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Dissertation, RWTH Aachen University, 2023; Aachen : Apprimus Verlag, Applied microbiology 30, 1 Online-Ressource : Illustrationen, Diagramme (2023). = Dissertation, RWTH Aachen University, 2023, The sensation of “smell”, caused by volatile organic compounds, is native to all domains of life. The sum of all emitted molecules is called the volatilome but this is a sparsely populated research field. Saccharomyces cerevisiae is a common host for modern biotechnology and has been used for biotechnological production of ethanol for most of human civilisation, but still, the gas phase above fermentations is yet to be fully understood. This thesis aims to contribute to the knowledge of different aspects of the yeast volatilome. Carbon dioxide, even with the current fight against human-made climate change, is an often neglected metabolite. Through complementing a bioethanol fermentation in an overpressure reactor with a Ru-catalyst in an organic phase and high hydrogen pressure, carbon dioxide was converted to formic acid. With optimised reaction parameters, over 26 % of the greenhouse gas were converted to the non-volatile, nontoxic,C1-source formate. Biotechnological production processes often suffer from high downstream purificationcosts, which could be minimised through the targeted overproduction of volatile metabolites. One prime example is acetaldehyde, with a worldwide production of over 1 Mt/a, which is chiefly synthesised from petrochemical feedstocks. S. cerevisiae with completely deleted alcohol dehydrogenase activity was used to produce acetaldehyde from glucose at rates of up to 100 mg/g/h in up to 750 mL scale. Because of the compound’s low boiling point, it is inevitably stripped from the reactor. For this in situ separation, water traps were designed to trap the acetaldehyde from the off-gas. As a new method for volatile and volatilome analysis, SESI-Orbitrap MS was established on the example of the heat-labile allicin from garlic. This compound was measured from a microreaction tube with a solution of synthetic allicin, freshly crushed garlic, and from human breath after garlic consumption. Further, the differences between different Allium species were examined, showing the versatility of this measurement methodology. Lastly, the complete volatilome was measured online with a time resolution of0.4 Hz from the off-gas of a yeast fermentation. While the ethanol signal showed high agreement to standard measurement techniques, acetaldehyde as an example of low-abundance high-volatile compounds, was measured hours earlier. In over 16,000scans, over 200 compounds were identified by their molecular formula, each with their unique intensity over time profile. Two metabolic shifts were visible, and, for example, the production of medium-chain fatty acid ethyl esters was shown uniquely in the transition period during the C-source shift. In conclusion, diverse aspects of the yeast volatile space were examined: omitting unwanted volatiles, overproducing valuable volatiles, and finding new methods to analyse volatiles., Published by Apprimus Verlag, Aachen

Die Gattung Fusarium ist der weltweit am häufigsten vorkommende Mykotoxin produzierende Pilz. Viele von Fusarien produzierte Toxine sind bereits gut bekannt und erforscht. Aufgrund verschiedener Faktoren, wie z. B. des Klimawandels, sind jedoch in den letzten Jahren und Jahrzehnten neue Stoffe entstanden für die noch nicht genügend Daten gesammelt wurden. Zu diesen neuen, so genannten Emerging Mycotoxins, gehören Fusaproliferin und Terpestacin, die meist von den Stämmen Fusarium proliferatum und Fusarium subglutinans gebildet werden. Ziel dieser Arbeit ist es, mehr Daten über diese neu auftretenden Mykotoxine zu sammeln. Verschiedene Fusarium-Stämme wurden auf Reis angebaut, und nach zwei und drei Wochen wurden die Toxine mit Methanol extrahiert und mit Massenspektrometrie gemessen. Die Messungen zeigten, dass ein F. subglutinans-Stamm die höchste Menge an Fusaproliferin produzierte. Darüber hinaus wurde durch homologe Rekombination ein neuer empfindlicher Hefestamm erzeugt. Dieser Stamm wurde dann auf SC-Platten mit rohem Fusaproliferin getupft. Die Ergebnisse zeigen, dass der neue Hefestamm viel empfindlicher ist als der ursprüngliche Wildtyp-Stamm. Dieser neue empfindliche Stamm könnte nun für weitere Tests mit Fusaproliferin und Terpestacin verwendet werden. The Fusarium genus is the most common mycotoxin producing fungi worldwide. Many toxins produced by Fusarium are already well known and researched. However, due to various factors, such as climate change, new substances have been emerging in recent years and decades, for which not enough data has yet been collected. These new, so-called emerging mycotoxins include fusaproliferin and terpestacin and are mostly produced by the strain Fusarium proliferatum and Fusarium subglutinans. This thesis aims to collect more data on these new emerging mycotoxins. Different Fusarium strains were grown on rice and after two and three weeks the toxins were extracted with methanol and measured with mass spectrometry. The measurements showed, that a F. subglutinans strain produced the highest amount fusaproliferin. In addition, a new sensitive yeast strain was created via homologous recombination. This strain was then spotted on SC plates containing crude fusaproliferin. The results show, that the new yeast strain is much more sensitive than the original wild type strain. This new sensitive strain could now be used for further testing of fusaproliferin and terpestacin.

I will be conducting tests to determine the influence of specific audio frequencies on microbiological life. Specifically utilising Weihenstephan lager yeast otherwise known as 34/70 and what is called „congress mash“ as the standardised median. One the most widely used and documented yeast strains in the world. We measure factors of audio frequencies as enhancement tools to accomplish things like; reducing ester formation, influence or better biomass, help clarity, killing or reducing yeast count, speed up fermentation or conditioning or potentially reducing or killing potential infections.

Saccharomyces cerevisiae ist das am häufigsten verwendete eukaryotische Chassis in der Syn-thetischen Biologie, weil die Menschheit und diese Hefe eine lange und fruchtbare Geschichte miteinander verbindet. Bei Anwendungen in der Synthetischen Biologie wurde S. cerevisiae häufig für biotechnologische Biosynthesewege sowie den Aufbau künstlicher Netzwerke ein-gesetzt. Unser Beitrag zur biotechnologischen Nutzung der Hefe S. cerevisiae ist, dass wir deren metabolischen Kapazitäten erweiterten, indem wir nicht natürlich vorkommende kurzkettige Acyl-Coenzym-A-Ester als Stoffwechselvorläufer bereitgestellt haben. Um den Bau künstlicher Netzwerke zu mehrzelligen Systemen voranzutreiben, haben wir einen umfassenden Hefe-kommunikations-Baukasten (YCTK) bereitgestellt und gezeigt, dass es für den schnellen Aufbau synthetischer Zell-Zell-Kommunikationssysteme verwendet werden kann. Designte Bereitstellung von kurzkettigen Acyl-Coenzym A-Estern in Saccharomyces cerevi-siae Weltweit ist S. cerevisiae einer der am häufigsten verwendeten Organismen in der modernen Biotechnologie und stellt einen hohen wirtschaftlichen Wert für die wachsende Bioökonomie dar. Mit dem Ziel, in S. cerevisiae neuartige Naturprodukte herzustellen, wurde ein Mangel des Organismus offensichtlich. Kurzkettige Acyl-Coenzym A-Ester dienen als Vorstufen für wertvol-le Produkte, wie Fettsäuren, Polyketide, Biopolymere und anderen Chemikalien. Das begrenzte Repertoire von S. cerevisiae an kurzkettigen Acyl-CoAs verhindert jedoch, dass S. cerevisiae als Produktionswirt für eine Vielzahl an Naturstoffen eingesetzt werden kann. Um diese Einschrän-kung zu beseitigen, haben wir die Biosynthesewege zu fünf verschiedenen Acyl-CoA-Estern in S. cerevisiae etabliert. Wir entwickelten Hefen, welche die Biosynthesewege für Propionyl-CoA, Methylmalonyl-CoA, n-Butyryl-CoA, Isovaleryl-CoA und n-Hexanoyl-CoA von Plasmiden expri-mierten. Für die Herstellung von Propionyl-CoA und Methylmalonyl-CoA haben wir einen veröf-fentlichten, fütterungsabhängigen Produktionsweg unter Verwendung von PrpE und Pcc En-zymen eingesetzt, der als Maßstab für unsere fütterungsunabhängigen Produktionswege dien-te, die in unserer Studie vergleichbare Produktkonzentrationen ergaben. Um eine effiziente Extraktion der produzierten Metaboliten sicherzustellen, haben wir ein hefespezifisches Meta-bolitenextraktionsprotokoll erstellt, um die intrazellulären Acyl-CoA-Konzentrationen in den gentechnisch hergestellten Stämmen zu bestimmen. Für die Herstellung von Isovaleryl-CoA haben wir zwei verschiedene Wege getestet, aber nur Produktbildung aus dem alternativen Isovaleryl-CoA-Biosyntheseweg (AIB) erhalten, der aus Myxococcus xanthus stammt und 5,5 ± 1,2 µM Isovaleryl-CoA produzierte. Unseres Wissens nach ist dies die erste funktionelle artfrem-de Expression dieses Stoffwechselweges in S. cerevisiae. Für die Herstellung von n-Butyryl-CoA und n-Hexanoyl-CoA haben wir den Butanol-Produktionsweg für unsere Zwecke angepasst und ca. 6 µM intrazelluläre Konzentration von Butyryl-CoA und Hexanoyl-CoA gemessen. Für den fütterungsabhängigen Weg zu Propionyl-CoA erhielten wir intrazelluläre Konzentrationen von 5,3 ± 2,4 µM, während der fütterungsunabhängige 3HP-Weg 8,5 ± 3,7 µM produzierte. Die Ver-längerung beider Propionyl-CoA-Wege zur Produktion von Methylmalonyl-CoA führte nur zur Produktion von 0,5 ± 0,1 µM und 0,3 ± 0,3 µM Methylmalonyl-CoA. Nicht nur, aber insbesondere für die Herstellung von Methylmalonyl-CoA, ist eine weitere Optimierung erforderlich. Wir haben einen kurzkettigen Acyl-CoA-Golden-Gate-Baukasten etabliert, um Prototypenentwick-lung, Optimierung und das Testen von alternativen Enzymen zu vereinfachen. Diese Sammlung ermöglicht zusammen mit dem bekannten Hefe-Baukasten Dueber YTK sowohl die Untersu-chung verschiedener Enzymvarianten als auch die optimierte Expression der entsprechenden Gene. Wir kommen zur Schlussfolgerung, dass die hier produzierten Acyl-CoAs, welche häufige Vor-stufen von Sekundärmetaboliten sind, den Grundstein für die künftige gentechnische Herstel-lung von Naturstoffen in S. cerevisiae legen. Diese Acyl-CoA-produzierenden Stämme bilden zusammen mit dem kurzkettigen Acyl-CoA-Baukasten die Grundlage für die weitere Erfor-schung von S. cerevisiae als heterologem Produktionsorganismus zur Herstellung hochwertiger sekundärer Stoffwechselprodukte. Hefe Kommunikationsbaukasten Die Konstruktion mehrzelliger Netzwerke wurde schon früh in der Synthetischen Biologie als Ziel definiert. Auch heute sind mit ihnen vielversprechende Vorteile, wie die Arbeitsteilung und die Lösung komplizierter Netzwerkfunktionen, verknüpft. Die meisten Systeme wurden bisher in bakteriellen Organismen etabliert und es existieren nur wenige Beispiele für eukary-otische Organismen wie S. cerevisiae. Speziell für gramnegative Bakterien bietet das Quorum-Sensing-System eine Vielfalt gebrauchsfertiger Kommunikationssysteme. Hefen entwickelten auch ein Kommunikationssystem unter Verwendung von Peptidpheromonen, um mit dem ent-gegengesetzten Paarungstyp zu interagieren. Wir haben die natürliche Diversität der Peptid-α-Faktor-Pheromone, der entsprechenden GPCR-Rezeptoren sowie der Proteasen, welche ähn-lich wie Quorum-Quenching-Enzyme funktionieren, genutzt. Mit der Einrichtung unseres Gol-den Gate Hefekommunikations-Baukastens stellen wir eine standardisierte Sammlung von Tei-len zur Verfügung, die den schnellen Aufbau von vielzelligen Netzwerken im Modellorganis-mus S. cerevisiae ermöglichen. Die möglichen Netzwerkdesigns und die daraus resultierenden denkbaren Anwendungen sind sehr vielseitig. Die YCTK-Sammlung besteht aus Rückmelder- (Pheromon-induzierbaren Promo-toren), Sender- (mfα1-Gene - α-Faktoren), Empfänger- (Ste2-Rezeptoren) und Barriere- (Bar1-Proteasen) -teilen. Wir haben die Dynamik der Pheromon-induzierbaren Promotoren in den verschiedenen Hintergründen der Paarungstypen charakterisiert und die Dosisreaktion auf den α-Faktor sowie deren zeitliche Reaktion bestimmt. Die verschiedenen Promotoren zeigten eine Reihe unterschiedlicher Dynamiken und Eigenschaften, die die Umsetzung unterschiedli-cher Designs ermöglichen. Die Charakterisierungsergebnisse der Ste2-Rezeptoren zeigten, dass unsere Sammlung aus Rezeptoren mit hoher Promiskuität für den α-Faktor und aus Rezep-toren mit hoher Substratspezifität für ihren zugehörigen α-Faktor besteht. Ferner fanden wir, dass verschiedene Ste2-Rezeptoren unterschiedliche Empfindlichkeiten gegenüber dem ver-wandten sowie dem nicht verwandten α-Faktor aufweisen. Die Promiskuität der Ste2-Rezeptoren korrelierte nicht mit den α-Faktor-Sequenzen. Unsere Wahrscheinlichkeitsanalyse der Ste2-Rezeptoren ergab, dass diejenigen, die eng mit S. cerevisiae verwandt sind, tendenziell durch die α-Faktoren verwandter Spezies stimuliert werden. Unsere Stammbaumanalyse der Ste2-Rezeptoren stimmt mit den phylogenetischen Beziehungen der Spezies überein. Interes-sant ist auch die Feststellung, dass α-Faktoren von Spezies, für die der Rezeptor eine hohe Pro-miskuität gegenüber α-Faktoren aufweist, nur wenige Rezeptoren stimulieren. Obwohl nur fünf der ausgewählten Proteasen funktionell exprimiert wurden, war die Charakterisierung der Pro-teasepromiskuität unseres Wissens die bislang umfassendste Studie dieser Art. Ähnlich wie bei den Rezeptoren identifizierten wir promiskuitive und substratspezifische Proteasen. Das vor-geschlagene Modell der Koevolution zwischen Rezeptoren und Proteasen zur Erkennung ähn-licher Sequenzmotive des α-Faktors wurde teilweise durch unsere Ergebnisse bestätigt, das Modell ist jedoch nicht universell anwendbar. Das erweiterte Wissen über die Pheromon-induzierbaren Promotoren, den Crosstalk zwischen α-Faktoren, Rezeptoren und Proteasen und der Einstellbarkeitstest der Teile ermöglichten die Anwendung des modelhaften Aufbaus von mehrzelligen Systemen unter Verwendung der YTCK-Sammlung. Wir haben mehrzellige logi-sche Gate-ähnliche Populationsnetzwerke entwickelt, die es den Empfängerzellen ermöglich-ten, auf die Populationszusammensetzung zu reagieren. Während das α-Faktor-Signalmotiv funktionsfähig ist und erfolgreich zur Etablierung von OR- und AND-Gate-ähnlichen Systemen verwendet wurde, muss die Signalstörung durch eine Barriereprotease eines selbststimulie-renden oder eines Signalmotivs weiter optimiert werden. Insgesamt hat sich die Realisierung mehrzelliger Netzwerke mit dem YCTK als erfolgreich erwiesen. Zusammenfassend haben wir mit den YCTK Baukasten Teilen sowie eine umfassende Charakteri-sierung von Sender-, Empfänger- und Barriereteilen bereitgestellt, um die Implementierung von Zell-Zell- und damit mehrzelligen Kommunikationsnetzwerke in S. cerevisiae zu erleich-tern., Saccharomyces cerevisiae is the most widely used eukaryotic chassis in synthetic biology, as hu-manity and yeast share a long and fruitful history. For synthetic biology applications, S. cerevisiae was extensively used for metabolic engineering as well as for the construction of artificial net-works. To contribute to the metabolic engineering achievements conducted in S. cerevisiae, we extended its metabolic capacities by providing non-native short-chain acyl-coenzyme A esters as metabolic precursors. In order to advance the construction of artificial networks to multicel-lular systems we provided a comprehensive yeast communication toolkit (YCTK), and demon-strated its usability for the rapid assembly of synthetic cell-cell communication systems. Engineered production of short-chain acyl-coenzyme A esters in Saccharomyces cerevisiae Globally, S. cerevisiae is one of the most commonly used chassis organisms in modern biotech-nology and constitutes a high economic value to the growing bioecomomy. With the objective to produce novel natural products in S. cerevisiae a bottleneck of the chassis was uncovered. Short-chain acyl-coenzyme A esters serve as intermediate compounds in fatty acid biosynthesis, and are building blocks for the production of polyketides, biopolymers, and other value-added chemicals. However, S. cerevisiae’s limited repertoire of short-chain acyl-CoAs effectively pre-vents its application as a production host for a plethora of natural products. To address and re-solve this limitation, we introduced metabolic pathways to five different acyl-CoA esters into S. cerevisiae. We engineered plasmid-based yeast strains that provide propionyl-CoA, methylmalonyl-CoA, n-butyryl-CoA, isovaleryl-CoA, and n-hexanoyl-CoA. For the production of propionyl-CoA and methylmalonyl-CoA, we reestablished a published feeding-dependent pro-duction route using the PrpE and Pcc enzymes to serve as benchmark for our feeding-independent production pathways that provided in our study comparable product concentra-tions. To ensure efficient extraction of the produced metabolites we established a yeast-specific metabolite extraction protocol to determine the intracellular acyl-CoA concentrations in the engineered strains. For the production of isovaleryl-CoA, we tested two different pathways but only obtained product formation from the alternative isovaleryl-CoA biosynthetic (AIB) pathway originating from Myxococcus xanthus and obtained 5.5±1.2 µM isovaleryl-CoA. To our knowledge, this is the first reported functional heterologous expression of this pathway in S. cerevisiae. For the production of n-butyryl-CoA and n-hexanoyl-CoA, we adapted the butanol production pathway for our purposes and measured approximately 6 µM intracellular concen-tration of butyryl-CoA and hexanoyl-CoA. For the feeding-dependent pathway towards propio-nyl-CoA we obtained intracellular concentrations of 5.3 ± 2.4 µM while the feeding independ-ent 3-hydroxypropionate (3HP) pathway produced 8.5 ± 3.7 µM. The extension of both propio-nyl-CoA pathways to produce methylmalonyl-CoA resulted only into production of 0.5 ± 0.1 µM and 0.3 ± 0.3 µM methylmalonyl-CoA. Not only but particularly for the production of methylmalonyl-CoA further optimization is required. To allow rapid pathway prototyping, op-timization and testing of alternative enzymes, we established a short-chain acyl-CoA Golden Gate collection. This collection enables together with the well-known Dueber yeast toolkit YTK collection the examination of different enzymes variants and to investigate optimized expres-sion of the corresponding genes. We conclude that the acyl-CoAs produced here, that are common building blocks of secondary metabolites, prepared the ground for prospective engineered production of a variety of natural products in S. cerevisiae. These acyl-CoA producing strains together with the short-chain acyl-CoA collection lay the foundation to further explore S. cerevisiae as a heterologous production host for high-value secondary metabolite production. Yeast communication toolkit The construction of multicellular networks was a proposed aim already early on in synthetic biology. Today, they still hold many promises like the division of labor or the performance of more complex tasks. Most of the systems so far were implemented in bacterial chassis and only a few examples exist for the eukaryotic chassis S. cerevisiae. Especially for gram-negative bacterial chassis, the quorum sensing system provides a large diversity of ready to use communication systems. Also, yeast species evolved a communication system using peptide-based pheromones to interact with the opposite mating type. Here, we employed the natural diversity of the pep-tide α-factor pheromones, the corresponding GPCR receptors, as well as of barrier proteases, that function similarly to quorum quenching enzymes. With the establishment of the Golden Gate yeast communication toolkit (YCTK) we provide a standardized collection of parts that al-low the rapid construction of multicellular networks in the model organism S. cerevisiae. The feasible designs are limitless as well as the number of envisioned applications. The YCTK collec-tion consists of responder (pheromone-responsive promoters), sender (mfα1 genes – α-factors), receiver (Ste2 receptors) and barrier (Bar1 proteases) parts. We characterized the dynamics of the pheromone-inducible promoters in the different mating-type strain backgrounds and de-termined the dose-response to the α-factor as well as their temporal response. The different promoters exhibited a range of different dynamics and properties that enable the implementa-tion of different prospective network design motives. The characterization results of the Ste2 receptors indicated that our collection is comprised of receptors with high α-factor promiscuity and of receptors with high substrate specificity for their cognate α-factor. Further we found that different Ste2 receptors exhibit different sensitivities towards the cognate as well as to non-cognate α-factors. The promiscuity of the Ste2 receptors did not correlate with the α-factor se-quences. Our likelihood analysis of the Ste2 receptors indicated that the ones closer related to S. cerevisiae tend to be stimulated by the α-factors of related species. Our likelihood analysis of the Ste2 receptors coincided with the phylogenetic relationships of the species. Interesting is also the finding that α-factors of species for which the receptor exhibited high α-factor promis-cuity stimulated only a few receptors. Even though only five of the selected barrier proteases were functionally expressed the characterization of the protease promiscuity was to our knowledge the most comprehensive study of its kind so far. Similar to the receptors we identi-fied promiscuous and substrate specific barrier proteases. The proposed model of a coevolution between the receptor and barrier proteases to recognize similar sequence motives of the α-factor was partly validated, however, the model is not universally applicable according to our results. The extended knowledge of the pheromone-inducible promoters, the crosstalk be-tween α-factors, receptors and barrier proteases, and an initial tunability test enabled proof of principle construction of multicellular systems using the YTCK collection. We engineered mul-ticellular logic gate-like population networks that allow the receiver cells to conditionally re-spond to the population composition. While the α-factor signaling motif is functional and was used to successfully establish OR and AND gate-like systems, signal disruption by a barrier pro-tease of a self-stimulating or a signaling motif requires further optimization. Overall, the reali-zation of multicellular networks using the YCTK was proven to be successful. To summarize, with the YCTK we provide a set of comprehensively characterized sender, re-ceiver, and barrier parts to facilitate the implementation of cell-cell and thus multicellular communication networks in S. cerevisiae.

