-Expression abhängig von der stringenten Kontrolle ist. Für die Expression der Gene lon1-4 wurde unter Differenzierungsbedingungen eine negative Regulation der Expression ermittelt, wohingegen lon5 konstitutiv exprimiert wird. Morphologische Differenzierungsstudien der entsprechenden Mutanten ergaben, dass alle einen Defekt in der Differenzierung aufwiesen und die entsprechenden Genprodukte in der Differenzierung von So ce56 beteiligt sind. Untersuchungen dieser differenzierungsdefekten Mutanten hinsichtlich der Produktion der Sekundärmetabolite ergaben, dass Lon2 in der Chivosazol-Biosynthese und Lon4 in der Etnangien-Biosynthese involviert sind. Im Verlauf der Untersuchungen wurden potenzielle Substrate der Lon-Proteasen Lon1 und Lon2 identifiziert, die allesamt im Stickstoffmetabolismus bekannter Bakterien, wie z. B. E. coli oder S. elongatus, involviert sind. Unter anderem konnte das PII-Protein (GlnB) als potenzielles spezifisches Substrat der Lon2-Protease ermittelt werden. Analysen der Aminosäuresequenz von GlnB aus So ce56 ergaben, dass sowohl der für die Uridylylierung in E. coli wichtige Aminosäurerest Tyr51 als auch der für die Phosphorylierung in Cyanobakterien wichtige Aminosäurerest Ser49 in So ce56 vorhanden sind. Genauere Untersuchungen der PII-Modifikationen in So ce56 ergaben eine Modifikation in Form einer Phosphorylierung des PII-Proteins, womit die Modifikation der in Cyanobakterien gleicht. Durch die Identifizierung stickstoffregulierter Proteine als mögliche Substrate der Lon-Proteasen konnten erste Hinweise auf eine Beteiligung der Lon-Proteasen am Stickstoffmetabolismus gefunden werden. Vergleichende Wachstumsstudien mit den zwei untersuchten lon-Mutanten Slon1 und Slon2 mit viel und wenig Stickstoff zeigten einen Wachstumsdefekt unter Stickstofflimitierung. Die gesammelten Ergebnisse lassen vermuten, dass die Lon-Proteasen entweder direkt über das mögliche Substrat oder aber indirekt in den Stickstoffmetabolismus von So ce56 involviert sind.

Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, den Bezug zwischen der morphologischen und der physiologischen Differenzierung und der stringenten Kontrolle in Sorangium cellulosum So ce56 zu untersuchen und Regulatoren der Differenzierungsprozesse zu identifizieren.

1. Bacillus subtilis Die vorliegende Arbeit hatte zum Ziel, das GlnK-Homolog aus B. subtilis zu charakterisieren und potentielle regulatorische Systeme aufzudecken. Das PII-Homolog besitzt eine trimere Form und bindet ATP. Die Gegenwart von Mg2+ und alpha-Ketoglutarat wirkt sich auf die ATP-Bindung aus. Immunoblot-Analysen zeigen, dass GlnK partiell an die Membran gebunden ist. ATP führt zu einem Ablösen des GlnK von der Membran. GlnK interagiert mit dem eigenen Transkriptionsaktivator TnrA. MALDI-TOF Analysen und Co-Immunopräzipitationen bestätigen diese Interaktion. TnrA ist vollständig mit dem Membran-gebundenem GlnK assoziiert. Fehlt GlnK in der Membranfraktion, liegt TnrA löslich vor. Der ATP- und alpha-Ketoglutarat-Spiegel regulieren die Membranassoziation und die Bindung von TnrA durch das B. subtilis GlnK. TnrA interagiert mit der Glutamin-Synthetase in Gegenwart und Abwesenheit von GS-Feedback-Inhibitoren. Die Glutamin-Synthetase wird durch die Interaktion mit TnrA in ihrer Aktivität gehemmt. 2. Synechococcus elongatus In dieser Arbeit konnte ein weiterer neuer Rezeptor für die PII-Signaltransduktionsproteine beschrieben werden. Dieser Rezeptor des PII-Proteins GlnB aus S. elongatus ist das Enzym N-Acetylglutamat-Kinase, das Schlüsselenzym der zyklischen Argininsynthese. ArgB wurde aufgereinigt und zur Produktion von Antikörpern verwendet. Durch Gelfiltrationsexperimente konnte eine multimere Struktur (Tetramer bzw. Hexamer) der NAG-Kinase bestimmt werden. Der NAG-Kinase-PII-Komplex wird aus einem NAG-Kinase Multimer und einem PII-Protein gebildet. PII steigert die NAG-Kinase-Aktivität um ein Zehnfaches. Die Interaktion basiert auf dem T-loop des PII-Proteins und kommt nur zustande, wenn PII unphosphoryliert vorliegt. Die NAG-Kinase unterliegt der Feedback-Hemmung durch Arginin, wobei diese Hemmung durch die Komplexbildung stark gesenkt wird.

