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Understanding the rationale for the generation of a pool of highly differentiated effector memory CD8+ T cells displaying a weakened capacity to scrutinize for peptides complexed with major histocompatibility class I molecules via their T cell receptor, lacking the “signal 2” CD28 receptor, and yet expressing a highly diverse array of innate receptors, from natural killer receptors, interleukin receptors, and damage-associated molecular pattern receptors, among others, is one of the most challenging issues in contemporary human immunology. The prevalence of these differentiated CD8+ T cells, also known as CD8+CD28−, CD8+KIR+, NK-like CD8+ T cells, or innate CD8+ T cells, in non-lymphoid organs and tissues, in peripheral blood of healthy elderly, namely centenarians, but also in stressful and chronic inflammatory conditions suggests that they are not merely end-of-the-line dysfunctional cells. These experienced CD8+ T cells are highly diverse and capable of sensing a variety of TCR-independent signals, which enables them to respond and fine-tune tissue homeostasis.

Chronic periodontitis is a pathological condition characterized by loss of the supporting tissues of the teeth. The aim of this study was to evaluate the distribution of disease sites in different areas of mouth, prior to and following short-term nonsurgical treatment, as well as the successful of treatment. Periodontal parameters, including Probing Pocket Depth (PPD), Clinical Attachment Level (CAL) and Bleeding on Probing (BOP) were recorded in each six surfaces per tooth (mesiobuccal, buccal, distobuccal, mesiolingual, lingual and distolingual), in all mouth teeth of patients with chronic periodontitis, prior to and following nonsurgical periodontal therapy. In total, 374 disease sites (PPD ≥ 4 mm) were found and constituted the sample population of this study. The prevalence of disease sites was higher at mandibular arch, in molars, and at interproximal tooth surfaces, both prior to and after treatment. There was a trend to be more prevalent on the right side of the mouth. Nonsurgical periodontal therapy resulted in a statistically significant decrease in PPD, CAL and in the percentage of BOP sites, even though with a similar pattern of disease distribution after treatment. Following treatment, molars had significantly higher PPD and CAL than other teeth. We conclude that it is important to take particular attention to specific sites in the mouth during management of patients with chronic periodontitis and that short-term nonsurgical treatment is effective in mild/moderate periodontal pockets., This study was supported by a grant (06-GCD-CICS-09) from Co-operativa de Ensino Superior, Politécnico e Universitário (CESPU), Portugal.

A publicação da segunda edição do livro Fundamentos de Imunologia vem confirmar o espírito inicial dos coordenadores de preencher uma lacuna na bibliografia disponível em português nesta área biomédica. Pensada essencialmente para orientar os estudantes do ensino superior universitário e politécnico na área da Imunologia e conduzir a uma melhor compreensão dos assuntos mais complexos do funcionamento do sistema imunológico, esta obra interessará também a médicos ou outros profissionais de saúde. Para além da revisão e atualização da maioria dos capítulos que integravam a edição anterior, acrescentaram-se novos capítulos dedicados às células dendríticas, às citocinas, à nutrição e ainda um último sobre as técnicas imunológicas que apoiam as áreas de diagnóstico e de investigação laboratorial. Sempre que pertinente foram introduzidos destaques clínicos que despertam o leitor para aspetos clínicos e laboratoriais de tópicos científicos atuais. Em linha com as edições anteriores, houve a preocupação de modernizar e uniformizar a terminologia científica utilizada ao longo de toda a obra, sendo que foi já adotado o novo Acordo Ortográfico. Esta nova edição foi ainda profusamente ilustrada a cores, sendo essa uma mais-valia em relação à edição anterior. As figuras são originais, com uma linha gráfica uniforme e de elevado rigor científico. Houve aliás grande preocupação em manter os traços e cores nos elementos que se repetem ao longo do livro. As discrepâncias que ocorrem são propositadas e têm fundamento (veja-se o caso do citoplasma que por vezes surge com cores diferentes dependendo da célula representada).