Das Ziel dieses Projektes war es festzustellen, ob alternatives Splicing in Saccharomyces cerevisiae für das Entwickeln eines Protein Assay Systems genutzt werden kann. Eine spezielle Form eines Protein-Fragment Complementation Assay (PCA) sollte verwendet werden, um Proteine (POI) auf ihre Fähigkeit zur Homodimerisierung zu testen. Alternatives Splicing wurde genutzt um jeweils eine der beiden Untereinheiten einer zweiteiligen Reportersequenz an das (POI) zu binden. Homodimerisierung des POI würde die beiden Untereinheiten in Kontakt bringen und somit die Funktion des Reporter Proteins wiederherstellen. Um 2 verschiedene Splicing Produkte aus demselben Gen zu erzeugen wurde eine 3‘ss 5‘ss 3‘ss Splice Site Sequenz erstellt. Die zwei gleichwertigen 3‘ss des ersten Intrors würden dazu führen, dass in der Hälfte der Splice Vorgänge die 5’ss eines zweiten Introns und damit das Intron selbst entweder inkludiert oder exkludiert würde. Als Reporter Sequenz wurde eine Methotrexat (MTX) resistente Form der Dihydrofolat Reduktase (DHFR) verwendet. Die Selektion in unserm Assay basiert somit auf Expression von MTX Resistenz. Wir waren in der Lage einen initialen Prototypen unseres Gens in Hefe zu erstellen und alternatives Splicing nachzuweisen. Es gelang uns aber in der verfügbaren Zeit nicht eine funktionelle Version unseres Assays zu erreichen. The aim of this project was to determine if alternative splicing in Saccharomyces cerevisiae could be used to create a protein assay system. For this, a special form of Protein-Fragment Complementation assay (PCA) was proposed, to test if a protein of interest (POI) has the ability to form homodimers. Alternative splicing would be used to link either of the two subunits of a reporter sequence to the POI. Homodimerization of the POI would link subunits of the reporter sequence to each other and thus restore their function. To achieve the creation of 2 different splicing products from the same gene, we created a 3’ss 5’ss 3’ss sequence of splice sites in which the two 3’ss of an initial intron are equally viable and regulate inclusion or exclusion of the 5’ss and thus the inclusion or exclusion of a secondary intron. As Reporter gene we used a Methotrexate (MTX) resistant Version of Dihydrofolate Reductase (DHFR). Thus, the selection in our Assay would be based on expression of MTX resistance. We were able to create our initial prototype gene in Yeast and to verify alternative splicing. However, within the available time frame we were not able to achieve a functional version of the assay.

Cell-cell fusion is a fundamental process in sexual reproduction and development but the mechanisms mediating and regulating this process are only now beginning to be uncovered. Despite recent progress in identifying key players in the plant and protist kingdoms, large gaps remain in other Eukaryotic lineages, including fungi. The cell fusion in the mating of the yeast Saccharomyces cerevisiae therefore presents itself as an ideal system to understand the molecular mechanisms underlying cell fusion in fungi. In an effort to identify novel components of the yeast fusion machinery and associated regulators, this thesis reports on the discovery and characterization of a membrane protein that negatively regulates the fusion of the plasma membrane (PM) which resembles tight junction claudins found in mammals. A proteomics analysis of pheromone-regulated membrane proteins revealed that components of the MCC/eisosomes, a specialized furrow-like, membrane domain important for PM organization, were preferentially down-regulated during the pheromone response. An exception was Pun1p, a four-pass membrane-spanning protein with a conserved claudin motif, which was up-regulated in response to pheromone and was targeted to the transient junction established between two mating cells. Whereas deletion of PUN1 and its paralogs presented mild fusion defects, its function was distinctly revealed in a sensitized prm1Δ null background, where high-copy expression of PUN1 resulted in a partial inhibition of cell fusion. Further examination of the Pun1p inhibition activity in prm1Δ mutants revealed that PUN1 expression had no effect on lysis or formation of cytoplasmic bubbles, two prm1Δ phenotypes that occur after the cell wall (CW) has been remodeled. Instead, PUN1 expression inhibited fusion by enhancing the formation of a flat PM interface between two cells. However, contrary to previous reports, further analysis revealed that in a proportion of these mating pairs, the flat PM interface was structurally stabilized without any underlying CW material, suggesting the arrest occurred at a stage after CW remodeling via an unknown mechanism. Notably, the Pun1p inhibition activity was dosage and concentration-dependent and was enhanced with increasing concentration of Pun1p molecules across the mating junction, indicating additive functional trans-interactions. Analysis of the mechanistic basis of Pun1p activity revealed a claudin-like activity as a Pun1p mutant version of the conserved claudin motif lost its inhibitory activity. Additionally, the mutant protein exhibited localization defects and was modified at the monomeric level. Together, these results suggest that Pun1p is expressed in mating conditions and localized at the mating junction where it interacts with other unknown proteins to promote the formation of a PM junction-like structure similar to mammalian claudin-mediated tight junctions. The PM junction-like structure would function as a fusion fidelity checkpoint that negatively regulates PM fusion in the event of a compromised fusion machinery. Finally, the identification of Pun1p as a novel component of the fusion machinery prompted further characterization of the mating junction by employing a Horseradish Peroxidase (HRP)-based proximity labeling approach. Using a HRP-Fus1p recombinant protein as a proof of principle, specific HRP-mediated labeling was observed at the shmoo tip of polarized cells, consistent with the pheromone-dependent localization of Fus1p. Although the ultimate objective of characterizing the labelled proteins was not plausible during the course of this thesis, these initial findings demonstrate the feasibility of this approach in yeast studies and its applicability in elucidating the molecular architecture of other similar junctions, a structure which we here refer to as a fertilization synapse.

Für die Brau- und Backwarenindustrie sind die Hefearten S. cerevisiae und S. pastorianus (ssp. S. carlsbergensis) essentielle Mikroorganismen für die Herstellung von Bier- und Backwaren. Zur Erstellung spezifischer Protein-Fingerprints werden häufig die ribosomalen Hefeproteine untersucht. Sie werden konstitutiv exprimiert und eignen sich daher gut für die Analytik [131]. Im Rahmen der vorliegenden Arbeit ist deshalb eine chemische Probenaufarbeitungsmethode entwickelt worden, mit der innerhalb von 25 Minuten Hefeproteine extrahiert werden und an der MALDI-TOF-MS gemessen werden können. Iterativ sind verschiedene Targets, Matrices sowie unterschiedliche Lösungsmittel- und Analyten-Verhältnisse getestet worden. In Kombination mit der entwickelten Probenaufarbeitung und der verwendeten Matrix a-Cyano-4-hydroxyzimtsäure wird das Probenmaterial im reverse thin layer Verfahren auf ein hochpoliertes Stahltarget aufgetragen. In einer notwendigen Adaption und Weiterentwicklung bereits etablierter diagnostischer Methoden wurden die Parameter an dem MALDI-TOF-MS angepasst. Die Messungen am MALDI-TOF-MS sind im positiven linearen Modus mit einem Nd/YAG Laser im Massenbereich von 2000,36-12999,34 Da durchgeführt worden. Durch die Kombination der mathematischen Verfahren PCA und SIMCA konnten die Protein-Fingerprints, der 11 Kulturhefestämme der Arten S. cerevisiae, S. pastorianus sowie der Fremdhefen S. diastaticus und Pichia membranifaciens, für eine Differenzierung der verschiedenen Wachstumsstadien eines Hefestammes genutzt werden. In Abhängigkeit von dem eingesetzten Nährmedium ist eine Differenzierung der Hefearten S. cerevisiae, S. pastorianus, S. diastaticus und Pichia membranifaciens auf Stammebene möglich gewesen. Auf Artebene war eine vollständige Differenzierung sowohl im SD-Medium und den Vollmedien möglich. Anhand spezifischer Protein-Fingerprints der Art S. cerevisiae konnten in weiteren Versuchen die beiden Prozessstufen der Stell- und Versandhefefermentation differenziert werden. Ebenfalls war eine Differenzierung der unterschiedlichen Erntehefen verschiedener Fermentationszyklen der Art S. pastorianus (ssp. carlsbergensis) möglich. Zur Überprüfung der Forschungsergebnisse wurde die etablierte molekularbiologische PCR-Methode mit spezifischen δ12/δ21-Primern angewendet., For the brewing and bakery industry, the yeast species S. cerevisiae and S. pastorianus (ssp. S. carlsbergensis) are essential microorganisms in the production process. For creating specific protein fingerprints, the ribosomal yeast proteins are often investigated. They are constitutively expressed and are therefore well suited for analysis [131]. In the present work, a chemical sample processing method for extracting yeast proteins within 25 minutes has been developed allowing measurement by MALDI-TOF-MS. Iteratively, various targets, matrices and different solvent and analyte ratios have been tested. In combination with the developed sample preparation and the used matrix a-cyano-4-hydroxycinnamic acid the sample material is applied on a highly polished steel target in the reverse thin layer process. In a necessary adaptation and further development of already established diagnostic methods, the parameters of the MALDI-TOF-MS were adapted. The measurements on the MALDI-TOF-MS were carried out in the positive linear mode with a Nd/YAG laser in the mass range of 2000.36-12999.34 Da. By combining the mathematical methods PCA and SIMCA, the protein fingerprints of the 11 strains of S. cerevisiae, S. pastorianus and the foreign yeasts S. diastaticus and Pichia membranifaciens could be used to differentiate the different growth stages of a yeast strain. Depending on the nutrient medium used, successful differentiation of the yeast species S. cerevisiae, S. pastorianus, S. diastaticus and Pichia membranifaciens has been possible at the strain level. At the species level, complete differentiation was possible in both synthetic defined media and full media. On the basis of specific protein fingerprints of the species S. cerevisiae, the two process stages of Stellhefefermentation and Versandhefefermentation could be differentiated in further experiments. It was also possible to differentiate the different harvest yeast samples of the various fermentation cycles of the species S. pastorianus (ssp. carlsbergensis). To verify the research results, the established molecular biology PCR method with specific δ12/δ21 primers was applied.

Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Flotation sowie deren Anwendungspotenzial als Fest-Flüssig-Trennschritt im biotechnologischen Downstream. Das Funktionsprinzip der Flotation ist vereinfacht beschrieben: Zur Biomasseabtrennung werden Luftblasen in eine Flotationszelle eingeleitet. Dort steigen sie auf Grund ihrer, im Vergleich zum Fermentationsmedium, geringeren Dichte auf. Eine Biomasseabtrennung findet statt, wenn einzelne, in der Fermentationsbrühe suspendiert vorliegende, Zellen oder Biomasseflocken an eine Blasenoberfläche adsorbieren und flotieren. An der Flüssigkeitsoberfläche der Flotationszelle bildet sich ein (stabiler) Schaum aus, in welchem die Biomasse aufkonzentriert vorliegt. Zur Abtrennung des Schaumes kann ein Räumer eingesetzt werden. Die Flotation ist ein Separationsprozess mit geringen Investitions- und Betriebskosten. Als etablierter großtechnischer Prozessschritt kommt sie in der Mineralien-, Abwasser- und Altpapieraufbereitung zum Einsatz. Die dort gewonnenen Erkenntnisse können teils auf Anwendungen in der Biotechnologie übertragen werden. In dieser werden jedoch auch neue Herausforderungen an die Flotationstechnik gestellt. Diese bestehen im Wesentlichen in der Analyse sowie in der Optimierung verfahrenstechnischer und physico-chemischer Prozessparameter. Weitere Aspekte sind die höheren Hygieneanforderungen sowie die Notwendigkeit eines Containment-Konzeptes beim Einsatz von gentechnisch veränderten Organismen (GVO). Im Rahmen einer Wirtschaftlichkeitsbetrachtung wurde die Flotation mit den etablierten Zellernteverfahren der Zentrifugation und der Querstromfiltration verglichen. Dabei zeigte sich, dass die Flotation eine sowohl energetisch als auch finanziell konkurrenzfähige und somit interessante Separationstechnik sein kann. Ein detailliertes Prozessverständnis ist Voraussetzung, um das Einsatzpotenzial der Flotation zur Abtrennung von Mikroorganismen aus Fermentationsbrühen abschätzen zu können. Zu diesem Zweck wurde eine Laborflotationsanlage in Kooperation mit der Firma Enviplan Ingenieurs-GmbH entwickelt und gebaut, deren Blasenerzeugung auf dem Prinzip der Druckentspannungsflotation (DAF) beruht. Sie ermöglicht eine kontinuierliche Erzeugung von Mikroblasen mit Durchmessern unterhalb von 100 µm. In Prozessmodellen wird die Kinetik der Flotation durch eine exponentielle Flotationsratenkonstante ausgedrückt. Diese beschreibt die Reduktion der Partikelkonzentration im Medium über der Flotationszeit. Die Flotationsratenkonstante steht in linearer Abhängigkeit zum spezifischen Grenzflächeneintrag sowie zur Flotationswahrscheinlichkeit, die beide durch die Blasengröße beeinflusst werden. Je kleiner die generierten Blasen sind, desto größer ist das Verhältnis von Blasenoberfläche zu Blasenvolumen jeder einzelnen Blase. Bei konstantem Blasenvolumen steigt die Flotationsratenkonstante mit der Blasenanzahl, was auf der positiven Erhöhung der verfügbaren Blasengrenzfläche beruht. Die Größe einer Blase beeinflusst deren Aufstiegsgeschwindigkeit im Medium, die Wahrscheinlichkeit der Koaleszenz mit anderen Blasen sowie die Interaktion mit weiter vorhandenen Partikeln und dem Medium selbst. Somit stellt die Blasengröße im Flotationsprozess einen Schlüsselparameter dar. Deshalb nehmen Blasengrößenmessungen für die Prozessoptimierung der Flotation eine fundamentale Rolle ein. Im Rahmen dieser Arbeit wurde eine online-Blasengrößenanalysetechnik mit automatisierter Software für die Bildauswertung entwickelt, der „Bubble Size Analyzer“ (BSA). Die Kalibrierung und Evaluation des BSA erfolgte mit zertifizierten monodispersen Referenzpartikeln. Eine inline Blasenanalyse direkt in der Flotationszelle war wegen zu hoher Blasenanzahlkonzentration und mangelnder Bildausleuchtung nicht möglich. Deshalb erfolgte die Messung online, indem ein Probenstrom aus der Flotationszelle abgezogen und in einem Messspalt analysiert wurde. Der durch die Probenentnahme verursachte Messfehler basierend auf Klassierung und Koaleszenz von Blasen wurde für verschiedene Stoffsysteme abgeschätzt. Die Klassierung beschreibt eine Verfälschung der Stichprobe durch ungleichmäßige Anpassung an Strömungsveränderungen. Sie konnte durch isokinetische Probenentnahme weitgehend ausgeschlossen werden. In Koaleszenz fördernden Medien (z.B. Wasser) ist eine Abweichung der gemessenen gegenüber der realen Blasengröße im Prozess zu berücksichtigen. In Koaleszenz hemmenden Stoffsystemen (z.B. Fermentationsbrühe, konzentrierte Saline) kann diese jedoch vernachlässigt werden. Somit zeigte sich der BSA als geeignet, die Blasengröße als Schlüsselparameter für die Flotationskinetik in der Laborflotationszelle zu bestimmen und ermöglichte eine prozessnahe Optimierung der Blasengröße. Durch operative Prozessparameter konnte Einfluss auf die Blasengröße im Flotationsprozess genommen werden. Da die Blasenerzeugung in der Laborflotationszelle auf dem Prinzip der Druckentspannungsflotation basierte, waren Gas- und Recyclevolumenstrom sowie der Sättigungsdruck relevante zu untersuchende operative Prozessparameter. Blasengrößenanalysen wurden in einem Modellstoffsystem, dem Fermentationsmedium Yeast-Malt-Broth (YMB, Hefe-Malz-Brühe) durchgeführt und es wurden die Blasengrößenverteilung sowie der spezifische Grenzflächeneintrag ermittelt. Zusätzlich wurden Flotationskinetiken des Modellmikroorganismus Hefe (Saccharomyces cerevisiae) in YMB aufgenommen und in Form ihrer Flotationsratenkonstanten verglichen. Das Ausmaß des Einflusses der Blasengröße sowie der spezifischen Grenzflächeneinträge auf die Flotationsratenkonstante wurde ermittelt und die Energieeffizienz des Prozesses berechnet. Dabei wurde beobachtet, dass die Blasengeneration in der Laborflotationsanlage im Betrieb mit YMB, einem Koaleszenz hemmendem Medium, medienbedingt nicht ausschließlich durch Druckentspannungsflotation (DAF) stattfand, sondern durch Induced Air Flotation (IAF) ergänzt wurde. Dadurch war der Gaseintrag nicht, wie bei der reinen DAF, thermodynamisch durch die druckabhängige Gaslöslichkeit limitiert. Messergebnisse des BSA zeigten, dass mit zunehmendem Gas- und Recyclevolumenstrom, wie auch bei höherem Sättigungsdruck steigende spezifische Grenzflächeneinträge erzielt wurden. Die Flotationsratenkonstante stieg stets proportional zum spezifischen Grenzflächeneintrag. Die Energieeffizienz konnte jedoch nur durch den zunehmenden Gasvolumenstrom signifikant verbessert werden, ein steigender Recyclevolumenstrom und Sättigungsdruck hatten nur einen geringen Effekt. Somit konnte die Anhebung des Gasvolumenstroms als der energetisch interessanteste operative Prozesseinfluss zur Steigerung der Flotationsratenkonstante herausgearbeitet werden. Zuletzt lag der Fokus auf der Entwicklung und Kombination geeigneter Analysemethoden für die Schlüsselparameter Partikelgröße, Partikelhydrophobizität und Blasengröße und die Partikel-Blase-Wechselwirkungen. Die Flotationsratenkonstante des Mikroorganismus Hefe wurde in zwei Modellstoffsystemen, komplexer Fermentationsbrühe YMB und isotonischer Saline (NaCl), untersucht. Mit variierenden pH-Werten und Flockungsmittelkonzentrationen wurde gezielt Einfluss auf diese Schlüsselparameter und damit auf das Flotationsergebnis genommen. Dies erfolgte mit dem Ziel, den physico-chemischen Effekt eines Additivs auf die Flotation durch eine Kombination der Analysemethoden begründen zu können. Durch eine zielgerichtete Kombination der einzelnen Analysemethoden für Schlüsselparameter im Labormaßstab konnte ein besseres Prozessverständnis erreicht werden. Mit Hilfe der kombinierten Methoden war es möglich, die Einflüsse auf die Flotierbarkeit von Hefe in verschiedenen Stoffsystemen in kleinstem Maßstab zu charakterisieren. Anhand der Ergebnisse konnte ein Flotationsmodell entwickelt werden, welches auf den Parametern Partikel- und Blasengröße und Partikelhydrophobizität basiert. Dieses Flotationsmodell wurde mit einem verbreiteten Modell nach Yoon et al. verglichen und dessen Validität wurde diskutiert. Die Schlüsselparameteranalysen in Kombination mit dem erarbeiteten Flotationsmodell erwiesen sich als geeignet für eine Flotationsprognose. Sie können zukünftig dafür genutzt werden, um das Potenzial der Flotation im Downstream für verschiedene biotechnologische Prozesse zu eruieren. Des Weiteren ermöglichen sie eine gezielte und effiziente Prozessoptimierung durch die Untersuchung des Einflusses verfahrenstechnischer und physico-chemischer Parameter auf die Schlüsselparameter.

During the years 1989-1996 the European Commission took a leading role in sequencing the yeast genome. The project was completed in April 1996 and celebrated as the success of a European research strategy based on a distributed model of scientific collaboration. Almost one hundred laboratories and private companies dispersed all over Europe took part in the sequencing work sponsored by the European Commission and an industrial platform was created to facilitate the exploitation of the genomic data by companies which were interested in yeast. The yeast genome project was part of the biotechnology strategy developed by the European Commission during the 1980s and 1990s. The Commission expected biotechnology to be relevant in crucial areas of political, economic and social intervention and wanted to promote economic growth and contribute to the process of European integration by developing a community strategy in biotechnology. Due to the strong industrial value of yeast, which is used by agrofood, pharmaceutical and biotechnology companies, sequencing the genome of this microorganism proved an ideal opportunity to pursue the Commission’s plans and the paper will examine how the yeast genome project was shaped to build human and industrial capacity in European biotechnology. By investigating capacity building, it will be possible to understand why the European Commission decided to sponsor and coordinate a scientific project in genomics, but with the real aim to strengthen economic growth in the biotechnology sector and promote integration among new and old member states of the European Economic Community.

Bier ist eines der ältesten Produkte der Menschheit. Über Jahrtausende wurde es stetig verändert und verbessert. Der jüngste uns bekannte Rohstoff, die Hefe spielte immer eine wesentliche Rolle. Heutzutage wird sie vor der Abfüllung meistens filtriert und pasteurisiert. In dieser Arbeit soll gezeigt werden, dass lebende Hefe in der Flasche Auswirkungen auf die Lagerfähigkeit sowie das Aromaprofil von Bier hat. Die Grundannahme hierfür bildet die These, dass Hefe im Bier geschmacksstabilisierend wirkt, da sie den vorhandenen Sauerstoff verbraucht und hierdurch einer Oxidation entgegenwirkt. Hierfür werden Biere mit acht verschiedenen Hefen gebraut und teilweise pasteurisiert. Nach jeweils drei, sechs und neun Monaten werden Proben gezogen und sensorisch, analytisch sowie enzymatisch untersucht. Die untersuchten Parameter sind Gesamtzellzahl, Viabilität, Ethanolgehalt, Glucosidaseaktivität sowie eine sensorische Überprüfung auf Unterschied zwischen pasteurisierten und nicht pasteurisierten Bieren. Es konnte gezeigt werden, dass auch nach 11 Monaten fruchtige, trockene als frisch empfundene Biere durch die Flaschengärung erzielt werden können. Zu den analytischen Parametern lassen sich keine generellen Aussagen treffen. Beer is one of the oldest Products made by humans. Over the past thousands of years this product was changed and improved a lot. The newest knows resource is yeast, which always played a key role. Nowadays yeast is usually filtered and pasteurized before bottling. In this thesis, it should be shown that living yeast plays a significant role in bottle fermented beers. Living yeast uses up oxygen, the substance which leads to oxidized flavours. To examine this, eight different yeast strains were used to brew beer. Some of the beers were later pasteurized. After three, six and nine months samples were taken and examined analytically, enzymatically as well as sensorial. Interesting parameters were cell count, viability, ethanol concentration, glucosidase activity as well as distinctness between the pasteurized version versus the unpasteurized version and differences in the aromatic profile of the yeasts. It could be shown that although the beers were as old as 11 months a distinct fresh, fruity and dry beer could be archieved. No general statement could be given about the analytical Parameters. vorgelegt von: Stephan Hülber Auch als Printexemplar in der Bibliothek verfügbar Wien, FH Campus Wien, Masterarb., 2018

There are some organisms on Earth that have an especially close relationship with humankind, and one of them is Saccharomyces cerevisiae. This species, which is also known as the baker´s or brewer´s yeast, has been used for thousands of years, and almost all around the world, for the production of alcoholic beverages and bread. Today, we owe even more to this organism than wine, as it became one of the best studied model organisms in biology and is widely used in different scientific disciplines like Cell Biology, Biochemistry, Genetics and Molecular Biology. But surprisingly little is known about its natural ecology. The habitat of wild, undomesticated Saccharomyces yeasts cannot be reliably defined and contrary hypotheses exist. There is some evidence that the yeast is adapted to live in sugar rich environments like fruits, but on the other hand there is also indication that wild Saccharomyces yeasts are associated with oak trees, especially their bark. In both environments, yeast is only found in a small proportion of samples and most studies additionally suffer from different biases making it impossible to conclude which, if either, environment is truly the natural habitat of the yeast. In this thesis the natural ecology of Saccharomyces spp. was studied, with an emphasis on the natural environment. The oak bark environment was analyzed by characterizing the associated microbial community using culturing and pyrosequencing methods. S. paradoxus, the wild and undomesticated relative of S. cerevisiae, could indeed grow on nutrients present in oak bark but is only a rare member of the microbial community. Studying the influence of co-isolated oak bark microorganisms on S. paradoxus’ growth and survival in natural oak bark medium revealed a wide range of effects strongly dependent on temperature. Further experimental analysis of the interactions between the yeast and two of the bacteria gave insights into the diversity and complexity of natural microbial interactions. While one Pseudomonas spp. killed the yeast, another bacterium; Mucilaginibacter spp. promoted its growth. Saccharomyces’ metabolic specialty of fermenting under aerobic conditions (Crabtree effect) is taken as evidence that the yeast is adapted to sugary fruit environments. To test this, a Crabtree positive (“fermenter”) and its isogenic Crabtree negative mutant strain (“respirer”) were competed in laboratory media and grape juice, confirming that the Crabtree effect provides a benefit under resource competition in lab medium. Unexpectedly, this benefit was absent in the more natural grape juice, although adding natural microbial competitors restored the benefit of fermentation over respiration, perhaps by interference competition. Finally, the yeast / oak association could be confirmed by an intense sampling study, but Saccharomyces was found to be much more abundant in oak leaf litter than on bark. Oak leaf litter provides a stable habitat over the year from which yeast can be easily isolated and studied. This is a useful discovery for the ecology and evolutionary history of Saccharomyces yeasts, with great promise for future studies.

Eisen-Schwefel (Fe/S) Cluster sind die ältesten anorganischen Protein-Kofaktoren und ubiquitär in allen Reichen des Lebens vorhanden. Fe/S-Proteine koordinieren häufig essentielle Aufgaben in der Zelle wie z.B. Teile der Zellatmung, der DNA Synthese und der Proteintranslation. Trotz der vergleichsweise einfachen chemischen Struktur und Zusammensetzung von Fe/S-Clustern benötigt die Zelle ein komplexes System für deren Synthese und Einbau in apo-Proteine. Defekte in der Fe/S-Proteinbiogenese sind mit schwerwiegenden Krankheiten, wie z.B. der Friedreich-Ataxie oder der sideroblastischen Anämie verknüpft. Ein besseres Verständnis der Biogenese von Fe/S-Proteinen eröffnet neben dem grundlegenden Verständnis dieses lebenswichtigen Prozesses auch eine eventuelle Behandlung solcher oft lebensbedrohlichen Erkrankungen. In Eukaryoten beginnt die Synthese von Fe/S-Clustern in den Mitochondrien, bzw. in den verwandten Mitosomen. Diese Organellen beherbergen die sog. „iron-sulfur cluster“ (ISC) Assemblierungsmaschinerie. Der frühe Teil der ISC-Maschinerie dient zur Synthese eines [2Fe-2S]-Clusters auf dem Gerüstprotein Isu1, wozu fünf weitere ISC Komponenten benötigt werden. Der Desulfurasekomplex aus Nfs1 und Isd11 liefert dabei den Schwefel, während das Frataxin Yfh1 als Eisendonor und/oder Schwefelüberträger wirkt. Eisen und Schwefel werden schließlich auf Isu1 unter Elektronenzufuhr durch das Ferredoxin Yah1 und seiner Reduktase Arh1 zu einem Fe/S-Cluster zusammengesetzt. In dieser Arbeit konnten mechanistische und strukturelle Einblicke in die Funktion dieser frühen ISC Maschinerie auf molekularer Ebene gewonnen werden. Erstens konnte auf Basis der durch NMR Spektroskopie atomar aufgelösten Strukturen des Ferredoxins Yah1, des Gerüstproteins Isu1 und des Yah1-Isu1 Komplexes gezeigt werden, wie die beiden Proteine interagieren. Daraus konnte ein Vorschlag abgeleitet werden, wie die Elektronenübertragung vom reduzierten Fe/S-Cluster des Ferredoxins zum Isu1 bewerkstelligt wird. Hierbei spielen vor allem strukturelle Veränderungen innerhalb des Yah1 bei der Reduktion eine große Rolle, wobei das essentielle Histidin 51 als „Elektronenbrücke“ fungieren könnte. Zweitens konnten biochemische Untersuchungen der Interaktionen aller frühen ISC-Faktoren mittels Thermophorese zu einem zeitlich aufgelösten Modell des Mechanismus der initialen Fe/S-Cluster Biogenese beitragen. Es konnte gezeigt werden, dass alle primären ISC-Faktoren miteinander interagieren und den biosynthetischen Komplex bilden. Dieser ist vom Redoxzustand der Komponenten und der Anwesenheit von Fe(II) und Cystein abhängig. Schließlich konnte auf Basis von SAXS-Daten (SAXS: small angle X-ray scattering) die Gesamtstruktur der frühen ISC-Maschinerie ermittelt werden. Dadurch konnte der frühe ISC-Komplex als Dodekamer mit folgender Stöchiometrie definiert werden: 2(Nfs1+2Isd11+Yfh1+Isu1+Yah1). Diese strukturellen Daten erlaubten trotz der relativ niedrigen Auflösung erstmals weitreichende Rückschlüsse auf den molekularen 9 Mechanismus der Fe/S-Cluster Biogenese. Der Komplex aus Yah1 und Isu1 ist in räumlicher Nähe zum essentiellen Persulfid-tragenden Cysteinrest des Nfs1 lokalisiert, und ermöglicht damit räumlich eine Persulfidübertragung von Nfs1 auf Isu1. Anschließend kann das Persulfid durch Yah1 reduziert werden. Die bereits vorgeschlagene Funktion des Frataxins Yfh1 als Eisendonor konnte aufgrund seiner Lage im ISC-Komplex und im Speziellen der Position seines konservierten Histidins 23 weiter untermauert werden. Auch die Lage von Isd11 auf Nfs1 konnte erstmals gezeigt werden. Isd11 bindet weit vom aktiven Zentrum des Komplexes entfernt, befindet sich aber in unmittelbarer Nähe zum aktiven Zentrum des Nfs1 und der Cysteinbindestelle. Dies lässt den Schluss zu, dass Isd11 die Aktivität von Nfs1 reguliert. Somit konnte auf molekularer Ebene ein Vorschlag für die Herkunft und die Übertragung sowohl des Schwefels als auch des Eisens gemacht und Einblicke in die Lokalisation von Isd11 auf Nfs1 gewonnen werden. Zusammen genommen bilden diese Ergebnisse einen wichtigen Schritt in Richtung des molekularen Verständnisses der Fe/S-Cluster Biogenese und damit auch die Basis für weitere Untersuchungen., Iron-sulfur (Fe/S) clusters are ancient protein cofactors and ubiquitously present in all kingdoms of life. Fe/S-proteins coordinate essential functions within the cell, e.g. cellular respiration, DNA-synthesis and protein translation. Despite the relatively simple chemical structure and composition of Fe/S-clusters, the cell requires a complex system for their synthesis and incorporation into apo-proteins. Deficiencies in Fe/S-protein biogenesis are often linked with severe metabolic defects and serious diseases such as Friedreich‘s ataxia or sideroplastic anemia. A better understanding of the biogenesis of Fe/S-proteins may help to find new therapies for such life-threatening diseases. In eukaryotes, the synthesis of Fe/S-clusters starts inside mitochondria (or related organelles such as mitosomes). These organelles contain the so-called „iron-sulfur-cluster“ (ISC) assembly machinery. The early part of the ISC-machinery accomplishes the synthesis of a [2Fe-2S]-cluster on the scaffold protein Isu1 which requires five additional factors. The desulfurase complex Nfs1/Isd11 delivers the sulfur while the frataxin Yfh1 serves as an iron-donor and/or sulfur-carrier. The so provided iron and sulfur will finally be assembled to an Fe/S-cluster. The assembly process depends on an electron supply by the ferredoxin Yah1 and its reductase Arh1. In this study, additional mechanistic and structural insights into the early ISC-machinery were gained at a molecular level. First, it was shown how the two proteins interact, based on the atomic structures of Yah1, Isu1 and the Yah1-Isu1 complex solved by NMR-spectroscopy. This revealed a possible mechanism for the electron transfer from the reduced Fe/S-cluster of Yah1 to Isu1. Therefore, the structural changes of Yah1 upon reduction play a major role while the essential His51 may have an electron-bridging function. Second, biochemical studies of the interactions of all early ISC factors by Thermophoresis contributed to a time-resolved model of the mechanism of the initial Fe/S-cluster biogenesis. All primary ISC factors interact with each other and form a biologically competent complex, which is dependent on both the redox-state of the components and the presence of Fe(II) and cysteine. Finally, the overall structure of the early ISC-machinery was determined by SAXS (small angle X-ray scattering). This allowed the early ISC complex to be defined as a dodecamer having the following stoichiometry: 2(Nfs1+2Isd11+Yfh1+Isu1+Yah1). These structural data, despite the relatively low resolution, allowed new insightful conclusions about the molecular mechanism of Fe/S-cluster biogenesis. The Yah1-Isu1 complex is located in close proximity to the essential persulfide-bearing cysteine residue of Nfs1, and thus enables a persulfide-transfer from Nfs1 to Isu1. Then the persulfide can be reduced by Yah1. The previously proposed function of the frataxin Yfh1 as an iron-donor was further substantiated due to its localization within the ISC-complex and in particular the position of its conserved histidine 23. For the first time the location of Isd11 on Nfs1 could be shown. Isd11 binds far away from the active site of the ISC-complex, but is located in close proximity to the active site of Nfs1 and its cysteine binding pocket. This leads to the conclusion that Isd11 may regulate the activity of Nfs1. Thus, these data offer an explanation for the origin and the transfer mechanism of both the iron and the sulfur on a molecular basis and suggest a possible location of Isd11 on Nfs1. Taken together, these results constitute an important step in the direction of the molecular understanding of the Fe/S cluster biogenesis and therefore also form the basis for further investigations.