Rhodobacter capsulatus ist ein fakultativ phototrophes Purpurbakterium, das unter anaeroben Bedingungen in der Gegenwart von Licht in der Lage ist, eine anoxygene Photosynthese zu betreiben. Fällt der Sauerstoffpartialdruck in der Umgebung unter einen Schwellenwert, so beginnt Rhodobacter mit der Herstellung der Photosynthesekomplexe. In der sauerstoff-regulierten Synthese des Photosyntheseapparates spielt das RegB/RegA-Zweikomponentensystem eine wichtige Rolle. Die membrangebundene Sensorkinase RegB autophosphoryliert wenn der Sauerstoffgehalt der Umgebung fällt und überträgt eine Phosphatgruppe auf den response Regulator RegA. Phosphoryliertes RegA reguliert dann die Transkription von zahlreichen Zielgenen. Zu diesen Zielgenen gehören, neben den Genen, die zur Herstellung des Photosyntheseapparates benötigt werden, auch solche Gene, die für Stickstoff-Fixierung, Kohlendioxid-Fixierung und eine Reihe weiterer Prozesse, notwendig sind. RegA ist damit ein globaler Transkriptionsregulator, der die Transkription zahlreicher verschiedener Gene bei niedrigem Sauerstoffpartialdruck aktiviert bzw. in einigen Fällen auch reprimiert. Neben dem RegB/RegA Zweikomponentensystem sind eine Vielzahl weiterer Faktoren an der Regulation der einzelnen Gene beteiligt. Daher ist es denkbar, dass der response Regulator RegA eine Wechselwirkung mit anderen Proteinen eingeht, um eine spezifische Regulation der einzelnen Prozesse zu gewährleisten. Für die Suche nach solchen interagierenden Proteinen wurde in dieser Arbeit das Hefe 2-Hybridsystem eingesetzt. Mit dieser Methode konnte der response Regulator NtrX als Interaktionspartner von RegA identifiziert werden. Das zugehörige Zweikomponentensystem bestehend aus der Sensorkinase NtrY und dem response Regulator NtrX ist in Azorhizobium caulinodans an der Regulation von Stickstoff-Fixierungsgenen beteiligt. Zur transkriptionellen Regulation dient in A. caulinodans der nifA-Promotor, der in R. capsulatus unter anderem unter der Kontrolle des RegB/RegA-Zweikomponentensystems steht. Die Interaktion von RegA und NtrX konnte anschließend mit einem GST-pulldown assay verifiziert werden, bei dem eine Kopräzipitation beider Proteine in vitro festgestellt werden konnte. NtrX-Deletionsmutanten von R. capsulatus zeigten deutlich veränderte Zusammensetzungen innerhalb der Photosynthesekomplexe, die abhängig vom Ammoniumgehalt des verwendeten Mediums waren. Weiterhin wiesen die NtrX-Mutanten höhere Mengen an Photosynthesekomplexen auf, verglichen mit dem Wildtyp. Bei einer Überexpression von NtrX in R. capsulatus dagegen ist die Menge an Photosynthesekomplexen um 30 % niedriger als im Wildtypstamm. NtrX könnte also ein negativer Regulator der Photosynthesegenexpression sein. Eine NtrX-Variante, bei der die putative Phosphorylierungsstelle D52 gegen Glutamat ausgetauscht wurde, zeigte in Gelretardationsexperimenten eine Bindung an den Promotor des Photosynthese-Operons puf (kodiert u. a. Proteine für Antennenkomplex I und Reaktionszentrum). Diese DNA-Bindung von NtrX deutet darauf hin, dass das Protein durch direkte Wechselwirkung mit der Ziel-DNA einen Einfluss auf die Menge der Photosynthesekomplexe nehmen kann. Rhodobacter capsulatus is a facultatively phototrophic purple bacterium. It is able to perform anoxygenic photosynthesis under anaerobic conditions in the presence of light. The formation of pigment protein complexes in facultatively photosynthetic bacteria of the genus Rhodobacter is only induced when the oxygen tension drops below a threshold value. In R. capsulatus the sensor kinase RegB autophosphorylates in a redox-dependent manner. It then transfers the phosphatidyl residue to the response regulator RegA, a DNA binding protein which activates transcription of a number of genes for pigment binding proteins and for pigment syntheses. Among the genes activated by RegA at low oxygen tension are the genes of the puf and puc operons. The puf operon comprises genes encoding pigment binding proteins of the light harvesting (LH) I complex and of the reaction center complex, and regulatory proteins. Genes required for the formation of the LH II complex are part of the puc operon. The RegB/RegA two component system is also involved in redox-dependent regulation of genes for nitrogen fixation, Calvin cycle enzymes, hydrogenase, and for enzymes of the respiratory chain. In order to test whether the coregulation of different redox-controlled