Existem três tipos de linfócitos B: os linfócitos B-1, B-2 e linfócitos B da zona marginal. As respostas humorais caracterizam-se pela ativação dos linfócitos B, sua proliferação e diferenciação em plasmócitos, secretores de anticorpos, e em linfócitos B de memória. Existem dois tipos de repostas humorais: as independentes dos linfócitos T (TI) e as dependentes dos linfócitos T (TD). As primeiras podem ainda ser divididas em TI-1, no caso de serem desencadeadas por antigénios capazes de ativação policlonal dos linfócitos B, ou TI-2, quando são desencadeadas por antigénios com uma estrutura altamente repetitiva como as cápsulas polissacarídicas de algumas bactérias. As repostas TD são desencadeadas, sobretudo, por antigénios proteicos e caracterizam-se por serem dependentes do contacto entre os linfócitos B e os linfócitos T auxiliares (T CD4+). Tipicamente a proliferação e diferenciação dos linfócitos B ocorre em microambientes especializados dos órgãos linfoides, onde a hipermutação somática gera diversidade das Ig dos linfócitos B. Aqueles linfócitos B que liguem fortemente o antigénio são selecionados positivamente, pelo que a afinidade dos anticorpos aumenta ao longo de uma resposta anticórpica (maturação da afinidade). A ajuda dos linfócitos T está também envolvida na comutação da classe das imunoglobulinas, originando a produção de anticorpos de isotipos distintos. Os diferentes isotipos de anticorpos participam em mecanismos efetores distintos: a neutralização do agente agressor (IgG, IgM e IgA), a opsonização e fagocitose (principalmente IgG1 e IgG3), a ativação do complemento (sobretudo a IgM, a IgG3 e IgG1 e também a IgA), a citotoxicidade dependente de anticorpos (IgG1 e IgG3) e a desgranulação de mastócitos, basófilos e/ou eosinófilos (IgE).

Este capítulo tem como objetivo principal apresentar algumas das técnicas mais importantes usadas em Imunologia para isolar e estudar os diferentes tipos celulares que constituem o sistema imunológico, nomeadamente linfócitos, monócitos e células dendríticas, assim como os mediadores biológicos que produzem. Não pretende ser um manual de laboratório, mas antes um guia que ajude à compreensão de alguma das principais técnicas imunológicas utilizadas em investigação e diagnóstico. O capítulo incidirá, sobretudo, em técnicas imunológicas mais nas áreas da bioquímica e da biofísica (por exemplo, imunoprecipitação de proteínas, microscopia de fluorescência, e citometria de fluxo), referindo mais sucintamente técnicas imunológicas clássicas de deteção e quantificação de antigénios (por exemplo, imunoensaios). Todavia, em primeiro lugar serão abordadas as técnicas de isolamento e cultura de populações de células mononucleares do sangue.