Macrophages (Mϕ) are professional phagocytic cells responsible for internalizing and clearing particles and pathogens. The prevailing Mϕ phenotype largely depends on the local immune status of the host. Whereas M1-polarized Mϕ are considered as pro-inflammatory Mϕ, M2 Mϕ exhibit anti-inflammatory functions and promote tumor growth. Yeast Saccharomyces cerevisiae is taken up by phagocytic cells and is a promising vehicle for nucleic acids vaccines. Herein, we aimed to study the response of human Mϕ to S. cerevisiae exposure and its potential use as a gene delivery system in M1 and M2 cells. Opsonized S. cerevisiae was taken up to the same extent by M1 and M2 Mϕ and induced an M1 like-phenotype in both cell types. Furthermore, yeast delivered functional nucleic acids to Mϕ, especially when constitutively biosynthesized mRNA was used. Interestingly, protein expression of the delivered nucleic acid was higher in M2 cells when compared with M1 Mϕ. Finally, the delivery of proinflammatory mediator mRNA to M2 Mϕ re-educated them towards an M1 phenotype. Silica nanoparticles represent another potential delivery system. Interestingly, nanoparticle uptake was enhanced in M2 compared with M1 Mϕ. In contrast, the uptake of microparticles did not differ between M1 and M2 phenotypes. Our results suggest the use of yeast- or nanoparticle-based gene delivery as promising approach for the treatment of pathologic conditions that may benefit from the presence of M1-polarized Mϕ, such as cancer. Makrophagen (Mϕ) sind professionelle Phagozyten und damit für die Aufnahme und den Abbau von Partikeln und Pathogenen verantwortlich. Der vorherrschende Mϕ-Phänotyp wird vom lokalen Immunstatus des Wirts bestimmt. Während M1-Mϕ Entzündungsreaktionen unterstützen, haben M2-Mϕ antiinflammatorische Funktionen, können allerdings auch das Tumorwachstum fördern. Der Hefestamm Saccharomyces cerevisiae wird von phagozytierenden Zellen aufgenommen und bietet so die Möglichkeit, DNA-Impfstoffe zu verabreichen. In dieser Arbeit wurde der Einfluss von S. cerevisiae auf den Makrophagen-Phänotyp sowie eine mögliche Verwendung als Genübertragungs-System untersucht. Opsonierte Hefezellen wurden von M1- und M2-Mϕ im gleichen Ausmaß aufgenommen und riefen in beiden Zelltypen einen pro-inflammatorischen Phänotyp hervor. Darüber hinaus konnte S. cerevisiae zur Übertragung funktioneller DNA und mRNA genutzt werden. Durch Übertragung von mRNA, die für pro-inflammatorische Mediatoren kodierte, konnten M2-Mϕ erfolgreich in Richtung M1 repolarisiert werden. Silica-Nanopartikel könnten ebenfalls ein nützliches Werkzeug zur Genübertragung darstellen. Interessanterweise zeigten M2-Mϕ eine höhere Kapazität zur Aufnahme von Silica-Nanopartikeln. Zusammengefasst zeigen unsere Ergebnisse, dass Hefe- oder Nanopartikelbasierte Gentherapie einen vielversprechenden Ansatz zur Therapie von Erkrankungen darstellen könnte, die von der Anwesenheit von M1-Mϕ profitieren, wie z.B. Tumorerkrankungen.

In balancing accuracy versus speed in protein synthesis, numerous parameters serve to increase translational efficiency by optimizing the binding kinetics of translation factors to the ribosome. On the one hand, use of frequent codons, recognized by higher-abundance tRNAs, correlates with lower mistranslation rates. On the other hand, autocorrelation, the re-use of tRNAs by different synonymous codons, is a proven predictor of translational velocity. Factors that limit diffusion of ribosome interacting molecules, e.g. aminoacyl tRNA synthetases, can also contribute to higher efficiency. Additionally, accumulation of positively charged amino acids in the peptide exit tunnel is a reliable predictor of translational stalling. The budding yeast multi-KH domain RNA-binding protein Scp160p binds to over 1000 mRNAs as well as polyribosomes, and its mammalian homolog vigilin binds tRNAs and translation elongation factor EF1alpha. Despite its implication in translation, studies on Scp160p's molecular function are lacking to date. Our lab previously applied translational profiling approaches and demonstrated that the association of a specific subset of mRNAs with ribosomes or heavy polysomes depends on Scp160p. Interaction of Scp160p with these mRNAs requires the conserved K homology (KH) domains 13 and 14. Transfer RNA pairing index (TPI) analysis of Scp160p target mRNAs had indicated a higher degree of consecutive use of iso-decoding codons in more depletion-affected messages. As shown previously for one target mRNA encoding the glycoprotein Pry3p, Scp160p depletion results in translational downregulation but increased association with polysomes, suggesting that it is required for efficient translation elongation. In my study, depletion of Scp160p decreased the relative abundance of ribosome-associated tRNAs whose codons show low potential for autocorrelation on depletion-affected mRNAs. Conversely, tRNAs with highly autocorrelated codons in mRNAs are less impaired. The data indicates that Scp160p might increase the efficiency of tRNA recharge, or prevent diffusion of discharged tRNAs, both of which were also proposed to be the likely basis for the translational fitness effect of codon autocorrelation. Yeast Scp160p also interacts with Asc1p, the homolog of mammalian RACK1, on the ribosomal small subunit - which in turn has been shown to interact physically with kinases, and genetically with aminoacyl-tRNA synthetases. After analyzing the role of Scp160p and Asc1p in translational efficiency and fidelity in yeast in my study, more insights were gained: scp160Δ and asc1Δ mutants decode stop codons with increased fidelity, consistent with the proteins’ roles in promoting elongation velocity. Loss of Scp160p or Asc1p increases rates of both programmed and nonprogrammed -1 ribosomal frameshifting but not +1 frameshifting, consistent with roles for both these proteins in enhancing elongation speeds. Differential mistranslation of codons for tRNAs with low or high abundances by the respective mutants on the other hand matches their proposed roles in limiting tRNA diffusion and boosting tRNA recycling, respectively. In conjunction with their known physical interactions with other components of the ribosome and trans-acting factors, a biophysical model is presented describing how these two proteins might stabilize polysomes and help to channel tRNAs between successive ribosomes during translation elongation.

Wenn Hefe in einer kontinuierlichen Kultur wächst, kommt es zu einer spontanen Synchronisation der Zellen resultierend in einer stabilen respiratorischen Oszillation. Sowohl weite Teile des Transkriptoms als auch des Metaboloms oszillieren in klaren Phasenbeziehungen zu dieser respiratorischen Aktivität. In dieser Arbeit wird das Phänomen sowohl von theoretischer als auch experimenteller Seite untersucht. Es wird die Dynamik des Lipidoms analysiert und gezeigt, dass dieses ebenfalls oszillatorisches Verhalten aufweist. Dabei gibt es eine Gruppe an Lipiden, die ihre höchsten Konzentrationen in der Phase hoher Sauerstoffaufnahme zeigt und eine andere Gruppe in der Phase niedriger Sauerstoffaufnahme. Zudem werden vier Szenarien betrachtet, die in biochemischen Netzwerken zu Oszillationen führen können. Es wäre möglich, dass es sich um einen rein mechanistischen Effekt ohne eine unmittelbare Funktion - beruhend auf einer negativen Rückkopplung und einer intrinsischen Zeitverzögerung - handelt. Weiterhin könnten diese Oszillationen die sich ändernen physiologischen Anforderungen eines Prozesses, der in einer gegebenen Ordnung abzulaufen hat, widerspiegeln. Unter Verwendung von Minimalsystemen und in-silico Evolution wird gezeigt, dass Oszillationen zu einem Fitnessvorteil auf Einzelzellebene führen können. Dieser beruht zum einen darauf, dass Oszillationen eine zeitliche Trennung der Produktion toxischer Nebenprodukte von der Produktion der durch sie geschädigten Komponenten ermöglicht. Zum anderen erlaubt oszillatorisches Verhalten das Ablaufen von Reaktionen in dem für sie jeweils günstigsten Reaktionsmilieu. Basierend auf den experimentell bestimmten Austauschraten für Glucose, O2 und CO2 wird mittels FBA untersucht, wie sich die optimalen Syntheseraten von Biomasse und die Vorläufer selbiger über den Zyklus hinweg ändern. Die Ergebnisse deuten auf eine Trennung von Biosynthese und Stressantwort hin, was eine mögliche Funktion dieser Zyklen darstellen könnte. When grown in continuous culture, budding yeast tend to autosynchronize resulting in a stable respiratory oscillation. Thereby, respiration toggles between high and low oxygen uptake rates. In parallel with this toggling, most facets of cellular physiology oscillate with distinct phase relationships e.g the transcriptome and metabolome. In this work, the phenomenon is examined from a theoretical as well as an experimental point of view. It can be shown that also the lipidome is oscillatory whereby one group of lipids peaks in the phase of high oxygen uptake and the second group of lipids in the phase of low oxygen uptake. Furthermore, four scenarios are presented that might lead to oscillatory dynamics in biochemical networks: Oscillation might occur due to a negative feedback and an intrinsic time delay without bearing a certain function. They could further reflect the changing physiological requirements of a process that has to be performed in a certain order. Using generic models and in-silico evolution, it can be shown that oscillations can also be beneficial on a single cell level since they allow a temporal separation of the production of a toxic by-product and the synthesis of its target and also that reactions can occur in their respective favored reaction milieu. Using measured exchange rates for glucose, O2 and CO2 as constraints for FBA, it is examined how the optimal synthesis rates for biomass and its precursors vary over a cycle. The results suggest that there is a temporal separation of processes related to biosynthesis and stress response which might reflect a possible function of the yeast metabolic cycle.

A distinctive character of the mature intraerythrocytic form of the malaria parasite, Plasmodium falciparum, is a high glycolytic flow rate to fulfill its energetic requirements. This action produces two mole of lactic acid per mole of glucose as the anaerobic end product resulting in large quantities that need to be removed from the parasite cytosol. On its way out into the bloodstream lactate has to cross three different phospholipid bilayers, the parasite plasma membrane, the parasitophorous vacuole membrane and the red blood cell membrane. Although transport characteristics have been described for lactate in P. falciparum the molecular identity of the underlying permease(s) is still unknown. Here the discovery of a gene, PfFNT, responsible for the peptide that facilitates lactate transport over the parasite plasma membrane is described. It is a member of the formate nitrite transporter family (FNT) with high sequence similarities to microbial FNTs. For characterization of the protein a Saccharomyces cerevisiae knock out strain was employed that has lost the ability to transport monocarboxylates. Using this system PfFNT lactate/proton symport was found. This was confirmed by a direct proportionality of L-lactate transport to the prevailing pH gradient. Moreover when this gradient was abolished by proton decouplers, i.e. carbonylcyanide-3-chlorophenylhydrazone (CCCP) and 2,4-dinitrophenol (DNP), transport ceased. The PfFNT facilitated substrate pattern fits microbial FNTs, with acetate exhibiting the highest permeability followed by formate, L-lactate, D-lactate and pyruvate in decreasing order. The dicarboxylate malonate was excluded showing selectivity of monovalent anions over multivalent anions which is also a common feature shared by all FNTs discovered so far. The non-charged molecule glycerol, which is similar in size to lactate, was also excluded. Moreover facilitation features, such as transport rates and inhibition profile, match earlier findings from measurements performed in isolated living parasites in vitro hinting at a central position of PfFNT in parasite metabolism. For this the antiplasmodial compounds phloretin, furosemide, and cinnamate derivatives where tested revealing IC50 values around 1 mM. Inhibition requires a negative moiety though, since the uncharged cinnamamide had no effect. Notably the organomercurial p-chloromercuribenzene sulfonate (pCMBS), an inhibitor of human lactate transport, did not alter transport rates of PfFNT. This, taken together with the fact that there are no FNT homologs apparent in the human genome indicates PfFNT as a novel promising antimalarial drug target. Additionally PfFNT is the only transporter of the plasmodial glycolytic pathway for which structure information is available from crystals of homologous proteins predisposing it to further design of high affinity inhibitors. Ein herausragendes Merkmal des intraerythrozytären Malariaerregers, Plasmodium falciparum, ist eine hohe glykolytische Flussrate um seinen Energiebedarf zu decken. Bei diesem Vorgang werden aus einem Molekül Glukose zwei Moleküle Laktat gebildet, welches als metabolisches Endprodukt in hohen Mengen anfällt und aus dem parasitären Zytosol ausgeschleust werden muss. Auf seinem Weg ins Blut muss das Laktat drei Phospholipid Doppelmembranen überwinden, die parasitäre Plasmamembran, die parasitäre Vakuolen Membran und die Membran der Erythrozyten. Obwohl diese Transportprozesse in P. falciparum bereits beschrieben wurden, konnte die molekulare Identität der zugrunde liegenden Permease(n) bis jetzt nicht geklärt werden. In dieser Arbeit wurde das Gen, PfFNT, identifiziert das für das Peptid codiert, welches für die Laktatleitung über die Parasiten Membran verantwortlich ist. Es gehört zur Familie der Formiat Nitrit Transporter (FNT) und besitzt ähnliche Transporteigenschaften wie mikrobielle FNTs. Zur Charakterisierung des Proteins wurde ein Saccharomyces cerevisiae knock-out Stamm verwendet, welcher nicht dazu befähigt ist Monocarboxylate zu transportieren. In diesem System wurde gezeigt, dass PfFNT Laktat in Symport mit Protonen leitet. Dieses wurde durch eine direkt zum vorherrschenden pH-Wert proportionale Transportrate belegt. Zudem konnte der Transport gestoppt werden, indem der pH-Gradient durch Protonenentkoppler, wie Carbonylcyanid-3-chlorophenylhydrazon (CCCP) und 2,4-Dinitrophenol (DNP) zerstört wurde. Das durch PfFNT geleitete Subtratspektrum entspricht dem der bisher beschriebenen mikrobiellen FNTs. Dabei zeigt das Acetat Molekül die höchste Permeabilität, gefolgt von Formiat, L-Laktat, D-Laktat und Pyruvat in absteigender Reihenfolge. Das zweifach negativ geladene Malonat wurde nicht transportiert, was ebenfalls zu der Selektivität der bisher beschriebenen FNTs passt, die alle nur einfach geladene Anionen leiten. Das ungeladene Glycerol, welches eine ähnliche Größe zum Laktat Molekül aufweist, wurde ebenfalls nicht transportiert. Des Weiteren passen die Transporteigenschaften, wie Transportrate und Inhibitionsprofil zu denen, welche aus Daten gewonnen wurden, die in lebenden isolierten Parasiten in vitro gemessen wurden. Dieses deutet auf eine zentrale Rolle von PfFNT im parasitären Metabolismus hin. Hierfür wurden die antiplasmodial wirkenden Substanzen Phloretin, Furosemid und Zimtsäurederivate getestet, welche alle IC50 Werte um 1 mM zeigen. Inhibition erfordert zudem eine einzelne negative Ladung da das ungeladene Zimtsäureamid keine Wirkung auf die Transportrate hat. Bemerkenswert ist, dass die Organoquecksilber-Verbindung p-Chloromercuribenzensulfonat (pCMBS), ein bekannter Inhibitor des menschlichen Laktat Transports, den Transport durch PfFNT nicht verändert. Dies, zusammengenommen mit der Tatsache, dass es keine homologen Gene zu FNTs im menschlichen Genom gibt, deutet auf eine potentielle Rolle von PfFNT als neues Wirkstoffziel zur Behandlung von Malaria hin. Zusätzlich ist PfFNT der einzige Transporter des plasmodialen glykolytischen Stoffwechsels für den Strukturdaten aus Proteinkristallisationen in hoher Auflösung verfügbar sind. Daher ist PfFNT prädispositioniert für ein Design von hochaffinen Inhibitoren.