regulons also involves a direct interaction of regulatory proteins the yeast two-hybrid system was applied to search for proteins interacting with the response regulator RegA. NtrX, the response regulator of the NtrY/NtrX two component system was identified as interaction partner of RegA. In Azorhizobium caulinodans the NtrY/NtrX two component system is involved in the regulation of nitrogen fixation genes. The interaction of RegA and NtrX was confirmed by GST pulldown experiments. To learn more about the role of NtrX in R. capsulatus, Rhodobacter strains were constructed, which harbor a knock-out of the chromosomal ntrX gene. These mutants showed a different composition of their photosynthetic components compared to the wild type. The change in composition was dependent on the amount of ammonium added to the medium. Additionally, all NtrX mutants showed more photosynthetic complexes than the wild type strain. When NtrX was overexpressed in R. capsulatus the cells contained lower amounts of photosynthetic complexes than wild type cells. NtrX seems to be a negative regulator of the photosynthetic complexes in R. capsualtus. Since NtrX has a typical helix-turn-helix motif for DNA-binding, gel retardation assays should show, whether NtrX can directly interact with the promoter regions of the photosynthesis operons puf and puc. An interaction of NtrX with the puf promoter region was only detectable, when a NtrX variant was used in the gel retardation assay. This NtrX variant harbored an amino acid exchange at the putuative phosphorylation site of the protein so that the conserved aspartate at position 52 was changed to glutamate. Theses results lead to the suggestion that the NtrX mediated negative regualtion of photosynthetic complexes in R. capsulatus is due to a direct interaction of NtrX with the puf promoter region.

In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Transkription, Replikation und Verpackung (Passage) viraler Fremdsegmente über die Länge der größten Virus-eigenen Segmente (2341 nt) hinaus bis auf 4000 nt ausgedehnt werden kann. Transkriptions- und Replikations-Effizienz sinken jedoch mit zunehmender Länge ab. Mit Hilfe des RNA-Polymerase I-Transkriptionssystems konnte der Einfluss von gezielt gesetzten Mutationen in der cRNA-Promotorstruktur detektiert werden. Für die direkte Untersuchung des cRNA-Promotors wurde die DNA-Sequenz, die in dem RNA-Polymerase I-Transkriptionskonstrukt für das RNA-Segment kodiert, so verändert, dass nach in vivo Transfektion eine cRNA entsteht, die ihrerseits die Transkription einer Reportergen-mRNA initiieren kann. Nach Infektion bzw. Expression der viralen Polymerase und des NP-Proteins liess sich die Aktivität des Reportergens nachweisen. Somit wurde die Fähigkeit des cRNA-Promotors zum Transkriptionsstart erstmalig nachgewiesen. Zu diesem Zweck wurde das kodierende CAT-Gen in inverser Orientierung (als Minusstrang-Sequenz) eingesetzt und am 5´-cRNA-Promotorende zusätzlich eine Folge von 6 Uridin-Basen eingefügt, um die Polyadenylierung der mRNA zu ermöglichen. Basierend auf der Mutationsanalyse des vRNA-Promotors ist die komplementäre cRNA-Promotorsequenz in gleicher Weise durch Substitution und Doppelsubstitution untersucht worden. Die Mutationsanalyse des cRNA-Promotors zeigt, dass die aktive cRNA-Promotorstruktur, wie die des vRNA-Promotors, eine 'corkscrew'-Sekundärstruktur aufweist. Allerdings unterscheidet sich die Erkennungs- und Bindungs-Konformation der viralen RNA-Polymerase in der Interaktion mit einer optimierten cRNA-'corkscrew'-Struktur in einigen Einzelheiten von der Wechselwirkung mit der vRNA-'corkscrew'-Struktur. Zur Bestimmung aller basenspezifischen Erkennungselemente der viralen Polymerase bedarf es weiterer cRNA-Promotoranalysen. Die Analyse der 5´-Endsequenzen der aus der cRNA synthetisierten mRNA (c-mRNA) nach der RACE-Methode ergab, dass die 5´-Promotorsequenz durch Fremdsequenzen verlängert vorliegt, wie es für die aus der vRNA gebildete mRNA (v-mRNA) typisch ist. Auch der c-mRNA-Transkriptionsstart ist daher ein 'cap-snatching'-Prozess. Das unterschiedliche Verhalten der CAT-Expression der cRNA und vRNA bei den NP-Abhängigkeitsversuchen und die Ergebnisse der RACE-Analyse bestätigen, dass die in unserem System nach einer Infektion nachgewiesene CAT-Expression die Transkriptionsaktivität der cRNA- bzw. der vRNA-Moleküle widerspiegelt und nicht die Replikation. Nachdem