Nos diferentes tipos de linfócitos, os princípios gerais da transmissão de sinais extracelulares entre a membrana plasmática e o núcleo são idênticos em vários aspetos, envolvendo proteínas sinalizadoras, mensageiros intracelulares, assim como a ativação de fatores de transcrição. Apesar de a transdução de sinais extracelulares tanto nos linfócitos B como nos linfócitos T ser iniciada pela agregação dos respetivos recetores para o antigénio, quer o BCR quer o TCR possuem uma pequena cauda citoplasmática incapaz de transmitir sinais intracelulares para o interior da célula. Esta limitação é superada através da associação com as cadeias Igalfa/Igbeta (no caso do BCR) ou as cadeias CD3 (no caso do TCR), as quais têm caudas citoplasmáticas longas contendo sequências ricas em tirosinas (ITAM) que, uma vez fosforiladas, permitem a ligação de proteínas sinalizadoras e adaptadoras que apresentam domínios de ligação específicos (por exemplo, SH, PH) capazes de transmitir os sinais extracelulares através da ativação de substratos presentes no citosol, incluindo fatores de transcrição. Contudo, os linfócitos estão sujeitos a sinais extracelulares independentes do antigénio e resultantes da agregação de recetores ativadores (por exemplo, CD40, CD28), recetores inibidores (por exemplo, CD22, CTLA-4), recetores de citocinas (por exemplo, IL-2, IL-15), assim como recetores NK (por exemplo, KIR). Estes recetores utilizam mecanismos moleculares muito similares aos utilizados pelos recetores do antigénio para transmitir os sinais, funcionando, porém, como moduladores do sinal principal transmitido quer pelo BCR quer pelo TCR. No caso dos recetores NK, é importante salientar que podem funcionar quer como recetores que transmitem o sinal principal (por exemplo, linfócitos NK), quer como recetores moduladores do sinal principal transmitido pelo TCR (por exemplo, linfócitos NKT). Em última instância, o resultado final para o linfócito dependerá do balanço entre os sinais positivos e negativos transmitidos.

As respostas imunológicas são mediadas por leucócitos que, no período pós-embrionário, derivam de precursores existentes na medula óssea. O processo de formação das células sanguíneas a partir de células estaminais é designado por hematopoiese. No período embrionário a hematopoiese ocorre sobretudo no fígado fetal. Existem duas grandes linhagens celulares: a linhagem mieloide que origina os granulócitos polimorfonucleados e os monócitos; e a linhagem linfoide que origina os linfócitos T, B e NK. Os linfócitos maturam nos órgãos linfoides primários: os linfócitos B na medula óssea e os linfócitos T no timo. Daí os linfócitos entram para a circulação sanguínea, da qual saem para os demais tecidos do corpo, sobretudo para os órgãos linfoides secundários. Estes órgãos proporcionam um encontro eficiente entre os linfócitos e as células apresentadoras de antigénios, diferenciando-se os linfócitos em células efetoras ou de memória. Existem três tipos principais de órgãos linfoides secundários: o baço, que recolhe antigénios do sangue; os gânglios linfáticos que recolhem antigénios dos demais tecidos do organismo; e os tecidos associados às mucosas, que recolhem antigénios das superfícies epiteliais do organismo. Diferentes subpopulações de linfócitos povoam diferentes órgãos, refletindo as diferentes necessidades funcionais, particulares a cada tecido.

A linhagem linfoide origina de um precursor comum que vai dar lugar aos linfócitos B e NK (na medula óssea) e aos linfócitos T (no timo). Os estádios de desenvolvimento dos linfócitos B são marcados por alterações irreversíveis (rearranjos somáticos) nos genes das imunoglobulinas, de maneira a que o BCR expresso à superfície de um linfócito B tenha apenas uma especificidade. Se na fase de desenvolvimento o BCR reconhecer antigénios do próprio os linfócitos B são eliminados, ou substituem o seu recetor (receptor editing) de modo a estabelecer a tolerância a antigénios do próprio. Os estádios de desenvolvimento dos linfócitos T que originam as diferentes subpopulações (Talfa/abeta, Tgama/delta, NKT, CD4+CD25+) derivam de precursores CD4-CD8- que passam por estádios de duplos positivos, após o qual têm de decidir se se desenvolvem para CD8+ ou CD4+. Os linfócitos Talfa/beta são selecionados positivamente após interação do TCR, e dos seus correcetores (CD4 ou CD8), com moléculas MHC:péptido do próprio expressas pelas células epiteliais do timo. Por seu lado, as células apresentadoras de antigénio têm um papel fundamental na eliminação de linfócitos T autorreativos, assegurando a tolerância imunológica. Os linfócitos T CD4+ ou T CD8+ convencionais desenvolvem-se no contexto de moléculas de MHC classe II ou classe I, respetivamente. Por seu lado, as populações de linfócitos T não convencionais (ex. NKT invariantes que utilizam a cadeia Valfa24beta11) são selecionados positivamente quando reconhecem um glicolípido específico associado à molécula de CD1d. Os mecanismos por detrás do desenvolvimento dos linfócitos NK são pouco conhecidos, tendo sido utilizado apenas marcadores de superfície e atividades efetoras.