In this work the dynamic behaviour of wild yeasts during spontaneous wine fermentation at a winery in the Valais region of Switzerland was studied. Wild yeast in the winery environment (i.e. the grape surface, vineyards and cellar) were characterised using a novel polymerase chain reaction/terminal restriction fragment length polymorphism (PCR T-RFLP) method. Up to 11 different yeast species were isolated from the vineyard air, whereas only seven were recovered from the surface of grapes. We initially investigated a culture-independent cultivation method in pilot-scale steel fermentation tanks and found greater diversity of yeast in the musts from two red grape varieties compared to three white grape varieties. We found that the yeast Metschnokowia pulcherima, Rhodotorula mucilaginosa, Pichia kluyveri, P. membranifaciens and Saccharomyces cerevisiae remained active through to the end of the fermentation process. We also studied the dynamic behaviour of yeast in Qvevris (amphora-like clay vessels) for the first time using a novel, highly-sensitive quantitative real-time PCR method. We found that non-Saccharomyces yeasts were present during the entire fermentation process, with R. mucilaginosa and P. anomala the most prominent species. We studied the relationship between the predominance of different species and the output of the fermentation process. We identified so-called spoilage yeasts in all fermentation procedures, but high levels of acetic acid accumulated only in fermentations with an extended lag phase. It was found that growth of non-Saccharomyces species, such as P. anomala and R. mucilaginosa was favoured when fermentations were performed at colder temperatures (18°C), consequently producing more ethyl acetate and higher alcohols. The organic and mineral components of 20 qvevri wines from selected wineries throughout Europe were evaluated to gain insight into one of the oldest known methods of wine production. Qvevri wines were less acidic than conventional wines, containing higher levels of acetic and lactic acids but lower levels of tartaric acid. They also contained higher levels of antioxidants and total phenolic, the latter being up to 10 times more abundant in white wine varieties than conventional wines. Despite fermentation in clay vessels, the mineral content of Qvevri wines was within the normal reported range, although the levels of phosphorus were slightly higher. This is one of only a few studies that have considered the compositional nature of Qvevri wines.

Das Killertoxin K28 ist ein viral codiertes A/B-Toxin der Hefe Saccharomyces cerevisiae, das nach endozytotischer Aufnahme und retrogradem Transport zum ER gelangt. Nach Retrotranslokation äußert sich der letale Effekt in Abhängigkeit zur applizierten Konzentration entweder in einem G1/S-Zellzyklusarrest oder der Apoptose. Im Rahmen dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die ER-Zytosol-Dislokation des Dimers durch das Chaperon BiP sowie die Isomerase-Aktivität der Protein-Disulfidisomerase und eine ausgeglichene Ca2+-Konzentration katalysiert wird. Die Überwindung der ER-Membran wird vermutlich durch Sec61p vermittelt und findet unabhängig von ERAD-Komponenten, UPR sowie Autophagozytose oder der Synthese von „lipid droplets“ (LD) statt. Die Expression der α Untereinheit führt ebenfalls zu einem G1/S-Arrest der Zielzelle. Auch hier werden Kar2p sowie eine intakte Ca2+-Homöostase zur effizienten Retrotranslokation in das Zytosol benötigt. Sec61p sowie Der1p des ERAD-L-Pathways bilden wahrscheinlich die potentielle Dislokationspore, wobei der ER-Export auch mit der LD-Synthese in Zusammenhang gebracht werden kann. Die gängigen zellulären Degradations-Prozesse wie ERAD, HiP und Autophagie tragen jedoch ausschließlich zum Abbau des Toxins bei. Die Wirkung der K28α-Untereinheit auf höhere Eukaryonten resultiert in der Induktion der Apoptose. UPS scheint im Säuger den ER-Export von K28α zu unterstützen, da die Substitution interner Lysinreste mit einer Reduktion der Toxizität einhergeht. The killer toxin K28 is a viral encoded A/B toxin of the yeast Saccharomyces cerevisiae which is taken up by endocytosis and is transported retrogradely to the ER. After retrotranslocation the lethal effect culminates either in a G1/S cell cycle arrest or in apoptosis depending on the toxin concentration. In this work it was shown that ER-cytosol dislocation of the α/β dimer is catalyzed by the chaperone BiP and the isomerase activity of protein disulfide isomerase Pdi1p and requires balanced intracellular Ca2+ levels. Passing the ER-membrane is assumed to be mediated by Sec61p and is independent of ERAD components, UPR, autophagy or the synthesis of "lipid droplets" (LDs). The expression of the plasmid-driven K28α-subunit also leads to a G1/S-arrest of the target cell. Kar2p and an intact Ca2+ homeostasis are also required for efficient retrotranslocation into the cytosol. As part of the ERAD-L pathway, Sec61p and Der1p are likely to form the potential dislocation pore whereupon ER export of K28α can also be associated with LD-synthesis. However, all major cellular degradation processes such as ERAD, HiP and autophagy contribute exclusively to the degradation of the toxin. The effect of K28α expression in higher eukaryotes results in the induction of apoptosis. In this case, the UPS seems to support ER export of K28α since the substitution of internal lysine residues is accompanied by a reduction of toxicity.

Ziel dieser Arbeit war es, den zentralen Kohlenstoffwechsel mit besonderem Fokus auf Regulation zu untersuchen, insbesondere durch die Auftrennung von zwei Regulationsebenen: metabolische Regulation, assoziiert mit direkten Wech- selwirkungen zwischen Metaboliten und Enzymen, sowie hierarchische Regulation, assoziiert mit Änderungen in Enzymmengenänderungen durch die Regulation von de novo Enzymproduktion. Unsere Untersuchungen basieren größtenteils auf drei Datensätzen aus glukoselimitierten Chemostatkulturen von S. cerevisiae. Im Kap. 2 wurden Extrazelluläre Bedingungen im Makroskopischen unter- sucht. Das wichtigsten Ergebnis dieser the- oretischen Analyse ist die Charakterisierung des Selektionsdruckes in einem Chemostatkultur. Im Kap. 4 wurde eine Analyse auf Systemebene des zentralen Kohlenstoffwech- sels durchgeführt. Unter Verwendung der Metaboliten- und der Flußdaten wurde ein kinetisches Modell konstruiert, welches wesentliche Teile des zentralen Kohlen- stoffwechsels umfaßt. Die meisten kinetischen Ausdrücke und Parameterwerte wurden aus einem bestehenden kinetischen Modells (Teusink-Modell) übernom- men., In this work, we aimed to elucidate central carbon metabolism focusing on the aspect of regulation, especially by separating two regulatory levels: metabolic regulation, associated with direct interactions of metabolites and enzymes, and hierarchic regulation, associated with enzyme level change via regulation of de novo enzyme production. Our investigations were largely based on the analysis of three datasets from glucose limited continuous cultures of S. cerevisiae. Extracellular conditions on the macroscopic scale were investigated in Chapter 2. This was inspired by the perceived lack of clarity regarding an important aspect: concentration of glucose, the limiting nutrient and main carbon source in these cultures. The main outcome of this theoretical analysis was characterisation of the selection pressure in a chemostat culture, as selecting for cells which produce the growth rate, defined by the pre-set dilution rate, with lower external concentration of the limiting nutrient. Flux regulation on the scale of individual enzymes was investigated for selected reactions in Chapter 3. This analysis was based on the attempt to reproduce flux changes through these reactions, using enzyme kinetic expressions with inputs from the three aforementioned datasets. The notion of hierarchic and metabolic regulation was introduced and modified. System-level analysis of central carbon metabolism was undertaken in Chap- ter 4. Using the information on metabolite levels and flux, a kinetic model representing significant parts of central carbon metabolism was constructed. To get feasible flux distributions, constrained metabolic flux balance analysis was performed, using a stoichiometric network, constructed to be consistent with the model’s stoichiometry. Fitting the model resulted in two sets of parameters corresponding to steady states reproducing, the nominal data values of the anaerobic and the fully aerobic conditions.

In dieser Schrift wird die Installation des Genome Browsers GBrowse Version 2.39 dargestellt. Weiters wird die Reimplementierung der Leistungsmerkmale, die von Andreas Redl (Redl 2008) in GBrowse Version 1.69 eingebracht wurden, präsentiert. Die Einleitung enthält einen Überblick und Vergleich unterschiedlicher, frei erhältlicher, Genom Browser. Die Phylogenie von Pichia pastoris wird dargestellt. Einige der Gründe, warum P. pastoris gerne als Organismus für Genexpression gewählt wird, werden ebenfalls dargestellt. Die zusätzlichen Leistungsmerkmale, die Andreas Redl (Redl 2008) in GBrowse Version 1.69 eingebracht wurden, werden vorgestellt. Einer der Hauptteile dieser Arbeit beschreibt die Reimplementierung dieser Leistungsmerkmale in GBrowse Version 2.39 und die Datenvorbereitung für die drei P. pastoris Stämme DSMZ 70382, GS115 und CBS7435. Das Kapitel ‚Discussion’ stellt die Vorteile manuell kuratierter GFF3 Dateien gegenüber automatisch erstellten Dateien dar. Einige Probleme bei der Installation und Datenpräparation werden auch gebracht. Das Kapitel ‚Outlook’ schlägt die Implementierung zweier Hilfsscripts vor und die Ausnutzung des ‚Renderfarm’ GBrowse Version 2.39 Leistungsmerkmals. This paper presents the Installation of GBrowse 2.39 and the re-implementation of the additional features implemented by Andreas Redl (Redl 2008) for GBrowse 1.69. The introduction presents an overview and a comparison of some of the free available genome browsers. The phylogeny of Pichia pastoris is outlined and reasons for choosing P. pastoris are presented and the additional features in the GBrowse version 1.69 are described. Further the changes in the GBrowse version 2.39, the installation of this version from scratch, starting with the OS, are described. The appendix contains the command list for the installation. The re-implementation of the additional features and the reasons for the selection of algorithms are presented, also the data preparation for the three strains DSMZ 70382, GS115 and CBS7435. The ‘Discussion’ section discusses the merits of manually curated GFF3 data files and the problems of automatically creates ones. Further some of the installation and data preparation problems are also presented. The ‘Outlook’ chapter suggests the implementation of some helper scripts and the exploit of the ‘render farm’ feature as expansion for the new GBrowse version 2.39. vorgelegt von: Hans Kraus Masterarbeit Wien, FH Campus Wien 2012

submitted by Stefan Neubauer Zsfassung in dt. Sprache Wien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2012 OeBb

Die toxische Wirkung von Kationen ist verantwortlich für eine Reihe biologischer und pathologischer Erscheinungen. Zu den übergreifenden Zielen des Gesamtvorhabens wurden als wissenschaftliche Arbeiten i) die Analyse, graphische Darstellung und darauf basierende Gewichtung spezifischer genomischer Promotor-Regionen, ii) die Verarbeitung, Auswertung und genomweite Analyse von Mikro-Array Experimenten über die Auswirkung verschiedener Schwermetalle auf S. cerevisiae, iii) Mitarbeit an einer Simulations-Umgebung mit Modulen zur Digitalisierung, Präsentation, Analyse und mathematischer Modellierung der räumlichen Verteilung biologisch relevanter Moleküle sowie iv) ein Ansatz zur Modellierung der Kationen-Homöostase unter Verwendung der Theorie der Nichtgleichgewichts Thermodynamik beigetragen. Im Vordergrund der bioinformatorischen Arbeiten stand dabei der iterative Prozess, in dem verfügbare experimentelle Ergebnisse in aussagefähige Modelle oder Anwendungen übertragen wurden und die Resultate der Modellierung oder Vorhersage wiederum in neue entsprechende Experimente umgesetzt wurden. Die Anwendungsumgebung zur Promotoranalyse sowie die Simulationsumgebung zur räumlichen Verteilung biologisch relevanter Moleküle wie zum Beispiel markierte Signalmoleküle wurde bereits veröffentlicht und erfolgreich eingesetzt. Die Ergebnisse der genomweiten Analyse liefern Erkenntnisse über die individuellen Mechanismen und Strategien der Hefe auf verschiedene Metallionen in toxischer Konzentration zu reagieren. Der theoretische biophysikalisch-thermodynamische Ansatz liefert ein fundamentales Modell der Kationen-Homöostase der zahlenmäßig bedeutendsten Kationen: Kalium, Natrium und Protonen. Das Modell wurde an experimentellen Daten getest und konnte diese reproduzieren. Entsprechende Perspektiven für die Weiterentwicklung des Modells werden diskutiert. Cationic toxicity is relevant for a number of qualitatively different biological and medical phenomena such as cationic surfactants, salt and heavy metal stress in plants and a number of pathological conditions which share similar critical metabolic processes (i.e. protein aggregation and oxidative stress). In line with the overall project goals the scientific work contributed to i) the analysis, graphical presentation and the respective assessment of specific genomic promoter-regions, ii) the conversion, evaluation and genome wide analysis of micro-array experiments on the effects of exposition of S. cerevisiae to heavy metals, iii) a simulation environment comprising modules for digitalization, presentation, analysis and mathematical modeling of the spatio-temporal distribution of biologically relevant molecules, and iv) a cation homeostasis modeling approach based on the non-linear thermodynamics theory. The bioinformatical work focused on an iterative process in which available experimental results were transferred into meaningful models or applications and results of modeling or prediction into corresponding new experimental designs. The software for the promoter-analysis and the simulation environment for integration of spatio-temporal distribution of biologically relevant molecules like labeled signal molecules have already been published and successfully implemented.The results of the genome-wide analysis - based on experiments of a project partner - provide insights in the individual mechanisms and strategies of the yeast cell upon exposition to various (heavy) metals in toxic concentrations. The theoretical biophysical-thermodynamic approach provides a fundamental model of cation homeostasis in S.cerevisiae of the major cations: potassium, sodium and protons. The model - confronted with experimental data - is capable to reproduce the observed uptake rates to a reasonable degree. Perspectives for further development of the model are discussed.