gezeigt werden konnte, dass die cRNA außer der bekannten Replikations- eine Transkriptionsaktivität aufweist, war es möglich, cRNA- und vRNA-Transkription in einem System zu kombinieren. Dies enthält in einem ambisense bicistronischen RNA-Segment zwei Transkriptionseinheiten mit zwei einander entgegengesetzt orientierten Genen. Darin kann die Transkription des einen Gens von dem ambisense cRNA-Promotor, die des anderen Gens von dem ambisense vRNA-Promotor aus gestartet werden. Für die Polyadenylierung ist beiderseits eine U6-Sequenz benachbart zur 5´-Promotorsequenz eingeführt worden. In den primär transfizierten Zellen lässt sich die Expression der ambisense Gene CAT und GFP nachweisen. In den passagierten Zellen lässt sich bei diesen Konstrukten die Expression desjenigen Gens mit deutlicher Leistung nachweisen, dessen Transkription von dem vRNA-Promotor des ambisense Segmentes aus gestartet wird. Um die Expression desjenigen Gens weiter zu stärken, dessen Transkription von dem cRNA-Promotor des ambisense Segmentes aus gestartet wird, bedarf es weiterer Experimente. Jedoch zeigen die Ergebnisse, dass ein solches ambisense Segment von der viralen RNA-Polymerase transkribiert und repliziert wird. Außerdem wird das virale ambisense Segment in die Tochter-Virionen verpackt. Mit diesem System kann man zwei verschiedene Gene, z.B. ein Influenza-eigenes und ein beliebiges Fremdgen, zu einem ambisense Segment kovalent zusammenfügen, mit der Gewähr für einen stabilen Aufbau eines solchen rekombinanten Influenza-Virus. Influenza viruses belong to the Orthomyxoviridae family which are negative stranded RNA viruses. Their RNA is segmented (7 segments in influenza C and 8 segments in influenza A and B viruses). The segments of negative single-stranded viral genome RNA (vRNA) are contained in the form of ribonucleoprotein (RNP). Small amounts of the polymerase complex are associated with the RNPs, consisting of the subunits PB1, PB2 and PA (see influenza virus structure, page 12, Abb. 11). The in vivo analysis in this work was based on the polymerase I transcription system (Zobel et al., 1993; Neumann et al., 1994, see page 32, Abb. 1.7,). In this reverse genetic system cDNA coding for one of the influenza RNA segments is inserted between the cellular RNA polymerase I promoter (in this work human promotor) and terminator (murine) sequence. The coding region in the cDNA is replaced by CAT reporter gene. After transfection of such constructs in 293T cells, the human RNA polymerase delivers the precise viral RNA (vRNA, negative strand). Later the transfection is followed by infection with the FPV influenza A virus. During the infection the different influenza proteins are delivered beside the nucleoprotein (NP) and the polymerase subunits (PB1, PB2, PA), so that functional RNPs are built. The viral RNA polymerase and NP transcribe the vRNA (negative strand) to mRNA (positive strand). The replication is also catalyzed by the viral RNA polymerase and NP. For the replication a complementary RNA (cRNA, positive strand) is synthetized, which functions as a template for synthetizing further vRNAs. All of these processes (see page 26, Abb. 1.6) occur in the cell nucleus. CAT activity is then detectable in these cells. The foreign vRNA CAT segment is selectivly packaged in the progeny viruses by the end of an infection cycle additional to the eight influenza A segments. The package of this CAT segment is detectable by passaging the supernatant of the primer infection to MDCK cells. Detecting CAT activity in those infected MDCK cells means that the CAT segment was succesfully packaged. To raise the transcription and replication levels and therewith the possibility of packaging foreign segment tested in this system, we use the 1104 mutations (G`3 -> A`3, U`5 -> C`5, C`8 -> U`8) in the noncoding promoter region of the vRNA (Neumann and Hobom, 1995). The analogous mutations in the 5´end of the cRNA promoter (C 3 -> U 3, A 5 -> G 5, G8 -> A 8) were concerned in the cRNA constructs. While the longest influenza segment is only 2341 nt (nucleotides) in length, we were able to show that foreign segments of about 3000 nt and 4000 nt are transcribed, replicated and packaged in influenza A progeny viruses. However the efficiency of transcriptrion, replication and packaging of influenza A viral foreign segments decrease the longer these segments are (see page 84, Abb. 3.5). The RNA polymerase