Os linfócitos TCRalfa/beta são uma das linhagens originadas a partir de precursores hematopoiéticos da medula óssea que completam a sua maturação no timo, sendo a característica que melhor os define a expressão de uma estrutura polimórfica responsável pelo reconhecimento do antigénio – o recetor de antigénio da célula T ou TCR (do inglês T Cell Receptor). No microambiente do timo os precursores dos linfócitos T, atendendo ao correcetor que será expresso junto com o TCR, podem diferenciar-se em linfócitos T CD4+ e linfócitos T CD8+. Como veremos a seguir, estas duas grandes populações estão constituídas por linfócitos T com características fenotípicas e funcionais diferentes. Por outro lado, e devido à contínua exposição a estímulos provenientes do meio ambiente que os rodeia, os linfócitos T que saem do timo estão sujeitos a processos de ativação que levam a uma fase de expansão seguida de uma fase de contração. Estes ciclos de ativação-expansão-contração estão regulados por recetores ativadores e inibidores da divisão celular e permitem que uma fração de linfócitos T entre num processo de diferenciação que leva a mudanças drásticas, por vezes irreversíveis, das suas características tanto fenotípicas como funcionais. Este processo de diferenciação é responsável pela formação de linfócitos T auxiliadores, citotóxicos e reguladores/supressores presentes na circulação.

O processamento de proteínas, tanto próprias (endógenas) como não próprias (exógenas), que irão ser apresentadas aos linfócitos T na forma de péptidos de diferentes tamanhos associados a moléculas clássicas de MHC classe I e classe II, é o resultado de uma série de eventos altamente regulados. Apesar de os aspetos bioquímicos do processo terem sido objeto de estudos intensivos durante os últimos anos, só recentemente começaram a ser integrados no contexto dos diferentes compartimentos celulares, sendo este facto mais relevante aquando do processamento e apresentação de lípidos pelas moléculas de CD1. A capacidade das moléculas de MHC apresentarem aos linfócitos T péptidos e glicolípidos, a priori representando o universo de possíveis proteínas e lípidos presentes tanto dentro como fora do nosso organismo, constitui, do ponto de vista imunológico, um dos maiores logros da evolução. Assim, o processamento de qualquer proteína e/ou lípido e a sua subsequente apresentação, no contexto de moléculas de MHC, aos linfócitos T, confere a estes últimos a capacidade de “sentir” o estado de uma célula e detetar alterações resultantes de uma série de situações possíveis de acontecer como a invasão por agentes patogénicos, a transformação celular associada aos tumores, ou a degenerescência resultante da injúria por agentes tóxicos, para citar algumas. Nestas situações, o processamento e apresentação de péptidos e glicolípidos poderá iniciar uma resposta mediada por diferentes populações de linfócitos T (resposta adaptativa) que irá complementar possíveis respostas iniciadas por células do sistema imunológico inato. Contudo, o processamento e apresentação de antigénios serve funções que, por vezes, não são dependentes do reconhecimento do péptido, como no caso de recetores NK presentes tanto nos linfócitos T como nos NK.