V letu 2007 smo na Univerzitetnem centru za vinogradništvo in vinarstvo Meranovo Fakultete za kmetijstvo in biosistemske vede ugotavljali vpliv defoliacije in različnih sevov kvasovk na kakovost vina sorte 'Sauvignon'. Poskus v vinogradu je bil zastavljen po metodi naključnih blokov z dvema obravnavanjema (defoliacija—Def in kontrola—K) z 12 ponovitvami (24 trt v ponovitvi). Prvi teden po cvetenju so bili pri defoliaciji odstranjeni vsi listi od bazalnega dela mladike do lista nasproti najvišje ležečega grozda. V moštu iz kontrolnih trsov in defoliacije smo preizkušali dva seva kvasovk (Uvaferm CS2 ter Zymaflore VL3). Pri vinifikaciji so bila 4 obravnavanja z dvema ponovitvama.V času trgatve so bile statistično značilne razlike v vsebnosti skupnih titracijskih kislin. Nižja vsebnost je bila pri defoliaciji s 10,33g/l, pri kontroli pa 10,91g/l (p≤0,05). Ob trgatvi ni bilo statistično značilnih razlik pri gostoti mošta, pH vrednosti, masi pridelka in masi 100 jagod. Kvasovke Zymaflore VL3 so fermentirale hitreje kot kvasovke Uvaferm CS2, defoliacija ni imela vpliva na hitrost fermentacije. Pri organoleptični oceni so bila obravnavanja s kvasovko Uvaferm CS2 ocenjena bolje kot obravnavanja s kvasovko Zymaflore VL3 (p≤0,05). Im Jahr 2007 haben wir auf dem Universitätszentrum für Weinbau und Önologie Meranovo der Fakultät für Landwirtschaft und Lebenswissenschaften den Einfluss von Entblätterung und verschiedener Hefestämme auf die Weinqualität der Sorte 'Sauvignon' geprüft. Das Experiment im Weinberg wurde als randomisierter Block mit zwei Behandlungen (Entblätterung—Def und Kontrolle—K) mit 12 Wiederholungen (24 Reben in einer Wiederholung) konzipiert. Bei der Entblätterung wurden alle Blätter vom basalen Teil der Triebe bis zum gegenüberliegenden Blat des Clusters entfernt, in der ersten Woche nach der Blüte. Im Traubenmost der Kontrolle und Entblätterung haben wir zwei Hefestämme getestet (Uvaferm CS2 und Zymaflore VL3). In der Weinbereitung gab es 4 Behandlungen mit zwei Wiederholungen. In der Erntezeit wurden statistisch signifikante Unterschiede im Niveau der gesamten titrierbaren Säuren ermittelt. Bei der Entblätterung wurden gesamt titrierbare Säuren mit 10,33 g/l gemessen, bei der Kontrolle dagegen 10,91 g/l (p≤0,05). Bei der Ernte gab es keine statistisch signifikanten Unterschiede im Zuckergehalt, pH-Wert, Erntemasse und der Masse von 100 Beeren. Die Hefe Zymaflore VL3 hat den Traubenmost schneller vergoren als die Hefe Uvaferm CS2, die Entblätterung hatte keinen Einfluss auf die Geschwindigkeit der Gärung. Bei der sensorischen Beurteilung der Behandlungen wurden die mit der Hefe Uvaferm CS2 vergorenen Weine besser bewertet als die mit der Hefe Zymaflore VL3 (p≤0,05).

Mathematische Modellierung ist ein wichtiges Werkzeug biologischer Forschung geworden, was sich in der Entstehung von Systembiologie widerspiegelt. Eine erfolgreiche Anwendung mathematischer Methoden auf biologische Fragen erfordert die Zusammenarbeit zwischen experimentell und theoretisch arbeitenden Wissenschaftlern, auch um sicherzustellen, dass die Biologie im Modell adäquat dargestellt wird. Ich präsentiere hier zwei Untersuchungen zur Anpassung von Saccharomyces cere- visae an hyperosmotische Bedingungen: Eine biologisch detailgetreue Beschreibung der Signaltransduktion zur Aktivierung von Hog1 und ein Model, das Anpassung an osmotischen Stress in zellulärem Zusammenhang beschreibt. Die Studie zur Osmoadaptation in zellulären Kontext impliziert, dass Hog1 und Fps1, zwei wichtige Bausteine dieses Adaptationsvorgangs, miteinander in Wechselwirkung treten und dies zur Anpassung beiträgt. Dieses Ergebnis wird durch die Integration verschiedener Hefestämme mit zum Teil gegensätzlich wirkenden Mutationen ermöglicht. Diese Studie offenbart des weiteren, dass die Rolle von Glycerol in der langfristigen Anpassung bisher überschätzt wurde. Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass Glycerol als ’Not’-Osmolyt eingesetzt wird und andere Stoffe, z.B. Trehalose, erheblich zu dauerhafter Osmoadaptation beitragen. Durch die Betrachtung des Zustands mehrerer zellulärer Mechansimen wird deutlich, dass Osmoadaptation stark vom Kontext abhängig ist und nicht perfekt ist. Der Preis schlägt sich in langsamerem Wachstum nieder. Zeitabhängige Sensitivitätsanalyse des Modells untermauert diese Hypothese. Die gewählte Perspektive ermöglicht die Betrachtung von intrazellulären Signaltransduktionskomponenten, Metaboliten und des Wachstums. Der Vergleich mit einer Studie, die Anpassung an osmotischen Stress als perfekte Adaptation auf Grund eines vereinfachten Modells beschreibt, hebt die Rolle der gewählten Perspektive zum Verständnis biologischer Systeme hervor. Mathematical modeling has become an important tool in biology, reflected in the emergence of systems biology. Successful application of mathematical methods to biological questions requires collaboration of experimental and theoretical scientists to identify and study the problem at hand and to ensure that biology and model match. In this thesis, I present two studies on adaptation to hyperosmotic conditions in the yeast Saccharomyces cerevisae: A biologically faithful description of the signaling pathways activating Hog1 and a model integrating the effects of Hog1-activity and cellular metabolism, describing osmoadaptation in cellular context. The study of osmoadaptation in cellular context suggests that Hog1 and Fps1, two crucial components of adaptation, interact upon hyperosmotic stress. This finding is facilitated by incorporating multiple strains with mutations leading to partly oppositional phenotypes. This study further reveals that the role of glycerol in long term adaptation has been overestimated so far. According to the results presented here, glycerol is utilized as an ’emergency’ osmoprotectant and other compounds, e.g. trehalose, contribute significantly to osmoadaptation. Accounting for the state of multiple cellular mechanisms (Hog1-activity, glycolysis, growth) shows that adaptation to hyperosmotic stress and the impact of the individual mechanisms of adaptation is context dependent and that adaptation to sustained osmostress is not perfect, the expense reflected in a reduced growth rate in hyperosmotic medium. Time-dependent sensitivity analysis supports the notion of context. The perspective chosen allows observations on intracellular signaling components, metabolites and growth speed. Comparison with a study that describes osmoadaptation as perfect adaptation highlights the role of this perspective for the conclusions drawn, thus emphasizing the importance of an integrative perspective for understanding biological systems.

Aus Pressehefe wurden Milchsäurebakterien isoliert und bei der Herstellung von Weizenbrot eingesetzt. Erste vielversprechende Resultate zeigen klare Auswirkungen auf das Brotaroma. Weitere Untersuchungen sollen Aufschluss geben, ob sich ausgewählte Milchsäurebakterienstämme für Neuentwicklungen von Weizenbroten einsetzen lassen.

Bevor sich eine Zelle teilt muss sie ihr gesamtes genetisches Material verdoppeln. Eukaryotische Genome werden von einer Vielzahl von Replikationsstartpunkten, den sogenannten Origins, aus repliziert, die über das gesamte Genome verteilt sind. In dieser Arbeit wird der zugrundeliegende molekulare Mechanismus quantitativ analysiert, der für die nahezu simultane Initiierung der Origins exakt ein Mal pro Zellzyklus verantwortlich ist. Basierend auf umfangreichen experimentellen Studien, wird zunächst ein molekulares regulatorisches Netzwerk rekonstruiert, welches das Binden von Molekülen an die Origins beschreibt, an denen sich schließlich komplette Replikationskomplexe (RKs) bilden. Die molekularen Reaktionen werden dann in ein Differentialgleichungssystem übersetzt. Um dieses mathematische Modell zu parametrisieren, werden gemessene Proteinkonzentrationen als Anfangswerte verwendet, während kinetische Parametersätze in einen Optimierungsverfahren erzeugt werden, in welchem die Dauer, in der sich eine Mindestanzahl von RKs gebildet hat, minimiert wird. Das Modell identifiziert einen Konflikt zwischen einer schnellen Initiierung der Origins und einer effizienten Verhinderung der DNA Rereplikation. Modellanalysen deuten darauf hin, dass eine zeitlich verzögerte Origininitiierung verursacht durch die multiple Phosphorylierung der Proteine Sic1 und Sld2 durch Cyclin-abhängige Kinasen, G1-Cdk bzw. S-Cdk, essentiell für die Lösung dieses Konfliktes ist. Insbesondere verschafft die Mehrfach-Phosphorylierung von Sld2 durch S-Cdk eine zeitliche Verzögerung, die robust gegenüber Veränderungen in der S-Cdk Aktivierungskinetik ist und außerdem eine nahezu simultane Aktivierung der Origins ermöglicht. Die berechnete Verteilung der Fertigstellungszeiten der RKs, oder die Verteilung der Originaktivierungszeiten, wird auch genutzt, um die Konsequenzen bestimmter Mutationen im Assemblierungsprozess auf das Kopieren des genetischen Materials in der S Phase des Zellzyklus zu simulieren. Before a cell divides it has to duplicate its entire genetic material. Eukaryotic genomes are replicated from multiple replication origins across the genome. This work is focused on the quantitative analysis of the underlying molecular mechanism that allows these origins to initiate DNA replication almost simultaneously and exactly once per cell cycle. Based on a vast amount of experimental findings, a molecular regulatory network is constructed that describes the assembly of the molecules at the replication origins that finally form complete replication complexes. Using mass–action kinetics, the molecular reactions are translated into a system of differential equations. To parameterize the mathematical model, the initial protein concentrations are taken from experimental data, while kinetic parameter sets are determined using an optimization approach, in particular a minimization of the duration, in which a minimum number of replication complexes has formed. The model identifies a conflict between the rapid initiation of replication origins and the efficient inhibition of DNA rereplication. Analyses of the model suggest that a time delay before the initiation of DNA replication provided by the multiple phosphorylations of the proteins Sic1 and Sld2 by cyclin-dependent kinases in G1 and S phase, G1-Cdk and S-Cdk, respectively, may be essential to solve this conflict. In particular, multisite phosphorylation of Sld2 by S-Cdk creates a time delay that is robust to changes in the S-Cdk activation kinetics and additionally allows the near-simultaneous activation of multiple replication origins. The calculated distribution of the assembly times of replication complexes, that is also the distribution of origin activation times, is then used to simulate the consequences of certain mutations in the assembly process on the copying of the genetic material in S phase of the cell cycle.

Ergosterol ist das Endprodukt der Sterolbiosynthese in Hefen und Pilzen. Als Membrankomponente ist es für diese Organismen essentiell. Wirtschaftlich ist Ergosterol als Ausgangstoff für die Vitamin D2 Synthese und als Precursormolekül in der pharmazeutischen Industrie interessant. Seine Synthese ist streng reguliert und an Sauerstoffverfügbarkeit gebunden; sie lässt sich in den sog. Prä- und Post-Squalensyntheseweg unterteilen. Während im Prä-Squalenweg die Synthese der Sterolvorstufe Squalen stattfindet, erfolgt im Post-Squalensyntheseweg die Bildung des Sterols Lanosterol aus Squalen und dessen Umwandlung über Sterolzwischenstufen in das Endprodukt Ergosterol. In Säugetierzellen ist das Endprodukt der Sterolbiosynthese Cholesterol. Beide Reaktionswege sind entschlüsselt. Die meisten der an der Sterolbiosynthese beteiligten Enzyme wurden in der Vergangenheit identifiziert und ihre Funktion (z.B. in Genexpressionsstudien) bestimmt. Dennoch ist bisher die Regulation der Sterolbiosynthese nicht vollständig aufgeklärt. Ziel dieser Arbeit war es, vergleichende Stoffflussanalysen innerhalb des Post-Squalensyntheseweges durchzuführen, um Kontrollmechanismen der Sterolbiosynthese zu untersuchen. Hierfür wurden Stimulus-Response-Experimente etabliert, in denen die Sterolsynthese durch veränderte Umgebungsbedingungen beeinflusst wurde. Die dynamischen Änderungen der intrazellulären Sterolkonzentrationen wurden gemessen und für die Stoffflussberechnung verwendet. So wurden Batch-Kultivierungen der Hefe S.cerevisiae mit einem Wechsel von anaeroben zu aeroben Bedingungen durchgeführt. Hierbei wurden sehr hohe Bildungsraten der Sterole induziert, die sich durch eine Sterolsupplementierung des Kulturmediums noch verstärken ließen. Bei der Auswertung der Stoffflussanalyse konnte festgestellt werden, dass z.B. die Esterbildung des Intermediates Zymosterol den Stofffluss in Richtung des Endproduktes Ergosterol maßgeblich beeinflusst. Die Erkenntnisse der Stoffflussanalyse wurden für den Entwurf eines strukturierten Modells genutzt, das die Ergosterolbildung beschreibt. Die aus den Stoffflussberechnungen hervorgehenden Bildungsraten wurden verwendet, um die Sterolbildung in mathematischen Ansätze abzubilden. Durch die Etablierung einer Stoffflussanalyse der Cholesterolbiosynthese in humanen Fibroblastenzellen wurde geprüft, inwieweit sich die Methode zur Untersuchung der Sterolbildung in humanen Zellen eignet und ob sich die Erkenntnisse aus dem Hefesystem auch auf die humane Sterolbiosynthese übertragen lassen. Beim Vergleich beider Systeme wurde festgestellt, dass bei den Fibroblasten - im Gegensatz zur Hefe - kaum eine Veresterung oder Zwischenspeicherung von Sterolintermediaten stattfand. Abschließend wird daher diskutiert, inwiefern sich die Hefe S.cerevisiae als Modellorganismus zur Untersuchung der Sterolbiosynthese eignet., Ergosterol is the final product of the sterol biosynthesis in yeast and fungi. As membrane component, it is an essential compound of these organisms. Ergosterol is of economic interest because it is used as raw material for the vitamin D2 synthesis and as a precursor molecule in the pharmaceutical industry. Its synthesis is highly regulated and requires the availability of oxygen; it can be divided in the pre- and post-squalene pathway. While the synthesis of the precursor squalene occurs in the pre-squalene pathway, the first sterol lanosterol, several intermediates and the final product ergosterol are biochemically converted in the post-squalene pathway. The final product of the sterol biosynthesis in mammalian cells is cholesterol. Both reaction pathways are well known. Most enzymes of the sterol biosynthesis are identified and their functions have been evaluated (e.g. in gene expression studies). However, the detailed regulation of the sterol biosynthesis is not completely understood. The aim of this work was to conduct a metabolic flux analysis within the post-squalene pathway to investigate the underlying control mechanisms of the sterol biosynthesis. Therefore stimulus-response-experiments were performed to influence the sterol biosynthesis by changing the environmental conditions. The dynamic changes of the intracellular sterol concentrations were measured and used for the calculation of the metabolic fluxes. For this purpose, the yeast Saccharomyces cerevisiae was cultivated in a batch process including a switch from anaerobic to aerobic growth conditions. In these experiments, high sterol fluxes were initiated, which could be even increased by sterol supplementation to the cultivation media. The analysis of the metabolic fluxes revealed a significant influence of the ester formation of the intermediate zymosterol on the flux to the final product ergosterol. The results of the metabolic flux analysis were used to design a concept of a structured model, which describes the ergosterol formation. The sterol reaction rates obtained from the flux analysis were used to describe the sterol formation with mathematical equations. The application of a metabolic flux analysis for the investigation of the cholesterol biosynthesis in human fibroblasts was evaluated. It was determined, if the results from the investigations with the yeast could be transferred to the human sterol biosynthesis. When comparing both systems with each other, it was observed, that fibroblasts do neither synthesize esters nor accumulate sterol intermediates as the yeast does. Therefore it was discussed, if the yeast S.cerevisiae can serve as a general model organism for the investigation of the sterol biosynthesis.

Das virale A/B-Toxin K28 aus Saccharomyces cerevisiae tötet sensitive Hefen in einem rezeptorvermittelten Prozess durch Induktion eines Zellzyklusarrestes. Nach endozytotischer Internalisierung durchläuft das Toxin den Sekretionsweg retrograd über Golgi und ER. In dieser Arbeit wurde der Mechanismus der ER/Cytosol-Retrotranslokation von K28 im Detail untersucht. Durch die Expression einer letalen K28alpha-Variante im ER-Lumen ausgewählter Deletionsmutanten konnte nachgewiesen werden, dass K28alpha nach Eintritt in den Sekretionsweg mit Hilfe von Erv29p und Bst1p in COPII-Vesikel verpackt und zum Golgi transportiert wird, wo die pro-Region durch die Aktivität der Endoprotease Kex2p entfernt wird. Dieser Schritt ist zwingend notwendig für die in vivo Toxizität von alpha. Im Gegensatz zu exogen appliziertem A/B-Toxin nutzt K28alpha den zellulären ERAD-Qualitätskontrollmechanismus, um aus dem ER in das Cytosol zu gelangen. Es konnte gezeigt werden, dass die Funktion des HRD1-Komplexes (im Unterschied zu CDC48) von essenzieller Bedeutung für die Toxizität von alpha ist. Wurde eine Polyubiquitinierung von K28alpha durch Austausch der internen Lysinreste verhindert oder eine Ubiquitinmutante, die keine Polyubiquitinketten mehr bilden kann, simultan überexprimiert, so kam es in beiden Fällen zu einem Verlust der Toxizität. Die Ubiquitinierung von K28alpha scheint somit für die Toxin-Retrotranslokation wichtig zu sein; ein direkter biochemischer Nachweis hierfür konnte bislang jedoch noch nicht erbracht werden. K28, a viral A/B toxin produced by killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae, kills sensitive yeasts in a receptor mediated process by inducing a cell cycle arrest. After endocytotic uptake the toxin passes the secretory pathway in reverse via Golgi and ER. In this study, toxin retrotranslocation from the ER into the cytosol has been investigated in detail by regulated expression of a lethal K28alpha variant in the ER of selected deletion mutants. By this means it became evident that K28alpha is packaged into COPII vesicles and transported to the Golgi by the help of Erv29p and Bst1p which normally recruit lumenal ERAD substrates. Within a late Golgi removal of the pro-region by endopeptidase Kex2p cleavage is crucial for the in vivo toxicity of K28alpha. In contrast to exogenously applied A/B toxin, K28alpha reaches the cytosol by abusing components of the ER quality control pathway ERAD. Sensitivity assays further indicated that HRD1 (in contrast to CDC48) complex components play a central role in K28alpha in vivo toxicity. Preventing polyubiquitination of K28alpha either by substitution of all internal lysine residues or by simultaneous overexpression of mutant ubiquitin, unable to form polyubiquitin chains, severely impaired in vivo toxicity. Thus, ubiquitination of K28alpha seems to be essential for its retrotranslocation, although a direct biochemical proof is still missing.