I transcription system was used to detect the influence of site- directed mutations in the cRNA promoter. For the direct analysis of the cRNA promoter and in contrary to the nature of the positive stranded cRNA of the influenza virus, the CAT reporter gene was inserted in the antisense orientation. While the ends remained to be cRNA ends, beside the fact that the polyadenylation signal consisting of 6 uridine nucleotides was added to the distal region of the 5´ end of the cRNA promoter. The 6 Adenin nucleotides in the 3´ end of the cRNA promoter were deleted to avoid base pairing with the polyadenylating signal in the 5´end (compare page 109, Abb. 3.26 with page 89, Abb. 3.11). After transfection in 293T cells and followed infection of such a cRNA transcription construct, a positive CAT signal was detected. This means, that the cRNA was transcribed by the viral RNA polymerase to the positive stranded mRNA, which was translated to the CAT protein. The replication of this cRNA produces a positive stranded vRNA, which replicates to negative stranded cRNA. The transcription of the positive stranded vRNA would produce a negative stranded mRNA, which can´t lead to the CAT expression. This way we guarantee that the detected CAT activity can only arise from the mRNA, which is transcribed from the cRNA by the action of the cRNA promoter, not the vRNA. The mutational analysis of the cRNA promoter showed that the active cRNA promoter also builds a corkscrew secondary structure (see page 97, Abb. 3.17) like the vRNA promoter (see page 96, Abb. 3.16). Nevertheless, the interaction of the viral RNA polymerase with the corksrew of the cRNA promoter differs from that with the corkscrew of the vRNA Promoter. These differences are obvious in the nucleotide specifity during the recognition of the promoter by the viral RNA polymerase. The 5´ ends of the mRNA and vRNA resulted from the cRNA transcription and replication were analysed using the RACE method (see page 111, Abb. 3.27). This analysis showed, that the 5´ end of the mRNAs detected were always elongated by foreign sequence, which is typical for mRNA transcribed from the vRNA. This means that the mRNA transcribed from the cRNA is also primer-dependent which requires cap-snatching process, known for mRNA transcribed from vRNA. In this process the polymerase subunit PB2 recognizes the 5´ cap ends of newly synthetized cellular mRNAs, the PB1 subunit cleaves 12-15 nucleotides at those ends which are used as primer for the mRNA synthesis from vRNA and cRNA as we introduce here. The levels of CAT activities detected in this work after transfection of cRNA constructs differs from those after transfection of vRNA constructs. This proves that detected CAT activities in this system are originated from the transcription process of the cRNA and the vRNA and not from the replication process. The transcription ability of the cRNA to mRNA led us to a new design of the polymerase I transcription system. We combined the cRNA and vRNA molecules to an ambisense molecule and inserted this in a polymerase I transcription unit (see page 122, Abb. 3.37 and page 123, Abb. 3.38). We used CAT and GFP as reporter genes, which were inserted in opposite orientations. The simultaneous expression of the two genes was detected in those ambisense constructs, where the GFP transcription is resulted from the vRNA by the action of the vRNA promoter and the CAT transcription is resulted from the cRNA by the action of the cRNA promoter, both proteins were detected in 293T cells after the primer infection. After passaging in MDCK cells only the protein, whose transcription originated from the vRNA strand was detected, which is GFP in this case. In the other ambisense case, the GFP expression was originated from cRNA and the CAT expression from the vRNA, only CAT expression was detected after the primer infection, and the same result was detected after the passage in MDCK cells. According to this results, the construction of the cRNA strand in the ambisense constructs must be optimized to support the transcription of the cRNA. Nevertheless, these results show, that such an ambisense segment can be transcribed, replicated and packaged in the progeny influenza viruses. Influenza genes or even other foreign genes can also be combined in such an ambisense system which might give a chance for producing stable recombinant influenza virus or other viral vectors.