Os linfócitos B expressam à sua superfície um recetor cuja parte responsável pelo reconhecimento do antigénio é uma imunoglobulina. As imunoglobulinas pertencem à superfamília das imunoglobulinas pelo facto de serem constituídas por domínios V e C, com propriedades características. Estas moléculas apresentam uma região variável que confere especificidade para o antigénio e uma região constante com propriedades efetoras. Os genes que codificam para as imunoglobulinas são constituídos após rearranjos somáticos do ADN da linha germinal. Durante a recombinação somática e por mutação somática, mecanismos especializados são responsáveis pela geração de diversidade que explica a existência de um elevadíssimo número de imunoglobulinas com distintas especificidades para o antigénio. Em resposta ao antigénio, os linfócitos B podem efetuar uma mudança no isotipo da imunoglobulina que expressam, podendo assim alterar as propriedades efetoras destas moléculas mantendo a mesma especificidade para o antigénio. A capacidade dos linfócitos B expressarem uma forma membranar ou segregada da mesma imunoglobulina, assim como de expressarem simultaneamente IgM e IgD, deve-se a um processo de splicing alternativo do ARN.

A imunidade inata consiste na acção concertada de variados tipos celulares, receptores, sistemas de sinalização e mecanismos efetores. Primeiro as barreiras epiteliais têm um papel fundamental na protecção do organismo contra a invasão de agentes patogénicos externos. Por sua vez, o reconhecimento directo de diferentes agentes agressores (sejam eles bacterianos, víricos ou outros) induz a imunidade inata que constitui a primeira linha de defesa do organismo. Dentro dos vários mecanismos estudados, o sistema do complemento e a fagocitose constituem dois dos meios de defesa mais importantes, humorais e celulares, respectivamente. Porém a imunidade inata tem também um papel fundamental no encetar e no controle da imunidade adaptativa. A inflamação, que tratamos com algum detalhe, é um bom exemplo da passagem de uma imunidade inata para o estabelecimento de uma resposta imunológica adaptativa. A imunidade adaptativa ocupará a maior parte do conteúdo deste livro.

Os linfócitos NK constituem uma população heterogénea de linfócitos citotóxicos e produtores de citocinas com um papel crucial na regulação de respostas imunes inatas e adaptativas. Os linfócitos NK são caracterizados pela ausência de um TCR, a expressão do recetor CD8 na sua forma homodimérica (CD8 alfa/alfa), e com uma atividade funcional regulada por recetores inibidores e ativadores, e designados usualmente como recetores NK. A identificação dos ligandos de alguns destes recetores como sendo moléculas de MHC classe I revolucionou a compreensão do funcionamento do sistema imunológico. Assim, o único ligando conhecido das moléculas de MHC classe I, até há relativamente pouco, era o recetor do linfócito T. A ativação de linfócitos NK resulta na secreção de citocinas que regulam respostas imunológicas inatas (fagocitose, apresentação de antigénios, etc.) e adaptativas (diferenciação de linfócitos T e B, etc.), e na eliminação de células-alvo através de processos citotóxicos que podem envolver a produção de grânulos citotóxicos, assim como a agregação de recetores que induzem a morte celular.

Iron overload in the liver may occur in clinical conditions such as hemochromatosis and nonalcoholic steatohepatitis, and may lead to the deterioration of the normal liver architecture by mechanisms not well understood. Although a relationship between the expression of ICAM-1, and classical major histocompatibility complex (MHC) class I molecules, and iron overload has been reported, no relationship has been identified between iron overload and the expression of unconventional MHC class I molecules. Herein, we report that parameters of iron metabolism were regulated in a coordinated-fashion in a human hepatoma cell line (HepG2 cells) after iron loading, leading to increased cellular oxidative stress and growth retardation. Iron loading of HepG2 cells resulted in increased expression of Nor3.2-reactive CD1d molecules at the plasma membrane. Expression of classical MHC class I and II molecules, ICAM-1 and the epithelial CD8 ligand, gp180 was not significantly affected by iron. Considering that intracellular lipids regulate expression of CD1d at the cell surface, we examined parameters of lipid metabolism in iron-loaded HepG2 cells. Interestingly, increased expression of CD1d molecules by iron-loaded HepG2 cells was associated with increased phosphatidylserine expression in the outer leaflet of the plasma membrane and the presence of many intracellular lipid droplets. These data describe a new relationship between iron loading, lipid accumulation and altered expression of CD1d, an unconventional MHC class I molecule reported to monitor intracellular and plasma membrane lipid metabolism, in the human hepatoma cell line HepG2., This work was funded by the Inova Foundation for Medical Research/The American Portuguese Biomedical Research Fund (APBRF, USA). The authors would like to thank L. Mayer and K. Uchida for providing antibodies, A. do Vale, F. Pisarra and M.T. Silva for help and comments on TEM, and M. Santos and R. Hultcrantz for critical reading of the manuscript. We also thank M. de Sousa for mentoring this work. M.C. and C.F.P. were supported by a fellowship from Inova/APBRF. E.M.C. was partially supported by EU grant (QLG1-CT-1999–00665).