The yeast Pichia stipitis is of biotechnological importance because of her ability to ferment the sugar xylose to ethanol. This is not very widespread among yeast. Xylose can be obtained out if the wood composite hemicellulose, what makes wastes of paper and wood industry a possible source for bioethanol and biofuel. To pave the way to efficient biofuel production the physiological and genetically particularities of P. stipitis need to be better understood Within this work we first tested the ability of Pichia stipitis to use amino acids as carbon and nitrogen source. For this reason we performed growth experiments on several distinct amino acids. The gained results showed that P. stipitis is able to use glutamate, aspartate and proline as sole source of carbon and nitrogen. This is a trait, not very common and not very well examinated in yeasts. Only a few yeasts are known to possess this ability. To see how distributed this ability is, a choice of 34 yeasts strains, belonging to 24 species, was tested. Their growth on glutamate, aspartete and proline was determined. 20 of the tested yeasts were able to use amino acids as carbon source. This ability does not depend on the belonging to a defined cladus. After this observation we took a more detailed look at the behaviour of P. stipitis during growth on glutamate as carbon and as nitrogen source. An interesting result was that the ethanol yield and formation rate was higher when glutamate was used as nitrogen source compared to ammonium. In both cases glucose was used as carbon source. Another result of the experiment was that glutamate was used as carbon source simultaneously with glucose. In this constellation seems to be no carbon catabolite repression caused by glucose. When cultivated with glutamate as carbon source, P. stipitis secretes a great amount of ammonium into the medium which has so far not been described for yeasts. An ammonium secretion seems to point at an efficient ammonium export system. The growth experiments with glutamate as carbon source showed that P. stipitis grows after adaption with a rate similar to that on medium with glucose and glutamate or glucose and ammonium. The biomass yield is also very similar to that in cultivation with glucose, drawn to the yield per mol C-source. To get an insight into the physiological background of the utilization of glutamate as carbon source the activity of the glutamate dehydrogenases GDH1 and GDH2 was examinated. The activity of the catabolic GDH2 was measured whenever glutamate or aspartate were present in the medium. The highest activity was measured with glutamate or aspartate as carbon source. It was observed that the GDH2 activity is increased when ammonium is present in cultures with glutamate or aspartate as carbon source. No activity of the GDH2 was found during cultivation on glucose and ammonium. The activity of the anabolic GHD1 was only found in presence of glucose and ammonium, even if glutamate was also present. The correlation between glutamate utilization and GDH2 activity leads to the idea of disrupting the PsGDH2 gene. For this reason a strain disrupted in the PsKU80 gene was constructed. This was done to circumvent the high rate of non-homologous integration of DNA, transformed into P. stipitis. The disruption of the KU80 gene was successful and the gained mutant showed nearly 100 percent of homologous integration of DNA after transformation. This strain provides a useful tool for further genetic approaches on P. stipitis. Further information about these strain is given in the article send with these synopsis. Using the KU80 strain we performed the disruption of the GDH2 gene in P. stipitis. The gained transformant was unable to use glutamate as carbon or nitrogen source. It was also unable to use aspartate or proline as carbon source. But to a limited amount it was able to use these two amino acids as nitrogen source. A retransformation with an amplificate of the GDH2 ORF restored the ability to utilize glutamate. After these experiments a random mutagenesis was performed to obtain mutants that are unable to utilize glutamate as carbon source. It might have been possible to indentify other factors involved into the regulation of glutamate utilization by these experiments. The random mutagenesis delivered two mutants which were unable to use glutamate as carbon source. But they were still able to use it as nitrogen source. In a plasmid-rescue these mutants were identified as ubiquitin ligase and cytochrome-C-oxidase subunit V (COX5). The COX5 mutant was chosen for further characterization. This was done by determination of the substrate spectrum, measuring of the ethanol formation under different aeration conditions, and by testing the sensitivity to inhibitors of the respiratory chain. The COX5 mutant was unable to utilize any kind of non-fermentable carbon source. No activity of cytochrome-C-oxidase was detectable in crude cell extracts of the mutant. According to these observations it seems likely that the respiratory chain is no longer able supply energy for the cells. The COX 5 mutant forms significantly more ethanol under fully aerated conditions, compared to wild type and transformation strain. The ethanol formation is also higher on glucose compared to xylose. Under less aerated conditions the ethanol yield of the COX5 mutant was lower but still higher than in the wild type. These findings lead to the estimation that in the COX5 mutant the fermentative pathways are more active than in the wild type under highly aerated conditions. Growth experiments with SHAM, the inhibitor of the alternative oxidase, showed that the COX5 mutant is completely sensitive to SHAM. The gas exchange was affected by SHAM in the same way. The wild type shows only minor reactions to high SHAM concentrations. This sensitivity of the mutant to SHAM shows the importance of the alternative oxidase after the lost of cytochrome-C-oxidase activity. The role seems to lie in maintaining the redox-balance of the cell, not in energy supply. If the alternative oxidase would deliver energy the mutant should be able to grow on non-fermentable substrates. Cultivations with KCN reduced the drymass yield of the wild type, but increased the one of the mutant. These observations were also supported by measuring the gas exchange. The gas exchange of the mutant was also increased in presence of KCN. Concerning these findings a stimulation effect of the KCN on the alternative oxidase could be possible.

Flavonoide sind eine wichtige Klasse sekundärer Pflanzenstoffe, die in allen höheren Pflanzen vorkommen. Bis heute sind mehr als 6400 verschiedene Verbindungen bekannt. Anthocyane, farbige Flavonoide, stellen die wichtigsten Blütenfarbstoffe dar. Sie verleihen Blüten eine rosa, rote, malvenfarbige und blaue Färbung und locken Bestäuber an. Darüber hinaus besitzen Anthocyane, wie alle anderen Flavonoide, zahlreiche wichtige Eigenschaften für Pflanzen, wie z.B. der Schutz vor UV-B-Strahlung und Pflanzenschädlingen. Die am weitesten verbreiteten Anthocyane sind durch das Hydroxylierungsmuster des B-Ringes des Flavonoidgrundgerüsts charakterisiert. Die Hydroxylierung des B-Ringes wird durch die Aktivität der zwei Cytochrom P450-Enzyme Flavonoid 3'-Hydroxylase (F3'H) und Flavonoid 3',5'-Hydroxylase (F3',5'H) kontrolliert. Ohne die Aktivität eines dieser Enzyme wird hauptsächlich das 4'-hydroxylierte Anthocyan Pelargonidin gebildet, welches für viele rosa und orange Blütenfarben verantwortlich ist. Die Aktivität der F3'H führt vorwiegend zu der Bildung von Cyanidin (3',4'-hydroxyliert) und die Aktivität der F3',5'H vorwiegend zu der Bildung von Delphinidin (3',4',5'-hydroxyliert). Cyanidin verleiht Blüten rote und malvenfarbige Farben, Delphinidin ist das vorherrschende Pigment in vielen blauen Blüten. Ziel dieser Arbeit war es die F3'H und die F3',5'H durch die Klonierung der entsprechenden cDNA-Klone aus verschiedenen Pflanzen zu isolieren und durch heterologe Expression in Hefe zu charakterisieren. Zu diesem Zweck stand sowohl chemogenetisch definiertes als auch nicht definiertes Pflanzenmaterial zur Verfügung. Aus chemogenetisch definierten Linien von Matthiola incana konnte durch differentielle PCR ein komplementärer cDNA-Klon der F3'H, die vom Genlocus B kontrolliert wird, isoliert werden. In Enzymtests setzte das als CYP75B7 klassifizierte Enzym das 4'-hydroxylierte Naringenin (NAR) zu 3',4'-hydroxyliertem Eriodictyol (ERI) und das 4'-hydroxylierte Dihydrokaempferol (DHK) zu 3',4'-hydroxyliertem Dihydroquercetin (DHQ) um. Es konnte darüber hinaus durch Northernblot-Analyse eindeutig gezeigt werden, dass es sich bei den homozygot rezessiven Matthiola-Linien (bb) ohne F3'H-Aktivität um Trans-kriptions-Mutanten handelt. Zwei F3'H codierende cDNA-Sequenzen wurden aus einer cDNA-Genbank von Callistephus chinensis mit Hilfe einer F3'H cDNA-Sonde aus Arabidopsis thaliana isoliert. Bei der heterologen Expression des Klons CYPCcppHt1 zeigte das entsprechende Protein eine eindeutige F3',5'H-Aktivität, obwohl es aufgrund seiner Aminosäuresequenz nicht zu der Unterfamilie der F3',5'Hs CYP75A sondern in die Unterfamilie der F3'Hs CYP75B gehört. In den durchgeführten Enzymtests war das als CYP75B5 klassifizierte Enzym in der Lage NAR und DHK sowohl in 3'-Position als auch in 5'-Position zu hydroxylieren. Somit ist dies der erste Bericht über die Isolierung eines Enzyms mit einer F3'H spezifischen Aminosäuresequenz, das über eine F3',5'H-Aktivität verfügt. Bei der heterologen Expression des zweiten cDNA-Klons CYPCcpHt2 konnte bislang keine spezifische Enzymaktivität des codierten Enzyms, welches als CYP75B6 klassifiziert wurde, beobachtet werden. Eine weitere F3'H konnte aus Pelargonium zonale isoliert werden. Dabei wurde mit einem CYP-spezifischen Primer, der von der Hämbindungs-Region bekannter F3',5'H Sequenzen abgeleitet wurde, ein entsprechendes cDNA-Fragment durch PCR amplifiziert. Mit Hilfe des neuen RLM-RACE-Verfahrens konnte ein vollständiger cDNA-Klon generiert werden, der anschließend heterolog in Hefe exprimiert wurde. Sowohl in in vivo Enzymtests mit lebenden Hefezellen (Bioconversion) als auch in in vitro Enzymtests mit Hefemikrosomen setzte das als CYP75B8 klassifizierte Enzym NAR zu ERI und DHK zu DHQ um. Da die F3'H in Pflanzenextrakten von P. zonale aufgrund interferierender Inhaltsstoffe bisher nicht nachgewiesen werden konnte, ist dies der erste Nachweis der Existenz einer F3'H und des entsprechenden Gens in P. zonale. Durch den Einsatz des CYP-spezifischen Primers konnte außerdem ein F3',5'H-spezifisches cDNA-Fragment aus Lycianthes rantonnetii kloniert werden. Nach einem RLM-RACE wurde der offene Leserahmen des vollständigen Klons in Hefe exprimiert. Dabei zeigte das als CYP75A9 klassifizierte Enzym nur in den in vivo Enzymtests mit lebenden Hefen eine Enzymaktivität, aber nicht in Enzymtests mit Hefemikrosomen. Außerdem offenbarte das Enzym nur eine F3’H-Aktivität aber keine F3',5'H-Aktivität, so dass bislang nicht feststeht, ob es sich um eine F3'H oder um eine F3',5'H handelt . Durch die Klonierung und Charakterisierung der F3'H und der F3',5'H können viele neue und interessante Blütenfarben bei wirtschaftlich bedeutenden Zierpflanzen erzeugt werden. Darüber hinaus ermöglichen sie zusammen mit anderen Enzymen aus dem Flavonoidbiosyntheseweg die biotechnologische Produktion einer Vielzahl von verschiedenen Flavonoiden, die dadurch in ausreichender Menge und Reinheit der medizinischen Forschung und der Nahrungsmittelindustrie zur Verfügung gestellt werden können. Flavonoids are an important class of secondary metabolics present in all higher plants. Up to today more than 6400 different compounds are known. Anthocyanins, coloured flavonoids, represent the major pigments in flowers. They confer pink, red, mauve and blue to flowers and attract pollinators. Furthermore, Anthocyanins possess like all the other flavonoids various important properties for plants, such as protection against UV-B radiation and pests. The most prevalent Anthocyanins are characterized by the hydroxylation pattern of the B-ring of the basic flavonoid skeleton. The hydroxylation of the B-Ring is controlled by the activities of the two cytochrome P450 enzymes flavonoid 3'-hydroxylase (F3'H) and flavonoid 3',5'-hydroxylase (F3',5'H). Without the activity of one of these enzymes the 4'-hydroxylated Anthocyanin Pelargonidin is mainly generated which is responsible for many pink and orange flower colours. The activity of the F3'H predominantly leads to the production of the Cyanidin (3',4'-hydroxylated) and the activity of the F3',5'H predominantly leads to the production of delphinidin (3',4',5'-hydroxylated). Cyanidin gives flowers red and mauve colours, delphinidin is the main pigment in many blue flowers. The aim of this thesis was to isolate the F3'H and the F3',5'H by cloning of the corresponding genes from several plants and to characterize them by means of heterologous expression in yeast. For that purpose both chemogenetic defined and none defined plant material have been available. From chemogenetically defined lines of Matthiola incana a complementary cDNA clone of the F3'H that is controlled by the genetic locus B was isolated by means of differential PCR. In enzyme tests the enzyme classified as CYP75B7 converted the 4'-hydroxylated Naringenin (NAR) to 3',4'-hydroxylated Eriodictyol (ERI) and the 4'-hydroxylated Dihydrokaempferol (DHK) to 3',4'-hydroxylated Dihydroquercetin (DHQ). It could also clearly be shown through Northern blot analysis that the recessive lines of Matthiola (bb) without F3'H activity are transcription mutants. Two F3'H coding cDNA sequences were isolated from a cDNA library of Callistephus chinensis by using a F3'H cDNA labelled probe of Arabidopsis thaliana. During the heterologous expression of the clone CYPCcpHt1 the corresponding protein showed a definite F3',5'H activity even though it does not belong due to its amino acid sequence to the subfamily of the F3',5'Hs CYP75A but to the subfamily of the F3'Hs CYP75B. In the enzyme tests carried out the enzyme classified as CYP75B5 was able to hydroxylate NAR and DHK in the 3'-position as well as in the 5'-position. Thus, this is the first report on an isolation of an enzyme with a F3'H specific amino acid sequence which has a F3',5'H activity. Up to now the heterologous expression of the second clone CYPCcpHt2 has revealed no specific activity of the encoded enzyme which was classified as CYP75B6 . Another F3'H was isolated from Pelargonium zonale. For that purpose a corresponding fragment was amplified by PCR with a CYP-specific primer which derived from the heme-binding region of known F3',5'H sequences. By using the new RLM method a full-length cDNA clone could be generated and heterlogous expressed in yeast afterwards. In vivo enzyme tests (bioconversion) as well as in vitro enzyme tests showed the conversion of NAR to ERI and DHK to DHQ catalysed by the enzyme classified as CYP75B8. Since a F3'H activity could never be demonstrated in plant extracts of P. zonale due to interfering compounds this is the first evidence of the existence of a F3'H and of the corresponding gene in P. zonale. By using the same CYP-specific Primer a cDNA fragment from Lycianthes rantonnetii was also cloned by PCR. After a RLM-RACE the open reading frame of the full-length clone was expressed in yeast. The enzyme classified as CYP75A9 showed only a enzyme activity in the in vivo enzyme tests with living yeast, but not in enzyme tests with yeast microsomes. Additionally, the enzyme revealed only a F3'H activity, but no F3',5'H activity, so it is not certain at the moment whether this enzyme is a F3'H or a F3',5'H. Because of the cloning and characterization of the F3'H and the F3', 5'H many new and interesting flower colours can be created in economically important ornamental plants. Moreover, together with other enzymes of the flavonoid biosynthetic pathway they enable the biotechnological production of a multiplicity of different flavonoids, which can thereby be made available in sufficient quantity and purity for medical research and food industry.

Lactic acid bacteria constitute the main part of the microbial flora of food fermentaions. Cereal fermentations are mainly dominated by the genus Lactobacillus. Sourdough fermentations are grouped into three so-called types (type I-III), reflecting the numerous internal and external fermentation parameters. In turn, they exert influence on the composition of the microflora. Lactobacillus sanfranciscensis is one of the most prominent species found in type I doughs, while species like L. pontis, L. panis, L. reuteri, L. fermentum and L. amylovorus are found in type II doughs. Type III doughs are dominated by species like L. plantarum, L. brevis or Pediococcus pentosaceus. Classically, the chracterization of lactic acid bacteria is based on phenotypical properties, leading to an identification of the bacteria. Such properties are, the fermentaion of certain carbohydrates, to cleave certain substrates or simply their macroscopic/ microscopic shape. Lactic acid bacteria from the sourdough environment are strongly adapted to their environment, thus a identification on the mentioned approach is often leading to ambigous results. Furthermore, a routine identification is hampered by their poor growth on synthetic media, caused by their adaption to the sourdough environment. In this work identification methods focusing the genotype of lactic acid bacteria are presented, to circumvent these problems. These methods are targeted on nucleic acids, and in here the 16S rRNA. For an improved identification procedure a PCR protocol based on these data was developed for the fast and reliable identification of L. pontis, L. panis and L. frumenti, which was described as a new species. The combination of these PCR procedure together with a DNA extraction method directly from the sourdough led to a further acceleration of the identification without the necessity of a cultivation step. A further PCR based technique developed in this work is the generation of DNA fingerprints by RAPD-PCR. Applying this method, the understanding of the microbial ecology of such fermentations was markedly improved. The fermentation flora of an industrial type II fermentation was investigated, grouping isolates from independent fermentations into genotypes by RAPD-PCR. It could be demonstrated, that such fermentations conducted under non-sterile conditions remain remarkly constant, with a composition of 70% L. amylovorus, 30% L. pontis and L. frumenti and in a few cases L. reuteri. Beside the characterization of lactic acid bacteria, RAPD-PCR revealed appropriate also for the characterization of yeast species. 45 yeast strain were isolated from various traditionally propagated sourdoughs and subsequently typed by RAPD-PCR. All isolates could be grouped into three clusters, and by including reference strains they were identified as Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica and Pichia membranaefaciens. These results were confirmed by FT-IR spectroscopy, SDS-PAGE and physiological investigations. 16S rDNA sequencing with subsequent comparative sequence analysis revealed as the gold standard for a reliable identification of new isolates from sourdough. Numerous strains from type II fermentations couldn't be assorted to already classified species in a phylogenetic tree. The most closest neighbours were L. vaginalis, L. oris, L. pontis, L. panis and L. reuteri. More detailed investigations regarding physiology, chemotaxonomic properties, G +C content and DNA-DNA homolgy showed the idependent status of this species, recently described as L. frumenti. Milchsäurebakterien stellen den Hauptteil der mikrobiellen Flora bei Lebensmittelfermentationen dar. Bei Getreidefermentationen ist der Gattung Lactobacillus eine tragende Rolle beizumessen. Sauerteigfermentationen lassen sich drei Typen (Typ I-III) zuordnen, die hauptsächlich die Art der Führung mit zahlreichen internen und externen Parametern widerspiegeln. Diese wiederum haben entscheidenden Einfluss auf die Zusammensetzung der Mikroflora. So findet man in Typ I Teigen hauptsächlich Lactobacillus sanfranciscensis, während Typ II Teige durch die Spezies L. pontis, L. panis, L. reuteri, L. fermentum und L. amylovorus dominiert werden. In Typ III Teigen kann man häufig L. plantarum, L. brevis oder Pediococcus pentosaceus antreffen. Die klassische Identifizierung von MSB beruht auf einer Erfassung phänotypischer Merkmale, die dann zur Charakterisierung herangezogen werden. Standardmerkmale sind die Fähigkeit der Organismen bestimmte Kohlenhydrate zu verwerten, Substrate zu spalten oder ihr makro-, bzw. ihr mikroskopisches Erscheinungsbild. Gerade bei stark an ein Milieu angepaßten Organismen, wie es die MSB aus Sauerteig sind, führt diese Vorgehensweise nicht immer zu eindeutigen Ergebnissen. Dazu kommt, dass Sauerteig-MSB eben durch ihre Anpassung an ihr Milieu auf Labormedien oft schwer kultivierbar sind, was eine schnelle Routineidentifizierung erschwert. Um diese Problematik zu umgehen, wurden in dieser Arbeit Identifizierungsmethoden entwickelt, die auf den Genotyp von MSB gerichtet sind. Diese haben Nukleinsäuren als Zielmoleküle, wobei hier die 16S rRNA eine tragende Rolle spielt. Für einen schnellen Nachweis von Sauerteig-Laktobazillen wurde beruhend auf vorhandenen und selbst erzeugten 16S rRNA Daten ein PCR-Nachweis entwickelt, der eine schnelle und zuverlässige Identifizierung von L. pontis, L. panis und der in dieser Arbeit neu beschriebenen Spezies L. frumenti sowie eine Differenzierung von phylogenetisch verwandten Spezies und anderen Sauerteig-MSB erlaubt. Darüber hinaus wurde das PCR-System mit einer DNA-Extraktion direkt aus dem Sauerteig kombiniert, was einen noch schnelleren Nachweis ohne Kultivierungsschritt ermöglicht. Die Daten über das Vorhandensein von L. pontis und L. frumenti in einer Modellfermentation stimmen mit alternativen Untersuchungen überein. Die PCR-Nachweismethoden können als schnelles Identifizierungswerkzeug, sowie als zur Kontrolle und Analyse von Fermentationen eingesetzt werden. Eine weitere PCR gestützte Technik, die in dieser Arbeit entwickelt wurde, ist die Erzeugung von "DNA-Fingerabdrücken" mittels RAPD-PCR. Diese Methode wurde angewandt, um das Verständnis zur mikrobiellen Ökologie in Sauerteigfermentationen zu verbessern. Dazu wurde die Flora industrieller Typ II Fermentationen untersucht, indem die Isolate aus unabhängigen Fermentationen aus einem längeren Zeitraum mittels RAPD-PCR zu Genotypen gruppiert wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die Flora solcher unter nicht sterilen Bedingungen geführten Fermentationen sehr stabil ist. Die dominante Flora besteht aus 70% L. amylovorus und 30% L. pontis, L. frumenti und selten L. reuteri. RAPD-PCR erwies sich neben der Charakterisierung von MSB auch für Hefen aus Sauerteigen geeignet. Dazu wurden aus traditionellen griechischen Sauerteigen 45 Hefestämme mit RAPD-PCR typisiert. Alle Isolate konnten drei Clustern zugeordnet werden. Durch Einbeziehung von Referenzstämmen konnten diese als Saccharomyces cerevisiae, Yarrowia lipolytica und Pichia membranaefaciens identifiziert werden. Diese Ergebnisse konnten durch alternative Ansätze, wie FT-IR-Spektroskopie, SDS-PAGE und physiologische Charakterisierung untermauert werden. 16S rDNA Sequenzierung und vergleichende Sequenzanalyse erwies sich als die zuverlässigste Methode zur Identifizierung von neuen Isolaten aus Sauerteigen. Zahlreiche Stämme aus einer Typ II Fermentation konnten nach der Einberechnung in einen phylogenetischen Baum keiner bekannten Spezies eindeutig zugeordnet werden. Die nächsten Nachbarn sind L. vaginalis, L. oris, L. pontis, L. panis und L. reuteri. Weitere Untersuchungen zu physiologischen Eigenschaften, chemotaxonomischen Merkmalen, sowie G + C-Gehalt und DNA-DNA Homologie, ergaben, dass es sich um eine eigenständige Spezies handelt, für die der Name L. frumenti vorgeschlagen wurde.

Die Hefe Saccharomyces cerevisiae sezerniert das von dsRNA Viren kodierte, heterodimere K28-Toxin in das sie umgebende Medium und ist somit in der Lage, Hefen derselben oder einer anderen Gattung abzutöten. Der als Präprotoxin (pptox) vorliegende Toxinvorläufer wird posttranslational in das ER-Lumen transportiert und nach Abspaltung der Signalsequenz werden die beiden Untereinheiten des reifen Toxins, α und β, durch eine Disulfidbrücke miteinander verbunden. Die Toxinaufnahme durch sensitive Zielzellen erfolgt über rezeptorvermittelte Endozytose, an deren Anschluss K28 retrograd über Golgi und ER bis auf die Stufe des Zytosols transportiert wird. Die Retrotranslokation aus dem ER erfolgt über den Sec61-Komplex der ER-Membran. Im Zytosol dissoziiert das α/β-Heterodimer in seine Toxinuntereinheiten, β wird ubiquitiniert und proteasomal abgebaut, während die zytotoxische α-Komponente mittels passiver Diffusion in den Zellkern gelangt und einen Zellzyklusarrest am G1/S-Übergang induziert. In der vorliegenden Arbeit wurden vier Themenschwerpunkte bearbeitet, die sich mit der intrazellulären Expression toxischer K28α-Derivate und deren intrazellulären Transportroute beschäftigten. (1) Im Rahmen einer Transposon(mTn3)-Mutagenese konnten überwiegend nicht-essentielle Hefeproteine als potentielle Interaktionspartner der beiden toxischen α-Varianten α(SS/R) und α(NLS/R) identifiziert werden: APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 und ZWF1. Die toxischen α-Varianten wurden in den jeweiligen knock-out-Mutanten der betreffenden Gene intrazellulär exprimiert und zusätzlich gegen exogen appliziertes K28-Toxin getestet. Es stellte sich heraus, dass die beiden Proteine Prp6p und Apl3p potentielle Interaktionspartner von α darstellen könnten. Das Gen PRP6 wurde anhand des Konstruktes α(NLS/R)identifiziert. PRP6 kodiert den RNP(U4/U6)-assoziierten Spleißfaktor Prp6p, der am prä-mRNA-Spleißen beteiligt ist und sich in der Kernmatrix befindet. Prp6p könnte somit mit K28α im Kern in direkte Wechselwirkung treten, was die Theorie des Kernimportes unterstützt. Die Mutation des Genes ist letal, weshalb das Protein nicht weiter untersucht wurde, da keine Expressionsstudien damit durchgeführt werden konnten. Des Weiteren wurde mit α(NLS/R) das Gen APL3 identifiziert, was einen Hinweis auf einen gerichteten Kernimport von K28α lieferte. Bei Apl3p handelt es sich um einen Teil des an der Clathrin-vermittelten Endozytose beteiligten AP2-Komplexes. Apl3p durchläuft ein nukleoplasmatisches "Shuttling". Auf dem Weg in den Zellkern könnte es mit der α-Untereinheit interagieren und eventuell dessen Import in den Nukleus erleichtern; alternativ wäre eine Interaktion nach passiver Diffusion von α(NLS/R) im Nukleus möglich. Interessanterweise verhielt sich die Δapl3-Mutante auch resistent gegen exogen appliziertes Toxin. Diese Resistenz beruht jedoch nicht auf einem Defekt der endozytotischen Toxin-Aufnahme (das Toxin war im Zytosol nachweisbar), sondern manifestiert sich vermutlich weiter "downstream", da sich die Mutante auch resistent gegen die Expression von α(SS/R) im ER verhielt. (2) Mit Hilfe eines Mutanten-Screenings konnte untermauert werden, dass α(SS/R) in den Sekretionsweg der Zelle eingeschleust wird und die Signalpeptidaseaktivität im ER eine entscheidende Rolle für die Retrotranslokation und Toxizität spielt. Darüber hinaus wurden deutliche Hinweise dafür erbracht, dass α(SS/R) bis auf die Stufe des Golgi gelangt und anschließend wieder retrograd zum ER transportiert wird, was aus der Resistenz der Mutanten Δkex1, Δerv29, Δerv46, Δerv41, Δemp24, Δemp46 und Δbst1 nach intrazellulärer Expression von α(SS/R)gezeigt werden konnte. Zwei Möglichkeiten sind somit beim intrazellulären Transport der α-Untereinheit denkbar: α wird nach Erreichen des Golgi wieder retrotransportiert und aus dem ER in das Zytosol transloziert; im Zytosol angekommen, erfolgt eine passive Diffusion in den Kern, der eventuell eine Interaktion von α mit zytosolischen Proteine vorausgeht. Hinweise darauf lieferten die Nukleoporinmutanten Δnup60, Δnup84 und Δgfd1, die nach intrazellulärer Expression von α(SS/R) und α(NLS/R) resistent waren oder lediglich ein leicht verzögertes Wachstum zeigten. Eine weitere Alternative wäre, dass α im Fall von α(SS/R) direkt vom Golgi das Zytosol erreicht. (3) Der intrazelluläre Nachweis der K28α-Untereinheit konnte erstmals anhand einer cmyc-markierten Toxinvariante (α(R)cmyc) erbracht werden. Die in vivo toxischen Varianten α(SS/R)cmyc und α(NLS/R)cmyc wurden weder im Zellaufschluss noch im Kulturüberstand nachgewiesen. Die durchgeführten Versuche ließen in Übereinstimmung mit den Mutantenanalysen den Schluss zu, dass α(SS/R) in den Sekretionsweg geschleust werden muss, um seine toxische Wirkung entfalten zu können; α(NLS/R) hingegen gelangt aufgrund der NLS direkt in den Kern; übereinstimmend hiermit war α(R) nicht mehr toxisch. (4) Der Austausch aller Lysinreste innerhalb von K28pptox gegen Arginine lieferte K28—Derivate mit einer verminderten Sekretionsrate und einer dadurch bedingten verminderten Toxizität. Die Lysin-freien Varianten waren jedoch in der Lage, den Zellen eine protektive Immunität zu verleihen. Eine Erhöhung der Toxizität war in den K-0 Varianten von K28 nicht zu beobachten, so dass eine Ubiquitinierung bei der Vermittlung der Toxizität keine Rolle spielt. K28 killer strains of the yeast Saccharomyces cerevisiae secrete a heterodimeric killer toxin (K28) which is genetically encoded by dsRNA viruses persisting within the cytosol. The toxin kills sensitive strains of the same or related genera by cell-cycle inhibition. The toxin precursor (preprotoxin, pptox) is postranslationally imported into the ER. On its intracellular transport route through ER and Golgi, the pptoxsignal sequence is proteolytically cleaved within the ER, and the α- and β-subunits of the mature toxin are covalently linked by a single disulfide bridge. Toxin uptake by a sensitive target cell resembles receptor-mediated endocytosis followed by retrograde transport via Golgi and ER and translocation into the cytosol through the major ER-import and -export channel Sec61p. Within the cytosol, the two subunits dissociate, β is ubiquitinated and proteasomally degraded, while α diffuses into the nucleus and induces a cell cycle arrest at the G1/S-boundary. The located HDEL-sequence is responsible for the endocytotic uptake and represents a classical ER retention signal which is recognized and bound by the HDEL-receptor Erd2p of the target cell. The subjects being worked on within this thesis cope with the intracellular expression and transport of certain toxic K28α-variants. The method of mTn3-mutagenesis was supposed to shed light onto intracellular interaction partners of the K28α-subunit. These partners should be investigated with respect to their cellular function. Moreover, an intensive mutant screening should show which compartments and modifications are necessary to confer α into its cytotoxic conformation. We also tried to detect the α-subunit intracellularly and in the supernatant. We asked whether there is any difference between the intracellular way the toxic subunit takes and the way "normal'; toxin follows when exogenously applied. Finally we focused on different toxin variants that were modified by the exchange of their lysine residues against arginine to analyze the effect of ubiquitination on toxin retrotranslocation and in vivo toxicity. (1) By transposon(mTn3)mutagenesis several yeast genes could be identified whose gene products might be potential interaction partners of the suicidal α-variants α(SS/R) and α(NLS/R): APL3, CWP2, IRA2, PFK26, PRP6, RNH203 and ZWF1. The lethal α-derivatives were expressed in each knock-out mutant and, additionally, each mutant was tested for sensitivity/resistance against extracellularly applied K28-toxin. After intracellular expression of the two α-variants, Apl3p and Prp6p were identified as potential interaction partners of α. Prp6p is an essential gene product that plays a role within the snRNP(U4/U6)-associated splicing factor located in the nuclear matrix and involved in pre-mRNA-splicing. It is< known that Prp6p interacts with a wide range of proteins, including the ubiquitin ligase Ubc9p, and it might be possible that Prp6p interacts with K28α in the nucleus, supporting the necessity of nuclear import for in vivo toxicity of K28. Besides Prp6p, another yeast protein (Apl3p) could be identified as possible interaction partner of α(NLS/R) and α(SS/R). As of the AP2-complex, Apl3p is associated with the clathrin dependent endocytosis machinery. Apl3p undergoes a nucleoplasmatic shuttling and therefore could interact with α on its way to the nucleus and facilitate its nuclear import; alternatively, an interaction could take place within the nucleus. Interestingly, a Δapl3-knock-out was not only resistant against the intracellular expression of either α(NLS/R) or α(SS/R) but also against exogenously applied toxin. Toxin resistance in a Δapl3-mutant was not caused by a defect in endocytic toxin uptake, since toxin was detectable in the cytosol of toxin-treated mutant cells. Thus, its resistance is likely to be manifested downstream from endocytosis, presumably within the nucleus. (2) Phenotypic analysis of various yeast mutants strongly indicated that α(SS/R) is transported into the ER lumen where signal peptidase processing is crucial for the in vivo toxicity of α. Furthermore, strong evidence was obtained that the variant α(SS/R) even reaches the Golgi compartment from where it is transported retrograde back to the ER. The following yeast knock-out mutants showed complete resistance against the intracellular expression of lethal K28α-variants: Δkex1, Δerv29, Δerv46, Δerv41, Δemp24, Δemp46 and Δbst1. Thus, two possible intracellular transport routes for K28α can be postulated: either α is transported from the Golgi back to the ER and thereafter into the cytosol from where it diffuses into the nucleus to kill a cell. Such a pathway is supported by the observed toxin resistance in the yeast nucleoporine mutants Δnup60, Δnup84 and Δgfd1 after intracellular expression of either α(SS/R) or α(NLS/R). Alternatively, α(SS/R) directly translocates from the Golgi to the cytosol to reach the nucleus. (3) For the first time, after expression of a cmyc-tagged, non-toxic α-variant (α(R)cmyc) the subunit could be detected by western analysis. Neither the toxic variant α(SS/R)cmyc nor α(NLS/R)cmyc could be detected within the cell cytosol or in the cell-free culture supernatant. These tests, in addition to the mutant screen, also showed that α(SS/R) has to gain access to the secretory pathway in order to be converted into its cytotoxic conformation; in contrast, α(NLS/R) directly enters the nucleus via its NLS. (4) Substitution of all internal lysine residues within K28pptox by arginines resulted in a toxin variant that was still in vivo toxic and capable to translocate from the ER into the cytosol, while immunity of lysine-free pptox was negatively affected. Therefore it can be concluded that ubiquitination is neither involved in ER exit nor in in vivo toxicity of K28.

vorgelegt von Verena Beck Zsfassung in dt. Sprache Wien, Univ. für Bodenkultur, Diss., 2007 OeBB

[no abstract]