BACKGROUND: Although most Caucasian patients with hereditary haemochromatosis (HH) show the same mutation in the HFE gene, the phenotypic expression of the disease varies greatly. We have previously shown that patients with HH who have high iron stores have low numbers of circulating CD8+ T lymphocytes. PATIENTS AND METHODS: Liver and peripheral blood were studied in 37 C282Y homozygous HH patients; nine normal livers and 11 livers from patients with cirrhosis due to hepatitis C virus or alcoholic liver disease were also investigated. Eleven jejunal biopsies from HH patients and 17 normal biopsies were studied. The numbers of CD8+ cells were determined in peripheral blood by fluorescence-activated cell sorting analysis, and in the liver or small intestine by immunohistochemistry. RESULTS: In HH patients the number of CD8+ T lymphocytes in peripheral blood correlated significantly with the number of CD8+ cells in the liver lobuli but not with that in the small intestine. Body iron stores correlated negatively with the number of CD8+ T lymphocytes in peripheral blood and in the liver, but not with the number in the small intestine. HH patients with cirrhosis had the lowest CD8+ cell count in liver sections, in contrast with other forms of cirrhosis. CONCLUSION: The results indicate that HH patients with the HFE C282Y mutation and low numbers of CD8+ cells in the liver lobuli have higher iron stores and are more prone to develop liver cirrhosis., This study was supported by the Swedish Medical Research Council (n. 9127), the Bengt Ihres Foundation, Ruth and Richard Julins Foundation and the Karolinska Institute. Elsa Cardoso is a recipient of a PRAXIS XXI Grant BD/5095/95.

To determine the frequency of mutations (C282Y and H63D) in a newly identified gene HFE in patients with hereditary haemochromatosis (HH) in Sweden. DESIGN: Molecular genetic analyses of the HFE gene (polymerase chain reaction (PCR) followed by enzyme restriction) were performed in genomic DNA from unrelated patients with a clinical diagnosis of HH and in healthy subjects. SETTINGS: Patients with HH treated with phlebotomies at Karolinska Hospital and Huddinge Hospital were analyzed. SUBJECTS: Eighty-seven unrelated patients with HH and 117 healthy controls. RESULTS: It was found that the HFE C282Y mutation occurs in 94.2% of chromosomes from patients with HH. Eighty patients (92.0%) were homozygous for the C282Y mutation and one was heterozygous. Three patients were heterozygous for both C282Y and H63D mutations. One patient was homozygous and one was heterozygous for the H63D mutation. One patient carried normal alleles. In healthy controls, the C282Y mutation occurred in nine subjects (7.7%), all of which were heterozygous. The H63D mutation was found in 28 control subjects, one of which was homozygous. CONCLUSIONS: We found that the majority of patients with HH have the C282Y mutation in the HFE gene. The frequency of the H63D mutation was higher in controls than in patients with HH, although in chromosomes at risk the frequency of the H63D mutation was higher in patients., This study was supported by the Swedish Medical Research Council (n. 9127), the Swedish Society of Medicine, Ruth and Richard Julins Foundation and the Karolinska Institute. Miss Elsa Cardoso is a recipient of a PRAXIS XXI Grant BD/5095/95.